CN105087506A - 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 - Google Patents

一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，该方法能够对猪伪狂犬病病毒进行有效地、可重现性地致弱，经该方法致弱的猪伪狂犬病病毒弱毒株，能够对猪只提供有效免疫。

Description

一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
技术领域
本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、致弱的病毒株及利用该病毒株制备的疫苗组合物，属于兽用生物制品领域。
背景技术
伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suidherpesvirus1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。
最近的研究报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间(参见猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.彭金美等.中国预防兽医学报，2013，35(1)：1-4；免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.童武等.中国动物传染病学报，2013,21(3):1-7；PathogenicPseudorabiesVirus,China,2012.Yuetal.,EmerginginfectiousDiseases.2014,20(1):102-104；PseudorabiesvirusvariantinBartha-K61-vaccinatedpigs,China,Anetal.,EmerginginfectiousDiseases.2013.19(11)：1749-1755，现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
预防和控制猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病有效的方法是疫苗接种，开发商品化的疫苗可以是灭活疫苗，也可以是弱毒株制备的活疫苗。然而，灭活疫苗成本较高，活疫苗一般是通过基因工程手段人工缺失毒力基因致弱毒株来制备的，存在生物安全风险。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过细胞传代方式，自然致弱毒株，使其完全在自然进化过程中发生变异，达到完全适应自然环境条件，以保证该致弱毒株的稳定性，不存在生物安全方面的风险。
本发明的第一方面在于一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：(1)所述猪伪狂犬病病毒的适应培养步骤，将猪伪狂犬病病毒接种到哺乳动物传代细胞中，进行传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代5代以上，得到猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株；以及(2)所述猪伪狂犬病病毒的致弱步骤，将所述步骤(1)的所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株接种到禽源传代细胞中，进行传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代1代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(1)中的猪伪狂犬病病毒包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRVTJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株。
猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于PathogenicPseudorabiesVirus,XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.China,2012EmergingInfectiousDiseases，www.cdc.gov/eidol.20,No.1,January2014；PRVTJstrain(PRVTJ)株，公开于ChinaChun-HuaWangJinYuan1,Hua-YangQin1，etal，AnovelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotectionfromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61-vaccinatedswinepopulationinChinaVaccine32(2014)3379–3385中；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170公开于CN103627678A；猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏号为CCTCCNO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日；猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏号为CCTCCNO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日；猪伪狂犬病病毒Fa株公开于伪狂犬病毒Fa株gB_gC_gD基因的克隆与序列分析[J].陈振海等，福建农业学报2007，22(2)：120-125。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(1)所述的猪伪狂犬病病毒株为HN1201株、HN1202株、Fa株、PRV-ZJ01株、HeN1株、JS-2012株。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(1)中的所述哺乳动物传代细胞包括猪睾丸传代细胞ST，猪肾传代细胞PK15或IBRS-2、兔肾传代细胞RK、非洲绿猴肾传代细胞vero、猴胚胎肾上皮传代细胞Marc-145、牛睾丸传代细胞BT或乳仓鼠肾传代细胞BHK-21；所述步骤(2)中所述的禽源传代细胞为DF-1。
所述的哺乳动物传代细胞为猪睾丸传代细胞ST(ATCC编号：CRL-1746)，猪肾传代细胞PK15(ATCC编号：CCL-33)或IBRS-2(见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture：susceptibilityoftheIB-RS-2swinecellline.ArquivosInstitutoBiologica31：63-78)，兔肾传代细胞RK(ATCC编号：CCL-106)，非洲绿猴肾传代细胞vero(ATCC编号：CCL-81)，猴胚胎肾上皮传代细胞Marc-145(ATCC编号：CRL-12219)，牛肾传代细胞MDBK(ATCC编号：CCL-22)，牛睾丸传代细胞BT(ATCC编号：CRL-1390)，乳仓鼠肾传代细胞BHK-21(ATCC编号：CCL-10)。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(1)所述的哺乳动物传代细胞为猪睾丸传代细胞ST，猪肾传代细胞PK15或猴胚胎肾上皮传代细胞Marc-145；优选地，步骤(2)所述的禽源传代细胞为DF-1(ATCC编号：CRL-12203)。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(1)的猪伪狂犬病病毒的适应培养步骤包括：
所述哺乳动物传代细胞经胰酶进行细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；以及将所述猪伪狂犬病病毒接种至所述的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液作为继续传代用毒种，进行下一步的传代，所述传代传至5代以上，得到猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株。
优选地，步骤(1)猪伪狂犬病病毒在哺乳动物传代细胞进行传代的代数≥5代。
优选地，步骤(1)猪伪狂犬病病毒在哺乳动物传代细胞进行传代的代数为≥18代。
优选地，步骤(1)还包括如下步骤：
(1a)接毒用细胞的传代与培养：所述传代细胞经胰酶细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；
(1b)病毒的繁殖：将所述猪伪狂犬病病毒接种至所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液作为继续传代用毒种。
优选的，步骤(1a)、(1b)中的细胞培养所用的温度为36℃～38℃。
优选的，步骤(1b)中猪伪狂犬病病毒接种时的接种量为1％～2％体积百分比的猪伪狂犬病病毒的维持液。
优选的，步骤(1a)中的细胞生长液含90％～97％体积百分比的细胞培养液和3％～10％体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～8.0。
优选的，步骤(1b)中的细胞维持液含95％～99％体积百分比的细胞培养液和1％～5％体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.1～7.5。
其中所述的适合培养易增殖猪伪狂犬病病毒的传代细胞的细胞培养液包括但不限于选自MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和α-MEM培养液中的任意一种，所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，其中，所述步骤(2)的所述猪伪狂犬病病毒的致弱步骤包括：
所述禽源传代细胞经胰酶进行细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；以及将所述步骤(1)得到的所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株接种至所述的禽源传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，收获细胞培养病毒液，即为猪伪狂犬病病毒弱毒株；或将所述收获的病毒液进行下一步的传代，所述传代传至1代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
优选地，步骤(2)猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数≥1代。
优选地，步骤(2)猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数≥3代。
优选地，步骤(2)猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株继续在禽源传代细胞进行传代的代数为3～110代。
优选地，步骤(2)还包括如下步骤：
(2a)接毒用细胞的传代与培养：所述传代细胞经胰酶细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；
