CN109091669A - 猪瘟-圆环混合抗原的制备方法及其产品、猪瘟-圆环二联亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

猪瘟-圆环混合抗原的制备方法及其产品、猪瘟-圆环二联亚单位疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪瘟‑圆环混合抗原的制备方法及其产品、猪瘟‑圆环二联亚单位疫苗及其制备方法，涉及生物制品技术领域。该方法将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，得到混合抗原。该猪瘟‑圆环混合抗原的制备方法缓解了传统工艺中两种病毒分批培养、收获后复配的繁琐工序，用该混合抗原制备的疫苗免疫后抗体效价高。

Description

猪瘟-圆环混合抗原的制备方法及其产品、猪瘟-圆环二联亚 单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体而言，涉及一种猪瘟-圆环混合抗原的制备方法及其产品、猪瘟-圆环二联亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
猪瘟是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性，一年四季均可发生；猪圆环病毒病，由猪圆环病毒引起，具有多种临床症状，如厌食、呼吸困难或行动迟缓等多种症状的疾病，死亡率较高；上述两种疾病均为我国畜养殖业的重点防控疾病。
市场上对于上述两种疾病的防控大部分采用只针对其中一种疾病的单苗，免疫接种过程浪费人力物力；近年来，市场上也有应用猪瘟-圆环二联苗进行疾病防控的，多数为全病毒疫苗，两种病毒分别培养，然后收毒液进行混合，抗原制备过程中浪费了较高的成本，而且两种病毒液进行混合往往容易造成抗原浓度不够高或者需要增加病毒浓缩工艺，制备工艺较为繁琐，两种病毒培养液混合后，相对地，细胞内部释放的杂蛋白也较多，杂蛋白往往也具有免疫原性，后续用这种抗原制备疫苗后，会与我们的目标抗原竞争免疫球蛋白，影响免疫效果，其制备工艺也造成了人力物力和时间的浪费。
因此，开发一种工艺简单的制备混合抗原的方法，而且混合抗原制成疫苗后，免疫效果好，抗体水平高是疫苗研发的关键，具有重要的应用价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，该方法将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，得到混合抗原。该猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，工艺简单，得到的混合抗原制成的疫苗免疫效果好，抗体效价高。
本发明目的之二在于提供上述猪瘟-圆环混合抗原制备方法制备得到的猪瘟-圆环混合抗原，用该混合抗原制备的疫苗，免疫效果好。
本发明的目的之三在于提供包含上述猪瘟-圆环混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗，该疫苗免疫后抗体效价高。
本发明的目的之四在于提供包含上述猪瘟-圆环混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗的制备方法，该方法工艺简单，用时短，制备的疫苗免疫后抗体效价高。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，包括如下步骤：
将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，得到混合抗原。
优选地，在本发明方案基础上，重组病毒为重组杆状病毒；
猪瘟E2蛋白重组杆状病毒中编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒中编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；
细胞包括Sf-9、Sf-21或High5，优选为High5。
优选地，在本发明方案基础上，细胞培养物在接种猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液后的培养条件为：溶氧量为28-32％，温度为26-28℃，pH为5.9-6.4；
优选地，培养在生物反应器中进行；
优选地，按MOI值为0.09-0.11的毒量接种猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒。
优选地，在本发明方案基础上，猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液的制备方法包括如下步骤：
将猪瘟E2重组杆状病毒和猪圆环病毒2型重组杆状病毒同时接毒于昆虫细胞培养物中培养，得到猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液；
优选地，昆虫细胞培养物的细胞密度为50-200万/ml，优选为50-150/ml，进一步优选为90-110万/ml；
优选地，用于接毒的昆虫细胞培养物的细胞活率为95-100％；
