CN105821006A - 变异猪流行性腹泻病毒弱毒yn150株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150株及其应用。本发明弱毒株是由毒株YN144(微生物保藏号是：CCTCC V201547)在10μg/mL胰酶的条件下在Vero细胞上连续传6代得到的。本发明PEDV弱毒株来源于变异猪流行性腹泻病毒，其安全性好，对妊娠母猪、育肥猪和仔猪等各年龄猪均安全。本发明的疫苗可以刺激猪产生抵抗变异猪流行性腹泻病毒的保护性免疫反应，有效防止变异猪流行性腹泻病毒的感染。

Description

变异猪流行性腹泻病毒弱毒YN150株及其应用

技术领域

本发明涉及变异性猪流行腹泻病毒弱毒株，具体地指一种变异猪流行性腹泻病毒弱毒YN150株及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触传播性疾病。猪在感染PEDV以后，常引起仔猪的急性肠炎及致命性水泻直至脱水死亡，其临床特征主要表现在仔猪呕吐、严重腹泻和脱水；PEDV感染猪，剖检病理变化主要表现为猪的空肠和回肠部分的肠绒毛的萎缩和脱落(PensaertMBetal.,2006)。各年龄阶段的猪均易感，但主要影响哺乳仔猪，发病率100％，死亡率80％～100％(TimoneyJFetal.,1988)，给世界养猪业带来重大的经济损失(SongDetal.,2012)。猪流行性腹泻的疫苗主要分为基因工程疫苗，灭活疫苗和弱毒疫苗等。其中，弱毒疫苗因其可以口服进而诱发有效地黏膜免疫应答，免疫效果良好，成本低廉而备受关注。

PEDV弱毒疫苗是通过将PEDV在Vero细胞上连续传代得到的。1999年，韩国学者通过将临床分离的PEDV毒株KPEDV-9在Vero细胞上连续传93代，得到该毒株的致弱毒株，通过将此弱毒株口服接种母猪和小猪能够大大提高母猪的抗体水平和仔猪的成活率，并且没有观察到明显的临床症状，因此KPEDV-9弱毒株可以作为疫苗来预防PED(KweonCHetal.,1999)。2007年，韩国学者通过将临床分离株DR13在Vero细胞上经过传100代得到致弱的DR13，试验证明致弱的DR13对猪具有很高的保护率，并且在猪体内经过三代的传代，毒力也没有增强。同时他们发现此致弱毒通过口服比肌注效果更好，因为口服疫苗后的仔猪的死亡率相对于肌注的要低，并且抗体水平要高的多(SongDSetal.,2007)，该疫苗是韩国用于预防PED的口服疫苗。中国学者佟有恩等人通过将CV777毒株在Vero细胞上传代125代后，获得了CV777弱毒株，临床试验表明，弱毒株的毒力显著下降，接种仔猪后，仔猪能够有效地抵抗强毒感染，并且该弱毒株在猪体内传了6代，也没有见到毒力的返强，区域性的临床试验表明此毒株的免疫原性和安全性都很好(佟有恩等，1998)。1999年，佟有恩等在以前的工作基础上，又研发出了TGEV和PEDV的二联弱毒苗，经过临床试验，二联弱毒苗的主动免疫和被动免疫的免疫保护率分别为97.7％和98％，高于二联灭活疫苗的免疫保护率，免疫剂量也比灭活疫苗低，显示了弱毒疫苗的优势(佟有恩等，1999)。

近年来，弱毒疫苗成为了研究的热点，其优越性主要表现在：

⑴抗原递呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫时，效果更佳；

⑵可产生特异性细胞毒性T细胞杀伤反应(CTL效应)；

⑶可以激发黏膜和系统免疫反应。以弱毒疫苗经口服或滴鼻的方式免疫后，可以直接将外源抗原运载至机体的黏膜相关淋巴组织(MALT)，从而激发机体的黏膜和系统免疫反应；存在于血清中PEDVIgG不能提供保护，注射免疫并不能产生母源抗体，只有肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔猪通过初乳来获得母源SIgA，从而产生对流行性腹泻的被动免疫保护，这种免疫效果确实、保护率也最高。

