CN102949718B - 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗及其制备方法，其中，三种病毒的含量≥107.5TCID50/mL，体积比为1∶1∶1。本发明的三联活疫苗解决了目前市场上缺少的有效的防治猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒三种疾病的多联疫苗的问题，尤其是对猪轮状病毒的防控。和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，该发明经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本，为国内养殖场提供了一种简单方便的新的免疫途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种多联动物活病毒疫苗，特别是指一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。
背景技术
猪传染性胃肠炎(TGEV)是猪的一种高度接触性肠道传染病，发病急，传播快，各种年龄的猪只都可以感染，以引起7～10日龄以内仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(通常100％)为特征，而周龄较大或成年猪只虽然几乎没有死亡，但是掉膘、降低饲料报酬，增加药物和人力等所造成的经济损失是非常严重的。该病是世界性的疾病之一。
猪流行性腹泻(PED)是一种急性、高度接触性的传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率为特征。PEDV主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口途径自然感染。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤以哺乳仔猪受害最为严重，母猪发病率为15％～90％。PEDV病毒主要寄生在小肠，也以细胞免疫为主。
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)，也是引起幼龄猪的急性消化道传染病，该病毒主要存在肠道内，随粪便排到外界环境。能感染各年龄段的猪，以2～5周龄的仔猪多发，仔猪死亡率达50％～100％，而中猪和大猪多为亚临床感染和隐性感染。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)在抗原形态，临床症状，流行病学极其相似，唯免疫学和血清学相互没有交叉反应。轮状病毒是一种人畜共患病，在猪群中感染率也很高，在临床症状上也很难与TGEV和PEDV感染猪群区别开来，并且都是以感染仔猪为主，临床上无特效治疗药物。唯有发展联苗是预防这三种病毒的关键。目前国内仅有传染性胃肠炎和流行性腹泻二联灭活疫 苗，但由于多联灭活疫苗中抗原的相互干扰等问题，在传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒与轮状病毒多联灭活疫苗方面一直也未能取得成功。
现有技术中，动物疫苗常常选用灭活疫苗，因为活疫苗中使用活病毒，如弱毒株或减毒株，但是由于在实际使用中弱毒株或减毒株会出现返强的问题，因此通常避免使用活疫苗作为免疫手段，特别是多联活疫苗或多联活疫苗，由于病毒成分复杂，返强的几率更大，因此在目前市场上一直未能出现关于猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。
发明内容
本发明的发明人经过大量细致地实验和认真的研究发现，目前国内已有传染性胃肠炎病毒(TGEV)和流行性腹泻病毒(PEDV)二联灭活疫苗用于预防传染性胃肠炎和流行性腹泻这两种病，灭活疫苗免疫猪体后猪体的血清抗体水平虽然很高，但肠道局部免疫水平较差，不能达到阻止TGEV感染的目的。其次，轮状病毒感染猪只可产生血液循环抗体及肠道分泌抗体，但血清中的抗体水平和对感染的抵抗力并不相关。而TGEV和PEDV感染猪体后均能产生分泌型IgA(sIgA)，sIgA能提供对上述三种病毒的强毒攻击的免疫保护。而且TGEV和PEDV均在肠道内吸附和增殖，sIgA还能提供对TGEV和PEDV对肠道的局部免疫力，阻断TGEV和PEDV的吸附和增殖途径；此外，发明人还发现sIgA还能中和部分猪轮状病毒。但是，灭活病毒即灭活的TGEV和PEDV不能感染机体，也不能诱导产生sIgA，因此，不能诱导产生sIgA，这也是灭活病毒作为疫苗时，不能有效地同时提供免疫三种病毒的保护性免疫反应的原因。
其次，本发明通过大量细致的试验，适当地选择了三种病毒的含量与配比，并通过较大数量的实验动物和本动物的免疫效果测定，保证多价疫苗中各个免疫成分之间不发生免疫干扰现象，也就是不降低各该免疫成分的免疫效能，使得三价疫苗的免疫效力比二价苗的免疫 效力没有明显降低，实现了本领域一直没有实现的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联疫苗的制备与应用。最后，本发明提供了适宜的佐剂与三种病毒混合配苗，适合而高效的超滤浓缩的处理方法，使得到三种病毒抗原的相互干扰现象降到了最低，进一步提高了多价疫苗的安全性和免疫效力。
即，意外地，发明人发现本发明的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗比自制的轮状病毒弱毒疫苗和市售的传染性胃肠炎与流行性腹泻二联活疫苗免疫效力都更好，而通常情况下，多价疫苗的免疫效果比单苗或二联苗的免疫效果会降低很多，因此，本发明的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗可以替代现有技术中的轮状病毒弱毒疫苗和市售的传染性胃肠炎与流行性腹泻二联活疫苗，避免多次注射不必要的麻烦，节约了成本和使用免疫环节，提高了生产效率。
