JP2017512455A - ヘルペスウイルス弱毒化方法及びその弱毒化ウイルス株、ワクチン組成物と応用 - Google Patents
ヘルペスウイルス弱毒化方法及びその弱毒化ウイルス株、ワクチン組成物と応用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明はヘルペスウイルスの弱毒化方法を提供する。当該方法は、安定性、取り扱い性及び再現性に優れ、ヘルペスウイルス強毒株を有効に弱毒化して生物的安全性が高いヘルペスウイルス弱毒株を提供できる。当該方法により弱毒化されたヘルペスウイルス弱毒株は、毒性が低く、より良い免疫保護が得られ、早期に抗体を誘導できるため、豚を有効に免疫できる。
Description
本発明はヘルペスウイルス弱毒化方法、弱毒化ウイルス株及び当該ウイルス株を利用して製造するワクチン組成物に関し、獣用生物製品の分野に属する。
オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）アルファヘルペスウイルス亜科におけるヘルペスウイルスＩ型（Ｓｕｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １ ｓｔｒａｉｎ）を原因として、豚、牛、羊等の多種の家畜、家禽と野生動物で引き起こされ、発熱、かゆみ（豚を除く）及び脳脊髄炎を主症状とする急性伝染病である。豚オーエスキー病は、わが国で広く存在しており、被害が深刻化し、大規模養豚場の生産を阻害する主な疫病の一つである。感染すると、妊娠豚が流産、死産、ミイラ胎子を起こし、また、子豚が神経症状、まひを起こし、死亡率が高い。ＰＲＶは強い向汎性、神経向性、潜伏感染特性を有し、末梢神経系に長期にわたって潜伏して感染することができる。潜伏するウイルスが活性化されて、感染力を持つウイルスに転換した場合、潜伏感染している宿主は発病する。
最近の研究から、豚オーエスキー病が新しい特徴を有することが報じられている。目立つ表現として、どんな年齢の豚でも感染することがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲である。また、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲であり（子豚の死亡率は１００％と高い）、豚が感染すると、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがきを起こし、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠豚は流産（流産率が３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚の産出（弱い子豚が１４日齢になるまでに全例死亡）などの生殖障害症状を引き起こす。
従来のワクチンを接種した豚は、野生ウイルスの攻撃に完全には抵抗できず、依然として、高熱、意気消沈、食欲不振又は絶食などの症状を起こす。感染率は８０％を超え、発病率は３０％を超え、死亡率は１０％〜２０％の範囲である（ヘルペスウイルスの新しい流行株の分離・同定及び抗原多様性の解析、彭金美など、中国予防獣医学報、２０１３、３５（１）：１−４；免疫後発症した子ブタにおけるヘルペスウイルスの分離・同定、童武など、中国動物伝染病学報、２０１３，２１（３）：１−７；Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１２．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１４，２０（１）：１０２−１０４； Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｐｉｇｓ，Ｃｈｉｎａ，Ａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３．１９（１１）：１７４９−１７５５を参照）。従来技術において、ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病を解決できるワクチンは未だ存在しない。
ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病の有効な予防・制御方法はワクチンを接種することであり、開発されたワクチン製品は不活化ワクチンであってもよく、弱毒株から製造された生ワクチンであってもよい。しかし、不活化ワクチンはコストが高く、他方、生ワクチンは、一般的には、遺伝子工学手段により毒力遺伝子を人工的に欠失させてウイルス株を弱毒化して製造されるので、生物的安全性に問題がある。
上記の問題を解決するために、本発明は、細胞継代培養で、ウイルス株を自然に弱毒化し、完全な自然進化過程において変異させ、自然環境条件に完全に適応して、当該弱毒化ウイルス株の安定性を確保し、生物的安全性には危険性がない弱毒化方法を提供する。
本発明の第１の態様はヘルペスウイルスの弱毒化方法であり、前記方法は、（１）ヘルペスウイルスを哺乳動物継代細胞に接種して継代培養し、前記ヘルペスウイルスを５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適合株を得るヘルペスウイルスの適応培養工程と、（２）前記工程（１）の前記ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適合株を禽由来継代細胞に接種して継代培養し、前記ヘルペスウイルスを１代以上継代して、前記ヘルペスウイルス弱毒株を得るヘルペスウイルスの弱毒化工程と、を含む。
本発明の一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）におけるヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＨＥＢ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＰＲＶ ＴＪ株、ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ−ＺＪ０１、ヘルペスウイルス変異株ＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルス変異株ＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株を含む。
ヘルペスウイルス株ＪＳ−２０１２株は、「免疫後発症した子ブタにおけるヘルペスウイルスの分離・同定」（童武、張青占、鄭浩など、中国動物伝染病学報、２０１３，２１（３）：１−７）に開示される。ヘルペスウイルスＨｅＮ１株は、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタに寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣＮＯ．６６５６であり、中国特許出願ＣＮ１０２９９４４５８Ａに開示される。ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株は、Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，Ｘｉｕｌｉｎｇ Ｙｕ，Ｚｈｉ Ｚｈｏｕ，Ｄｏｎｇｍｅｉ Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｎａ，２０１２ ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ ｏｌ．２０，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４に開示される。ＰＲＶ ＴＪ ｓｔｒａｉｎ（ＰＲＶ ＴＪ）株は、ＣｈｉｎａＣｈｕｎ−Ｈｕａ Ｗａｎｇ Ｊｉｎ Ｙｕａｎ１，Ｈｕａ−Ｙａｎｇ Ｑｉｎ１、ｅｔ ａｌ、Ａ ｎｏｖｅｌ ｇＥ−ｄｅｌｅｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＲＶ ｖａｒｉａｎｔｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎ Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｓｗｉｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｖａｃｃｉｎｅ ３２（２０１４）３３７９-３３８５に開示される。
ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ−ＺＪ０１は、受託番号がＣＧＭＣＣＮｏ．８１７０であり、ＣＮ１０３６２７６７８Ａに開示される。ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年５月２０日である。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ． Ｖ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年８月２６日である。ヘルペスウイルスＦａ株は、ヘルペスウイルスＦａ株ｇＢ＿ｇＣ＿ｇＤ遺伝子のクローンと配列解析［Ｊ］．陳振海等、福建農業学報２００７、２２（２）：１２０−１２５に開示される。
本発明の好ましい一実施態様では、工程（１）におけるヘルペスウイルス株が、ＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、Ｆａ株、ＰＲＶ−ＺＪ０１株、ＨｅＮ１株、ＪＳ−２０１２株である。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）における前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはＩＢＲＳ−２、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５、ウシ精巣継代細胞ＢＴ或いはベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１を含み、前記工程（２）における前記禽由来継代細胞がＤＦ−１である。
前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４６）、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−３３）或いはＩＢＲＳ−２（たとえば、ＤＥＣＡＳＴＲＯ、Ｍ．Ｐ．１９６４．Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢ−ＲＳ−２ ｓｗｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ａｒｑｕｉｖｏｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ３１：６３−７８を参照）、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０６）、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２１９）、ウシ腎臓継代細胞ＭＤＢＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２）、ウシ精巣継代細胞ＢＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１３９０）、ベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０）である。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）における前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはＩＢＲＳ−２、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５、ウシ精巣継代細胞ＢＴ或いはベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１を含み、前記工程（２）における前記禽由来継代細胞がＤＦ−１である。