⑷免疫具有持续性，减毒疫苗提供长期的免疫保护，从而不需反复多次地加强免疫也可长期地激发机体的免疫应答反应；

⑸接种方式简便，易于操作，适于群体免疫，且安全性好。

1971年在英国首次报道PED，其临床症状类似猪传染性胃肠炎(TGE)，被命名为病毒性腹泻(EVD)；1976年在欧洲其他国家报道该病流行。直到1977年在比利时第一次分离到，证实该病毒是冠状病毒，命名为猪流行性腹泻病毒(PEDV)(PensaertMBetal.,1978；WoodEN,1977b)。在欧洲各国，PED较以前的流行程度已明显降低，泰国于2007年出现大流行，新生仔猪死亡率达100％。在中国近几年来，PED在我国广泛流行。2005年至2007年间，哈尔滨兽医研究所对国内部分省市猪场腹泻病例做了一项调查，结果显示：PED病例占46％，是我国仔猪腹泻的主要病因(甘振磊等，2010)。华中农业大学张坤、刘云波分别在2009年1月～2010年2月和2011年4月～2012年4月对全国部分省市做了流行病学调查，发现PED仍在仔猪腹泻中占主导地位(张坤等,2010；刘云波等,2013)。从2010年冬季开始，我国南方省市大部分猪场大规模爆发PED流行，且迅速蔓延至全国(ChenJFetal.,2012；LiZLetal.,2012；SunRQetal2012)，给我国养猪业造成巨大损失。在我国流行的PED的主要特征哺乳仔猪的高死亡率，临床症状主要是严重的肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水和体重减轻。2011年我国生猪产业特别是华南地区损失了一百多万头仔猪，造成了巨大的损失(SunRQetal.,2011)。2011年末，本实验首先报道了本次猪流行腹泻病是由变异的猪流行性腹泻病毒引起的(WenTL.,2011)，北美之前一直没有猪流行性腹泻病的报道，但是2013年5月之后美国首次发现并报道了猪流行腹泻病毒的感染，之后该疫情迅速蔓延到美国境内的33个州，造成了巨大的经济损失，通过对病原的测序和比对，发现病原和我国安徽毒株的核苷酸同源性最高。其他的美洲国家，比如加拿大、墨西哥、古巴、哥伦比亚、阿根廷等先后报道了猪流行腹泻病疫情。韩国，菲律宾、泰国等东南亚国家也报道了猪流行性腹泻病疫情，甚至许多欧洲国家的生猪产业都受到猪流行性腹泻病的巨大冲击，比如德国、英国、法国、比利时、荷兰、瑞士等。之后杨汉春等报道了变异毒株在我国发病猪场中占主导地位，并且现有的来源于CV777毒株的疫苗不能对变异PEDV毒株PED起到足够的保护能力(GaoYetal.,2013)。2013年8月本实验室分离到一株变异毒株YN1(GenBankNO.：KT021227)，经过Vero细胞上传代，获得了一种来源于变异毒株的弱毒毒株YN144(GenBankNO.:KT021232)(ChenFZetal.,2015)，经实验证明该毒株安全性和对变异毒株引起的PED有很好的保护性(WuMZetal.,2016)。

PEDV粒子形态特征与冠状病毒科其它成员的很相似(Chaseyetal.,1978)，纤突糖蛋白(S蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和包膜糖蛋白(E蛋白)分布于病毒粒子的表面；核衣壳蛋白(N蛋白)位于病毒粒子内部，PEDV的核衣壳结构是由N蛋白与基因组RNA相互作用而形成的，这使得PEDV与传染性胃肠炎病毒在形态学上很难区别(Pensaertetal.,1982)。目前为止，研究发现PEDV只存在一个血清型(Witteetal.,1981)。

S基因是PEDV的多功能的结构基因，负责结合病毒受体、诱导产生中和抗体以及宿主细胞融合，S基因是PEDV毒株毒力和进化的特征性基因。已有报道通过S基因构建的进化树能将PEDV毒株分为两个基因型，即G1和G2。其中G1是由变异毒株组成的，G2是有经典的PEDV毒株，以及经典PEDV衍生的疫苗毒株组成的。S基因的长度约4.2kb，进行全长测序较为困难，已有报道S基因的N端，即S1基因变异性最大，由S1基因构建的进化树和S基因全长构建的进化树的一致，因此本实验依据前期已经设计的两对引物对S1基因进行测序，以期了解病原的核酸变异特征。ORF3基因是PEDV的唯一的附属基因，和离子通道密切相关，现在商品化的来源于CV777毒株或DR13毒株的弱毒或灭活疫苗的ORF3都有49bp的核苷酸缺失，通过对ORF3基因的测序能更好了解我们检测到的毒株是临床野毒株还是疫苗毒株。

