CN108721615A - 一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗,病毒接种所用细胞系为EB66细胞系(一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株),病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养;并经过1)毒种选育;2)建立毒种种子批;3)制备细胞毒液;4)灭活病毒;5)乳化等步骤完成疫苗的制备。本发明方法具有制备的细胞毒液病毒含量高、生产工艺稳定、智能化控制、可大规模无血清悬浮培养、易操作和成本低等特点,制备的鸭坦布苏病毒灭活疫苗具有安全、副反应低、免疫效力高、批间差异小、检验次数少和成本低等优点,为水禽产业预防鸭坦布苏病毒病发生和流行的理想疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法,更具体地说涉及用一种细胞系生产鸭坦布苏病毒病灭活苗的方法,属于生物技术领域。
技术背景
我国鸭存栏量每年约40亿只。从2010年春季开始,我国浙江、江苏、山东、河北和北京等地区相继暴发了一种以鸭产蛋下降为主要特征的疫病,雏鸭发病后期出现精神沉郁、体重减轻、仰翻、侧翻和死亡等临床症状,若细菌继发感染,出现肝周炎、心包炎和气囊炎等,死淘率增加。2010年,根据产蛋下降和卵泡出血,将该病命名鸭出血性卵巢炎(duckhemorrhagic ovaritis, DHO),后经病原学研究证实该病是由黄病毒科坦布苏病毒(DuckTembusu Virus, DTMUV)引起,将该病命名为鸭坦布苏病毒病。北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、麻鸭和康贝尔鸭等均可发病,该病给养鸭业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是预防传染病有效和经济的方法之一,疫苗制备方法与疫苗的质量和成本密切相关,能够生成出抗原含量高、批间差异小、低成本和易放大等工艺是研究的重点,是行业发展方向。
在疫苗研究方面,研究人员就全病毒灭活疫苗和致弱活疫苗进行了大量的研究工作,鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)和活疫苗(WF100)先后获得新兽药注册证书。目前资料表明,研究人员或疫苗生产企业主要利用鸭胚、鸡胚、鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞、BHK-21、Vero细胞、DF-1细胞等细胞增殖病毒。我们的研究结果表明,利用无血清全悬浮BHK-21细胞反应器培养的鸭坦布苏病毒含量低,利用微载体灌流法悬浮培养Vero细胞培养的病毒液,其病毒含量可达到制备疫苗的标准,但是由于微载体和血清昂贵,存在成本高和不易放大的缺点,不适合养鸭企业适用。采用无血清全悬浮何种细胞培养病毒含量高、培养成本低的鸭坦布苏病毒培养工艺,是我们多年来一直研究和摸索的工作。
EB66细胞来源于鸭胚干细胞,经驯化后形成的一种遗传稳定、纯净、可在无血清培养基中大规模悬浮培养、广泛用于人或动物疫苗生产用细胞系。国内外尚未见建有利用鸭胚干细胞EB66和无血清全悬浮反应器培养鸭坦布苏病毒的报道或专利申请。
发明内容
为克服利用鸭胚生产存在的劳动强度大、成本高、工艺复杂、自动化程度低、抗原批间差异大和现有细胞培养的病毒含量低等缺点,提供一种用鸭胚干细胞系EB66生产鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种制备鸭坦布苏病毒病出血性卵巢炎灭活疫苗的方法,所述细胞系为EB66(一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株),病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。
上述方法,包括如下步骤:
1)选育毒株:将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞,经鸡胚有限稀释克隆法,取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养,培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株(基础种毒株);
2)建立毒种种子批:将步骤1)所得候选株病毒接种EB66细胞,用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代,处理细胞培养液,各代次毒种的病毒含量应≥106.5 ELD50/1ml。以1~10ml/冻存管的剂量分装,-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的F2~F7代作为毒种种子批,其中F2~F5代病毒为基础毒种,F6~F7代为生成种毒(工作种子);确定病毒感染复数(MOI):测定F6和F7代生成种毒的病毒含量(ELD50,鸡胚半数感染量),通过1个ELD50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量,按照≥107.1 ELD50/1ml的标准,确定了F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001;
3)制备细胞毒液:在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞,培养条件为温度30~37℃,pH7.2~7.5;当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的EB66细胞数量达到400~1000万时,接种F6或F7代毒种,作用2h后,加入2倍细胞体积维持液,30~37℃继续培养,30~120h后,当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液,该细胞毒液病毒含量应≥107.1 ELD50/1ml;
4)灭活病毒:取步骤3)所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理,加入细胞毒液总量(V/V)0.1~0.2%的灭活剂,2~37℃振荡灭活16~144h;成品检验:取所得灭活病毒,以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚,观察144小时,无特异性鸭胚或鸡胚死亡,判定毒液灭活完全;同时,取样,接种细菌检验用TG、GA和GP培养基,观察10日,无细菌生长,判定灭活毒液无细菌污染;