前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４６）、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−３３）或いはＩＢＲＳ−２（たとえば、ＤＥＣＡＳＴＲＯ、Ｍ．Ｐ．１９６４．Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢ−ＲＳ−２ ｓｗｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ａｒｑｕｉｖｏｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ３１：６３−７８を参照）、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０６）、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２１９）、ウシ腎臓継代細胞ＭＤＢＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２）、ウシ精巣継代細胞ＢＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１３９０）、ベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０）である。
本発明の好ましい一実施態様では、工程（１）に記載される哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはサル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５であり、好ましくは、工程（２）に記載される禽由来継代細胞はＤＦ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２０３）である。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）のヘルペスウイルスの適応培養工程は、前記哺乳動物継代細胞がパンクレアチンで分散されて消化し、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成することと、前記ヘルペスウイルスを前記継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を収集して継続継代用ウイルス種として、次の継代を行い、５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を得ること、を含む。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞５代である。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞１８代である。
好ましくは、工程（１）は、更に以下の工程を含む。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）のヘルペスウイルスの適応培養工程は、前記哺乳動物継代細胞がパンクレアチンで分散されて消化し、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成することと、前記ヘルペスウイルスを前記継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を収集して継続継代用ウイルス種として、次の継代を行い、５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を得ること、を含む。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞５代である。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞１８代である。
好ましくは、工程（１）は、更に以下の工程を含む。
（１ａ）ウイルス接種用細胞の継代・培養 前記継代細胞はパンクレアチンにより細胞分散して消化され、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成する。
（１ｂ）ウイルスの繁殖
前記ヘルペスウイルスを前記工程（１ａ）で得られた継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を継続継代用ウイルス種として獲得する。
工程（１ａ）、（１ｂ）において、細胞培養の温度が３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（１ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
（１ｂ）ウイルスの繁殖
前記ヘルペスウイルスを前記工程（１ａ）で得られた継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を継続継代用ウイルス種として獲得する。
工程（１ａ）、（１ｂ）において、細胞培養の温度が３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（１ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
その中で、ヘルペスウイルスを増殖しやすい継代細胞の培養を適する細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液からなる群から選ばれるいずれか１種を含むが、それらに限定されない。また、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含むが、それらに限定されない。
また、前記細胞培養液はＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清はウシ胎児血清であることが好ましい。
また、前記細胞培養液はＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清はウシ胎児血清であることが好ましい。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（２）の前記ヘルペスウイルスの弱毒化工程は、前記禽由来継代細胞がパンクレアチンにより細胞分散されて消化され、細胞培養液を用いて継続培養され、継代細胞単層を形成することと、前記工程（１）で得られた前記ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を前記禽由来継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養することと、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得することと、或いは、前記獲得したウイルス液は次の継代を行い、１代以上継代して、前記ヘルペスウイルス弱毒株を得ることと、を含む。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞１代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が引き続いて禽由来継代細胞で継代する継代数は３〜１１０代であることが好ましい。
好ましくは、工程（２）は、更に以下の工程を含む。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞１代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が引き続いて禽由来継代細胞で継代する継代数は３〜１１０代であることが好ましい。
好ましくは、工程（２）は、更に以下の工程を含む。
（２ａ）ウイルス接種用細胞の継代・培養
前記継代細胞は、パンクレアチンにより細胞分散して消化され、細胞培養液を用いて継続培養され、継代細胞単層を形成する。
（２ｂ）ウイルスの繁殖
前記工程（１）で得たヘルペスウイルスを、前記工程（２ａ）で得た継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得する。
工程（２ａ）、（２ｂ）で、細胞培養の温度は、３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（２ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
その中で、ヘルペスウイルスを増殖しやすい禽由来継代細胞の培養に適する細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液からなる群から選ばれるいずれか１種を含むが、それらに限定されない。また、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含むが、それらに限定されない。
また、前記細胞培養液は、ＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であることが好ましい。
前記継代細胞は、パンクレアチンにより細胞分散して消化され、細胞培養液を用いて継続培養され、継代細胞単層を形成する。
（２ｂ）ウイルスの繁殖
前記工程（１）で得たヘルペスウイルスを、前記工程（２ａ）で得た継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得する。
工程（２ａ）、（２ｂ）で、細胞培養の温度は、３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（２ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
その中で、ヘルペスウイルスを増殖しやすい禽由来継代細胞の培養に適する細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液からなる群から選ばれるいずれか１種を含むが、それらに限定されない。また、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含むが、それらに限定されない。
また、前記細胞培養液は、ＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であることが好ましい。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）では、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）では、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）では、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）に、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数が３〜１１０代である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０である。前記細胞維持液は９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であり、前記細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液を含む。前記ウシ血清はウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含み、前記細胞培養の温度は３６℃〜３８℃である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）では、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）に、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数が３〜１１０代である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０である。前記細胞維持液は９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であり、前記細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液を含む。前記ウシ血清はウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含み、前記細胞培養の温度は３６℃〜３８℃である。
本発明の最も好ましい一実施態様として、前記細胞培養液がＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であり、前記細胞培養の温度が３６℃〜３８℃である。