优选地，待昆虫细胞活率≤85％时收获上清得到病毒混合液，优选为细胞活率≤80％时收获上清得到病毒混合液；
优选地，昆虫细胞培养物在生物反应器中培养，培养条件为：溶氧量为35-45％，温度为26-28℃，pH为5.9-6.4；
优选地，昆虫细胞包括Sf-9、Sf-21或High5，优选为Sf-9。
优选地，在本发明方案基础上，细胞培养物的制备包括如下步骤：
细胞经静止培养复苏后，以传代后初始密度≥2.5×105/ml的接种量逐步放大至转瓶，然后放大至生物反应器；
优选地，细胞生长密度≤5×106/mL时进行传代；
优选地，放大至生物反应器后总体积为3-10L。
优选地，在本发明方案基础上，包括如下步骤：待猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白浓度均为30-100ug/ml时收获混合抗原，优选均为40-100ug/ml，进一步优选均为50-100ug/ml。
第二方面，提供了上述猪瘟-圆环混合抗原的制备方法制备得到的猪瘟-圆环混合抗原。
第三方面，提供了包含上述猪瘟-圆环混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗。
第四方面，提供了上述猪瘟-圆环二联亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
将混合抗原灭活并与佐剂混合，乳化后，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；
优选地，混合抗原灭活后还包括加入阻断剂进行阻断的步骤，然后再与佐剂混合，乳化后，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；
优选地，混合抗原在灭活之前进行纯化；
优选地，佐剂包括Montanidetm ISA 206VG、Montanidetm ISA 15VG、MontanidetmISA 563VG或Montanidetm ISA 201VG中的一种或几种，优选为Montanidetm ISA 563VG；
优选地，灭活剂为二乙烯亚胺，二乙烯亚胺的浓度为1-2mmol/L；
优选地，阻断剂为硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的浓度为10-20mmol/L。
优选地，在本发明方案基础上，混合抗原与佐剂的混合比例为体积比为(1-3)：(1-3)。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，该方法将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，重组病毒在侵染细胞后病毒核酸释放到昆虫细胞内，能够高效利用细胞内的营养物质合成猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白，在总营养物质量相对固定的情况下，由于目的蛋白的大量合成，相对的病毒的复制量要少一些；培养获得的混合抗原中猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白均具有较好的免疫原性，是猪瘟病毒和猪圆环病毒的主要抗原表位，适合用于亚单位疫苗的制备和免疫接种。此外，本发明省去了两种病毒单独培养、分别收获的繁琐工序，以及收获以后两种抗原的复配工序，也避免了使用多个反应器造成的洗涤、灭菌和培养液的浪费，节省人力物力；另外两种重组病毒分别培养后制备二联苗，往往需要在两种抗原液复配以后对抗原液进行浓缩，而浓缩工艺会造成较高的成本。综上所述，本发明方法成本低，工艺简单，用时短；制备的混合抗原免疫后抗体效价高。
(2)本发明提供了猪瘟-圆环混合抗原制备方法制备的得到的混合抗原，包含上述混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗及其制备方法，包含上述混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗免疫后抗体效价高，其制备方法成本低，工艺简单，用时短。
附图说明
图1为本发明实施例1中猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液在High5细胞中培养96h取样检测结果SDS-PAGE图；
图2为本发明实施例1中猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液在High5细胞中培养96h取样用猪瘟病毒阳性血清进行作为一抗进行Western blot检测结果图；
图3为本发明实施例1中猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液在High5细胞中培养96h取样用猪圆环病毒阳性血清作为一抗进行Western blot检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
根据本发明的第一个方面，提供了一种猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，包括如下步骤：