基于上述发现和认识，本发明的主要目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，抗原成分为活的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，其中，猪传染性胃肠炎病毒的含量≥107.5TCID50/mL、猪流行性腹泻病毒的含量≥107.5TCID50/mL和猪轮状病毒的含量≥107.5TCID50/mL。
优选地，本发明的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的体积比为1∶1∶1。
优选地，本发明的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒为弱毒株或减毒株。
优选地，本发明的猪传染性胃肠炎病毒为保藏号CCTCC-V200609的华毒弱毒株，猪流行性腹泻病毒为保藏号为CCTCC-V200608的弱毒株，猪轮状病毒株为保藏号CVCC AV56的弱毒株。
本发明的另一目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，包括以下步骤：
1)将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量分别接 种猪传染性胃肠炎病毒，并加入猪传染性胃肠炎病毒维持液，在37℃下继续培养；
2)将长满致密单层的哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量分别接种猪流行性腹泻病毒，并加入猪流行性腹泻病毒维持液，在37℃下继续培养；
3)将长满致密单层的哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量分别接种猪轮状病毒，并加入猪轮状病毒维持液，在37℃下继续培养；
4)当细胞病变在90％以上时，分别收获病毒，并反复冻融2次后，保存于-40℃以下，备用；
5)对收获的病毒液进行病毒含量和纯净性检验，病毒含量在7.5log10/ml以上，纯净性检验合格的病毒用于配苗；。
6)将上述检验合格的三批病毒液经过2000～5000r/min低速离心，2次微孔滤膜过滤纯化；
7)将检验合格的病毒液按1∶1∶1体积比例混合，即得猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞，选自乳猪肾原代细胞，猪睾丸细胞，猪肾细胞或猪肾细胞；所述的猪流行性腹泻病毒的宿主细胞，选自Vero细胞、Vero E6细胞、PK15细胞或猪肾原代细胞；所述的猪轮状病毒的宿主细胞，选自猴肾细胞或罗猴肾细胞。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞为猪睾丸细胞，猪流行性腹泻病毒的宿主细胞为Vero E6细胞，猪轮状病毒的宿主细胞为猴肾细胞。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒维持液为MEM培养基，其中MEM培养基含有非必须氨基酸。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒维持液中还含有2.2g/L的NaHCO3，10mg/L的胰酶，1％DMSO(v/v)，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，PH7.3～7.4， 其中所述维持液是经过无菌过滤处理的。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪流行性腹泻病毒维持液为DMEM培养基，其中DMEM培养基为高糖培养基，葡萄糖含量为4500mg/L。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪流行性腹泻病毒维持液中还含有3.7g/L的NaHCO3，10mg/L的胰酶，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，PH7.3～7.4，其中所述维持液是经过无菌过滤处理的。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪轮状病毒维持液为DMEM培养基，其中DMEM培养基为低糖，葡萄糖含量为1000mg/L，并且不含非必须氨基酸。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述的猪轮状病毒维持液中还含有3.7g/L的NaHCO3，1.5mg/L的胰酶，15mg/l的核糖核苷和脱氧核糖核苷，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，PH7.3～7.4，其中所述维持液是经过无菌过滤处理的。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述离心方法为3000r/min。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，所述微孔滤膜过滤纯化为使用二套滤膜过滤，其中，使用孔径分别为1.2μm的滤芯和0.45μm的滤芯。
优选地，上述三联活疫苗制备方法中，所述三联活疫苗还可以加入冻干保护剂进行冻干，获得冻干的三联活疫苗。
优选地，本发明的三联活疫苗制备方法中，冻干保护剂为由每100毫升体积中含有蔗糖2g，多聚蛋白胨3g，D-山梨醇1g，聚乙烯吡咯烷酮2g，其余组分为注射用水，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤除菌。