国内外常用的预防PED发生的方法是免疫预防，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，PED商业化的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗两种，其中弱毒疫苗主要是来之经典毒株CV777的致弱疫苗，这两种疫苗各自有自己的优点。返饲在一段时间很流行，主要的做法是将PEDV感染猪的粪便或发病仔猪的肠内容物制成自家苗，人工感染妊娠母猪，刺激产生母源抗体，仔猪吮乳后，获得保护，降低死亡率和缩短PED流行时间，但现已证实该方法的害处大于益处，容易散毒，而且产品质量和批次间的差异无法很好的把控。灭活疫苗具有安全、稳定的优点，但同时由于灭活疫苗具有需要大剂量接种或者应用浓缩抗原；免疫期短，常需强化接种；不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；产生完全免疫力需要2周；不利于紧急预防接种与降低疫苗费用等缺点，促进了PED弱毒疫苗的研制。目前，PED的商品化弱毒疫苗主要有我国的CV777株，日本的P-5V株和韩国的KPED-9株、DR13株。1993年佟有恩研究员等将适应Vero细胞的CV777株从90代起进行克隆纯化，目的是稳定减弱的毒力并保持良好的免疫原性。克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主动免疫与被动免疫的保护率分别达到95.9％及96.2％。哈尔滨兽医研究所基于CV777弱毒株已开发PED-TGE二联弱毒苗；福建省生物药品厂同中国农业大学合作开发TGE-PED-RV三联弱毒苗，认为这3种病毒组织嗜性相同，所以研制多联苗是可行的。然而2006年我国报道的PED疫苗免疫猪场不能提供完全的保护(ChenJFetal.,2010)，以及近期的研究发现我国变异毒株占主导地位(GaoYetal.,2013)，在中国，用来预防猪流行性腹泻的活疫苗毒株主要是CV777疫苗毒株。2011年由猪流行性腹泻变异毒株引起的腹泻在CV777弱毒活疫苗免疫猪场暴发，表明传统CV777弱毒疫苗免疫已经不能有效地预防变异毒株所造成的腹泻，而当今变异毒株引起的PED在世界范围类肆掠，所以通过PEDV临床分离到的变异毒株开发安全、高效、廉价的变异毒株来源的PEDV弱毒疫苗是世界养猪业的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是提供了一种变异猪流行性腹泻病毒弱毒YN150株及其应用。

为实现上述目的，本发明提供的一种变异猪流行性腹泻病毒弱毒YN150株，所述YN150株是由毒株YN144在10μg/mL胰酶的条件下在Vero细胞上连续传6代得到的，其中，毒株YN144的保藏号为：CCTCCV201547。YN150株的全长序列如SEQIDNo.1所示。

变异猪流行性腹泻病毒弱毒YN150株的获得说明：

从云南省某猪场送检的仔猪小肠病料中成功分离到一株猪流行性腹泻病毒。将分离毒株进行全基因组测序，鉴定分离的毒株为变异猪流行性腹泻病毒。

将分离到的变异猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代120代，然后通过克隆纯化继续在Vero细胞上传代至144代，命名YN144，即猪流行性腹泻病毒弱病毒PEDV-YN144，将该毒株于2015年11月10日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO：V201547，然后在10μg/mL胰酶的条件下在Vero细胞上连续传6代得到的YN150。从30代开始在ORF3基因433bp处有1个碱基的缺失，造成了ORF3蛋白的提前终止，S蛋白在144-145aa处有两个氨基酸的缺失，这些特点在60代，90代，120代，144代和150代毒株都稳定存在。

致弱实验表明，从60代开始，变异PEDV对仔猪失去致病性；将PEDVYN150在猪体内连传5代，没有任何毒力返强现象。

本发明还提供了一种利用YN150株制备变异猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)培养病毒YN150株的毒价达到10^6.0TCID50)/mL，

2)将变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150与牛奶保护剂按照体积比：6～9∶1混合(优选为7∶1)；于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，确保没有杂菌污染，置于-20℃保存备用。

进一步地，所述活疫苗中，变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150株的含量1×10⁶～2×10⁶TCID₅₀/mL。

本发明还提供了一种变异猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗在预防新型猪流行性腹泻中的应用。

本发明原理

本研究运用分离到的变异PEDV毒株运用Vero细胞传代致弱PEDV的方法，获得一种变异PEDV弱毒YN150株，区域性的临床试验表明此毒株对变异毒株引起的PED的免疫原性和安全性都很好，该毒株已经致弱，免疫猪后产生抗体，对猪安全无害，对人和植物无害，对环境没有污染。变异PEDV毒株引起的PED在世界范围内肆掠，所以本疫苗有极为广阔的应用前景。我国猪病毒性腹泻病很严重，且混合感染情况普遍，因此本疫苗还为猪腹泻病的多联苗研制打下了很好的基础。