将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，得到混合抗原。
猪瘟是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性，一年四季均可发生。猪瘟是目前畜类疾病中重点防控的疾病之一，该病的爆发容易造成养殖业的重大损失。
猪圆环病毒病，由猪圆环病毒引起，具有多种临床症状，如厌食、呼吸困难或行动迟缓等多种症状的疾病，死亡率较高，也是目前畜类疾病中重点防控的疾病之一。
猪瘟E2蛋白，研究证实猪瘟病毒的E2糖蛋白是主要诱导感染猪只产生中和抗体的结构蛋白。因此本研究应用优化修饰了猪瘟病毒的E2基因的猪瘟E2蛋白重组杆状病毒。
猪圆环病毒2型Cap蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体，是猪圆环病毒的主要抗原表位。
将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，重组病毒在侵染细胞后病毒核酸释放到昆虫细胞内，能够高效利用细胞内的营养物质合成猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白，在总营养物质量相对固定的情况下，由于目的蛋白的大量合成，相对的病毒的复制量要少一些；培养获得的混合抗原中猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白均具有较好的免疫原性，是猪瘟病毒和猪圆环病毒的主要抗原表位，适合用于亚单位疫苗的制备和免疫接种。此外，本发明省去了两种病毒单独培养、分别收获的繁琐工序，以及收获以后两种抗原的复配工序，也避免了使用多个反应器造成的洗涤、灭菌和培养液的浪费，节省人力物力；另外两种重组病毒分别培养后制备二联苗，往往需要在两种抗原液复配以后对抗原液进行浓缩，而浓缩工艺会造成较高的成本。综上所述，本发明方法成本低，工艺简单，用时短；制备的混合抗原免疫后抗体效价高。
在一种优选的实施方式中，重组病毒为重组杆状病毒；猪瘟E2蛋白重组杆状病毒中编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒中编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；细胞包括Sf-9、Sf-21或High5，优选为High5。
杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状核酸病毒，经过遗传重组，可以形成重组杆状病毒。应用基因工程技术进行遗传修饰的杆状病毒，即为重组杆状病毒。常用于杆状病毒表达载体系统产生工程蛋白制剂或病毒杀虫剂。
猪瘟E2蛋白重组杆状病毒中编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒中编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。上述序列对密码子进行了优化，在病毒侵染细胞以后，能够更高效地表达目的蛋白，此外猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白均具有较高的免疫原性；此外，通过重组杆状病毒的昆虫细胞培养进行目的蛋白的表达，操作较简便，成本低，表达量较高。
在一种优选的实施方式中，细胞培养物在接种猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液后的培养条件为：溶氧量为28-32％，温度为26-28℃，pH为5.9-6.4。
典型但非限制性的溶氧量例如为：28％、29％、30％、31％或32％等。
典型但非限制性的温度例如为：26℃、27℃或28℃等。
典型但非限制性的pH例如为：5.9、6、6.1、6.2、6.3或6.4等。
溶解氧是细胞存活的关键因素，保证接种时昆虫细胞的健康状态，能够更好地提供营养物质，对重组病毒的存活以及重组病毒合成更多的目标蛋白都至关重要，因此优化培养过程中体系内部的溶解氧，能够避免由缺氧造成的细胞存活率降低。细胞对温度较为敏感，因此培养过程中对培养对体系内的温度要求较严格，温度过低不利于细胞存活，不能更好地为病毒复制和病毒核酸的转录提供物质基础。此外pH过高或过低，也不利于细胞的存活，进而影响重组病毒核酸的转录翻译，影响目标蛋白的表达以及病毒的增殖。
优选地，培养在生物反应器中进行。
生物反应器更方便对体系内的溶解氧、温度或pH等参数进行控制，并且参数控制更为准确，有利于细胞的存活，为病毒核酸的转录翻译以及病毒的复制提供更好的物质基础。
培养过程中，典型但非限制性的生物反应器中的转速设置例如为：生物反应器中培养物的体积为2L-4L时，转速为35-50rpm/min，和/或，生物反应器中培养物的体积为4L-6L时，转速为50-70rpm/min，和/或，生物反应器中培养物的体积为6L-8L时，转速为70-90rpm/min，和/或，生物反应器中培养物的体积为8L-10L时，转速为90-105rpm/min。
培养物的体积与转速具有一定相关性，当培养物的体积较小时，转速不宜过大，转速过大容易导致细胞死亡，进而不利于重组病毒的复制，也不利于获得更多的目标抗原。