(2b)病毒的繁殖：将所述步骤(1)得到的猪伪狂犬病病毒接种至所述步骤(2a)中得到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，收获细胞培养病毒液即为猪伪狂犬病病毒弱毒株。
优选的，步骤(2a)、(2b)中的细胞培养所用的温度为36℃～38℃。
优选的，步骤(2b)中猪伪狂犬病病毒接种时的接种量为1％～2％体积百分比的猪伪狂犬病病毒的维持液。
优选的，步骤(2a)中的细胞生长液含90％～97％体积百分比的细胞培养液和3％～10％体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～8.0。
优选的，步骤(2b)中的细胞维持液含95％～99％体积百分比的细胞培养液和1％～5％体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.1～7.5。
其中所述的适合培养易增殖猪伪狂犬病毒的禽源传代细胞的细胞培养液包括但不限于选自MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和α-MEM培养液中的任意一种，所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(1)中所述猪伪狂犬病病毒株在哺乳动物细胞上传代培养代数为≥18代；所述步骤(2)中所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数为≥3代，
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(1)中所述猪伪狂犬病病毒株在哺乳动物细胞上传代培养代数为≥18代，所述步骤(2)中所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数为3～110代。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述细胞生长液含90％～97％体积百分比的细胞培养液和3％～10％体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～8.0；所述细胞维持液含95％～99％体积百分比的细胞培养液和1％～5％体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.1～7.5；所述细胞培养液包括MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和α-MEM培养液，所述的牛血清包括胎牛血清、新生牛血清或小牛血清；所述细胞培养所用的温度为36℃～38℃。
作为本发明的一种最优选实施方式，所述的细胞培养液为DMEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清；所述细胞培养所用的温度为36℃～38℃。
本发明的另一方面在于提供所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法致弱的猪伪狂犬病病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株不能不能表达gI、gE、11K和28K蛋白。
优选地，步骤(2)得到猪伪狂犬病病毒弱毒株与亲本强毒株相比，病毒基因不能表达gI、gE、11K和28K四个蛋白。
优选地，步骤(2)得到猪伪狂犬病病毒弱毒株与亲本强毒株相比，病毒基因缺失gI/gE/11K/28K基因。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株基因从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp缺失。
优选地，所述猪伪狂犬病病毒株为伪狂犬变异株，包括猪伪狂犬病病毒HN1201株、猪伪狂犬病病毒HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株、猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株、猪伪狂犬病病毒HeN1株、猪伪狂犬病病毒JS-2012株。
优选地，步骤(2)得到猪伪狂犬病病毒弱毒株与亲本强毒株相比，病毒基因缺失从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201-R株，保藏号为CCTCCNO.V201516，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年3月17日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HN1202-R株。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒Fa-R株。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HeN1-R株。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒HN1201株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HN1201-R株，与猪伪狂犬病病毒HN1201株相比，病毒基因连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，所缺失序列如SEQIDNO.1所示，其包含SEQIDNO.2所示的gI蛋白氨基酸序列、SEQIDNO.3所示的gE蛋白氨基酸序列、SEQIDNO.4所示的11K蛋白氨基酸序列和SEQIDNO.5所示的28K蛋白氨基酸序列。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株培养1代至110代之间，对猪致病力显著降低。猪在接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒猪伪狂犬病病毒HN1201株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株培养至第110代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种后21天，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒HN1201株的攻击。同时，未接种HN1201-R株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒HN1201株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至110代之间的病毒，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒HN1202株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HN1202-R株，与猪伪狂犬病病毒HN1202株相比，病毒基因连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株培养1代至110代之间，对猪致病力显著降低。猪在接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒猪伪狂犬病病毒HN1202株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株培养至第110代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种后21天，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒HN1202株的攻击。同时，未接种HN1202-R株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒HN1202株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至110代之间的病毒，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒Fa株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒Fa-R株，与猪伪狂犬病病毒Fa株相比，病毒基因连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒Fa-R株培养1代至110代之间，对猪致病力显著降低。猪在接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒猪伪狂犬病病毒Fa株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒Fa-R株培养至第110代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种后21天，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒Fa株的攻击。同时，未接种Fa-R株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒Fa株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至110代之间的病毒，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株，与猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株相比，病毒基因连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株培养1代至110代之间，对猪致病力显著降低。猪在接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株培养至第110代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种后21天，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株的攻击。同时，未接种PRV-ZJ01-R株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至110代之间的病毒，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒HeN1株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HeN1-R株，与猪伪狂犬病病毒HeN1株相比，病毒基因连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HeN1-R株培养1代至110代之间，对猪致病力显著降低。猪在接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒猪伪狂犬病病毒HeN1株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HeN1-R株培养至第110代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种后21天，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒HeN1株的攻击。同时，未接种HeN1-R株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒HeN1株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至110代之间的病毒，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒JS-2012株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株，与猪伪狂犬病病毒JS-2012株相比，病毒基因连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株培养1代至110代之间，对猪致病力显著降低。猪在接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒猪伪狂犬病病毒JS-2012株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株培养至第110代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种后21天，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒JS-2012株的攻击。同时，未接种JS-2012-R株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒JS-2012株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至110代之间的病毒，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