本发明的有益效果在于：

1、本毒株来源于变异的PEDV。

2、本毒株为弱毒活疫苗，能通过口服给药，便于机体产生黏膜免疫。

3、本毒株变异特征明显，能与其他毒株进行区分。

4、本发明所研制的疫苗，与现有的灭活苗和弱毒苗相比，具有制备过程简单、省时，且易于储存运输的特点，显著降低了疫苗的制作成本且免疫效果更为确切。

5、本发明的弱毒株疫苗，在S基因和ORF3基因处都有缺失，临床使用安全性很高，符合疫苗生物安全性要求。

6、本疫苗能很好的保护动物免受变异毒株的感染，我国猪病较为复杂，本发明毒株还可应用于制备成单苗或联苗等，为后续的三联疫苗的研制打下了坚实的基础。

本发明PEDV弱毒株来源于变异猪流行性腹泻病毒，其安全性好，对妊娠母猪、育肥猪和仔猪等各年龄猪均安全。本发明的疫苗可以刺激猪产生抵抗变异猪流行性腹泻病毒的保护性免疫反应，有效防止变异猪流行性腹泻病毒的感染。

附图说明

图1A：正常的Vero细胞对照。

图1B：病毒感染引起的CPE。

图2A：未接毒PEDV的Vero细胞间接荧光免疫对照。

图2B：感染PEDV的Vero细胞的间接荧光免疫阳性结果。

图3：PEDV的透射电镜照片。

图4：YN1、YN15、YN60、YN144和YN150的病毒滴度。

图5：YN1、YN15、YN60、YN144和YN150的一步生长曲线。

图6：感染YN15、YN144和对照组的免疫组化打分结果。

图7：经典和变异弱毒株和相应的强毒野毒株相比各个蛋白变化的具体位置，其中pairA为DR13疫苗毒株和DR13比较的结果，pairB为YN144和YN1比较的结果。

图8：不同免疫组IgA水平比较。

图9：不同免疫组IgG水平比较。

图10：不同免疫组中和抗体水平比较。

图11：不同免疫组仔猪存活率比较。

图12：不同免疫组仔猪情况比较。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1病料的采集和处理

病料采自云南省某免疫了猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻灭活苗但爆发PED猪场死亡的3日龄仔猪的小肠，经RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒。仔猪小肠按1：9(体积比)加入生理盐水，捣碎、反复冻融两次，离心，2000r/min，4℃，15min，收集上清，并按每毫升加入青、链霉素各1500单位，放4℃冰箱中过夜，然后再离心，10000r/min，4℃，15min，取上清，用0.22μm的滤器过滤，保存于-80℃冰箱。

实施例2病毒的分离和鉴定

病毒分离从-80℃冰箱中取出用做感染细胞的样品，并在溶液中按50μg/mL加入胰酶，放入37℃培养箱中处理30min，最后按每管1mL分装于不同的1.5mL灭菌的EP管中备用。取生长状况良好的Vero单层细胞，弃去培养液，用PBS液清洗单层细胞2次。按照25cm²培养瓶中加入1mL处理好的用于感染的病料样品，并按10μg/mL的终浓度加入胰酶，在37℃CO₂培养箱内吸附1h，其间轻摇1次，同时设立正常细胞作为对照。弃去吸附液(第二代以后的吸附液可以不弃去)，并补充加入含10μg/mL终浓度胰酶的DMEM维持液(不含血清)5mL，37℃培养。在倒置显微镜下观察接种病毒后24h和48h的Vero细胞的病变情况。连续传六代后，病变稳定(图1)。测定TCID₅₀，按照Reed-Muench法计算毒价。RT-PCR方法，扩增M基因、S基因和ORF3基因，根据扩增产物大小和序列测定，其中扩增的M基因主要用于PEDV的鉴定，其S基因与CV777(GenBank登录号：KT323979)S基因相比，在S基因N端长9bp(包括15bp的插入和6bp的缺失)，判定该毒株为变异毒株，与CV777毒株(GenBank登录号：AF353511)相比，PEDV毒株在ORF3基因245-293bp处有49bp的缺失，判定该毒株为疫苗毒株，所使用的引物如下(表1)。

表1用来检测PEDV以及对S和ORF3基因测序的引物

间接免疫荧光试验方法，用适量的PEDV病毒接种于Vero细胞，培养12h后，以未接种病毒的细胞为阴性对照，用本实验制备的单抗作为一抗，用SouthernBiotech公司的FITC标记的羊抗鼠抗体作为荧光二抗，进行间接免疫荧光试验。成功鉴定PEDV(图2)。