5)乳化:向步骤4)所得细胞毒液加入(V/V)4%~8%吐温80,搅拌均匀为水相,按照油相与水相的体积比1.5~3:1进行乳化,乳化后即得成品。
上述方法,所述细胞为鸭胚干细胞系(EB66);
上述方法:所述培养方法为细胞培养三角摇瓶或生物反应器,全悬浮细胞培养工艺;
上述方法:所述培养基为无血清培养基;
上述方法:毒株选育技术为鸡胚有限稀释法纯化技术;
上述方法,所述病毒感染复数(MOI)为0.1~0.001;
上述方法,所述培养工艺为接种病毒后,作用2h,再加入2倍体积的细胞维持液,30~37℃继续培养30~120h;
上述方法,细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理;
上述方法,所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液,2~37℃振荡灭活16~144h;
上述方法,所述灭活检验方法为以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚,观察144小时,无特异性鸭胚或鸡胚死亡;
上述方法,所述乳化成疫苗的方法为按照油相与水相的体积比1.5~3:1进行乳化,乳化后即得疫苗成品。
与现有技术相比,本发明具有如下显著的有益效果:
(1)鸭坦布苏病毒用本发明确定的鸭胚干细胞系EB66培养,病毒适应性好和病毒含量高;
(2)经鸡胚有限稀释法筛选出的毒种免疫原性好;
(3)用反应器培养鸭坦布苏病毒,显著降低了病毒的扩散风险,具有更好的安全性;
(4)不采用鸭胚培养病毒工艺,不需要专门饲养种鸭和避免了挑选易感鸭胚的繁琐;
(5)培养的病毒液中仅含有病毒和细胞碎片,与鸭胚增殖病毒方法相比,不需要无害化处理鸭胚组织物,对环境影响小;
(6)利用鸭胚干细胞系EB66无血清全悬浮培养的病毒液,其病毒含量不低于鸭胚,显著高于(10~100倍)BHK-21细胞培养的病毒。由于不使用微载体,成本显著低于微载体灌流法Vero细胞培养工艺。
(7)无血清全悬浮工艺培养的病毒液成本不到鸭胚工艺的一半。
(8)由于不需要鸭胚孵化车间、逐枚接种、逐枚收获、组织到随机捣碎等优点,该方法占用空间小,制备流程简单。
用鸭胚干细胞系EB66细胞生产的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗,安全,副反应小,免疫效力更高,疫苗批间质量差异小。该生产工艺简单稳定、易操作、产量大、培养的半成品病毒含量高、成本低和外源病原污染几率小等特点,具备工业化大生产的可行性和可放大性,具有很好的经济效益和应用前景。
具体实施方案
实施例1
一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,所述细胞系为鸭胚干细胞系EB66。
上述方法,包括如下步骤:
1)选育毒株:将鸭坦布苏病毒(鸭坦布苏病毒-HB株,北京市农林科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存,基因登录号为JF523187)鸭胚适应株在EB66细胞系(该细胞株于2015年由甘肃健顺生物购自法国Valneva公司,并拥有中国独家代理权)中连续传代至病毒适应细胞,经鸡胚有限稀释克隆法(即将病毒液进行10倍系列稀释,取最高稀释度毒液接种鸡胚后收获的病毒),取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养,培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株(基础种毒株);
2)建立毒种种子批:将步骤1)所得候选株病毒接种EB66细胞,用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代(疫苗研究过程中,对生产毒种的传代进行限定,由于传代次数增加,毒种的免疫原性会降低。本发明选择F6和F7作为生产毒种,F8代是疫苗代次。根据疫苗研究要求,一般往后在传3代,即F11代,如果F11代的免疫原性良好,表明F8代疫苗的保护效果会理想。处理细胞培养液,各代次毒种的病毒含量应≥106.5 ELD50/1ml。以1~10ml/冻存管的剂量分装,-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的F2~F7代作为毒种种子批,其中F2~F5代病毒为基础毒种,F6~F7代为生成种毒(工作种子);确定病毒感染复数(MOI):测定F6和F7代生成种毒的病毒含量(ELD50,鸡胚半数感染量),通过1个ELD50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量,按照≥107.1 ELD50/1ml的标准,确定了F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001;
3)制备细胞毒液:在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞,培养条件为温度30~37℃,pH7.2~7.5;当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的EB66细胞数量达到400~1000万时,接种步骤2)F6或F7代毒种,作用2h后,加入2倍细胞体积维持液,30~37℃继续培养,30~120h后,当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液,该细胞毒液病毒含量应≥107.1 ELD50/1ml;
4)灭活病毒:取步骤3)所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理,加入细胞毒液总量(V/V)0.1~0.2%的灭活剂(质量浓度37%的甲醛溶液),2~37℃振荡灭活16~144h;成品检验:取所得灭活病毒,以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚,观察144小时,无特异性鸭胚或鸡胚死亡,判定毒液灭活完全;同时,取样,接种细菌检验用TG、GA和GP培养基,观察10日,无细菌生长,判定灭活毒液无细菌污染;
5)乳化:向步骤4)所得细胞毒液加入(V/V)4%~8%吐温80,搅拌均匀为水相,按照油相(油佐剂Marcol52 +司盘制备而成)与水相的体积比1.5~3:1进行乳化,乳化后即得成品。
实施例2