术语“伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。
优选地，所述的伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病病毒变异株，当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株。
优选地，所述伪狂犬变异株为gE蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.3或与其序列同源性为95％以上的蛋白序列的毒株。
优选地，所述的伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后，所述猪依然感染猪伪狂犬病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，AltschulS.F.etal，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；StephenF.etal，NucleicAcidsRes.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，HigginsD.G.etal，MethodsinEnzymology，266：383-402(1996)；LarkinM.A.etal，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，PoirotO.etal，NucleicAcidsRes.，31(13)：3503-6(2003)；NotredameC.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
术语“gI蛋白”由US7编码，包含366个氨基酸。
术语“gE蛋白”由US8编码，包含579个氨基酸。
术语“11K”由US9编码，包含98个氨基酸。
术语“28K”由US2编码，包含256个氨基酸。
本发明术语“gI/gE/11K/28K”是指gI、gE、11K和28K，其中“/”在本发明中是和的意思，例如“gI/gE/11K/28K蛋白失活”是指gI、gE、11K和28K四个蛋白均失去活性。
除非另有说明本发明术语“PRV-gI-gE-11K-28K-TK-”，是指缺失gI、gE、11K和28K基因。
gI/gE/11K/28K基因的连续缺失使其相应的功能失活，也可使用本技术领域的公知方式，包括其基因缺失表达上述蛋白的功能性片段的核苷酸序列，其基因整个ORF缺失，或者其基因缺失、删除或添加一个或多个核苷酸使其不能正常表达功能蛋白或表达的蛋白不具有其原有的功能，或功能极弱。
本发明的另一方面在于提供一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)将所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株或培养物扩增培养，获得扩增的所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株；以及(2)在所述步骤(1)中获得的所述扩增的猪伪狂犬病病毒弱毒株中加入载体。
作为本发明的一个优选的实施方式，在本发明所述的制备疫苗组合物的方法中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株培养物包括猪伪狂犬病病毒弱毒株1～110代的培养物。
作为本发明的一个优选的实施方式，所述制备所述疫苗组合物的方法中，所述的方法包括：(1)培养猪伪狂犬病病毒弱毒株；以及(2)在所述培养的猪伪狂犬病病毒弱毒株中加入冻干保护剂。
本发明的另一方面在于提供制备的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株含量≥106.0TCID50/头份。
作为本发明的一个优选的实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株含量为106.0TCID50/头份～107.0TCID50/头份。
作为本发明的一个优选的实施方式，猪伪狂犬病病毒弱毒株抗原为猪伪狂犬病病毒HN1201-R株抗原。
作为本发明的一个优选的实施方式，猪伪狂犬病病毒弱毒株抗原为猪伪狂犬病病毒HN1202-R株抗原。
作为本发明的一个优选的实施方式，猪伪狂犬病病毒弱毒株抗原为猪伪狂犬病病毒Fa-R株抗原。
作为本发明的一个优选的实施方式，猪伪狂犬病病毒弱毒株抗原为猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株抗原。
作为本发明的一个优选的实施方式，猪伪狂犬病病毒弱毒株抗原为猪伪狂犬病病毒HeN1-R株抗原。
作为本发明的一个优选的实施方式，猪伪狂犬病病毒弱毒株抗原为猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株抗原。
优选地，所述疫苗组合物进一步包含冻干保护剂。
任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的猪伪狂犬病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的猪伪狂犬病毒和来自另一致病病毒或微生物(见下文)的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP109942)、皂苷、矿物油、植物油，和Carbopol。
因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
还可以包含可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。
作为本发明的一个优选的实施方式，所述的疫苗组合物中还包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原。
此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。
本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。
本发明所用术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗进一步含有失活病原体或抗原组分。
优选地，所述抗原为猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明的弱毒可以插入外源基因，所述的外源基因编码选自感染猪的多种病原中的一种或多种抗原，所述病原体由猪繁殖呼吸综合征(PRRS)病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪圆环病毒1型或者2型、大肠杆菌、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae),支气管败血性博德特菌(Bordetellabronchiseptica),副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)和猪链球菌(Streptococcussuis)组成。
作为本发明的一种实施方式，上述抗原作为外源基因插入本发明弱毒株gI/gE/11K/28K基因缺失区。
优选地，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。
本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的另一方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防与治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，所述的猪伪狂犬相关疾病是由猪伪狂犬病病毒变异株导致的猪伪狂犬病。
本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”可以指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成感染后成年猪(体重在50kg以上猪)可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬病病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明的毒株是通过自然传代的方式天然缺失毒性基因的，能更好的适应自然，无毒力返强风险，生物安全性好。
(2)本发明野毒致弱方法结果稳定性好，可操作，可重复，提供了一种不同的强毒致弱的方式。
(3)本发明的毒株，毒性小，能够获得较好的免疫保护，能够诱导较早产生抗体。
(4)本发明的毒株，其gI/gE/11K/28K基因缺失区可以按照常规生物学技术插入不同的外源基因构成相应的重组病毒，具有有益的应用前景。
序列表中：
序列1为猪伪狂犬病病毒弱毒株HN1201-R株经致弱过程缺失片段的核苷酸序列；
序列2为猪伪狂犬病病毒弱毒株HN1201-R株缺失片段中gI蛋白的氨基酸序列；
序列3为猪伪狂犬病病毒弱毒株HN1201-R株缺失片段中gE蛋白的氨基酸序列；
序列4为猪伪狂犬病病毒弱毒株HN1201-R株缺失片段中11K蛋白的氨基酸序列；
序列5为猪伪狂犬病病毒弱毒株HN1201-R株缺失片段中28K蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的实施例中以猪伪狂犬病毒HN1201株、HN1202株、Fa株、PRV-ZJ01株、HeN1株、JS-2012株为例说明本发明。
本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
本发明中所述的“TCID50”(50％tissuecultureinfectivedose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。
本发明的DMEM培养基用购自美国Gibco公司的DMEM干粉培养基按照其说明书配制。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSaline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