投射电镜观察，细胞病变约70％后收细胞培养物，12000rpm离心5min去细胞碎片后，取上清经27000rpm离心2h，使用透射电镜观察该病毒的形态大小，特别是特征性的放射冠(图3)。

实施例3病毒的传代致弱

用无血清的DMEM洗培养了24小时的大概长成80％融合的Vero细胞2次，按上面分毒的方法接种0.1MOI的YN1，维持液为含胰酶浓度为8μg/mL的DMEM。当约36h时，细胞病变达到85％的时候收毒，将病毒储存于-80℃的冰箱中。将该收集的病毒反复冻融三次后进行连续传代。

实施例4病毒的生物学特征

YN1、YN15、YN60、YN144和YN150的生长特性，将YN1，YN15，YN60，YN144和YN150的毒种10倍稀释，接种96孔板，按照ReedMuench方法测定这些毒株的毒价，以(PFU)/mL为单位进行表达。然后将0.1MOI的YN1、YN15、YN60、YN144和YN150接种12孔板，每隔6小时收集一个孔的样品于-80℃冰箱，直到接毒后36h，通过测定TCID₅₀的方法来制作这些毒株的一步法生长曲线。YN1、YN15、YN60、YN144和YN150的病毒滴度分别是4.2log10、6.8log10、7.2log10、7.6log10PFU/mL和7.5log10PFU/mL(图4)。

一步生长曲线结果显示YN1和YN15在接毒12、18、24、30和36h的病毒滴度分别为2.2log10、3.4log10、3.8log10、4.2log10、3.9log10PFU/mL和4.5log10、5.8log10、6.5log10、6.8log10、6log10PFU/mL，YN60、YN144和YN150在接毒12、18、24、30和36h的病毒滴度分别为5.0log10、6.6log10、7.2log10、6.4log10、5.5log10PFU/mL；6.0log10，7.6log10、6.9log10、5.5log10、4.0log10PFU/mL和5.9log10、7.5log10、6.7log10、5.3log10、4.0log10PFU/mL。YN1，YN15，YN60，YN144和YN150最高的病毒滴度分别是在接毒后30h4.2log10PFU/mL，在接毒后30h6.8log10PFU/mL，在接毒后24h7.2log10PFU/mL，在接毒后18h7.6log10PFU/mL，和在接毒后18h7.5log10PFU/mL(图5)。

实验结果显示同原始毒株YN1相比YN15、YN60、YN144和YN150毒株的毒价越来越高，而且达到最高毒株的时间越来越短。这些结果显示，与原始毒株YN1相比，YN15、YN60、YN144和YN150毒株核苷酸和氨基酸的改变使这些毒株更加适应细胞培养了。

实施例5YN15和YN150的毒力实验

12头PEDV、TGEV和RV阴性的10天大的仔猪用来评估YN15和YN150的毒力。这12头仔猪被随机分为三组，每组4头仔猪，这3组的仔猪分别口服2mL的10⁵TCID₅₀)/0.1mL的YN15毒株，YN150毒株和DMEM。病毒感染后的第一天和第五天收集每只仔猪的粪拭子，用本实验室的多重RT-PCR方法检测PEDV，每天观察这些猪只的临床症状。接毒5天后对这些仔猪进行剖杀，取肠道样品，运用免疫组化方法观察病毒的定植情况。免疫组化方法如下所示：

组织切片的制作：

将多聚甲醛固定好的组织进行处理，然后经过系列浓度的酒精脱水，再用二甲苯透明，石蜡包埋。具体如下：

(1)75％的酒精，脱水过夜；

(2)85％的酒精，脱水1h；

(3)90％的酒精，脱水1h；

(4)95％的酒精Ⅰ，脱水1h；

(5)95％的酒精Ⅱ，脱水1h；

(6)100％的酒精Ⅰ，脱水1h；

(7)100％的酒精Ⅱ，脱水1h；

(8)100％的酒精Ⅲ，脱水1h；

(9)100％的酒精Ⅳ，脱水1h；

(10)水杨酸甲酯透明，过夜；

(11)石蜡Ⅰ浸蜡0.5h；

(12)石蜡Ⅱ浸蜡0.5h；

(13)石蜡Ⅲ浸蜡0.5h；

(14)包埋，修理腊块

对处理好的腊块进行切片，厚度4μm或5μm，于温水中漂浮展平，载玻片捞起后烘干，保存使用。

免疫组化：

(1)对石蜡切片进行二甲苯脱蜡Ⅰ脱蜡10min，二甲苯Ⅱ脱蜡10min；

(2)梯度酒精水化(100％的酒精Ⅰ3min；100％的酒精Ⅱ3min；90％的酒精3min；80％的酒精3min；70％的酒精3min)；

(3)将切片置于PBS缓冲液中漂洗3次，每次5min；

(4)然后再使用10％的H₂0₂-甲醇溶液于室温中避光孵育30min，用于消除组织中的内源性过氧化物酶的影响，置于PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；