技术效果
本发明通过提供猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，解决了目前市场上缺少的有效的防治猪传染性 胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒三种疾病的多联疫苗的问题，尤其是对猪轮状病毒的防控。和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，该发明经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗的出现，改变人们以往对上述病毒惯常使用灭活疫苗的免疫方法，为有效防治对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三种病毒引起猪体病症相似，难以区别病发原因的国内养殖场提供了一种简单方便的新的免疫途径。
附图说明
图1为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗的制备流程图。
具体实施方式
本发明的病毒株为猪流行性腹泻病毒(Porcine diarrhea virus，PEDV)弱毒疫苗株，其保藏号是：CCTCC-V200608，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。此毒株在中国专利CN101117627中公开；猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株，其微生物保藏号是：CCTCC-V200609，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，此毒株在中国专利CN101235363中公开；猪轮状病毒疫苗弱毒株，购自中国兽医药品监察所，其微生物保藏号：CVCC AV56，保藏单位：国家兽医微生物菌种保藏管理中心。
本发明的病毒株均为国内市场常见的商品化毒株，具有普遍性，其他类型同属的自然病毒株，只要可以感染猪体，并产生sIgA抗体，或强毒株经过致弱后即可使用本发明的方法制备多联活疫苗。
本发明实施例中，用于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)制备的宿主细胞，可为乳猪肾原代细胞，猪睾丸细胞系(ST细胞)，猪肾细胞系(PK15细胞)和猪肾细胞系(IBRS-2细胞)，优选ST细胞系作为繁殖猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞。用于猪流行性腹泻病毒(PEDV) 制备的细胞，可为Vero细胞系(非洲绿猴肾细胞)，Vero E6细胞系(Vero细胞克隆细胞)，PK15细胞系，IBRS-2细胞系和猪肾原代细胞，优选Vero E6细胞系作为繁殖流行性腹泻病毒的宿主细胞。用于猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)繁殖的细胞系为猴肾细胞系(Marc145细胞)和罗猴肾细胞系(MA104细胞)，优选Marc145细胞。其中ST细胞，IBRS-2细胞引进于武汉典型培养物保藏中心；Vero细胞，Vero E6细胞引进于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；PK15细胞，MA104细胞和Marc-145细胞引进于中国兽医药品监察所。这些细胞按照按照《中华人民共和国兽药典》中的有关方法进行检验，均无细菌、霉菌、外源病毒污染。同时对其他特性病毒进行检验，取以上细胞培养物用PCR或RT-PCR分别检测猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)，猪细小病毒(PPV)，猪乙脑病毒(JEV)，猪圆环病毒I型(PCV1)，猪圆环病毒II型(PCV2)，狂犬病(RV)，牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹泻II型(BVDV-2)，其中CSFV、PRV、PPV和JEV外源病毒检测时用世纪元亨PCR/RT-PCR检测试剂盒，PCV1、PCV2、RV、BVDV-1和BVDV2为自己建立的PCR/RT-PCR检测方法，均无这些病毒的污染。
在一个具体实施方案中，传代细胞培养中使用的血清是胎牛血清。在细胞培养由于血清内毒素含量高，或则血清不纯净时，很容易造成细胞在传代培养过程中生长缓慢，状态不佳，容易脱落，并且制备的病毒液，极有可能把血清中的外源因子引入到成品中。为此，本发明优选使用胎牛血清，对国内外胎牛血清进行品牌和批次的筛选，选到国外一个品牌的胎牛血清，通过检测内毒素＜0.1EU/ml，外源因子通过《中华人民共和国兽药典》中的有关方法进行检验，均无细菌、霉菌、外源病毒污染，同时通过PCR或RT-PCR分别检测CSFV、PRV、PPV、JEV、PCV1、PCV2、RV、BVDV-1和BVDV-2，均为阴性。同时对血清对猪轮状病毒抗体检测也为阴性，可用于该发明具体实施方案中。
在一个具体实施方案中，所述的ST细胞生长液为MEM培养基 (含有非必须氨基酸)，用来培养TGEV，在一个优选实施方案中，在使用MEM培养基中加入终浓度为1.5g/L的NaHCO3，终浓度为5％胎牛血清(v/v)，过滤前用HCl或NaOH调节PH至7.1～7.2备用，用三套孔径分别为0.4μm，0.2μm和0.1μm的滤芯(默克密理博，MerckMillipore)对生长液进行过滤，过滤后4℃保存备用，临用时预热生长液至37℃直接使用。所述培养ST细胞的生长液中，把血清直接加入生长液再进行无菌过滤，这样不仅简化了步骤，同时避免无菌过滤后再加入血清时引入外源性污染；采用三套不同孔径的滤芯分级过滤，不仅能除菌还能除去培养基在配制过程中可能引入的支原体。所述猪传染性胃肠炎病毒维持液，为MEM培养基中加入终浓度为2.2g/L的NaHCO3，1mg/L～50mg/L的胰酶，优选10mg/L的胰酶，1％DMSO(v/v)，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清，过滤前用HCl或NaOH调节PH至7.3～7.4备用。
