CN110387354A

CN110387354A - 伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用

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Publication number: CN110387354A
Application number: CN201910759551.9A
Authority: CN
Inventors: 王继春; 陈赛赛; 郭容利; 乔永峰; 王志胜; 许梦微; 郑亚婷; 刘娅梅; 张传健; 吕家轩
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110387354B

Abstract

本发明提供伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用，属于动物医学的疫苗领域。该伪狂犬病病毒传代致弱毒株，是伪狂犬病病毒LA2017株，保藏编号为CGMCC No.18170。本发明还提供所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用以及以所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株为活性成分的疫苗。LA2017株是自然缺失弱毒株，毒力显著降低，接种初生仔猪无不良反应，由于该毒株是采用传代致弱方法获得，因此生物安全风险较低。LA2017株制备的疫苗，一次接种断奶易感仔猪后７天即能达到100%保护效果，免疫持续期可达5个月，该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，非常利于对伪狂犬病病毒变异株的净化。

Description

伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用

技术领域

本发明属于动物医学的疫苗领域，具体涉及伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用。

背景技术

伪狂犬病是一种多种动物均会发生的共患病，其病原为伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)。除猪之外的家畜(包括牛、羊等)、野生动物(包括狐狸和水貂等)和家养宠物(犬和猫等)等哺乳动物发生伪狂犬病时，常表现为奇痒和狂躁或抑郁等典型神经症状。猪是伪狂犬病病毒的贮存宿主，通常仔猪发病后死亡率高，而大猪一般不发生死亡，但可感染，并长期带毒和排毒，不同日龄猪发生伪狂犬病表现不同临床特征。母猪常发生流产；新生仔猪有神经症状，死亡率高；育肥猪主要是呼吸道症状，成年猪感染伪狂犬病毒后生长停滞，通常不发生死亡。疫苗免疫可以有效保护易感猪，但难于完全阻止感染，基因缺失疫苗(如gE基因缺失的Bartha K61株等)和与其配套的鉴别诊断技术可以区别出免疫动物和野毒感染动物，然后可能通过持续淘汰阳性种猪，实现伪狂犬病野毒的净化，由于这些疫苗和技术的推广应用，世界上许多国家实现了在家养猪群中伪狂犬病病毒的净化，在我国，1990年代以后，PRV的净化工作也取得了长足进展，许多规模化猪场逐步实现了PRV野毒的净化。

然而，自2011年以来，一种变异的PRV野毒株在我国许多猪场再次引起流行，该变异株的致病力较传统毒株显著增强，能对9周龄以上的猪引起100％死亡，原有疫苗虽然能提供一定保护，但其保护效力严重不足，不能阻止发病和排毒，研究表明其主要抗原基因gB、gC和gD均与传统疫苗株有明显变异，为更好防控PRV变异株对猪群的危害，应用变异株研制同源性疫苗是当前我国猪伪狂犬病防控的关键，研制变异株新型疫苗通常可以采用人工基因缺失或传代致弱等方法，人工基因缺失时，如果缺失基因较少，可能会存在较高的残余毒力，安全性不够高。例如，申请号为201510388390.9的发明专利中公开了通过人工缺失伪狂犬病病毒野毒AH02LA株gE基因后获得的LA-A株，仅对4周龄仔猪安全，但对初生仔猪致病力仍较强。人工基因缺失时，如果缺失基因较多，可能影响病毒的培养和免疫效力，而且人工基因缺失存在生物安全风险，须进行农业转基因生物安全评价，合格后方可应用。

发明内容

本发明的目的是提供伪狂犬病病毒传代致弱毒株，该毒株是在鸡胚成纤维细胞上传代后经克隆纯化而得的自然缺失弱毒株，毒力显著降低，接种初生仔猪无不良反应，由于该毒株是采用传代致弱方法获得，因此生物安全风险较低，是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。

本发明的另一目的是提供伪狂犬病病毒传代致弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用，采用该疫苗一次接种断奶易感仔猪后7天即能达到对伪狂犬病病毒变异株100％保护效果，免疫持续期可达5个月，该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，非常利于对伪狂犬病病毒变异株的净化。本疫苗株在安全性和免疫效力上都取得了非常好的技术效果。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