(5)进行抗原修复：切片置于枸橼酸钠缓冲液中(浓度为0.01mol/L)，微波炉煮沸20min，自然冷却至室温；

(6)PBS缓冲液中漂洗3次，每次5min；

(7)切片上滴加5％BSA于37℃封闭30min；

(8)倾去血清(尽量除尽)，滴加已优化好条件的一抗(1：100稀释)，设立阴性对照(PBS代替一抗)，置于湿盒，于4℃过夜；

(9)次日取出，于37℃，45min，置于PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；

(10)于切片上滴加羊抗鼠IgG二抗(使用HRP标记)，置于37℃，20min；

(11)置于PBS缓冲液漂洗3次，每次5min，风干后滴加SABC，置于37℃，30min；

(12)置于1％-2％的吐温PBS缓冲液漂洗3次，每次5min，然后纯PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；

(13)使用DAB显色，于显微镜下控制显色时间；

(14)显色好的切片用清水冲洗，用苏木素复染，控制复染时间，一般10-30s；

(15)清水冲洗切片，经梯度酒精脱水(75％的酒精3min；80％的酒精3min；95％的酒精3min；100％的酒精Ⅰ3min；100％的酒精Ⅱ3min；100％的酒精Ⅲ3min)；

(16)二甲苯Ⅰ透明10min，二甲苯Ⅱ透明10min，使用中性树胶封片；

(17)显微镜下观察判定结果，阴性时细胞不着色，阳性细胞呈现棕黄色。

实验结果显示，YN15感染组的仔猪临床表现为水样腹泻，感染后1天和5天时粪拭子能检到PEDV，剖检可见小肠有典型的粘液性和黄色水样堵塞物。IHC结果显示病毒定植情况严重。YN150和对照组的猪只情况类似，临床都没有腹泻症状，感染后1天和5天时粪拭子不能检到PEDV，剖检可见小肠情况较为正常。IHC结果显示YN150有病毒的定植，但是定植情况并不严重。YN15、YN150和对照组的IHC得分如下图所示(图6)。

实施例6不同代次毒株的基因组测定和基因组序列特点分析：

基因组RNA的提取：

取200μLYN1、YN15、YN30、YN60、YN90、YN144和YN150的病毒培养液于1.5mL无RNA酶的EP管中，加入1mL的TRIzol，剧烈振荡，室温于超净工作台中静置5min；再加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，使白色沉淀溶解，于冰上静置5min；12000rpm4℃离心10min；小心吸取上清液转移至另一新的1.5mL的EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，冰上静置10min；12000rpm4℃离心10min；小心弃去上清，缓缓的沿管壁加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤管壁，12000rpm4℃离心5min，弃去乙醇；室温干燥2-5min，加入适量的RNase-freeH₂O溶解沉淀，即为病毒总RNA，立即进行反转录或-80℃保存备用。病毒的全基因组测序，参照文献报道的方法(PanYF.,2012)，采用覆盖全长的12对引物扩增，结合末端测序方法，扩增的12条片段连接pMD-18T后，挑选阳性克隆送南京金斯瑞公司进行测定，所得序列通过MEGA5.05进行拼接，获得全序列，YN1、YN15、YN30、YN60、YN90和YN144已上传GenBank，GenBank的登录号分别为KT021227到KT021233，YN150的全基因组序列如序列附件。

结果显示和原始毒株YN1相比，后面的毒株有很多同意突变意义突变以及核苷酸的缺失。YN15和YN1相比基因的变异性最大，很可能是该阶段是病毒从体内增殖到体外传代的跨越式的进程的结果。与YN1相比YN15，YN30、YN60、YN90、YN144和YN150氨基酸的改变个数分别为15、20、22、25、33和36。YN150与YN1相比有36aa的改变，这其中在非结构开放阅读框ORF1a/b有8个氨基酸的改变，占总改变数目的22.2％，8/36，而该区域占整个基因组的72.6％。28aa在结构蛋白改变，占总改变数的77.8％，而该区域只占基因组的27.4％。在结构蛋白，S蛋白的突变数占总突变数的36.1％(13/36)。特别从YN30之后所有的毒株在S蛋白的144aa，145aa，和1197都有3个氨基酸的缺失。并且YN15以及之后的毒株都在ORF3基因有一个核苷酸的缺失，导致了该蛋白的在145aa的提前终止。ORF3蛋白在终止之前在138aa到145aa有8个aa的改变。各个基因的突变比率如表3所示。分析具体的氨基酸突变位点如图7所示。