在一个具体实施方案中，所述的Vero E6细胞生长液为DMEM培养基(高糖)，用来培养PEDV，在一个优选实施方案中，在使用DMEM培养基中加入终浓度为2.0g/L的NaHCO3，终浓度为5％胎牛血清(v/v)，过滤前用HCl或NaOH调节PH至7.1～7.2备用，用三套孔径分别为0.4μm，0.2μm和0.1μm的滤芯(默克密理博，MerckMillipore)对生长液进行过滤，过滤后4℃保存备用，临用时预热生长液至37℃直接使用。所述繁殖PEDV维持液，为DMEM培养基中加入终浓度为3.7g/L的NaHCO3，1mg/L～50mg/L的胰酶，优选10mg/L的胰酶，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清，过滤前用HCl或NaOH调节PH至7.3～7.4备用。
在一个具体实施方案中，所述的Marc145细胞生长液为DMEM培养基(低糖、不含有非必须氨基酸)，用来培养PoRV，在一个优选实施方案中，在使用DMEM培养基中加入终浓度为2.0g/L的NaHCO3，终浓度为5％胎牛血清(v/v)，过滤前用HCl或NaOH调节PH至7.1～7.2备用，用三套孔径分别为0.4μm，0.2μm和0.1μm的滤芯(默克密理博，Merck Millipore)对生长液进行过滤，过滤后 4℃保存备用，临用时预热生长液至37℃直接使用。所述维持液，为DMEM培养基中加入终浓度为3.7g/L的NaHCO3，1mg/L～50mg/L的胰酶，优选1mg/L～2mg/L的胰酶，10～20mg/l的核糖核苷和脱氧核糖核苷，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清，过滤前用HCl或NaOH调节PH至7.3～7.4备用。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1、繁殖病毒用适宜细胞的筛选
将猪TGEV接种于ST细胞(ATCC)、PK15细胞(中国动物疾病控制中心)，IBRS-2细胞(武汉典型培养物保藏中心)和乳猪肾原代细胞，将猪流行性腹泻病毒分辨接种于Vero细胞(上海生化所)，VeroE6细胞(上海生化所)、PK15细胞(中国动物疾病控制中心)、IBRS-2(武汉典型培养物保藏中心)，将猪轮状病毒接种于Marc145细胞(中国动物疾病控制中心)，MA104细胞(武汉典型培养物保藏中心)，在各自维持液中，控制其过滤前pH值为为7.3～7.4，温度为35℃～37℃，连续传代培养8代，使病毒适宜细胞，测定病毒增殖滴度，以病毒增殖滴度最高的细胞作为疫苗生产的适宜细胞系。
适宜的细胞系应该具有形态良好，状态稳定、一致，产毒高等特点。具体的细胞标准为：
细胞形态：用含5％胎牛血清的培养液，置5％CO2培养箱中37℃培养观察6h即可贴壁，48h可长成单层。显微镜下观察，细胞呈规则形状。
外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源性病毒污染。
胞核学检查：对不同传代水平的细胞，取50个处于有丝分裂中期的细胞进行检查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高 代次细胞中也应存在，与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式差异数不得超过15％，核型必须相同。
无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
细胞代次：原始细胞代次为1～5代，基础细胞代次为6～10代，工作细胞代次为11～25代，生产用细胞代次不超过30代。
致瘤性检验：取原始细胞种子，基础细胞种子和生产细胞种子最高代次加5代做致瘤性试验，在试验动物在试验期内均应无肿瘤的产生。
细胞保存：液氮保存。
三种病毒在各自适应细胞上连续继代8次后，进行病毒含量的测定，测定结果见表1。我们可以看出，用ST细胞连续繁殖TGEV病毒8代后滴度可达107.6TCID50/ml，这几种细胞中敏感性最高，并且ST细胞形态均一，生长速度快，无菌、无支原体和外源病毒污染，并且无致瘤型，因此确定了猪传染性胃肠炎病毒增殖用细胞为ST细胞；用Vero E6细胞连续繁殖猪流行性腹泻病毒(PEDV)8代后滴度可达107.7TCID50/ml，在这几种细胞中敏感性最高，并且Vero E6细胞形态均一，生长速度快，无菌、无支原体和外源病毒污染，并且无致瘤型，因此确定了PEDV增殖用细胞为Vero E6细胞。用Marc145细胞连续繁殖猪轮状病毒病毒(PoRV)8代后滴度可达107.7TCID50/ml，在这几种细胞中敏感性最高，并且Marc145生长速度快，无菌、无支原体和外源病毒污染，并且无致瘤型，因此确定了PEDV增殖用细胞为Marc145细胞。
表1：不同细胞对病毒的敏感性试验(Log10TCID50/ml)
实施例2、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗制备与检验
1、材料与方法
1.1细胞
ST细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)；