本発明の他の態様は、前記ヘルペスウイルスの弱毒化方法により弱毒化されたヘルペスウイルス弱毒株を提供し、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋの四つのタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子にはｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失する。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株において、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続する遺伝子を欠失する。
好ましくは、前記ヘルペスウイルス株がヘルペスウイルス変異株であり、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を含む。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失する。
本発明の他の態様は、前記ヘルペスウイルスの弱毒化方法により弱毒化されたヘルペスウイルス弱毒株を提供し、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋの四つのタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子にはｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失する。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株において、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続する遺伝子を欠失する。
好ましくは、前記ヘルペスウイルス株がヘルペスウイルス変異株であり、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を含む。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失する。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１−Ｒ）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１５１６であり、寄託単位が中国典型培養物寄託センタであり、寄託日が２０１５年３月１７日であり、寄託場所が中国武漢・武漢大学である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株である。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、これをヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株に比べて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、欠失配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｇＩタンパク質アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるｇＥタンパク質アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示される１１Ｋタンパク質アミノ酸配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示される２８Ｋタンパク質アミノ酸配列を含む。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒株の攻撃に抵抗できる。同時に、ＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなくので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒株の攻撃に抵抗できる。同時に、ＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなくので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株は本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、これをヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株に比べて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＦａ株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＦａ株に比べて、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＦａ強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＦａ強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、Ｆａ−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＦａ株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＦａ強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＦａ強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、Ｆａ−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＦａ株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に比べて、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に比べて、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨｅＮ１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変換して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨｅＮ１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変換して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に比べて、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒと完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＪＳ−２０１２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＪＳ−２０１２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を有する。
「ヘルペスウイルス変異株」という用語は、高病原性ヘルペスウイルス株とも呼ばれ、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短い（１〜２日）。発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがきを起こし、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠豚は流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚の産出（弱い子豚は１４日齢になるまでに全例死亡）などの生殖障害症状を引き起こす。
前記ヘルペスウイルス変異株は、分離された前記豚ヘルペスウイルス変異株であって、前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状を引き起こすウイルス株であることが好ましい。
前記ヘルペスウイルス変異株は、好ましくは、ｇＥタンパク質アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３であり、或いは配列相同性が９５％以上のタンパク質配列であるウイルス株である。
前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来のｇＥ、ＴＫ、ｇＩ遺伝子の１及び１以上の遺伝子を欠失したヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として豚オーエスキー病に感染し、かつ前記ヘルペスウイルス変異株が９〜１０日齢の子ブタを意気消沈と食欲不振にさせるウイルス株を含むことが好ましい。
前記ヘルペスウイルス変異株は、分離された前記豚ヘルペスウイルス変異株であって、前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状を引き起こすウイルス株であることが好ましい。
前記ヘルペスウイルス変異株は、好ましくは、ｇＥタンパク質アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３であり、或いは配列相同性が９５％以上のタンパク質配列であるウイルス株である。
前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来のｇＥ、ＴＫ、ｇＩ遺伝子の１及び１以上の遺伝子を欠失したヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として豚オーエスキー病に感染し、かつ前記ヘルペスウイルス変異株が９〜１０日齢の子ブタを意気消沈と食欲不振にさせるウイルス株を含むことが好ましい。
本発明における「相同性」という用語は、本出願では、二本のアミノ酸配列或いは二本のヌクレオチド配列の類似度を意味する。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性は、本分野で既知のあらゆる適当な方法によって算出される。たとえば、目標となるアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列を参照アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列に配列照合して、必要な場合には、欠失を入れて、照合する二本の配列の間で同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の数を最適化させ、それに基づいて二本のアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の間における同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）どうしの百分率を算出することができる。アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の照合と相同性の計算は、本分野で既知のソフトウェアによって実現され、たとえば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能である。または、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０） ；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェア（ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）から入手可能である。或いは、たとえば、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）を参照）；及びＴＣｏｆｆｅｅソフトウェア等（スウェ−デンバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）から入手可能である。或いは、たとえば、Ｐｏｉｒｏｔ Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）参照）が挙げられるが、それらに限定されない。ソフトウェアを使って配列を照合するときに、ソフトウェアの既定パラメーターを使用し、或いは実際の状況によってソフトウェアのパラメーターを調整することができ、それは当業者の知識範囲内にある。