胎牛血清购自PAA公司。
本实施例所用的猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏号为CCTCCNO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
本实施例所用的猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏号为CCTCCNO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。
本实施例所用的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201-R)保藏号为CCTCCNO.V201516；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2015年3月17日。
PRV是术语猪伪狂犬病毒Pseudorabiesvirus的英文简写。
Marc-145细胞，购自ATCC。
DF-1细胞，购自ATCC。
实施例1
猪伪狂犬病病毒HN1201-R株的获得
1.取生长良好的Marc-145细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的DMEM培养液和3％～10％体积比的胎牛血清的细胞生长液(pH调整为7.0～8.0)于36℃～38℃条件下继续培养，形成良好单层，用于接种病毒。
2.将猪伪狂犬病病毒HN1201株接种生长良好的上述传代细胞单层，用含有95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的胎牛血清的细胞生长液(pH调整为7.1～7.5)于36℃～38℃条件下继续培养，于40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液，即为猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株，作为继续传代用毒种。将收获的不同代次的病毒液P1代、P2代、P3代、P4代、P5代、P6代、P7代、P8代、P9代、P10代、P15代、P20代、P30代、P50代、P70代、P90代、P110代、P130代、P150代、P200代分别进行测序，结果显示各代次病毒没有发生基因缺失情况。
3.取生长良好的DF-1细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的DMEM培养液和3％～10％体积比的胎牛血清的细胞生长液(pH调整为7.0～8.0)于36℃～38℃条件下继续培养，形成良好单层，用于接种病毒。
4.将步骤2收获的猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株不同代次病毒液分别接种步骤3得到的生长良好的DF-1传代细胞单层，用含有95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的胎牛血清的细胞生长液(pH调整为7.1～7.5)于36℃～38℃条件下继续培养，于40h～48h后，分别收获细胞培养病毒液，即P1-1代、P2-1代、P3-1代、P4-1代、P5-1代、P6-1代、P7-1代、P8-1代、P9-1代、P10-1代、P15-1代、P20-1代、P30-1代、P50-1代、P70-1代、P90-1代、P110-1代、P130-1代、P150-1代、P200-1代。将收获的各病毒液分别进行测序，结果显示P1-1代、P2-1代、P3-1代、P4-1代病毒没有发生基因缺失情况，而P5-1代、P6-1代、P7-1代、P8-1代、P9-1代、P10-1代、P15-1代、P20-1代、P30-1代、P50-1代、P70-1代、P90-1代、P110-1代、P130-1代、P150-1代、P200-1代病毒均发生基因缺失情况，且各代病毒基因缺失均为从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp。
为验证P1-1代、P2-1代、P3-1代、P4-1代病毒没有发生基因缺失是否与在DF-1上传代次数有关，继续进行传代培养，分别收获P1-2代、P1-3代、P1-4代、P1-5代、P1-6代、P1-7代、P1-8代、P1-9代、P1-10代，P2-2代、P2-3代、P2-4代、P2-5代、P2-6代、P2-7代、P2-8代、P2-9代、P2-10代，P3-2代、P3-3代、P3-4代、P3-5代、P3-6代、P3-7代、P3-8代、P3-9代、P3-10代，P4-2代、P4-3代、P4-4代、P4-5代、P4-6代、P4-7代、P4-8代、P4-9代、P4-10代。将收获的各病毒液进行分别进行测序，结果显示不同代次病毒均没有发生基因缺失情况。说明猪伪狂犬病病毒发生基因缺失与在DF-1上传代次数无关，而与其在Marc-145细胞上适应代次有关。
为验证发生基因缺失的病毒继续在DF-1细胞上传代是否稳定，将P5-1代、P6-1代、P7-1代、P8-1代、P9-1代、P10-1代、P15-1代、P20-1代、P30-1代、P50-1代、P70-1代、P90-1代、P110-1代、P130-1代、P150-1代、P200-1代继续进行传代培养，分别收获P5-2代、P5-3代、P5-4代、P5-5代、P5-6代、P5-7代、P5-8代、P5-9代、P5-10代，P6-2代、P6-3代、P6-4代、P6-5代、P6-6代、P6-7代、P6-8代、P6-9代、P6-10代，P7-2代、P7-3代、P7-4代、P7-5代、P7-6代、P7-7代、P7-8代、P7-9代、P7-10代，P8-2代、P8-3代、P8-4代、P8-5代、P8-6代、P8-7代、P8-8代、P8-9代、P8-10代，P9-2代、P9-3代、P9-4代、P9-5代、P9-6代、P9-7代、P9-8代、P9-9代、P9-10代，P10-2代、P10-3代、P10-4代、P10-5代、P10-6代、P10-7代、P10-8代、P10-9代、P10-10代，P15-2代、P15-3代、P15-4代、P15-5代、P15-6代、P15-7代、P15-8代、P15-9代、P15-10代，P20-2代、P20-3代、P20-4代、P20-5代、P20-6代、P20-7代、P20-8代、P20-9代、P20-10代，P30-2代、P30-3代、P30-4代、P30-5代、P30-6代、P30-7代、P30-8代、P30-9代、P30-10代，P50-2代、P50-3代、P50-4代、P50-5代、P50-6代、P50-7代、P50-8代、P50-9代、P50-10代，P70-2代、P70-3代、P70-4代、P70-5代、P70-6代、P70-7代、P70-8代、P70-9代、P70-10代，P90-2代、P90-3代、P90-4代、P90-5代、P90-6代、P90-7代、P90-8代、P90-9代、P90-10代，P110-2代、P110-3代、P110-4代、P110-5代、P110-6代、P110-7代、P110-8代、P110-9代、P110-10代，P130-2代、P130-3代、P130-4代、P130-5代、P130-6代、P130-7代、P130-8代、P130-9代、P130-10代，P150-2代、P150-3代、P150-4代、P150-5代、P150-6代、P150-7代、P150-8代、P150-9代、P150-10代，P200-2代、P200-3代、P200-4代、P200-5代、P200-6代、P200-7代、P200-8代、P200-9代、P200-10代。将收获的各病毒液进行分别进行测序，结果显示各不同代次病毒基因缺失没有发生变化，依然为从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp。说明猪伪狂犬病病毒基因缺失株在DF-1上传代稳定。
将猪伪狂犬病病毒弱毒株P30-10代命名为猪伪狂犬病病毒HN1201-R株。
实施2猪伪狂犬病病毒HN1201-R株生物学特性研究
1.致病性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组(A、B和空白对照组)，每组5头，分组和攻毒情况见表1。
表1致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
A HN1201-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
B HN1201株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
空白对照组 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
病毒接种后观察28天，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表2。
表2HN1201-R株对7日龄仔猪的致病性
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而猪伪狂犬病病毒HN1201-R株毒性大幅度降低，仅2头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株与亲本强毒猪伪狂犬病病毒HN1201株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒HN1201-R株不同代次致病力的稳定性，用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株培养物，各接种一组7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪(5头)，滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头，5头猪作为对照组。每日观察、记录猪的临床变现，直至接种28天。
结果显示，第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株培养物，接种后观察28天，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株毒性大幅度降低，每组仅出现1～2头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化。
不同代次致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株不同代次培养物毒性均较低。
2.免疫原性试验
在免疫后第21天，对猪伪狂犬病病毒HN1201-R株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒HN1201株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表3。
表3HN1201-R株对7日龄仔猪的免疫原性
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HN1201株产生良好的保护作用。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒HN1201-R株不同代次免疫原性的稳定性，对分别免疫第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株培养物后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬病病毒HN1201株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。
结果显示，第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