优选地，按MOI值为0.09-0.11的毒量接种猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒。
优化合适的病毒接种量，能够更高效地产出目标蛋白，也能够使得到的混合抗原中猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白与增值的重组病毒之间的比例更为合理，得到的混合抗原制备的疫苗，能够产生更高效价的中和抗体，提高免疫效果。
典型但非限制性的MOI值例如为：0.09、0.1或0.11等。
在一种优选的实施方式中，猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液的制备方法包括如下步骤：
将猪瘟E2重组杆状病毒和猪圆环病毒2型重组杆状病毒同时接毒于昆虫细胞培养物中培养，得到猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液。
将猪瘟E2重组杆状病毒和猪圆环病毒2型重组杆状病毒同时接毒于昆虫细胞培养物中培养，得到猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液。
由于猪瘟E2重组杆状病毒和猪圆环病毒2型重组杆状病毒均能够适应昆虫细胞培养，因此将上述两种病毒共同接种于昆虫细胞培养物中，可以节省培养装置，减少培养工作量，省时省力，降低成本。
优选地，昆虫细胞培养物的细胞密度为50-200万/ml，优选为50-150/ml，进一步优选为90-110万/ml。
典型但非限制性的昆虫细胞培养物的细胞密度例如为：50万/ml、60万/ml、70万/ml、80万/ml、90万/ml、100万/ml、110万/ml、120万/ml、130万/ml、140万/ml、150万/ml、160万/ml、170万/ml、180万/ml、190万/ml或200万/ml等。
对于昆虫细胞培养物的细胞密度进行优化，是为了细胞后续培养过程中具有充足的营养，保持更好的细胞活力，进而为后续重组病毒内的重组核酸的转录和翻译提供更好的物质基础，获得更大量的目标抗原。
优选地，用于接毒的昆虫细胞培养物的细胞活率为95-100％。
典型但非限制性的用于接毒的昆虫细胞培养物的存活率例如为：95％、96％、97％、98％、99％或100％等。
优选昆虫细胞培养物的存活率也是为了保证接种的重组病毒在增殖过程中，核酸的转录和翻译能有更好的物质基础，进而获得更大量的目标抗原。
优选地，待昆虫细胞活率≤85％时收获上清得到病毒混合液，优选为细胞活率≤80％时收获上清得到病毒混合液。
典型但非限制性的收获病毒混合液时的细胞存活率例如为：85％、80％或75％等。
随着病毒的增殖，细胞的存活率会下降，优选特定的细胞存活率时，收获病毒混合液，有利于获得更多的病毒，并提高培养效率，继续培养病毒滴度上升较为困难，反而会由于温度较高，保持时间过长，而降低病毒的存活率。
优选地，昆虫细胞培养物在生物反应器中培养，培养条件为：溶氧量为35-45％，温度为26-28℃，pH为5.9-6.4。
优化培养条件有利于细胞的增殖，为重组病毒的增殖和重组病毒核酸的转录复制提供更好的物质基础，进而获得更多的目标抗原。
典型但非限制性的昆虫细胞培养物培养溶氧量例如为：35％、40％或45％等。
优选地，昆虫细胞包括Sf-9、Sf-21或High5，优选为Sf-9。
Sf-9、Sf-21或High5均属于昆虫细胞，其中Sf-9细胞培养工艺成熟，重组杆状病毒增殖快。
在一种优选的实施方式中，细胞培养物的制备包括如下步骤：
细胞经静止培养复苏后，以传代后初始密度≥2.5×105/ml的接种量逐步放大至转瓶，然后放大至生物反应器。
细胞培养中需要逐步进行放大，这样能够保证相对准确的接种比例，进而保证细胞接种后一定时间内存活率和密度均达到较高的水平。有利于后续病毒的增殖，以及重组病毒核酸的转录和翻译过程的顺利进行，进而合成更多的目标抗原。
优选地，细胞生长密度≤5×106/mL时进行传代；
优选地，放大至生物反应器后总体积为3-10L。
优化细胞生长密度，有利于培养过程中，细胞能够保持较高的活力。
典型但非限制性的放大至生物反应器后的总体积例如为：3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L或10L等。
在一种优选的实施方式中，包括如下步骤：待猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白浓度均为30-100ug/ml时收获混合抗原，优选均为40-100ug/ml，进一步优选均为50-100ug/ml。
收获混合抗原时，典型但非限制性的猪瘟E2蛋白液和猪圆环病毒2型Cap蛋白浓度例如为：30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml、60ug/ml、70ug/ml、80ug/ml、90ug/ml或100ug/ml等。