本发明提供伪狂犬病病毒传代致弱毒株，是伪狂犬病病毒LA2017株，保藏编号为CGMCC No.18170。

本发明还提供所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用以及以所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株为活性成分的疫苗。

优选的技术方案中，伪狂犬病病毒传代致弱毒株的病毒液采用如下方法制备：将伪狂犬病病毒LA2017株接种ST或CEF细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为伪狂犬病病毒LA2017株病毒液。

优选的技术方案中，所述疫苗为活疫苗。

本发明活疫苗，是以伪狂犬病病毒LA2017株为活性成分，疫苗内可以加入疫苗赋形剂和耐热保护剂等，本领域技术人员可以容易地进行生产。

本发明还提供一种重组载体活疫苗，其活性成分是在所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株基因组中插入了外源保护性抗原基因表达盒后得到的。伪狂犬病病毒传代致弱毒株可以作为载体构建载体活疫苗，启动子可以选择pMCMV IE、SV40和pHCMV IE等，外源基因的插入位点包括基因组的UL22与UL21之间、UL46与UL27之间、UL51与UL50之间、UL35与UL36之间、UL40与UL41之间、UL44与UL26.5之间和UL4与UL3.5之间的非编码区，插入的外源基因包括猪瘟病毒的E蛋白基因、猪圆环病毒的Cap蛋白基因、狂犬病病毒的G蛋白基因、口蹄疫病毒的VP1基因、猪流感病毒的HA基因和兔瘟病毒的VP60基因等。

申请人通过大量富有创造性的劳动，获得了一株伪狂犬病病毒变异株传代致弱的基因缺失毒株，即PRV LA2017株。LA2017株gC和gD基因与AH02LA株完全一致(gC基因GenBank:KR605320；gD基因GenBank:KR605321)，均与现公开变异毒株高度同源，LA2017株缺失了gI部分基因、gE全部基因、11K全部基因和28K部分基因，共缺少了3686bps碱基。本发明伪狂犬病病毒LA2017株是将PRV AH02LA株经鸡胚成纤维细胞连续传代，发生自然缺失后病毒毒力显著下降，然后经克隆筛选而得，没有人工缺失株可能存在的转基因生物安全风险。LA2017株免疫仔猪通过对PRV gE和gB抗体进行监测，可以区分免疫该疫苗的动物与野毒感染动物，非常有利于对PRV变异株的净化。伪狂犬病病毒LA2017株能够很好地适应ST和CEF细胞，生长滴度高达10^8.00TCID₅₀/mL以上。伪狂犬病病毒LA2017株的活疫苗对初生仔猪100％安全，可用于初生仔猪的早期免疫，尽早阻断野毒的感染。接种断奶PRV阴性仔猪后能快速产生高效保护力，对伪狂犬病病毒变异株100％保护，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒。接种一次，免疫持续期(PRV中和抗体10000(中和指数))可达5个月。该弱毒株安全性好，增殖性能佳，免疫后抗体水平高，免疫持续期长。将LA2017株用作活载体表达其他病原的保护性抗原，还能达到接种一针防两种或多种疫病的效果。

附图说明

图1、以PRV LA2017株F1代PCR鉴定图，采用△S F/R引物对，所得PCR扩增产物的电泳图。其中，M：DL15000DNA Marker，阴为阴性对照，1中样品为以PRV LA2017株F1代DNA为模板所得缺失位点，2是以AH02LA株DNA为模板所得缺失位点等位位点。

图2、PRV LA2017株缺失位点的示意图，(A)表示PRV AH02LA株的部分基因结构示意图，(C)为PRV LA2017株部分基因结构示意图。

图3、PRV LA2017株F18和F35代PCR鉴定图。M：DL15000 DNA Marker，阴为阴性对照，1中样品是以LA2017株F18代DNA为模板扩增所得缺失位点，2中样品是以LA2017株F35代DNA为模板扩增所得缺失位点。

图4、PRV LA2017株感染CEF细胞后的病毒生长曲线。

图5、PRV LA2017株感染ST细胞后的病毒生长曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明的范围和精神并不限于所列实施例。

实施例一、伪狂犬病病毒传代自然弱毒株的获得与鉴定

1、伪狂犬病病毒PRV AH02LA株的盲传

采用9～10日龄SPF鸡胚制备原代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryofibroblasts，CEF)，在含10％初生牛血清的DMEM培养液(Gibco)中37℃培养24～48小时，待细胞长成单层后备用。用于传代的病毒为伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)AH02LA株，该毒株为强毒株且与我国2011年以来流行的PRV变异株高度同源，该毒株已交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC NO.10891，保藏日期为2015年06月16日。