不同代次免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HN1201株产生良好的保护作用。
3.病毒返强安全性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒HN1201-R株(1代、30代、60代、85代、110代和1+30+60+85+110代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。
结果表明，同居感染试验至第4代，30头实验猪临床观察和大体剖检均未见异常，表明该弱毒株无毒力返强现象。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将猪伪狂犬病病毒HN1201-R株第1代至第110代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株HN1201株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株第1代至第110代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，即从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp，缺失序列如SEQIDNO.1所示。
表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例3猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株毒种5×104倍稀释后接种已长成单层的ST细胞，吸附1h后，加入1000ml含2％胎牛血清的DMEM培养液，置37℃温室中转瓶培养，转速为6转/小时。待80％细胞病变后，反复冻融2次，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表4。
表4猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗含量配比
疫苗1(TCID50) 疫苗2(TCID50)
HN1201-R株抗原 106.0 107.0
保护剂(V/V) 50％ 50％
实施例4猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗的免疫原性试验
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组，免疫实施例3制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗。第一组免疫疫苗1，第二组免疫疫苗2，第三组为对照组。免疫21日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表5。
表5HN1201-R株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例3制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后4日全部死亡。
证明了两个试验组猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，同时也证明了猪伪狂犬病病毒连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp后仍保持良好的免疫原性。
实施例5猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组。第一组免疫实施例3制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗疫苗1；第二组对照疫苗免疫西班牙海博莱生物大药厂的猪伪狂犬活疫苗(BarthaK-61株)，批号为42RH；第三组为空白对照组。免疫21日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表6。
表6HN1201-R株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验结果
结果显示，采用实施例3制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(不出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护；对照组仔猪攻毒后4日全部死亡；而现有商品化的疫苗不能对猪完全保护。
证明了猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗具有良好的保护力，显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
实施例6猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株的获得
分别将猪伪狂犬病病毒HN1202株及猪伪狂犬病病毒Fa株按照实施例1的方法进行传代培养得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HN1202-R株和猪伪狂犬病病毒Fa-R株。
实施例7猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株生物学特性研究
1.致病性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪20头随机分成4组(C、D、E、F)，每组5头，另设空白对照组10头，分组和攻毒情况见表7。
表7HN1202-R株及Fa-R株致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
C HN1202-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
D HN1202株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
E Fa-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
F Fa株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
空白对照组 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
病毒接种后观察28天，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表8。
表8HN1202-R株及Fa-R株对7日龄仔猪的致病性
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1202株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而猪伪狂犬病病毒HN1202-R株毒性大幅度降低，仅3头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化；猪伪狂犬病病毒Fa株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而猪伪狂犬病病毒Fa-R株毒性大幅度降低，仅4头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株与亲本强毒猪伪狂犬病病毒HN1202株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株；猪伪狂犬病病毒Fa-R株与亲本强毒猪伪狂犬病病毒Fa株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株不同代次致病力的稳定性，用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1202-R株培养物及第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒Fa-R株培养物，各接种一组7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪(5头)，滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头，5头猪作为对照组。每日观察、记录猪的临床变现，直至接种28天。
结果显示，第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1202-R株培养物，接种后观察28天，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株毒性大幅度降低，每组仅出现2～3头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化；第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒Fa-R株培养物，接种后观察28天，猪伪狂犬病病毒Fa-R株毒性大幅度降低，每组仅出现3～4头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化。
不同代次致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株不同代次培养物毒性均较低。
2.免疫原性试验
在免疫后第21天，对猪伪狂犬病病毒HN1202-R株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒HN1202株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表9。
在免疫后第21天，对猪伪狂犬病病毒Fa-R株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒Fa株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表9。
表9HN1202-R株及Fa-R株对7日龄仔猪的免疫原性
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡；猪伪狂犬病病毒Fa-R株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HN1202株产生良好的保护作用；猪伪狂犬病病毒Fa-R株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒Fa株产生良好的保护作用。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株不同代次免疫原性的稳定性，对用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1202-R株培养物免疫后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬病病毒HN1202株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况；对用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒Fa-R株培养物免疫后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬病病毒Fa株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。