「ｇＩタンパク質」という用語は、ＵＳ７によってコードされ、３６６個アミノ酸を含むことを意味する。
「ｇＥタンパク質」という用語は、ＵＳ８によってコードされ、５７９個アミノ酸を含むことを意味する。
「１１Ｋ」という用語は、ＵＳ９によってコードされ、９８個アミノ酸を含むことを意味する。
「２８Ｋ」という用語は、ＵＳ２によってコードされ、２５６個アミノ酸を含むことを意味する。
本発明の「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋを意味するとともに、「／」は本発明において「及び」という意味である。従って、「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質を不活性化させる」とは、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
別段の指摘がない限り、本発明の「ＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋ、ＴＫ遺伝子を欠失させることを意味する。
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子の連続欠失による相応の機能不活性化は、本技術分野の既知の方式で行われてよい。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はＯＲＦ全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
「ｇＥタンパク質」という用語は、ＵＳ８によってコードされ、５７９個アミノ酸を含むことを意味する。
「１１Ｋ」という用語は、ＵＳ９によってコードされ、９８個アミノ酸を含むことを意味する。
「２８Ｋ」という用語は、ＵＳ２によってコードされ、２５６個アミノ酸を含むことを意味する。
本発明の「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋを意味するとともに、「／」は本発明において「及び」という意味である。従って、「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質を不活性化させる」とは、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
別段の指摘がない限り、本発明の「ＰＲＶ−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−ＴＫ−」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋ、ＴＫ遺伝子を欠失させることを意味する。
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子の連続欠失による相応の機能不活性化は、本技術分野の既知の方式で行われてよい。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はＯＲＦ全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
本発明の他の態様では、ワクチン組成物を製造する方法を提供する。前記方法は、（１）前記ヘルペスウイルス弱毒株或いは培養物を増幅培養して、増幅した前記ヘルペスウイルス弱毒株を獲得する工程と、（２）前記工程（１）で得られた前記増幅したヘルペスウイルス弱毒株にベクターを加入する工程と、を含む。本発明の好ましい一実施態様では、本発明に係るワクチン組成物の製造方法において、前記ヘルペスウイルス弱毒株培養物はヘルペスウイルス弱毒株の１〜１１０代培養物を含む。
本発明の好ましい一実施態様では、前記ワクチン組成物の製造方法において、前記方法は、（１）ヘルペスウイルス弱毒株を培養する工程と、（２）前記培養したヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を加入する工程と、を含む。
本発明の他の態様は、製造したワクチン組成物を提供し、その中で、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量＞１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明により製造したワクチン組成物において、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量が１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様では、前記ワクチン組成物の製造方法において、前記方法は、（１）ヘルペスウイルス弱毒株を培養する工程と、（２）前記培養したヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を加入する工程と、を含む。
本発明の他の態様は、製造したワクチン組成物を提供し、その中で、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量＞１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明により製造したワクチン組成物において、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量が１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は凍結乾燥保護剤をさらに含有する。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は凍結乾燥保護剤をさらに含有する。
ワクチンにアジュバント活性を有する１種以上の化合物を添加しても良い。本発明に係る生きている弱毒化のヘルペスウイルスは、必ずしもこのようなアジュバントで効果を実現するわけではないが、特に本発明に係る生きている弱毒化のヘルペスウイルスと他の病原ウイルス或いは病原微生物（詳しくは後述する）の抗原性物質との組み合わせワクチンには、アジュバントを添加してもよい。アジュバントは免疫システムの非特異的刺激剤であり、宿主のワクチンへの免疫応答を補強するものである。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全アジュバント及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体、ヨーロッパ特許ＥＰ１０９９４２を参照すること）、サポニン、鉱油、植物油、Ｃａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。 更に、本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例を含有してもよく、ＳＰＧＡなどの安定化剤、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに加入する場合、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適するようになる。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。 更に、本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例を含有してもよく、ＳＰＧＡなどの安定化剤、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに加入する場合、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適するようになる。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
本発明の好ましい一実施態様として、前記ワクチン組成物には、更に豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群抗原、豚サーコウイルス抗原、ブタパラインフルエンザ菌抗原、豚肺炎マイコプラズマ抗原、豚パルボウイルス抗原、豚日本脳炎ウイルス抗原が含まれる。また、本発明のヘルペスウイルスワクチンを他の不活性化病原体或いは抗原と組み合わせて使用することで、豚オーエスキー病をはじめる各種類の疾病を抵抗する混合ワクチン或いは複合ワクチンを製造できる。
本発明における「混合ワクチン」という用語は、本発明のヘルペスウイルスと、少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンを意味する。
本発明における「複合ワクチン」という用語は、ウイルスと細菌から製造したワクチンを意味する。たとえば、本発明のヘルペスウイルスを、豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと混合し又は組み合わせることができる。
本発明における「混合ワクチン」という用語は、本発明のヘルペスウイルスと、少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンを意味する。
本発明における「複合ワクチン」という用語は、ウイルスと細菌から製造したワクチンを意味する。たとえば、本発明のヘルペスウイルスを、豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと混合し又は組み合わせることができる。
本発明の一実施態様として、前記ワクチンは、更に不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含むことができる。
好ましくは、上記の抗原は、豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び／又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
本発明の一実施態様として、本発明の弱毒株に外来遺伝子を挿入でき、前記外来遺伝子は、豚を感染するいろいろな病原体の１種以上の抗原をコードするものである。前記病原体は、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、豚サーコウイルス１型又は２型、大腸菌、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉ ｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブタパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、豚肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）からなる。
本発明の一実施態様として、前記抗原を外来遺伝子として本発明の弱毒株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に挿入する。
好ましくは、前記ワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。 本発明の組成物の成分或いは組成成分の量は、治療的有効量であることが好ましい。前記治療的有効量とは、組成物が投与された宿主においてそれらの免疫的作用をもたらして、過度な副作用を引き起こさないのに必要な量である。用いられる成分と投与しようとする組成物の正確な量は、様々な要素、例えば治療するべく疾患の類型、治療される動物の類型と年齢、投与方式、及び組成物における他の成分によって異なる。 本発明の他の態様は、ヘルペスウイルス関連疾病の予防・治療薬を製造するための上記のワクチン組成物の使用を提供する。
本発明の一実施態様として、上記のヘルペスウイルス関連疾病は、ヘルペスウイルス変異株に起因する豚オーエスキー病である。
好ましくは、上記の抗原は、豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び／又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
本発明の一実施態様として、本発明の弱毒株に外来遺伝子を挿入でき、前記外来遺伝子は、豚を感染するいろいろな病原体の１種以上の抗原をコードするものである。前記病原体は、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、豚サーコウイルス１型又は２型、大腸菌、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉ ｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブタパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、豚肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）からなる。