取PRV AH02LA株F6代病毒液0.1mL接种于六孔板CEF细胞中的1孔，吸附1小时后，吸去病毒液，应用无菌PBS缓冲液将细胞表面洗涤3次后，吸去PBS缓冲液，加入含10％初生牛血清的DMEM培养液，在37℃培养24～48小时，取细胞培养物上清，即得F7代病毒液。按照如上方法取F7代病毒液0.1mL接种于新鲜CEF，直至盲传到F185代，每10～20代取病毒样品冻存于-70℃备用。

2、PRV AH02LA株盲传致弱株的获得与鉴定

应用PRV AH02LA株盲后所得的F20代、F51代、F110代、F151代和F185代，其病毒含量分别为10^8.25TCID₅₀/mL、10^8.00TCID₅₀/mL、10^7.875TCID₅₀/mL、10^8.00TCID₅₀/mL和10^8.00TCID₅₀/mL，分别以0.5×10^6.50TCID₅₀/mL剂量滴鼻接种28～35日龄PRV阴性断奶仔猪(PRRSV抗原和抗体也为阴性)各5头，每头2mL，接种后每日检测试验猪体温，观察精神、饮食和临床情况，至接种后14日。并检测接种前和接种后的PRV gE和gB的ELISA抗体。

结果表明，PRV AH02LA株F20代、F51代和F110代接种猪均出现体温明显升高，部分猪出现打喷嚏、精神不振、食欲减退或废绝、呼吸困难、转圈或卧地四肢划水状等，甚至发生死亡，接种后14日PRV gE和gB的ELISA抗体均为阳性。PRV AH02LA株F151代和F185代接种猪体温均未超过39.5℃，饮食和精神均正常，未出现任何猪伪狂犬病症状，接种后14日PRV gB的ELISA抗体均为阳性，而PRV gE的ELISA抗体均为阴性。具体结果见表1。因此，可以看到，PRV AH02LA株F151代和F185代为致弱毒株。

表1 PRV AH02LA株盲传后不同代次毒株的安全性

应用PRV AH02LA株的F151代和F185代，其病毒含量分别为10^7.875TCID₅₀/mL和10^8.00TCID₅₀/mL，分别以0.5×10^6.00TCID₅₀/mL颈部肌肉注射接种28～35日龄PRV阴性断奶仔猪(PRRSV抗原和抗体也为阴性)各5头，每头2mL。接种后21日，与对照组同时应用PRVAH02LA株进行攻毒，攻毒剂量为10^6.50TCID₅₀/mL，滴鼻接种，每头2mL。其中，攻毒对照组，是仅采用相同方法攻毒，空白对照组不免疫不攻毒。攻毒后每日检测试验猪体温，观察精神、饮食和临床情况，至攻毒后14日。并检测攻毒前和攻毒后14日的PRV gE和gB的ELISA抗体。

结果表明，攻毒后攻毒对照组出现体温升高至41.5℃以上，5头均出现打喷嚏、精神不振、食欲减退或废绝、呼吸困难、转圈或卧地四肢划水状等症状，3头死亡，攻毒前PRVgB和gE的ELISA抗体均为阴性，攻毒后14日存活猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阳性。PRVAH02LA株F151代和F185代接种试验猪攻毒后体温均未超过40.0℃，饮食和精神均正常，未出现任何猪伪狂犬病症状，攻毒前PRV gB的ELISA抗体均为阳性，而PRV gE的ELISA抗体均为阴性，攻毒后14日PRV gB和gE的ELISA抗体均为阳性。具体结果见表2。

表2 PRV AH02LA株F151代和F185代免疫后的攻毒保护

将获得的PRV AH02LA株F151代稀释至20～50TCID₅₀/0.1mL，接种于六孔板CEF细胞中的1孔，吸附1小时后，吸去病毒液，应用无菌PBS缓冲液将细胞表面洗涤3次后，吸去PBS缓冲液，加入含0.5％(W/V)甲基纤维素和10％初生牛血清的DMEM培养液，在37℃培养24～48小时，挑取单个病毒蚀斑，接种于新鲜的CEF，吸附1小时后，再经洗涤后加入含0.5％甲基纤维素(W/V)和10％初生牛血清的DMEM培养液，继续培养。采用如上方法，经过三轮挑斑克隆纯化后，获得一株病毒(种毒)命名为伪狂犬病病毒LA2017株，即PRV LA2017株，分类命名为猪疱疹病毒1型。