结果显示，第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HN1202-R株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡；第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒Fa-R株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
不同代次免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HN1202株产生良好的保护作用；猪伪狂犬病病毒Fa-R株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒Fa株产生良好的保护作用。
3.病毒返强安全性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒HN1202-R株(1代、30代、60代、85代、110代和1+30+60+85+110代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒Fa-R株(1代、30代、60代、85代、110代和1+30+60+85+110代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。
结果表明，同居感染试验至第4代，30头HN1202-R株感染实验猪和30头Fa-R株感染实验猪临床观察和大体剖检均未见异常，表明这两株弱毒株无毒力返强现象。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将猪伪狂犬病病毒HN1202-R株第1代至第110代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株HN1202株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
同时，也将猪伪狂犬病病毒Fa-R株第1代至第110代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株Fa株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株第1代至第110代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失位置及大小完全相同；猪伪狂犬病病毒Fa-R株第1代至第110代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失位置及大小完全相同；猪伪狂犬病病毒HN1202-R株与猪伪狂犬病病毒Fa-R株与亲本强毒株相比均为连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp。
表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株病毒基因编码的氨基酸出现的基因缺失是完全一致的，也说明了本发明方法传代致弱猪伪狂犬病病毒是稳定的，有广阔的市场前景，同时，也进一步说明了猪伪狂犬病病毒连续缺失3455bp的gI/gE/11K/28K基因是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例8猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗的制备
参考实施例3的方法制备猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗，疫苗含量具体配比见表10。
表10猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗含量配比
抗原(TCID50) 保护剂(V/V)
疫苗3(HN1202-R株) 106.0 50％
疫苗4(Fa-R株) 106.0 50％
实施例9猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗的免疫原性试验
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪20头随机分成4组，5头/组，免疫实施例8制备的猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗。第一组免疫疫苗3，第三组免疫疫苗4，第二组、第四组为对照组。免疫21日后攻毒，第一组、第二组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1202株107.0TCID50/头，第三组、第四组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒Fa株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表11。
表11HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例8制备的猪伪狂犬病病毒HN1202-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后5日全部死亡；猪伪狂犬病病毒Fa-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后5日全部死亡。
证明了猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，同时也再次证明了猪伪狂犬病病毒连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp对免疫原性没有影响。
实施例10猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-基因缺失株的构建
利用同源重组的方法，通过分子克隆操作将PRVHN1201株的gI/gE/11K/28K基因敲除，获得猪伪狂犬病病毒HN1201-X-基因缺失株，具体操作方法如下：
以PRVHN1201株基因组DNA为模板，利用引物US7-LP1/US7-LP2、US2-RP1/US2-RP2，分别扩增出位于US7前端的序列和US2后部的序列，作为左右重组臂US7L和US2R，其中gIL和US2R的一端分别带有一个loxP位点，以绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记，借助pBluescriptSK质粒构建带有loxP位点的pSKUS7-2-GFP转移载体。
用DNAZol法提取PRVHN1201株感染的PK-15细胞总DNA，运用脂质体转染法，将细胞总DNA和转移载体pSKUS7-2-GFP以10ug：1ug的量共转染PK-15细胞，待出现80％细胞病变时收获病毒，倍比稀释后接种PK-15单层细胞，以空斑纯化法得到带有EGFP的重组病毒rPRV-US7-2-/GFP。取10ugrPRV-US7-2-/GFP基因DNA，加入2.5单位Cre重组酶，37℃作用1h；抽提DNA，制备rPRV-US7-2-的DNA，转染PK-15细胞，空斑纯化得到剔除EGFP的缺失株猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-基因缺失株。
实施例11猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-基因缺失株弱毒活疫苗的制备
参考实施例3的方法制备猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-基因缺失株弱毒活疫苗，疫苗含量具体配比见表12。
表12猪伪狂犬病病毒HN1202-R株及Fa-R株弱毒活疫苗含量配比
抗原(TCID50) 保护剂(V/V)
疫苗5(HN1201-gI-gE-11K-28K-株) 106.0 50％
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪10头随机分成2组，5头/组，免疫猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-株弱毒活疫苗。免疫21日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表13。
表13HN1201-gI-gE-11K-28K-株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
结果显示，采用基因工程手段制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供80％(4/5)保护，而对照组仔猪攻毒后4日全部死亡。
证明了猪伪狂犬病病毒HN1201-gI-gE-11K-28K-株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，同时也再次证明了猪伪狂犬病病毒连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp对免疫原性没有影响。
实施例12猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株的获得
分别将猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株、猪伪狂犬病病毒HeN1株及猪伪狂犬病病毒JS-2012株按照实施例1的方法进行传代培养得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、猪伪狂犬病病毒HeN1-R株和猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株。
实施例13猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株生物学特性研究
1.致病性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成6组(G、H、I、J、L、M)，每组5头，另设空白对照组15头，分组和攻毒情况见表14。
表14PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
G PRV-ZJ01-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
H PRV-ZJ01株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
I HeN1-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
J HeN1株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
L JS-2012-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
M JS-2012株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
空白对照组 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
病毒接种后观察28天，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表15。
表15PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株对7日龄仔猪的致病性