本発明の一実施態様として、前記抗原を外来遺伝子として本発明の弱毒株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に挿入する。
好ましくは、前記ワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。 本発明の組成物の成分或いは組成成分の量は、治療的有効量であることが好ましい。前記治療的有効量とは、組成物が投与された宿主においてそれらの免疫的作用をもたらして、過度な副作用を引き起こさないのに必要な量である。用いられる成分と投与しようとする組成物の正確な量は、様々な要素、例えば治療するべく疾患の類型、治療される動物の類型と年齢、投与方式、及び組成物における他の成分によって異なる。 本発明の他の態様は、ヘルペスウイルス関連疾病の予防・治療薬を製造するための上記のワクチン組成物の使用を提供する。
本発明の一実施態様として、上記のヘルペスウイルス関連疾病は、ヘルペスウイルス変異株に起因する豚オーエスキー病である。
本文に用いられる「ヘルペスウイルス関連疾病」という用語は、以下の症状を示す意味として用いられることがある。即ち、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲であり（子豚の死亡率は１００％と高い）、感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に不全による死亡に至る症状を引き起こす。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠豚は流産（流産率が３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚の産出（弱い子豚が１４日齢になるまでに全部死亡）などの生殖障害症状を引き起こすが、それらに限定されない。
上記の症状と従来技術において普通のヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染した成熟豚（体重５０ｋｇ以上の豚）の主な症状が、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に不全による死亡に至ることである。他方、初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上と上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることであり、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などの呼吸系症状を引き起こす。 本文に用いられる「予防」という用語は、本発明のワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。「治療」という用語は、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染による症状を緩和し又は改善するあらゆる行為を意味する。
上記の症状と従来技術において普通のヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染した成熟豚（体重５０ｋｇ以上の豚）の主な症状が、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に不全による死亡に至ることである。他方、初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上と上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることであり、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などの呼吸系症状を引き起こす。 本文に用いられる「予防」という用語は、本発明のワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。「治療」という用語は、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染による症状を緩和し又は改善するあらゆる行為を意味する。
本発明は、以下のような際立つ効果を有する。
（１）本発明のウイルス株は、自然継代手段で天然的に毒性遺伝子を欠失し、自然によく適応できて、毒力が回復する恐れがなく、生物的安全性が高い。
（２）本発明に係る野生ウイルス弱毒化方法は、方法を行った結果の安定性、取り扱い性、再現性に優れ、異なる強毒株の弱毒化手段を提供する。
（３）本発明に係るウイルス株は、毒性が低く、より良い免疫保護が得られ、早期に抗体を誘導できる。
（４）本発明のウイルス株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に、通常の生物学技術により異なる外来遺伝子を挿入して対応する組み換えウイルスを構築できるので、有益な潜在能力を期待できる。
（１）本発明のウイルス株は、自然継代手段で天然的に毒性遺伝子を欠失し、自然によく適応できて、毒力が回復する恐れがなく、生物的安全性が高い。
（２）本発明に係る野生ウイルス弱毒化方法は、方法を行った結果の安定性、取り扱い性、再現性に優れ、異なる強毒株の弱毒化手段を提供する。
（３）本発明に係るウイルス株は、毒性が低く、より良い免疫保護が得られ、早期に抗体を誘導できる。
（４）本発明のウイルス株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に、通常の生物学技術により異なる外来遺伝子を挿入して対応する組み換えウイルスを構築できるので、有益な潜在能力を期待できる。
（配列表）
配列１はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株が弱毒化されて断片を欠失したヌクレオチド配列である。
配列２はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列３はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＥタンパク質のアミノ酸配列である。
配列４はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における１１Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
配列５はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における２８Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
配列１はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株が弱毒化されて断片を欠失したヌクレオチド配列である。
配列２はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列３はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＥタンパク質のアミノ酸配列である。
配列４はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における１１Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
配列５はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における２８Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例を結合して、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は例示にすぎないが、本発明の範囲を限定しない。当業者は、本発明の主旨と範囲から外れない限り、本発明の技術方案の詳細や形式に対して修正又は変更を行うことができるが、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入ると理解すべきである。
本発明の実施例では、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、Ｆａ株、ＰＲＶ−ＺＪ０１株、ＨｅＮ１株、ＪＳ−２０１２株を例として本発明を説明する。
本発明における「／匹」という用語は、１匹豚当たりのワクチン注射量を意味する。
本明細書に記載される「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）という用語は、細胞培養物の５０％を感染させることができるウイルス量を意味し、ウイルス感染力を表す手段の一つである。
本明細書に記載されるＤＭＥＭ培地は、アメリカＧｉｂｃｏ会社から購入したＤＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、その説明書にしたがって調製したものである。
本明細書に記載される「ＰＢＳ」とは、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を用い、《分子クローン》第三版に従って調製した。
ウシ胎児血清はＰＡＡ会社より購入された。
本発明の実施例では、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、Ｆａ株、ＰＲＶ−ＺＪ０１株、ＨｅＮ１株、ＪＳ−２０１２株を例として本発明を説明する。
本発明における「／匹」という用語は、１匹豚当たりのワクチン注射量を意味する。
本明細書に記載される「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）という用語は、細胞培養物の５０％を感染させることができるウイルス量を意味し、ウイルス感染力を表す手段の一つである。
本明細書に記載されるＤＭＥＭ培地は、アメリカＧｉｂｃｏ会社から購入したＤＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、その説明書にしたがって調製したものである。
本明細書に記載される「ＰＢＳ」とは、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を用い、《分子クローン》第三版に従って調製した。
ウシ胎児血清はＰＡＡ会社より購入された。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年５月２０日である。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年８月２６日である。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１−Ｒ）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１５１６であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１５年３月１７日である。
ＰＲＶは、ヘルペスウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）の英語の略語である。
Ｍａｒｃ−１４５細胞はＡＴＣＣより購入された。
ＤＦ−１細胞はＡＴＣＣより購入された。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年８月２６日である。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１−Ｒ）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１５１６であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１５年３月１７日である。
ＰＲＶは、ヘルペスウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）の英語の略語である。
Ｍａｒｃ−１４５細胞はＡＴＣＣより購入された。
ＤＦ−１細胞はＡＴＣＣより購入された。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の獲得）