PRV LA2017株的保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

参椐的生物材料(株)：LA2017。

分类命名：猪疱疹病毒1型。

保藏号：CGMCC No.18170。

保藏日期：2019年07月12日。

3、PRV LA2017株的序列测定

将PRV LA2017株F1代(将伪狂犬病病毒LA2017株种毒传一代后所得病毒)接种到长成单层的CEF细胞培养24～48小时，待细胞病变达75％左右时提取病毒DNA为模板，分别应用表3中的3对引物进行PCR，扩增gC基因、gD基因和缺失位点。

表3扩增PRV gC、gD基因和缺失位点的PCR引物

PCR反应体系(表4)中的LA Taq DNA聚合酶、2×GC Buffer II购自Takara公司。将反应体系混匀，进行PCR扩增，反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸合适时间(根据目的条带大小按聚合酶说明书设定)，30个循环；72℃延伸10min。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否有特异性条带并将其切下，采用DNA凝胶回收试剂盒回收，将回收产物送华大基因公司测序。

表4 25μl PCR反应体系

样品	体积
		LA Taq DNA聚合酶	0.25μl
2×GC Buffer II	12.5μl
		dNTPs(2.5mM)	4μl
上游引物	1μl
		下游引物	1μl
模板DNA	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	5.25μl

结果显示，以PRV LA2017株DNA为模板，以gC F/R引物对扩增获得了3700～4000bp的特异性片段，测序结果表明其gC基因序列与AH02LA株完全一致；以gD F/R引物对扩增获得了1300～1600bp的特异性片段，测序结果表明其gD基因序列与AH02LA株完全一致。以△SF/R引物对扩增获得了2000～2300bp的特异性片段(图1)，测序结果表明该毒株相对于AH02LA株来说，缺失了从gI基因第118位核苷酸至28K基因第251位核苷酸，共缺失了3686bps碱基，包括gI部分基因、gE全部基因、11K全部基因和28K部分基因(图2)。

4、伪狂犬病病毒PRV LA2017株的稳定性

将PRV LA2017株种毒接种CEF继续传代，从F1代传至F35代，分别提取F18和F35代病毒的DNA为模板，分别以gC F/R引物对、gD F/R引物对和△S F/R引物对进行PCR，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否有特异性条带并将其切下，采用DNA凝胶回收试剂盒回收，将回收产物送华大基因公司测序。

结果显示，PRV LA2017株F18代和F35代病毒的gC和gD基因与PRV LA2017株F1代完全一致，基因缺失的位点也与PRV LA2017株F1代完全一致(图3)，表明PRV LA2017株种毒传代35代以内稳定。

本发明中“Fn代”，表示将种毒向后传n代所得病毒。

实施例二、PRV LA2017株的生长特性鉴定

将PRV LA2017株F1、F18和F35代，分别以MOI为0.004接种至长满单层CEF的六孔板，置5％CO₂恒温培养箱中37℃孵育1h后，吸去上清液，应用PBS缓冲液洗涤3次后，换成细胞维持液，每孔2mL，置5％CO₂恒温培养箱中37℃进行培养，分别于接种后0h、6h、12h、24h、36h、48h和72h测定培养物中病毒的含量。设PRV AH02LA株F5代为对照，相同方法培养并采用相同方法检测。重复3次。其中细胞维持液是含3％(体积百分浓度)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Gibco)。

另外，考察PRV LA2017株F1、F18和F35代在ST细胞上的生长特性。培养方法及检测方法同本实施例中第一段。

细胞培养物中病毒含量检测是按照以下方法进行操作的：将样品经-70℃与37℃反复冻融3次后取0.5～1ml，以500×g离心5min去除细胞碎片，取100μl上清液，加入900μlDMEM培养基中混匀，再从中吸取100μl，加入900μl DMEM培养基中，重复以上步骤至10^-10，即作10～10¹⁰倍比稀释。将各病毒稀释液接种于预先铺满的单层CEF或ST细胞的96孔细胞板(样品培养时采用的细胞与检测时采用的细胞保持一致)中，每个稀释度作4～8个重复，37℃孵育2h，弃掉病毒液，每孔加入100μl的细胞维持液(含3％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Gibco))。12h后开始观察细胞病变情况，连续观察3天，按照Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀，统计所有时间点病毒液的病毒滴度，绘制生长曲线。