表2不同代次变异毒株和原始毒株YN1在氨基酸水平上的差异

表3不同代次病毒和原始毒株YN1相比基因氨基酸的变化数目以及比率

*括号外面为氨基酸改变的数目，括号里面为氨基酸改变比率，其单位为％。

表4经典的和变异的临床野毒株以及相应的弱毒株的基因组变化特点对比

实施例7病毒弱毒苗的制备

一种变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150的弱毒疫苗，其特征包括，该疫苗含有权利要求1所述的变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150，使病毒的毒价达到10^6.0TCID₅₀)/mL，按照体积比，变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150与牛奶保护剂(牛奶保护剂配制方法：)比例为7：1。于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，确保没有杂菌污染，置于-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

实施例8病毒抗体检测技术IgG和IgAELISA方法的应用

待检材料的预处理，采集新鲜母猪乳汁，于4℃，10000rpm/min离心5min，弃去上层乳脂层，用灭菌枪头小心吸取中间层的乳清，注意不要将底部的乳汁沉淀部分吸出。乳清部分可以直接稀释用于抗体检测。待检样品长期放置需-80℃分装保存。

免疫荧光试验检测乳汁中的IgA抗体，将Vero细胞在75m²细胞瓶中培养，待长满单层后，使用15mLDMEM生长液(含10％的四季青新生牛血清)轻轻吹打，将吹散的细胞悬液加入DMEM生长液80mL，200μL/孔，加入96孔细胞板中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养。待细胞长成单层后，每孔接入200TCID₅₀PEDV病毒液，100μL/孔，再加入MEM细胞维持液100μL/孔，同时设两列不接毒的空白对照组。每隔6h观察细胞病变情况。待细胞刚出现病变时，弃去96孔细胞培养板中的DMEM维持液。用PBS液洗涤，200μL/孔，摇床摇动5min，甩干，重复3次。加入-20℃取出的冷乙醇，100μL/孔，然后放入-20℃冰箱，固定30min。洗涤同上，将96孔板自然晾干。分别将免疫母猪乳清及未免疫母猪乳清做1：10倍稀释，100μL/孔，加入96孔板，各做2孔重复；在37℃恒温箱孵育30min。用PBS溶液洗涤，200μL/孔，摇床摇动5min，甩干，重复3次。加入1：60倍稀释的FITC兔抗猪IgA荧光二抗，在37℃温箱孵育30min。洗涤同上；荧光显微镜下观察记录结果。

待检材料的预处理，采集新鲜母猪乳汁，于4℃，10000rpm/min离心5min，弃去上层乳脂层，用灭菌枪头小心吸取中间层的乳清，注意不要将底部的乳汁沉淀部分吸出。乳清部分可以直接稀释用于抗体检测。待检样品长期放置需-80℃分装保存。用于免疫荧光试验的96孔病毒细胞板制备过程同上面的检测IgA的实验。分别将免疫母猪血清和未免疫母猪血清做1：40倍稀释，100μL/孔加入96孔板，各做2孔重复；在37℃恒温箱孵育30min。用PBS溶液洗涤，200μL/孔，摇床放置5min，甩干，重复3次。加入1：60倍稀释的FITC兔抗猪IgG荧光二抗，在37℃温箱培养30min。洗涤同上；荧光显微镜下观察记录结果。

实施例9该制弱毒株初步临床保护效果观察

(1)疫苗安全性：

免疫10头后备母猪，剂量为2头份/头，观察免疫后是否发生腹泻。免疫10头育肥前期(80-90日龄)，剂量为1头份/头，观察免疫后是否发生腹泻。免疫10头产房仔猪(7日龄以内)，剂量为1头份/头，观察免疫后是否发生腹泻。产前3周免疫10头母猪，看是否有腹泻症状，以及窝产仔数和未免母猪的差别。发现所有猪只均未有腹泻症状，免疫母猪的窝产仔数和未免母猪一致。由此说明本发明制备的变异PEDV弱毒活疫苗是安全的。