１．良好に成長するＭａｒｃ−１４５細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
２．ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を上記の良好に成長する継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が確認された時に、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株として獲得し、継代用ウイルス種として用いた。獲得した異世代のウイルス液Ｐ１代、Ｐ２代、Ｐ３代、Ｐ４代、Ｐ５代、Ｐ６代、Ｐ７代、Ｐ８代、Ｐ９代、Ｐ１０代、Ｐ１５代、Ｐ２０代、Ｐ３０代、Ｐ５０代、Ｐ７０代、Ｐ９０代、Ｐ１１０代、Ｐ１３０代、Ｐ１５０代、Ｐ２００代をそれぞれ配列決定した結果、各世代のウイルスは遺伝子欠失が認められなかった。
３．良好に成長するＤＦ−１細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
４．工程２で得られたヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株の異世代のウイルス液をそれぞれ工程３で得られた良好に成長したＤＦ−１継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養た。４０〜４８時間後、それぞれ細胞培養ウイルス液、即ち、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代のウイルスに遺伝子欠失は認められなかった。一方、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代のウイルスはいずれも遺伝子を欠失し、且つ各世代のウイルスはいずれもｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続した遺伝子を欠失した。
１．良好に成長するＭａｒｃ−１４５細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
２．ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を上記の良好に成長する継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が確認された時に、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株として獲得し、継代用ウイルス種として用いた。獲得した異世代のウイルス液Ｐ１代、Ｐ２代、Ｐ３代、Ｐ４代、Ｐ５代、Ｐ６代、Ｐ７代、Ｐ８代、Ｐ９代、Ｐ１０代、Ｐ１５代、Ｐ２０代、Ｐ３０代、Ｐ５０代、Ｐ７０代、Ｐ９０代、Ｐ１１０代、Ｐ１３０代、Ｐ１５０代、Ｐ２００代をそれぞれ配列決定した結果、各世代のウイルスは遺伝子欠失が認められなかった。
３．良好に成長するＤＦ−１細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
４．工程２で得られたヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株の異世代のウイルス液をそれぞれ工程３で得られた良好に成長したＤＦ−１継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養た。４０〜４８時間後、それぞれ細胞培養ウイルス液、即ち、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代のウイルスに遺伝子欠失は認められなかった。一方、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代のウイルスはいずれも遺伝子を欠失し、且つ各世代のウイルスはいずれもｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続した遺伝子を欠失した。
Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代のウイルスが遺伝子を欠失しないこととＤＦ−１での継代数との関係を検証するために、引き続いて継代培養を行った。この結果、それぞれ、Ｐ１−２代、Ｐ１−３代、Ｐ１−４代、Ｐ１−５代、Ｐ１−６代、Ｐ１−７代、Ｐ１−８代、Ｐ１−９代、Ｐ１−１０代、Ｐ２−２代、Ｐ２−３代、Ｐ２−４代、Ｐ２−５代、Ｐ２−６代、Ｐ２−７代、Ｐ２−８代、Ｐ２−９代、Ｐ２−１０代、Ｐ３−２代、Ｐ３−３代、Ｐ３−４代、Ｐ３−５代、Ｐ３−６代、Ｐ３−７代、Ｐ３−８代、Ｐ３−９代、Ｐ３−１０代、Ｐ４−２代、Ｐ４−３代、Ｐ４−４代、Ｐ４−５代、Ｐ４−６代、Ｐ４−７代、Ｐ４−８代、Ｐ４−９代、Ｐ４−１０代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、異世代のウイルスはいずれも遺伝子欠失が認められなかった。ヘルペスウイルスをＭａｒｃ−１４５細胞で４代以下継代する場合、遺伝子の欠失はＤＦ−１での継代数と関係がないが、遺伝子の欠失はＭａｒｃ−１４５細胞での対応代数と関係があった。
遺伝子を欠失したウイルスがＤＦ−１細胞で引き続いて継代する際の安定性を検証するために、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代を引き続いて継代培養した。この結果、それぞれＰ５−２代、Ｐ５−３代、Ｐ５−４代、Ｐ５−５代、Ｐ５−６代、Ｐ５−７代、Ｐ５−８代、Ｐ５−９代、Ｐ５−１０代、Ｐ６−２代、Ｐ６−３代、Ｐ６−４代、Ｐ６−５代、Ｐ６−６代、Ｐ６−７代、Ｐ６−８代、Ｐ６−９代、Ｐ６−１０代、Ｐ７−２代、Ｐ７−３代、Ｐ７−４代、Ｐ７−５代、Ｐ７−６代、Ｐ７−７代、Ｐ７−８代、Ｐ７−９代、Ｐ７−１０代、Ｐ８−２代、Ｐ８−３代、Ｐ８−４代、Ｐ８−５代、Ｐ８−６代、Ｐ８−７代、Ｐ８−８代、Ｐ８−９代、Ｐ８−１０代、Ｐ９−２代、Ｐ９−３代、Ｐ９−４代、Ｐ９−５代、Ｐ９−６代、Ｐ９−７代、Ｐ９−８代、Ｐ９−９代、Ｐ９−１０代、Ｐ１０−２代、Ｐ１０−３代、Ｐ１０−４代、Ｐ１０−５代、Ｐ１０−６代、Ｐ１０−７代、Ｐ１０−８代、Ｐ１０−９代、Ｐ１０−１０代、Ｐ１５−２代、Ｐ１５−３代、Ｐ１５−４代、Ｐ１５−５代、Ｐ１５−６代、Ｐ１５−７代、Ｐ１５−８代、Ｐ１５−９代、Ｐ１５−１０代、Ｐ２０−２代、Ｐ２０−３代、Ｐ２０−４代、Ｐ２０−５代、Ｐ２０−６代、Ｐ２０−７代、Ｐ２０−８代、Ｐ２０−９代、Ｐ２０−１０代、Ｐ３０−２代、Ｐ３０−３代、Ｐ３０−４代、Ｐ３０−５代、Ｐ３０−６代、Ｐ３０−７代、Ｐ３０−８代、Ｐ３０−９代、Ｐ３０−１０代、Ｐ５０−２代、Ｐ５０−３代、Ｐ５０−４代、Ｐ５０−５代、Ｐ５０−６代、Ｐ５０−７代、Ｐ５０−８代、Ｐ５０−９代、Ｐ５０−１０代、Ｐ７０−２代、Ｐ７０−３代、Ｐ７０−４代、Ｐ７０−５代、Ｐ７０−６代、Ｐ７０−７代、Ｐ７０−８代、Ｐ７０−９代、Ｐ７０−１０代、Ｐ９０−２代、Ｐ９０−３代、Ｐ９０−４代、Ｐ９０−５代、Ｐ９０−６代、Ｐ９０−７代、Ｐ９０−８代、Ｐ９０−９代、Ｐ９０−１０代、Ｐ１１０−２代、Ｐ１１０−３代、Ｐ１１０−４代、Ｐ１１０−５代、Ｐ１１０−６代、Ｐ１１０−７代、Ｐ１１０−８代、Ｐ１１０−９代、Ｐ１１０−１０代、Ｐ１３０−２代、Ｐ１３０−３代、Ｐ１３０−４代、Ｐ１３０−５代、Ｐ１３０−６代、Ｐ１３０−７代、Ｐ１３０−８代、Ｐ１３０−９代、Ｐ１３０−１０代、Ｐ１５０−２代、Ｐ１５０−３代、Ｐ１５０−４代、Ｐ１５０−５代、Ｐ１５０−６代、Ｐ１５０−７代、Ｐ１５０−８代、Ｐ１５０−９代、Ｐ１５０−１０代、Ｐ２００−２代、Ｐ２００−３代、Ｐ２００−４代、Ｐ２００−５代、Ｐ２００−６代、Ｐ２００−７代、Ｐ２００−８代、Ｐ２００−９代、Ｐ２００−１０代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、異世代のウイルス遺伝子の欠失は変わらず、依然としてｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから連続した３４５５ｂｐの欠失であった。ヘルペスウイルス遺伝子欠失株は、ＤＦ−１で安定して継代することが認められた。
こうして得られたヘルペスウイルス弱毒株Ｐ３０−１０代を、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と命名した。
こうして得られたヘルペスウイルス弱毒株Ｐ３０−１０代を、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と命名した。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の生物学特性の検討）
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である７日齢の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組（Ａ、Ｂと空白対照組）に分け、組分けと攻撃状況を表１に示す。
表１ 病原性試験動物の組分け
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表２に示す。
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である７日齢の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組（Ａ、Ｂと空白対照組）に分け、組分けと攻撃状況を表１に示す。
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表２に示す。
上記結果から、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株は７日齢子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ２匹の豚が体温上昇するだけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０１親株に比べて、病原力が顕著に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を、それぞれ一組のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は毒性が大幅低減した。つまり、ただ１〜２匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められかなった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低かった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０１親株に比べて、病原力が顕著に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を、それぞれ一組のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は毒性が大幅低減した。つまり、ただ１〜２匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められかなった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低かった。
２．免疫原性試験
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹剤量で攻撃された。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表３に示す。
表３ ７日齢の子ブタに対するＨＮ１２０１−Ｒ株の免疫原性
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹剤量で攻撃された。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表３に示す。
上記結果から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、それぞれ第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を免疫した。免疫後２１日目、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、他方、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、それぞれ第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を免疫した。免疫後２１日目、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、他方、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