从病毒的体外生长曲线可以看出，PRV LA2017株在CEF细胞或ST上F1、F18和F35代具有相似的生长动力学(CEF：图4；ST：图5)，在接种后24h～48h都达到峰值，在ST细胞上滴度最高可达到10^9.0TCID₅₀/mL以上，在CEF上滴度达到10^8.0TCID₅₀/mL以上，均能满足活疫苗生产的要求。

实施例三、PRV LA2017株对初生仔猪和妊娠母猪的安全性

1、试验材料

1.1病毒

PRV LA2017株F1代批次20170622，病毒滴度10^8.5TCID₅₀/mL。

PRV LA2017株F1代采用如下方法制备：将伪狂犬病病毒LA2017株种毒接种CEF细胞，采用含3％(体积百分浓度)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在5％CO₂恒温培养箱中37℃培养36小时，收获病毒培养物，反复冻融后离心，取上清液即得到PRV LA2017株F1代病毒液。

1.2诊断试剂盒

PRV gE抗体诊断试剂盒、PRV gB抗体诊断试剂盒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)抗体诊断试剂盒和猪瘟病毒(CSFV)抗体诊断试剂盒，来自北京爱德士元亨生物科技有限公司(IDEXX)公司。

2、试验动物

试验仔猪为4日龄健康仔猪20头，其PRV gB抗体和PRRSV与CSFV抗体均为阴性。接种前核实猪只的吃奶、精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过仔猪耳标进行标识。与哺乳母猪共同在隔离环境中饲养。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。

试验妊娠母猪8头，分娩前30日，其PRV gB抗体和PRRSV与CSFV抗体均为阴性。接种前核实猪只精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过耳标进行标识。在隔离环境中饲养。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。

3、分组

4日龄试验仔猪，随机分成4组，每组5头，其中3组为试验组，1组为对照组，进行PRVLA2017株滴鼻接种的安全性试验，见表5。

产前30日母猪8头，随机分成2组，试验组5头，对照组3头，见表6。

4、试验方法

4.1 4日龄仔猪接种方法及临床观察

将PRV LA2017株F1代应用DMEM培养基稀释至10^7.0TCID₅₀/mL、10^6.0TCID₅₀/mL和10^5.0TCID₅₀/mL，分别滴鼻接种一组4日龄仔猪(4头)，接种量为1mL/头，空白对照组(D组)不接种作为对照，具体见表5。自接种日至接种后14天，每日测量试验仔猪的体温，观察饮食和精神状况以及临床症状。采集接种前和接种后14日血清，检测PRV gB和gE的ELISA抗体。

表5 PRV LA2017株对初生仔猪的安全性试验分组与处理

4.2妊娠母猪的接种方法及临床观察

将PRV LA2017株F1代应用DMEM培养基稀释至0.5×10^7.0TCID₅₀/mL，颈部肌肉注射接种试验组5头猪，接种量为2mL/头，空白对照组(B组)不接种作为对照，具体见表6。自接种日至产后28日，每日观察饮食和精神状况以及是否发生流产等异常情况，分娩时观察是否有死胎等，统计产仔数和断奶活仔数等。

表6 PRV LA2017株对妊娠母猪的安全性试验分组与处理

组别	接种量	动物数量	接种方法
				A组	10<sup>7.0</sup>TCID<sub>50</sub>	5	肌肉注射
B组	/	5	/

5、试验结果

5.1 4日龄仔猪安全性试验结果

A组、B组和C组仔猪接种前PRV gB和gE抗体均为阴性，接种后所有仔猪均健活，未见发病或死亡，未见体温异常。接种后14日，A组、B组和C组试验猪的PRV gE抗体为阴性，而PRV gB抗体全部为阳性，表明试验猪接种有效；D组PRV gE抗体亦全部为阴性，但5头中有4头的PRV gB抗体转为阳性，表明滴鼻接种初生仔猪会引起同群感染(表7)。上述结果表明了PRV LA2017株对4日龄初生仔猪具有良好的安全性。