优选上述两种蛋白浓度达到一定值的时候进行抗原收获，抗原浓度过低时，对抗原进行收获会导致后续免疫效果差，抗体水平低；或者，抗原浓度不够，要进行抗原浓缩的繁琐工序，才能保证免疫效果；因此，在特定浓度范围时候进行抗原收获。另外，抗原达到上述浓度范围以后，继续培养抗原浓度不会有显著增加，因此，在上述浓度范围内收获抗原，更省时省力。对抗原浓度的检测，可以采用培养过程中，间隔一定的时间取样检测，测定目标蛋白的浓度，待抗原达到目标浓度时候，对抗原液进行收获。
第二方面，提供了上述猪瘟-圆环混合抗原的制备方法制备得到的猪瘟-圆环混合抗原。
第三方面，提供了包含上述猪瘟-圆环混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗。
本发明提供了上述猪瘟-圆环二联亚单位疫苗的制备方法制备得到的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗，该疫苗具有免疫效果好，免疫后抗体水平高，以及由于培养工序较为简单而具有的成本低廉的优势。
第四方面，提供了上述猪瘟-圆环二联亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
将混合抗原灭活并与佐剂混合，乳化后，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；
佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质；有时能非特异性地改变或增强抗原物质的特异性免疫应答和发挥辅助作用的佐剂，也被称为免疫增强剂。佐剂按作用分类，分为储存佐剂和非储存佐剂，典型但非限制性的佐剂例如为：氢氧化铝明胶、明矾、磷酸铝、EDTA、脂质体或脂多糖等。也有很多商品化的佐剂，典型但非限制性的例如为：赛比克的佐剂产品Montanidetm ISA 206VG、Montanidetm ISA 15VG、MontanidetmISA 563VG或MontanidetmISA 201VG中的一种或几种，优选为Montanidetm ISA 563VG等。
灭活，抗原灭活的是否彻底关系到疫苗在临床应用的生物安全等方面，因此，进行灭活疫苗的灭活效果的检测是兽用生物制品生产过程中的重要环节。灭活过程中，定时进行间隔取样，检测灭活效果。
乳化，乳化可降低分散物的表面张力，在微粒表面形成薄膜或双片层，以阻止微粒之间相互凝结，乳化以后，形成的微粒典型但非限制性的例如为：水包油、油包水或水包油包水等。
优选地，混合抗原在灭活之前进行纯化；
在抗原灭活之前进行纯化目的是去除残留的细胞培养物碎片，或对其中混有的重组病毒进行去除。
优选地，混合抗原灭活后还包括加入阻断剂进行阻断的步骤，然后再与佐剂混合，乳化后，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；
例如将混合抗原与灭活剂混合，在温度为36-38℃条件下，保温40-50h，优选为44-48h，然后加入阻断剂进行阻断。
优选地，佐剂包括Montanidetm ISA 206VG、Montanidetm ISA 15VG、MontanidetmISA 563VG或Montanidetm ISA 201VG中的一种或几种，优选为Montanidetm ISA 563VG；
本发明不限制佐剂的种类，上述佐剂均适用于本发明，其中Montanidetm ISA563VG乳化效果和免疫后抗体水平较高，是优选的实施方式。本发明不限制乳化工艺，典型但非限制性的乳化方式例如为：4000转/min把佐剂剪切成无气泡，然后缓缓加入抗原液体，完毕后调整剪切机转速至10000转/min，持续10min即可得到稳定均一的疫苗。
优选地，灭活剂为二乙烯亚胺，二乙烯亚胺的浓度为1-2mmol/L；
优选地，阻断剂为硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的浓度为10-20mmol/L。
由于传统工艺中，应用最为广泛的甲醛灭活剂存在致癌危险和破坏抗原免疫原性等缺陷。本发明优选了二乙烯亚胺作为灭活剂，该灭活剂安全性较好，而且对抗原的破坏性较小，因此，本发明优选以二乙烯亚胺作为灭活剂。典型但非限制性的二乙烯亚胺的浓度例如为：1mmol/L或2mmol/L。典型但非限制性的硫代硫酸钠的浓度的浓度例如为：10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L、18mmol/L或20mmol/L。
在一种优选的实施方式中，混合抗原与佐剂的混合比例为体积比为(1-3)：(1-3)。
典型但非限制性的混合抗原与佐剂的混合比例例如为：1:1、1:2、1:3或2:3等。
优化抗原与佐剂的混合比例，有利于提高免疫效果，增加抗体水平，另外，能够对抗原起到缓释作用，持续刺激机体产生抗体，最终获得更高的抗体水平。