使用实施例1所用的方法制备得到的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)(外观 乳白色均匀乳剂;剂型 油包水型。取一清洁吸管,吸收少量疫苗,滴于清洁冷水表面,除第一滴外,均应不扩散;黏度 按现行《中国兽药典》附录进行检验,应符合规定;稳定性 吸取疫苗10mL加入离心管中,以3000r/min离心15分钟,应不分层,管底析出的水相应不超过0.5mL;无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长;安全检验 取28日龄DHOV抗体阴性健康北京鸭(或樱桃谷鸭)5只,每只颈部皮下注射 1mL。隔离饲养,观察14日,应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应;效力检验 取20只42~120日龄DHOV抗体阴性健康北京鸭(或樱桃谷鸭),10只为免疫组,每只胸部肌肉接种0.5mL疫苗,另10只作为非免疫对照。首次免疫14日后,按照同样的剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫。二次免疫后28日,免疫组和对照组,采血,测定HI抗体效价,且每只鸭各肌肉注射DHOV-HB株病毒液0.5mL(100个DID50)。攻毒后2日,采集血液,分离血清,进行病毒分离。对照组HI抗体效价应均小于1:10,免疫组应至少7只HI抗体效价不低于1:20。对照组应至少9只鸭病毒分离阳性,免疫组应至少7只鸭病毒分离阴性。
甲醛残留量测定 按现行《中国兽药典》附录进行测定,应符合规定。。
我们在利用鸭胚研制成鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的基础上,将疫苗生产用毒种HB株接种EB66细胞培养,连续培养11代病毒的含量表明,利用EB66细胞可以培养出高滴度的病毒(均不低于106.1ELD50/0.1ml)。8个代次病毒制备疫苗免疫鸭的结果表明,经EB66培养的病毒,其抗原性和免疫原性无明显的改变。利用EB66细胞悬浮培养工艺克服了利用鸭胚生产存在的工艺复杂问题,达到了工艺简单稳定、易放大、节省人力和疫苗批次差异小的目的。利用反应器无血清全悬浮EB66细胞工艺培养的鸭坦布苏病毒,制备成的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗质量高、价格低,是一种“物美价廉”的防疫用品。
Claims (7)
1.一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,其特征在于,病毒接种所用细胞系为EB66细胞系,病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。
2.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
1)选育毒株:将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞,经有限稀释克隆法,取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养并从中筛选出候选病毒株;
2)建立毒种种子批:将步骤1)所得候选株病毒接种EB66细胞系,用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代,处理细胞培养液,各代次毒种的病毒含量应≥106.5 ELD50/1ml;以 F2~F7代作为毒种种子批,其中F2~F5代病毒为基础毒种保存,F6~F7代为生成毒种进行下一步工作;
3)制备细胞毒液:在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞,培养条件为温度30~37℃,pH7.2~7.5;当反应器中EB66细胞数量达到400~1000万时,接种步骤2)所得的F6或F7代毒种;作用2h后,加入细胞维持液,30~37℃继续培养;30~120h后,当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液,该细胞毒液病毒含量≥107.1 ELD50/1ml;
4)灭活病毒:取步骤3)所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理,加入细胞毒液体积总量0.1~0.2%的灭活剂,2~37℃振荡灭活16~144h得到灭活病毒;
5)乳化:向步骤4)所得细胞毒液加入体积总量4%~8%吐温80,搅拌均匀为水相,按照油相与水相的体积比1.5~3:1进行乳化,乳化后即得疫苗成品。
3.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,其特征在于,所述F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001。
4.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤4)中所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液。
5.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤2)获得F6~F7代为生成毒种后,确定其病毒感染复数:测定F6和F7代生成毒种的病毒含量,通过1个ELD50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量,按照≥107.1 ELD50/1ml的标准,确定F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001。
6.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法,其特征在于,步骤4)获得灭活病毒后,进行半成品检验:取灭活病毒,以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚,观察144小时,无特异性鸭胚或鸡胚死亡,判定毒液灭活完全;同时,取样,接种细菌检验用TG、GA和GP培养基,观察10日,无细菌生长,判定灭活毒液无细菌污染。
7.一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制品,其特征在于,采用如权利要求1~6任一权利要求所述的方法制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。
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