表7 PRV LA2017株对初生仔猪的安全性试验结果

注：表中gB+、gE+分别表示gB抗体阳性、gE抗体阳性，下同。

5.2妊娠母猪安全性试验结果

试验组5头妊娠母猪在接种PRV LA2017株F1代后未见任何临床症状，未发生流产或产死胎现象，均正常生产，产仔数8～12头，断奶成活率100％；对照组3头未见任何异常，产仔数10～12头，断奶成活率97％(表8)。表明PRV LA2017株对妊娠母猪安全性好。

表8 PRV LA2017株对妊娠母猪的安全性试验结果

实施例四、PRV LA2017株接种仔猪后的排毒和同群传播研究

1、试验材料

1.1病毒

PRV LA2017株F1代，批次20170622，病毒滴度10^8.5TCID₅₀/mL。

1.2诊断试剂盒

2、试验动物

试验仔猪为28～35日龄健康仔猪10头，其PRVgB抗体和PRRSV与CSFV抗体均为阴性。接种前核实猪只的精神状况、饮食情况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过仔猪耳标进行标识。在隔离环境中混群饲养。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。

3、分组

随机分成2组，每组5头，其中1组接种疫苗，检测鼻拭子和肛拭子的排毒情况；另1组(空白对照组)不接种疫苗，观察是否引起同群感染。

4、试验方法

将PRV LA2017株F1代应用DMEM培养基稀释至0.5×10^6.0TCID₅₀/mL，肌肉注射接种试验组仔猪(5头)，接种量为2mL/头，空白对照组不接种作为对照，两组10头猪饲养于同一笼中，具体见表9。自接种日至接种后14天，所有试验猪每日采集鼻拭子和肛拭子，检测排毒情况。接种前和接种后14日检测试验组和对照组所有试验猪血清的PRV gB和gE的ELISA抗体。

5、结果

A组试验猪在接种后14日均未从鼻拭子和肛拭子检出排毒，B组亦未检出。接种前A组所有试验猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性，接种后14日，PRV gE抗体仍全部为阴性，而PRV gB抗体全部转为阳性；B组所有试验猪在接种前和A组接种后14日PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性(表9)。表明PRV LA2017株肌肉注射接种断奶阴性仔猪不发生排毒，无横向传播，不引起同群感染。

表9 PRV LA2017株接种仔猪后的排毒和同群传播的分组与结果

实施例五、PRV LA2017株的免疫效力研究

1、试验材料

1.1病毒与伪狂犬病活疫苗

PRV LA2017株F1代，批次20170622，病毒滴度10^8.5TCID₅₀/mL。

伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)，批次20170122，病毒滴度10^8.0TCID₅₀/mL。

PRV AH02LA株F6代，批次为20160709，病毒含量为10^7.5TCID₅₀/mL，用于攻毒试验和中和抗体检测，对45日龄PRV阴性猪的LD₅₀为10^6.5TCID₅₀。

1.2诊断试剂盒

2、试验动物

28～35日龄健康仔猪50头，其PRV抗原和PRV gE与gB抗体均为阴性，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)抗体均为阴性。接种前核实猪只的饮食、精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过耳标号码进行标识。在隔离环境中按组分笼饲养。饲料为全价配合饲料(市售产品)，饮水为自来水，每日上午和下午各饲喂一次。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。

3、分组

试验动物一次引入，随机分为10组，每组5头，具体见表10。

4、试验方法和研究的指标

4.1试验方法

4.1.1免疫：将PRV LA2017株F1代病毒液和伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)应用无菌DMEM培养液稀释至0.5×10^6.0TCID₅₀/mL，肌肉注射，2mL/头，A-7、A-14和A-21组分别接种PRV LA2017株病毒液，B7、B-14、B-21组接种伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)，C-7、C-14和C-21组每头肌注2mL DMEM液为攻毒对照，D组不处理为空白对照(表10)。

表10动物免疫攻毒试验分组

4.1.2攻毒：A-7、B-7和C-7组试验猪于接种后7日攻毒，A-14、B-14和C-14组试验猪于接种后14日攻毒，A-21、B-21和C-21组试验猪于接种后21日攻毒，每头攻毒均应用2mL的PRV AH02LA株病毒液，以2LD₅₀/头滴鼻攻毒，攻毒后观察14日。D组为空白对照组，不攻毒。