上述工艺过程中，未给出详细操作流程的均可按照《兽用生物制品规程》的有关规定进行操作。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的联合培养：向14L罐体中加入摇瓶培养的2.5L密度为100万/ml左右、细胞活率大于95％以上的Sf-9细胞，补液调节反应罐中细胞密度至100万/ml左右。设置生物反应器内的溶解氧(Do)：40％，温度为27℃，pH为6，控制反应器内细胞培养物体积为10L，转速为100rpm。当14L罐体细胞密度为100万/ml左右，按MOI＝0.1的毒量接入猪瘟E2杆状病毒和PCV2重组杆状病毒。每天记录反应器运行参数，第3-4天时取样计数。以后每天取样，用细胞计数仪计算细胞活率，在存活率约75％时收毒，得到猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液，对混合病毒液的两种病毒的毒价进行测定：猪瘟E2蛋白重组杆状病毒毒价为1×107.5TCID50/ml，猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒毒价为1×108TCID50/ml。
将猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液按MOI＝0.1接种于High5细胞培养物中培养，High5细胞培养物总体积是10L，转速控制在100rpm/min，控制体系内的溶氧为30％，温度为28℃，pH为6.4，培养期间定时取样检测体系内的E2蛋白浓度和2型Cap蛋白浓度，取样以后做SDS-PAGE检测，检测结果见附图1。
然后进行Western blot检测，猪瘟阳性血清采用猪瘟兔化弱毒株(简称C株)免疫健康猪获得的阳性血清；猪圆环病毒2型阳性血清为本实验室自行分离的猪圆环病毒CJ株免疫健康猪获得的阳性血清，Western blot检测结果见附图2和3，两种蛋白浓度均达到50ug/ml以上时，收获共计10L混合抗原。
实施例2
与实施例1的区别仅在于，猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液，不是联合培养得到，而是分别培养后，收毒，然后均以MOI＝0.1接种于High5细胞培养物中培养。
实施例3
与实施例1的区别仅在于，将猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液按MOI＝0.11接种于High5细胞培养物中培养。
实施例4
与实施例1的区别仅在于，两种蛋白浓度均达到60ug/ml时，收获共计10L混合抗原。
实施例5
High5细胞培养物总体积是6L，转速控制在70rpm/min，控制体系内的溶氧为29％，温度为28℃，pH为6。
实施例6-10
将实施例1-5获得的混合抗原，以灭活剂终浓度为1mmol/L加入二乙烯亚胺在37℃条件下灭活44h，期间每隔2小时混匀灭活样品并取样一次，将待检灭活样品加入6孔板内，每个样品做2个重复，设阳性与阴性对照，置26-28℃恒温培养箱中培养5日，用倒置荧光显微镜进行检验。阳性对照和未灭活彻底的样品应可观察到荧光信号，阴性对照与灭活彻底的样品应无荧光信号，44h检验时已灭活完全，以阻断剂的终浓度为10mmol/L，加入阻断剂硫代硫酸钠进行阻断，以4000转/min将赛比克Montanidetm ISA563VG佐剂剪切成无气泡，将阻断后得到的液体以体积比为1:1缓缓加入前述赛比克Montanidetm ISA 563VG佐剂中，然后调整剪切机转速至10000转/min，持续10min，观察样品均一稳定，得到5组猪瘟-圆环二联亚单位疫苗。
试验例
用21～35日龄健康易感仔猪30头，分6组，每组5头，第一组、第二组、第三组、第四组和第五组分别应用实施例1-5得到的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗进行耳后颈部肌肉注射4ml；对照组不进行任何免疫操作。注射后连续观察14日，所有猪只无由接种疫苗引起的相关不良反应，且全部健活。
用21～35日龄的健康易感仔猪30头，分6组，每组5头，第一组、第二组、第三组、第四组和第五组注射实施例1-5得到的猪瘟-圆环二联亚单位灭活疫苗2ml，另设5头不免疫作为对照组，在同等条件下隔离饲养，一免后间隔14日按相同途径和剂量进行第二次免疫。二免后14日，采集所有仔猪血液分离血清，用IFA方法检测猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白抗体效价。抗体效价检测结果见表1。
表1实施例6-10得到的混合抗原制备的疫苗免疫后抗体效价检测结果
由实施例6-10的抗体效价检测结果可见，将猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，将培养得到的混合抗原灭活，然后与佐剂混合，然后乳化，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；免疫后，抗体效价较高，能够很好地刺激机体产生抗体。
由实施例7可见，两种病毒在接种于细胞培养物之前可以是分别培养，也可以是在昆虫细胞培养物中联合培养，但是联合培养相对更省时省力。
由实施例8可见，改变猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的接种量，同样能够实现较高的抗体效价。
由实施例9可见，当培养物中蛋白浓度更高时候收获混合抗原，免疫后均能够实现更高的抗体效价。
由实施例10可见，改变接种重组病毒混合液接种细胞以后的培养条件参数，获得的混合抗原制成的疫苗，能够达到相似的抗体效价。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物股份有限公司