３．ウイルス毒力回復安全性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
結果から分かるように、同居伝染試験を第４代まで行ったところ、３０匹の実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかったことから、当該弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を確保できる。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
その結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物は、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸が共に連続してｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ欠失した。即ち、ｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐ連続して欠失した。欠失配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す。
なお、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸共通性として示される特徴変化は、その強毒親株の毒力が低下する原因となる可能性が高い。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
結果から分かるように、同居伝染試験を第４代まで行ったところ、３０匹の実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかったことから、当該弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を確保できる。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
その結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物は、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸が共に連続してｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ欠失した。即ち、ｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐ連続して欠失した。欠失配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す。
なお、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸共通性として示される特徴変化は、その強毒親株の毒力が低下する原因となる可能性が高い。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの製造）
１．ウイルスの増殖
実施例１で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス種を５×１０４倍で希釈した後、単層に成長したＳＴ細胞に接種し、１時間吸着した後、２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液１０００ｍｌを加入し、３７℃温室に６回転／時間の回転速度で回転培養した。８０％の細胞が病変した後、２回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定し、低温で保存した。
２．保護剤の調製
１００ｍｌ脱イオン水にショ糖４０ｇ、ゼラチン８ｇを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０ｍｉｎ）を行った。
３．ワクチンの製造
このように製造して保存しているウイルス液と保護剤を１：１（体積比）で混合し、凍結乾燥した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表４に示す。
表４ ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの含有量の配合比
１．ウイルスの増殖
実施例１で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス種を５×１０４倍で希釈した後、単層に成長したＳＴ細胞に接種し、１時間吸着した後、２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液１０００ｍｌを加入し、３７℃温室に６回転／時間の回転速度で回転培養した。８０％の細胞が病変した後、２回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定し、低温で保存した。
２．保護剤の調製
１００ｍｌ脱イオン水にショ糖４０ｇ、ゼラチン８ｇを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０ｍｉｎ）を行った。
３．ワクチンの製造
このように製造して保存しているウイルス液と保護剤を１：１（体積比）で混合し、凍結乾燥した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表４に示す。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚１５匹を５匹／群でランダムに３群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒活ワクチンを接種した。第１組は免疫ワクチン１とし、第２組は免疫ワクチン２とし、第３組は対照組とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表５に示す。
表５ ＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状は現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であるのに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
二つの試験群でのヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有することを証明した。また、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した後でも、依然として良い免疫原性を保持した。
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚１５匹を５匹／群でランダムに３群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒活ワクチンを接種した。第１組は免疫ワクチン１とし、第２組は免疫ワクチン２とし、第３組は対照組とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表５に示す。
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状は現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であるのに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
二つの試験群でのヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有することを証明した。また、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した後でも、依然として良い免疫原性を保持した。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性対比試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組に分けた。第１組は実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンワクチン１で免疫した。第２組は対照ワクチンとして、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ ＨＩＰＲＡ， Ｓ．Ａ．のヘルペスウイルス生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ Ｋ−６１株）、バッチ番号４２ＲＨで免疫し、第３組は空白対照群とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量は、ヘルペスウイルスが１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表６に示す。
表６ ＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性対比試験結果
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れず）、子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡し、従来のワクチン商品はブタを完全に保護できなかった。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有し、従来のワクチン商品より良い免疫保護と安全性を示すことが証明された。
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組に分けた。第１組は実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンワクチン１で免疫した。第２組は対照ワクチンとして、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ ＨＩＰＲＡ， Ｓ．Ａ．のヘルペスウイルス生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ Ｋ−６１株）、バッチ番号４２ＲＨで免疫し、第３組は空白対照群とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量は、ヘルペスウイルスが１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表６に示す。
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れず）、子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡し、従来のワクチン商品はブタを完全に保護できなかった。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有し、従来のワクチン商品より良い免疫保護と安全性を示すことが証明された。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の獲得）
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株及びヘルペスウイルスＦａ株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養し、ヘルペスウイルス弱毒株を得た。それぞれ、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株と命名した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株及びヘルペスウイルスＦａ株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養し、ヘルペスウイルス弱毒株を得た。それぞれ、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株と命名した。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の生物学特性の検討）