4.1.3血清gB和gE抗体检测：免疫前、攻毒前和攻毒结束时(即攻毒后14日)采取所有猪只血清样品，应用试剂盒检测PRV gE和gB抗体。

4.1.4中和抗体检测：免疫前和攻毒前采集试验猪血清样品，检测PRV中和抗体(中和指数)。操作步骤如下：

1)在96孔板上制备ST细胞，ST细胞生长24～48小时，待其长满单层，备用。

2)将待检血清样品于56℃热水浴加热30分钟。

3)将PRV AH02LA株病毒原液作10倍系列稀释至10^-8，分装到无菌EP管中，每管120μl。

4)在各稀释度病毒液中分别加入120μl已灭能的血清，混合后在37℃条件下作用1小时。

5)取制备好的96孔板ST细胞，吸去上清，从第1列孔至第8列孔将每个稀释度组的血清与病毒混合物接种4个细胞孔，每孔接种50μl，然后每孔加入50μl含2％新生牛血清的DMEM培养基，37℃继续培养5日，观察记录每个稀释度组的CPE数，按Reed&Muench法计算TCID₅₀，作为待检组TCID₅₀。设仅加入等量待检血清与DMEM混合物的细胞孔作为待检血清对照。

6)取PRV阴性的正常对照血清按上述相同方法测定TCID₅₀，作为对照组TCID₅₀。

7)计算求得待检血清样品的中和指数，计算公式如下：

中和指数＝待检组TCID₅₀/对照组TCID₅₀。

4.1.5临床症状观察：所有试验猪在攻毒后每日观察精神、饮食状况和各种呼吸系统、神经系统和全身性临床表现，至攻毒后14日。

4.1.6体温测量：从攻毒前开始，至试验结束(攻毒后14日)，所有猪只每天测量体温一次(直肠温度)。

4.1.7排毒情况检测：攻毒前、攻毒后至试验结束(攻毒后14日)，每天采集猪只鼻拭子样品，样品置-70℃保存，检测时倍比稀释后接种BHK-21细胞观察病变以确定是否排出病毒。

4.2研究的指标

发病率、死亡率、体温升高情况、排毒情况、血清抗体中和指数和gB与gE抗体阳转情况。

5、试验结果

接种前所有试验猪的PRV gB和gE抗体均为阴性，空白对照猪(D组)至试验结束时的PRV gB和gE抗体均为阴性。接种后7日、14日或21日各免疫组的所有试验猪的PRV gB抗体均为阳性，gE抗体均为阴性，攻毒对照组PRV gB和gE抗体均为阴性，攻毒后所有免疫组猪和攻毒对照组存活猪的PRV gB和gE抗体均为阳性(表11)。

表11免疫攻毒试验猪血清抗体阳转情况统计表

PRV LA2017株和PRV Bartha K61株接种后7日，中和抗体均达到100～1000；接种后14日，PRV LA2017株免疫组(A组)大幅上升至17782～100000，而PRV Bartha K61株免疫组(B组)未出现明显上升，仍维持在100～1000；接种后21日，PRV LA2017株免疫组(A组)保持较高水平，在31623～100000，而PRV Bartha K61株免疫组(B组)仍维持在100～1000(表12)。

表12试验猪免疫后7日、14日和21日PRV中和抗体

试验期间，空白对照组猪只无发病死亡，无体温升高，未检出排毒；C-7、C-14和C-21攻毒对照组试验猪从攻毒后第2天开始全部出现减食、精神沉郁、打喷嚏、流鼻涕、转圈、呆立和呼吸困难等症状，体温均升高到40.5℃以上，均从鼻拭子样品中检出排毒，在攻毒后第3～7天陆续死亡，每组死亡2头；表明试验对照成立(表13)。A-7、A-14和A-21组所有试验猪攻毒后均无临床症状，无体温升高，A-7和A-14均未检出排毒，A-21组的5头猪中仅1头检出排毒，表明PRV LA2017株能对PRV变异株产生坚强保护；B-7组试验猪攻毒后无发病，无死亡，但有4头猪出现体温升高，且5头猪鼻拭子样品均检出排毒；B-14组试验猪攻毒后有1头发病，无死亡，5头猪均出现体温升高，且鼻拭子样品均检出排毒；B-21组试验猪攻毒后5头均发病，未发生死亡，5头猪均出现体温升高，且鼻拭子样品均检出排毒，表明PRV BarthaK61株对变异株虽然能产生一定保护，但保护效力下降，持续期短(表13)。