Vero E6细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；
Marc145细胞购自中国动物疾病控制中心；
1.2生产用毒种的制备
传染性胃肠炎病毒毒种的制备：将已长满致密单层的ST细胞按0.001M.O.I(单位细胞感染剂量)接入检验合格的TGEV种毒，37℃吸附1h后，加入终浓度为2.2g/L的NaHCO3，10mg/L的胰酶，1％DMSO(v/v)，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清的MEM维持液，37℃培养24～36h，当CPE达90％以上时，收获病毒液，冻融2次后备用。
猪流行腹泻病毒毒种的制备：将已长满致密单层的Vero E6细胞按0.2M.O.I(单位细胞感染剂量)接入检验合格的PEDV种毒，37℃吸附1h后，加入终浓度为3.7g/L的NaHCO3，10mg/L的胰酶，100U/ml青霉素，100μ/ml的链霉素，不含胎牛血清的DMEM维持液，37℃培养48～72h，当CPE达90％以上时，收获病毒液，冻融2次后备用。
猪轮状病毒毒种的制备：将已长满致密单层的Marc145细胞按0.01M.O.I(单位细胞感染剂量)接入检验合格的PoRV种毒，37℃吸附1h后，加入终浓度为2.2g/L的NaHCO3，2mg/L的胰酶，20mg/l的核糖核苷和脱氧核糖核苷，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清的MEM维持液，37℃培养48h～72h，当CPE达90％以上时，收获病毒液，冻融2次后备用。
1.3生产用毒种的鉴定
1.3.1病毒含量测定
猪传染性胃肠炎病毒含量测定将病毒液用含有10mg/L的胰酶，1％DMSO(v/v)MEM维持液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板ST细胞单层8孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续24～48h后判毒，观察细胞病变，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每ml病毒含量≥107.5TCID50。
猪流行性腹泻病毒含量的测定将病毒液用含有10mg/L的胰酶DMEM维持液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板VeroE6细胞单层8孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续96～120h后判毒，观察细胞病变，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每ml病毒含量≥107.5TCID50。
猪轮状病毒病毒含量的测定将病毒液用含有2mg/L的胰酶，20mg/l的核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEM维持液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板Marc145细胞单层8孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续48h～72h后判毒，观察细胞病变，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每ml病毒含量≥107.5TCID50。
1.3.2按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
1.4病毒液的培养制备
传染性胃肠炎病毒液的制备：用转瓶细胞培养法制备病毒。将已长满致密单层的ST细胞按0.001M.O.I(单位细胞感染剂量)接入检验合格的TGEV种毒，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附1h后，加入终浓度为2.2g/L的NaHCO3，10mg/L的胰酶，1％DMSO(v/v)，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清的MEM维持液，37℃培养24～36h，当CPE达90％以上时，收获病毒液，冻融2次后，3000r/min离心除去细胞碎片，置-40℃备用，应不超过2个月。
猪流行腹泻病毒液的制备：用转瓶细胞培养法制备病毒。将已长满致密单层的Vero E6细胞按0.2M.O.I(单位细胞感染剂量)接入检验合格的PEDV种毒，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附1h后，加入终浓度为3.7g/L的NaHCO3，10mg/L的胰酶，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清的DMEM维持液，37℃培养48～72h，当CPE达90％以上时，收获病毒液，冻融2次后，3000r/min离心除去细胞碎片，置-40℃备用，应不超过2个月。
猪轮状病毒液的制备：用转瓶细胞培养法制备病毒。将已长满致密单层的Marc145细胞按0.01 M.O.I(单位细胞感染剂量)接入检验合格的PoRV种毒，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附1h后，加入终浓度为2.2g/L的NaHCO3，2mg/L的胰酶，20mg/l的核糖核苷和脱氧核糖核苷，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，不含胎牛血清的MEM维持液，37℃培养48h～72h，当CPE达90％以上时，收获病毒液，冻融2次后，3000r/min离心除去细胞碎片，然后通过1.2μm和0.45μm的微孔滤芯进行过滤纯化，纯化后并置于-40℃备用，应不超过2个月。