(2)免疫保护试验：

本试验共分成6个组，分别为M1，M2，M3，F1，F2和S1，其中M1组为分娩前35d和15d肌注接种猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活苗(以下简称商品化灭活苗)，M2组为分娩前35d肌注接种商品化灭活苗，分娩前10d再口服接种实验室弱毒苗，M3组为分娩前25d和10d口服接种实验室弱毒苗，F1组免疫方式同M2组，F2位分娩前35d和10d分别肌注接种商品化灭活苗与实验室弱毒苗(F1、F2组仅统计仔猪断奶存活率)，S1组为分娩前35d肌注接种商品化灭活苗，分娩前5d再口服接种实验室弱毒苗。疫苗临床使用效果主要从该疫苗的安全性、有效性和使用该疫苗猪只的生产成绩3方面进行评估。

1)IgA检测结果

采集M1、M2、S1、M3怀孕母猪分娩后初乳样品实验室猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测。以检测到的S/P值作为衡量IgA水平的标准，设阴阳性对照且结果正常，所测样品S/P值≥0.148为阳性，抗体合格；S/P值＜0.148为阴性。经检测，所有样品均为阳性，对阳性样品取平均S/P值并误差分析(图7)后得出，M3组初乳样品中平均S/P值最高，为0.774，M1、M2相近，分别为0.623与0.626，但M2组误差(0.367)比M1组(0.468)小，S1组IgA平均S/P值最低，仅0.371(图8)。

2)IgG检测结果

采集M1、M2、S1、M3组怀孕母猪分娩后初乳样品实验室猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测。以检测到的OD值作为衡量IgG水平的标准，设阴阳性对照且结果正常，所测样品OD值≥0.433为阳性，抗体合格；OD值＜0.433为阴性。

经检测，所有样品均为阳性，对阳性样品去平均OD值并误差分析(图9)后得出，M1组初乳样品平均OD值最高，为2.099，但误差波动最大，为0.746。M3组平均OD值为2.002，比M1组稍低，但误差值为0.399，说明M3组所测各样品OD较M1更为平均，抗体水平更稳定；S1组平均OD值为1.915，误差值为0.249；M2组平均OD值为1.840，误差值为0.541。

3)中和实验检测结果

M1、M2组乳汁检测中和抗体平均效价对比(图10)显示，M1组中和效价平均水平为1:4.082，M2组中和抗体平均效价为1:187.821，较M1组显著增高。

4)生产成绩

F1、F2及M1组统计的仔猪断奶存活率如图11所示：

F1组仔猪断奶存活率最高，为92.4％，平均窝仔数为9.59头/窝；其次是F2组仔猪断奶存活率为88.8％，平均窝仔数为9.00头/窝；最低为M1组，仔猪断奶存活率为0.795，平均窝仔数为9.72头/窝。

本试验从窝仔数、存活率及腹泻情况3方面指标评价M1、M2、M3、S1组生产成绩，其中M1为统计分娩当天的生产成绩，M2、M3、S1均统计为分娩后5d的生产成绩。

统计分析各指标平均水平(图12)结果表明，综合窝仔数与存活率以平均每窝存活数指标可以看出最高为M1组，平均每窝存活数为10.698头(平均产仔数10.778头/窝×平均存活率99.3％)；其次为M2组，平均每窝存活数为9.402头(平均产仔数9.474头/窝×平均存活率99.2％)；第三为M3组，平均每窝存活数为9.343头(平均产仔数11.000头/窝×平均存活率84.9％)；最低为S1组，平均每窝存活数为1.816头(平均产仔数8.667头/窝×平均存活率21.0％)。根据临床统计，腹泻情况最严重为S1组，腹泻率为100％；其次为M1组，腹泻率为55.56％；第三是M3组，腹泻率为35.71％，腹泻情况最轻的是M2组，腹泻率为0％。

由以上临床试验统计数据可知，制备的变异PEDV毒株YN150弱毒冻干活疫苗不仅安全性较好，且具有较好的预防效果。单独使用和配合现有的经典毒株来源的活疫苗都能起到很好的预防效果。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种变异猪流行性腹泻病毒弱毒YN150株，其特征在于：所述YN150株是由毒株YN144在10μg/mL胰酶的条件下在Vero细胞上连续传6代得到的，其中，毒株YN144的保藏号为：CCTCCV201547，YN150株的全长序列如SEQIDNo.1所示。

2.利用YN150株制备变异猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)培养病毒YN150株的毒价达到10^6.0TCID50)/mL，

2)将变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150与牛奶保护剂按照体积比：6～9∶1混合；于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，确保没有杂菌污染，置于-20℃保存备用。

3.根据权利要求2所述利用YN150株制备变异猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗的方法，其特征在于，所述活疫苗中，变异猪流行性腹泻病毒弱毒株YN150株的含量小于10^6.0TCID₅₀/mL。

4.变异猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗在预防新型猪流行性腹泻中的应用。