表13试验猪攻毒后临床情况和排毒情况统计表

综上所述，PRV LA2017株免疫猪后7日能产生对PRV野毒株AH02LA株的完全保护，但此时中和抗体效价不高，可能是细胞免疫发挥了重要作用，免疫猪后14日即产生高水平中和抗体，且仍对PRV野毒株AH02LA株完全保护，而PRV BarthaK61株接种后7日对PRV野毒株AH02LA株产生完全的临床保护，可能是细胞免疫发挥重要作用所致，而免后14日和21日对PRV野毒株AH02LA株的保护显著下降，且PRV Bartha K61株无法阻止排毒，对变异株的净化比较不利，因此，LA2017株作为疫苗株对变异株的保护效果显著优于Bartha K61株。

实施例六、PRV LA2017株免疫后中和抗体持续期测定

1、试验材料

1.1病毒与伪狂犬病活疫苗

PRV LA2017株F1代，批次20170622，病毒滴度10^8.5TCID₅₀/mL。

PRV AH02LA株F6代，批次为20160709，病毒含量为10^7.5TCID₅₀/mL，用于中和抗体检测。

1.2诊断试剂盒

2、试验动物

28～35日龄健康仔猪10头，其PRV抗原和PRV gE与gB抗体均为阴性，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)抗体均为阴性。接种前核实猪只的饮食、精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过耳标号码和笼号与圈号进行标识。在隔离环境中分笼饲养。饲料为全价配合饲料(市售产品)，饮水为自来水，每日上午和下午各饲喂一次。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。

3、分组

试验动物一次引入，随机分为A组和B组，每组5头，具体见表14。

4、试验方法和研究的指标

(1)试验方法

免疫：将PRV LA2017株病毒液和伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)应用无菌DMEM培养液稀释至0.5×10^6.0TCID₅₀/mL，肌肉注射，2mL/头，A组接种PRVLA2017株病毒液，B组接种伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)，具体见表14。

表14动物免疫攻毒试验分组

血清gB和gE抗体检测：免疫前、免疫后1、2、3、4、5、6个月采取所有猪只血清样品，应用试剂盒检测PRV gE和gB抗体。

中和指数检测：免疫前、免疫后1、2、3、4、5、6个月采取所有猪只血清样品，检测PRV中和抗体(中和指数，同实施例五)。

(2)研究的指标

血清抗体阳转情况和PRV中和抗体(中和指数)。

5、试验结果

接种前所有试验猪的PRV gB和gE抗体均为阴性，免疫后1、2、3、4、5和6个月所有试验猪的PRV gE抗体均为阴性，gB抗体均为阳性(见表15)。

表15试验猪血清PRV gB和gE抗体

免疫前所有试验猪的PRV中和抗体(中和指数)为1～10，没有PRV特异性抗体，A组5头猪免疫后1个月时，PRV中和抗体(中和指数)均达到10000或以上，且维持至免疫后5个月，免疫后第6个月仍有2头猪的PRV中和抗体(中和指数)均达到10000。而B组5头猪免后1个月至3个月针对PRV变异株的中和指数仅为178～1000，且4个月开始下降(表16)。

表16试验猪血清PRV中和抗体(中和指数)

Claims

1.伪狂犬病病毒传代致弱毒株，是伪狂犬病病毒LA2017株，保藏编号为CGMCCNo.18170。

2.权利要求1所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。

3.以权利要求1所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株为活性成分的疫苗。

4.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于伪狂犬病病毒传代致弱毒株的病毒液采用如下方法制备：将伪狂犬病病毒LA2017株接种ST或CEF细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为伪狂犬病病毒LA2017株病毒液。

5.根据权利要求4所述疫苗，其特征在于所述疫苗为活疫苗。

6.一种重组载体活疫苗，其特征在于其活性成分是在权利要求1所述伪狂犬病病毒传代致弱毒株基因组中插入了外源保护性抗原基因表达盒后得到的。