<120> 猪瘟-圆环混合抗原的制备方法及其产品、猪瘟-圆环二联亚单位疫苗及其制
备方法
<130> 20160808
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
accacggcat ttctcatctg cttggtaaaa gtattgagag gacagatcgt gcaaggtgtg 60
atatggctgc tattagtaac tggggcgcaa ggccggctag cctgcaagga agactacagg 120
tacgcaatat cgtcaaccga tgagataggg ctacttgggg ccggaggact caccaccacc 180
tggaaagaat acacccacga tctgcagctg aatgacggga ccgttaaggc cacttgcgtg 240
gcaggttcct ttaaaatcac agcacttaat gcggtcagta ggaggtattt ggcatcactg 300
cataagaagg ctttacccac ttccgtgaca ttcgaactcc tgttcgacgg gaccaaccca 360
tcaactgagg aaatgggaga tgacttcggg ttcgggctgt gcccgtttga tacgagaccc 420
gttgtcaagg gaaagtacaa tgcgaccttg gtgaacggta gtgctttcta tcttgtctgc 480
ccaatagggt ggacgggtgt tatagagtgc acagcagtga gcccaacaac cctgagaaca 540
gaagtggtaa agaccttcag gagagacaag ccctttccgc acagaatgaa ttgtgtgacc 600
accacagtgg aaaatgaaga cttattctac tgtaagttgg ggggcaactg gacatgtgtg 660
aaaggcgaac cagtggtcta cacagggggg ttagtgaaac aatgtagatg gtgtggcttc 720
gacttcaacg agcctgatgg gcttccgcac taccccatag gtaagtgcat tctggcaaac 780
gagaccagtt acagagtagt agattcaacg gactgtaaca gagatggcgt tgtaatcagc 840
acagagggga gtcatgagtg cttgattggt aacacgactg tcagggtgca tgcatcagat 900
gaaagattgg gccccatgcc atgcagacct aaagagattg tctctagtgc aggacctgca 960
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<210> 2
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgggatacc caagaagacg ataccgaaga agaagacacc gaccacgaag ccacctagga 60
caaatcctac gacgacgacc atggctacta cacccacgac accgataccg atggagaaga 120
aaaaacggaa tcttcaacac acgactatca cgaacattcg gatacacaat caaacgaaca 180
acagtaaaaa caccatcatg ggcagtagac atgatgagat tcaacataaa cgacttccta 240
ccaccaggag gaggatcaaa cccacgatca gtaccattcg aatactacag aataagaaaa 300
gtaaaagtag aattctggcc atgctcacca atcacacaag gagacagagg agtaggatca 360
agcgcagtaa tcctagacga caacttcgta acaaaagcaa cagcactaac atacgaccca 420
tacgtaaact actcatcacg acacacaata acacaaccat tctcatacca ctcacgatac 480
ttcacaccaa aaccagtact agactcaaca atcgactact tccaaccaaa caacaaaaga 540
aaccaactat ggctaagact acaaacagca ggaaacgtag accacgtagg actaggaaca 600
gcattcgaaa acagcatata cgaccaagaa tacaacatcc gagtaacaat gtacgtacaa 660
ttcagagaat tcaacctaaa agacccacca ctaaacccaa agtga 705

Claims (10)