结果显示，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株毒性大幅度降低，仅4头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化；猪伪狂犬病病毒HeN1株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而猪伪狂犬病病毒HeN1-R株毒性大幅度降低，仅4头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化；猪伪狂犬病病毒JS-2012株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株毒性大幅度降低，仅4头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株与亲本强毒猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株；猪伪狂犬病病毒HeN1-R株与亲本强毒猪伪狂犬病病毒HeN1株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株；猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株与亲本强毒猪伪狂犬病病毒JS-2012株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株不同代次致病力的稳定性，用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株培养物及第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HeN1-R株培养物及第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株培养物，各接种一组7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪(5头)，滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头，5头猪作为对照组。每日观察、记录猪的临床变现，直至接种28天。
结果显示，第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株培养物，接种后观察28天，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株毒性大幅度降低，每组仅出现4～5头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化；第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HeN1-R株培养物，接种后观察28天，猪伪狂犬病病毒HeN1-R株毒性大幅度降低，每组仅出现4～5头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化；第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株培养物，接种后观察28天，猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株毒性大幅度降低，每组仅出现4～5头猪体温升高，没有其他临床症状，剖检组织器官无变化。
不同代次致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株不同代次培养物毒性均较低。
2.免疫原性试验
在免疫后第21天，对猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表16。
在免疫后第21天，对猪伪狂犬病病毒HeN1-R株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒HeN1株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表16。
在免疫后第21天，对猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒JS-2012株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表16。
表16PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株对7日龄仔猪免疫原性
结果显示，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡；猪伪狂犬病病毒HeN1-R株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡；猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株产生良好的保护作用；猪伪狂犬病病毒HeN1-R株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HeN1株产生良好的保护作用；猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒JS-2012株产生良好的保护作用。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株不同代次免疫原性的稳定性，对用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株培养物免疫后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况；对用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HeN1-R株培养物免疫后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬病病毒HeN1株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况；对用第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株培养物免疫后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬病病毒JS-2012株以1×107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。
结果显示，第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡；第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒HeN1-R株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡；第1代、30代、60代、85代、110代的猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
不同代次免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株产生良好的保护作用；猪伪狂犬病病毒HeN1-R株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HeN1株产生良好的保护作用；猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒JS-2012株产生良好的保护作用。
3.病毒返强安全性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株(1代、30代、60代、85代、110代和1+30+60+85+110代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒HeN1-R株(1代、30代、60代、85代、110代和1+30+60+85+110代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株(1代、30代、60代、85代、110代和1+30+60+85+110代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。
结果表明，同居感染试验至第4代，30头PRV-ZJ01-R株感染实验猪、30头HeN1-R株感染实验猪和30头JS-2012-R株感染实验猪临床观察和大体剖检均未见异常，表明这三株弱毒株无毒力返强现象。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株第1代至第110代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株PRV-ZJ01株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
将猪伪狂犬病病毒HeN1-R株第1代至第110代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株HeN1株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
将猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株第1代至第110代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株JS-2012株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株第1代至第110代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失位置及大小完全相同；猪伪狂犬病病毒HeN1-R株第1代至第110代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失位置及大小完全相同；猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株第1代至第110代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株缺失位置及大小完全相同；猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、猪伪狂犬病病毒HeN1-R株与猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株与亲本强毒株相比均为连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp。
表明，猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株病毒基因编码的氨基酸出现的基因缺失是完全一致的，也说明了本发明方法传代致弱猪伪狂犬病病毒是稳定的，有广阔的市场前景，同时，也进一步说明了猪伪狂犬病病毒连续缺失3455bp的gI/gE/11K/28K基因是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例14猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R及JS-2012-R株弱毒活疫苗的制备
参考实施例3的方法制备猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株株弱毒活疫苗，疫苗含量具体配比见表17。
表17PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株株弱毒活疫苗含量
抗原(TCID50) 保护剂(V/V)
疫苗6(PRV-ZJ01-R株) 106.0 50％