1.5半成品检验
1.5.1病毒含量按1.3.1项进行检验，猪传染性胃肠炎每ml病毒含量应≥107.5TCID50；猪流行性腹泻每ml病毒含量应≥107.5TCID50；猪轮状病毒病毒每ml病毒含量应≥107.5TCID50。
1.5.2无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
1.6配苗配方如表1，将检验合格的3种病毒液(即病毒含量≥107.5TCID50/ml)按1∶1∶1(v/v)混合，然后混合液加入等体积的冻干保护剂作为稳定剂(冻干保护剂由每100毫升体积中含有蔗糖4g，多聚蛋白胨3g，D-山梨醇1g，聚乙烯吡咯烷酮2g，其余组分为注射用水)。充分混匀后定量分装，冻结真空干燥，盖密封后储存于4℃得到成品。
表1疫苗的配方及含量标准
1.7性状检验：肉眼观察疫苗物理性状。应为淡黄色海绵状疏松团块，无异物，易于瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，浓度均一，无异味。
1.8无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
1.9支原体检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无无支原体生长。
1.10鉴别检验：将疫苗用无血清MEM或DMEM细胞生长液稀释成103TCID50/ml，取3份稀释好的疫苗与在56℃灭活30min的1份猪传染性胃肠炎阳性血清、1份猪流行性腹泻阳性血清和1份猪轮状病毒阳性血清混合，置37℃水浴中作用1h后，分别接种已长满单层、弃去培养液的6孔ST细胞、Vero E6细胞和Marc145细胞培养板。每孔0.2ml；同时设病毒对照和正常细胞对照。置于37℃，含5％C02培养箱中吸附1h后，每孔补加各自维持液3ml。置于37℃，含5％C02培养箱继续培养观察5d。病毒对照孔应出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均无CPE出现。
1.11外源病毒检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，按照内部方法PCR/RT-PCR对特性病毒进行检验，对CSFV、PRV、PPV、JEV、PCV1、PCV2、RV、BVDV-1、BVDV-2这些病毒进行检验，应无这些病毒的污染。
1.12剩余水分测定：按《按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应符合规定。1.12真空度测定：按按现行《中华人民共和 国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
1.13安全检验：用经检验猪传染性胃肠炎、猪流行腹泻和猪轮状病毒抗体阴性母猪产3日龄哺乳仔猪10头，其中后海穴接种10倍免疫剂量5头，1倍免疫剂量5头，观察14d，均应无异常临床反应。
1.14效力检验：
1.14.1检验免疫仔猪血清中和抗体接种1倍免疫剂量的仔猪，于免疫后2周用中和抗体试验法检验血清中和抗体，8头仔猪应至少7头仔猪阳转，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒中和抗体效价≥1∶32，即能达到良好的免疫效果。
1.14.2对仔猪做免疫攻毒试验 接种1倍免疫剂量的仔猪免疫剂12头，于免疫后3周分为3组(每组4头)，连同未接种疫苗的同龄仔猪12头(也分为3组，每组4头)，以10-4/ml猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒强毒分别口腹攻毒，共度后免疫仔猪应分别有3/4保护，对照猪4/4发病，或免疫仔猪4/4保护，对照仔猪3/4发病，判为免疫合格。
2试验结果
2.1三种生产用毒种病毒含量的测定
按1.2种的方法分别用ST细胞繁殖猪传染性胃肠炎病毒，用VeroE6细胞繁殖猪流行性腹泻病毒，用Marc145细胞繁殖猪轮状病毒。制备的3种病毒液分别按1.3.1项中的方法进行病毒含量的测定，结果见表2。结果表明制备3种病毒液每ml病毒含量均大于107.5TCID50，另外按1.3.2方法对3种毒种进行纯净性检验，均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。因此，制备的3种病毒液可作为抗原生产用毒种。
表2生产用毒种病毒含量测定(滴度)
2.2三批抗原的含量测定 按1.4项中的方法分别制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒各三批，抗原的病毒含量测定结果表3。结果表明制备3种病毒液每ml病毒含量均大于107.5TCID50，并且无菌检验阴性，可以用于疫苗的制备。
表3抗原含量测定
2.3用2.2项中检验合格的病毒液，按1.6项中的方法制备3批疫苗，批号分别为V20100301、V20100302和V20100303。
2.4三批疫苗性状、无菌检验、支原体检验和鉴别检验结果
三批疫苗，批号分别为V20100301、V20100302和V20100303进行疫苗性状检验、无菌检验和支原体检验，结果见表4
表4三批疫苗性状检验、无菌检验、支原体检验、和鉴别检验结果
2.5三批疫苗外源病毒检验结果
三批疫苗，批号分别为V20100301、V20100302和V20100303按现 行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验和，对CSFV、PRV、PPV、JEV、PCV1、PCV2、RV、BVDV-1、BVDV-2这些病毒进行检验，三批疫苗外源病毒检测结果见表5。