1.一种猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将猪瘟E2蛋白重组病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组病毒的病毒混合液接种于细胞培养物中培养，得到混合抗原。
2.按照权利要求1所述的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，其特征在于，所述重组病毒为重组杆状病毒；
所述猪瘟E2蛋白重组杆状病毒中编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒中编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQID No.2所示；
所述细胞包括Sf-9、Sf-21或High5，优选为High5。
3.按照权利要求2所述的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，其特征在于，所述细胞培养物在接种猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液后的培养条件为：溶氧量为28-32％，温度为26-28℃，pH为5.9-6.4；
优选地，所述培养在生物反应器中进行；
优选地，按MOI值为0.09-0.11的毒量接种猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒。
4.按照权利要求2或3所述的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，其特征在于，所述猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液的制备方法包括如下步骤：
将猪瘟E2重组杆状病毒和猪圆环病毒2型重组杆状病毒同时接毒于昆虫细胞培养物中培养，得到猪瘟E2蛋白重组杆状病毒和猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒的病毒混合液；
优选地，所述昆虫细胞培养物的细胞密度为50-200万/ml，优选为50-150/ml，进一步优选为90-110万/ml；
优选地，用于接毒的昆虫细胞培养物的细胞活率为95-100％；
优选地，待昆虫细胞活率≤85％时收获上清得到病毒混合液，优选为细胞活率≤80％时收获上清得到病毒混合液；
优选地，所述昆虫细胞培养物在生物反应器中培养，培养条件为：溶氧量为35-45％，温度为26-28℃，pH为5.9-6.4；
优选地，所述昆虫细胞包括Sf-9、Sf-21或High5，优选为Sf-9。
5.按照权利要求2或3所述的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，其特征在于，所述细胞培养物的制备包括如下步骤：
细胞经静止培养复苏后，以传代后初始密度≥2.5×105/ml的接种量逐步放大至转瓶，然后放大至生物反应器；
优选地，细胞生长密度≤5×106/mL时进行传代；
优选地，放大至生物反应器后总体积为3-10L。
6.按照权利要求2或3所述的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：待猪瘟E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白浓度均为30-100ug/ml时收获混合抗原，优选均为40-100ug/ml，进一步优选均为50-100ug/ml。
7.按照权利要求1-6任一项所述的猪瘟-圆环混合抗原的制备方法制备得到的猪瘟-圆环混合抗原。
8.一种包含权利要求7所述的猪瘟-圆环混合抗原的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗。
9.按照权利要求8所述的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述混合抗原灭活并与佐剂混合，乳化后，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；
优选地，所述混合抗原灭活后还包括加入阻断剂进行阻断的步骤，然后再与佐剂混合，乳化后，得到猪瘟-圆环二联亚单位疫苗；
优选地，混合抗原在灭活之前进行纯化；
优选地，所述佐剂包括Montanidetm ISA 206 VG、Montanidetm ISA 15 VG、Montanidetm ISA 563 VG或Montanidetm ISA 201 VG中的一种或几种，优选为Montanidetm ISA 563 VG；
优选地，所述灭活剂为二乙烯亚胺，所述二乙烯亚胺的浓度为1-2mmol/L；
优选地，所述阻断剂为硫代硫酸钠，所述硫代硫酸钠的浓度为10-20mmol/L。
10.按照权利要求9所述的猪瘟-圆环二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合抗原与所述佐剂的混合比例为体积比为(1-3)：(1-3)。
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