疫苗7(HeN1-R株) 106.0 50％
疫苗8(JS-2012-R株) 106.0 50％
实施例15猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株弱毒活疫苗的免疫原性试验
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪30头随机分成6组，5头/组，免疫实施例14制备的猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株弱毒活疫苗。第一组免疫疫苗6，第三组免疫疫苗7，第五组免疫疫苗8，第二组、第四组、第六组为对照组。免疫21日后攻毒，第一组、第二组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株107.0TCID50/头，第三组、第四组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HeN1株107.0TCID50/头，第五组、第六组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒JS-2012株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表18。
表18三株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例14制备的猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后5日全部死亡；猪伪狂犬病病毒HeN1-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后5日全部死亡；猪伪狂犬病病毒JS-2012-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后5日全部死亡。
证明了猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01-R株、HeN1-R株及JS-2012-R株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，同时也再次证明了猪伪狂犬病病毒连续缺失gI/gE/11K/28K基因共3455bp对免疫原性没有影响。
实施例16猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗的免疫原性广谱性试验
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪50头随机分成10组，5头/组，免疫实施例3制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗。第一组、第三组、第五组、第七组和第九组免疫疫苗1，第二组、第四组、第六组、第八组和第十组为对照组。免疫21日后攻毒，第一组、第二组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1202株107.0TCID50/头，第三组、第四组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒Fa株107.0TCID50/头，第五组、第六组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01株107.0TCID50/头，第七组、第八组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HeN1株107.0TCID50/头，第九组、第十组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒JS-2012株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表19。
表19HN1201-R株弱毒活疫苗的免疫原性广谱性试验结果
结果显示，采用实施例3制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断不同来源的猪伪狂犬病病毒感染(不出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后5日全部死亡。
证明了本发明制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗具有很好的免疫广谱性，能提供对不同来源的流行猪伪狂犬病病毒侵袭完全的保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (13)

1.一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：
(1)所述猪伪狂犬病病毒的适应培养步骤，将猪伪狂犬病病毒接种到哺乳动物传代细胞中，进行传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代5代以上，得到猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株；以及
(2)所述猪伪狂犬病病毒的致弱步骤，将所述步骤(1)的所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株接种到禽源传代细胞中，进行传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代1代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)中的猪伪狂犬病病毒包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRVTJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)中的所述哺乳动物传代细胞包括猪睾丸传代细胞ST，猪肾传代细胞PK15或IBRS-2、兔肾传代细胞RK、非洲绿猴肾传代细胞vero、猴胚胎肾上皮传代细胞Marc-145、牛睾丸传代细胞BT或乳仓鼠肾传代细胞BHK-21。
4.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(2)中所述的禽源传代细胞为DF-1。
5.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)的猪伪狂犬病病毒的适应培养步骤包括：
所述哺乳动物传代细胞经胰酶进行细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；以及
将所述猪伪狂犬病病毒接种至所述的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液作为继续传代用毒种，进行下一步的传代，所述传代传至5代以上，得到猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株。
6.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(2)的所述猪伪狂犬病病毒的致弱步骤包括：
所述禽源传代细胞经胰酶进行细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；以及
将所述步骤(1)得到的所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株接种至所述的禽源传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，收获细胞培养病毒液，即为猪伪狂犬病病毒弱毒株；或将所述收获的病毒液进行下一步的传代，所述传代传至1代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
7.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)中所述猪伪狂犬病病毒株在哺乳动物细胞上传代培养代数为≥18代；所述步骤(2)中所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数为≥3代；优选地，所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数为3～110代。
8.根据权利要求5或6所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述细胞生长液含90％～97％体积百分比的细胞培养液和3％～10％体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～8.0；
所述细胞维持液含95％～99％体积百分比的细胞培养液和1％～5％体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.1～7.5；
所述细胞培养液包括MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和α-MEM培养液，所述的牛血清包括胎牛血清、新生牛血清或小牛血清；优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清；
所述细胞培养所用的温度为36℃～38℃。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法致弱的猪伪狂犬病病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株不能表达gI、gE、11K和28K蛋白；优选地，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株基因从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp缺失。
10.一种根据权利要求9所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株，其特征在于，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201-R株，保藏号为CCTCCNO.V201516，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年3月17日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
11.一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：
(1)将权利要求9所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株或培养物扩增培养，获得扩增的所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株；以及
(2)在所述步骤(1)中获得的所述扩增的猪伪狂犬病病毒弱毒株中加入载体。
12.根据权利要求11所述疫苗组合物的制备方法制备的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株含量≥106.0TCID50/头份；优选地，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株含量为106.0TCID50/头份～107.0TCID50/头份。
13.根据权利要求12所述的疫苗组合物，所述的疫苗组合物中还包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原。
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