表5、三批疫苗外源病毒检测结果
注：-表示阴性，即无外源病毒DNA污染。
2.6三批疫苗剩余水分测定和真空度测定
三批疫苗，批号分别为V20100301、V20100302和V20100303分别进行剩余水分和真空度检测，结果均符合规定，见表6。
表6三批疫苗剩余水分和真空度检测结果
2.7三批疫苗安全性检验
三批疫苗，批号为V20100301、V20100302和V20100303分别经过安全检验，结果三批疫苗成品均是合格的，结果见表7。仔猪均无体温升高，采食、精神状况及生长发育情况均正常，试验仔猪均存活。
表7疫苗安全性试验结果
2.8三批疫苗效力检验
2.8.1免疫仔猪血清中和抗体
三批疫苗，批号为V20100301、V20100302和V20100303，分别按1.14.1中的方法进行效力检验，结果三批疫苗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒中和抗体效价检验均合格，见表8。
表8疫苗免疫仔猪血清中和抗体检测结果
2.8.2免疫仔猪攻毒性保护
三批疫苗，批号为V20100301、V20100302和V20100303，分别按1.14.2中的方法进行效力检验，结果三批疫苗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒攻毒性保护检验均合格，见表9。
表93批疫苗的攻毒性保护结果
实施例3、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗与自制的轮状病毒弱毒疫苗和市售的传染性胃肠炎与流行性腹泻二联活疫苗免疫效力比较试验。
1材料
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗，实施实例2中的疫苗制品(批号：V20100303)；
猪轮状病毒弱毒疫苗，实验室试制产品；
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗，吉林正业生物制品有限公司(批号为20100102)。
2方法
2.1轮状病毒弱毒疫苗的制备方法
轮状病毒弱毒疫苗的制备用实施例2 1.4项中制备病毒含量为108TCID50/ml的猪轮状病毒液用于配苗。配苗时猪轮状病毒和无菌PBS按1∶2比例混合，然后再加入等体积50％(v/v)乳糖，各成分的含量见表1。充分混匀后定量分装，冻结真空干燥，盖密封后储存于4℃得到成品。并按实施例21.6～1.14项中的方法进行检验。
表1PoRV弱毒疫苗的配方
2.2动物试验设计
2.2.1仔猪的被动免疫试验
用批号为V20100303的三联弱毒疫苗后海穴(即尾根与肛门中间凹 陷的小窝部位)注射8头产前1个月母猪，每头注射1头份(2ml)，免疫母猪所产的仔猪21d后随机选40头，分为4组，每组10头，以10-4/ml猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒强毒分别口腹攻毒，另设10头不攻毒作阴性对照；批号为20100102的二联苗后海穴注射6头产前1个月母猪，每头注射1头份(2ml)，免疫母猪所产的仔猪21d后随机选30头，分为3组，每组10头，分别以10-4/ml猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻强毒口腹攻毒，设10头不攻毒免疫仔猪作阴性对照；PoRV弱毒疫苗后海穴注射4头产前1个月母猪，每头注射1头份(2ml)，免疫母猪所产的仔猪21d后随机选20头，分别以10-4/ml猪轮状病毒强毒口腹攻毒，设10头不攻毒免疫仔猪作阴性对照。另设6头TGEV抗体阴性、PEDV抗体阴性、PoRV抗体阴性的母猪作产的21d龄仔猪随机选30头，分为3组，每组10头，分别作为TGEV、PEDV和PoRV强毒攻毒对照。具体分组及处理情况见表2。
表2试验分组及处理
2.2.2仔猪的主动免疫试验
用比号为V20100303的三联弱毒疫苗、2.1项实验室试制产品PoRV弱毒单苗、猪传染性胃肠炎与流行腹泻二联活疫苗(批号为20100102)分别后海穴(即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位)分别后海穴(即尾根 与肛门中间凹陷的小窝部位)1日龄健康仔猪，每种疫苗接种数量表3，每头仔猪注射1头份(0.5ml)，21d后进行强毒攻击，设10头TGEV抗体阴性21龄仔猪作TGEV攻毒对照，10头PEDV抗体阴性21龄仔猪作PEDV攻毒对照，10头PoRV抗体阴性21龄仔猪作PoRV攻毒对照。具体分组及处理情况见表3。
表3试验分组及处理
3试验结果与讨论
3.1仔猪的被动免疫
用比号为V20100303的三联弱毒疫苗、2.1项实验室试制产品PoRV弱毒单苗、猪传染性胃肠炎与流行腹泻二联活疫苗免疫母猪后对所产仔猪攻毒性保护结果见表1。结果表明三联苗和PoRV弱毒单苗在用PoRV强毒攻毒时对仔猪被动免疫保护率没有明显差异，但三联苗与市售的猪传染性胃肠炎与流行腹泻二联活疫苗在用PEDV强毒攻毒时对仔猪被动免疫保护效率上前者优于后者，三联苗对在TGEV部分对仔猪的保护率为10/10(100％)，而市售二联苗对仔猪的保护率为9/10(90％)，因此在PEDV的免疫效力上三联苗优于市售的二联苗。从接种剂量比较而言，三联苗打1针，共2ml，轮状病毒单苗和传染性胃肠炎、流行腹泻二联活疫苗联用打2针，共4ml，显而易见的效果是三联苗使用更为方便，省时省力。
表4三联灭活苗和轮状病毒单苗、市售二联苗对仔猪的被动免疫试验效果比较
3.2仔猪的主动免疫
用比号为V20100303的三联弱毒疫苗、2.1项实验室试制产品PoRV弱毒单苗、猪传染性胃肠炎与流行腹泻二联活疫苗分别免疫1日龄健康仔猪，21日龄后攻毒性保护结果见表2。结果表明三联苗和PoRV弱毒单苗在用PoRV强毒攻毒时对仔猪主动免疫保护率没有明显差异，但三联苗与市售的猪传染性胃肠炎与流行腹泻二联活疫苗在用TGEV强毒攻毒时对仔猪主动免疫保护效率上前者优于后者，三联苗对在TGEV部分对仔猪的保护率为10/10(100％)，而市售二联苗对仔猪的保护率为9/10(90％)，因此在TGEV的免疫效力上三联苗优于市售的二联苗。从接种剂量比较而言，三联苗打1针，共0.5ml，轮状病毒单苗和传染性胃肠炎、流行腹泻二联活疫苗联用打2针，共1ml，显而易见的效果是三联苗使用更为方便，省时省力。
表5三联灭活苗和轮状病毒单苗、市售二联苗对仔猪的主免疫试验效果比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，其特征在于，所述三联活疫苗中抗原成分为活的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，其中，所述猪传染性胃肠炎病毒为保藏号CCTCC-V200609的华毒弱毒株，猪流行性腹泻病毒为保藏号为CCTCC-V200608的弱毒株，猪轮状病毒株为保藏号CVCC AV56的弱毒株，所述猪传染性胃肠炎病毒的含量≥107.5TCID50/ml、猪流行性腹泻病毒的含量≥107.5TCID50/ml和猪轮状病毒的含量≥107.5TCID50/ml，所述猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的体积比为1：1：1。
2.一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪传染性胃肠炎病毒华毒弱毒株CCTCC-V200609，并加入猪传染性胃肠炎病毒维持液，在37℃下继续培养；
2)将长满致密单层的哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪流行性腹泻病毒弱毒株CCTCC-V200608，并加入猪流行性腹泻病毒维持液，在37℃下继续培养；
3)将长满致密单层的哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪轮状病毒弱毒株CVCC AV56，并加入猪轮状病毒维持液，在37℃下继续培养；
4)当细胞病变在90％以上时，分别收获病毒，并反复冻融2次后，保存于-40℃以下，备用；
5)对收获的病毒液进行病毒含量和纯净性检验，所述猪传染性胃肠炎病毒的含量、猪流行性腹泻病毒的含量和猪轮状病毒的含量均≥107.5TCID50/ml，纯净性检验合格的病毒用于配苗；
6)将上述检验合格的三批病毒液经过2000～5000r/min低速离心，2次微孔滤膜过滤纯化；
7)将检验合格的病毒液按1:1:1体积比例混合，即得猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。
3.根据权利要求2所述的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞，选自乳猪肾原代细胞，猪睾丸细胞，猪肾细胞；所述的猪流行性腹泻病毒的宿主细胞，选自Vero细胞、Vero E6细胞、PK15细胞或猪肾原代细胞；所述的猪轮状病毒的宿主细胞，选自猴肾细胞。
4.根据权利要求2所述的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞为猪睾丸细胞，猪流行性腹泻病毒的宿主细胞为Vero E6细胞，猪轮状病毒的宿主细胞为猴肾细胞。
5.根据权利要求2所述的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪轮状病毒维持液为DMEM培养基，其中DMEM培养基为低糖，葡萄糖含量为1000mg/l，并且不含非必须氨基酸。
6.根据权利要求5所述的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪轮状病毒维持液中还含有3.7g/l的NaHCO3，1.5mg/l的胰酶，15mg/l的核糖核苷和15mg/l的脱氧核糖核苷，100U/ml青霉素，100μg/ml的链霉素，PH7.3～7.4，其中所述维持液是经过无菌过滤处理的。
7.根据权利要求2-6的任一项的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述三联活疫苗还加入冻干保护剂进行冻干，获得冻干的三联活疫苗。
8.根据权利要求7所述的三联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂为由每100毫升体积中含有蔗糖2g，多聚蛋白胨3g，D-山梨醇1g，聚乙烯吡咯烷酮2g，其余组分为注射用水，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤除菌。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Xuke Inventor after: Sun Jinzhong Inventor after: Bai Chaoyong Inventor after: Zhao Weinan Inventor before: Zhang Xuke Inventor before: Sun Jinzhong Inventor before: Bai Chaoyong |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHANG XUKE SUN JINZHONG BAI CHAOYONG TO: ZHANG XUKE SUN JINZHONG BAI CHAOYONG ZHAO WEINAN |