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ２０匹を５匹／組でランダムに４組（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に分け、また、空白対照群として１０匹を設置した。組分けと攻撃状況を表７に示す。
表７ ＨＮ１２０２−Ｒ株及Ｆａ−Ｒ株の病原性試験動物の組分け
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表８に示す。
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ２０匹を５匹／組でランダムに４組（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に分け、また、空白対照群として１０匹を設置した。組分けと攻撃状況を表７に示す。
表７ ＨＮ１２０２−Ｒ株及Ｆａ−Ｒ株の病原性試験動物の組分け
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表８に示す。
上記結果から、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ３匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、ヘルペスウイルスＦａ株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０２親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＦａ親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物及び第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ２〜３匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなかった。解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は毒性が大幅低減し、組ごとにただ３〜４匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０２親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＦａ親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物及び第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ２〜３匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなかった。解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は毒性が大幅低減し、組ごとにただ３〜４匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
２．免疫原性試験
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
表９ ７日齢の子ブタに対するＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の免疫原性
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
表９ ７日齢の子ブタに対するＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の免疫原性
上記結果から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに。ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株も良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の異世代の培養物もいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに。ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株も良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の異世代の培養物もいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
３．ウイルス毒力回復安全性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
また、ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
この結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＨＮ１２０２−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＦａ−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この二種類の弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性が高い。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
また、ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
この結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＨＮ１２０２−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＦａ−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この二種類の弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性が高い。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
併せて、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型Ｆａ親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
この結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒親株に比べて、いずれもｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸において共通となる特徴的変化として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸における遺伝子欠失と完全に一致することが明確になった。さらに、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になった。また、ヘルペスウイルスにおいて、連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することは、その強毒親株の毒性低下の原因となることが明確になった。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
併せて、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型Ｆａ親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
この結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒親株に比べて、いずれもｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸において共通となる特徴的変化として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸における遺伝子欠失と完全に一致することが明確になった。さらに、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になった。また、ヘルペスウイルスにおいて、連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することは、その強毒親株の毒性低下の原因となることが明確になった。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株弱毒生ワクチンの製造）
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１０に示す。
表１０ ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの含有量配合比
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１０に示す。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚２０匹を５匹／群でランダムに４群に分けて、実施例８で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン３を免疫し、第３組はワクチン４を免疫し、第２組と第４組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻撃後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１１に示す。
表１１ ＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚２０匹を５匹／群でランダムに４群に分けて、実施例８で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン３を免疫し、第３組はワクチン４を免疫し、第２組と第４組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻撃後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１１に示す。
上記結果から分かるように、実施例８で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚へ保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ遺伝子欠失株の構築）
相同組み換え方法を利用して、分子クローン操作によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子をノックオフして、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ遺伝子欠失株を獲得した。具体的な操作方法は下記の通りで行った。
ＰＲＶ ＨＮ１２０１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーとしてＵＳ７−ＬＰ１／ＵＳ７−ＬＰ２、ＵＳ２−ＲＰ１／ＵＳ２−ＲＰ２を利用し、それぞれＵＳ７の前に位置する配列とＵＳ２の後に位置する配列、左と右の組み換えアームとなるＵＳ７ＬとＵＳ２Ｒを増幅した。その中でｇＩＬとＵＳ２Ｒの一端にはそれぞれ一つのｌｏｘＰサイトがあり、緑色蛍光タンパク質となるＥＧＦＰを選別標識として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫプラスミドによりｌｏｘＰサイトを有するｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰ導入ベクターを構築した。
ＤＮＡＺｏｌ法によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株を感染したＰＫ−１５細胞総ＤＮＡを抽出し、リポソームトランスフェクション法を利用して、細胞総ＤＮＡと導入ベクターｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰを１０ｕｇ：１ｕｇの量でＰＫ−１５細胞に共トランスフェクションし、８０％の細胞が病変する時にウイルスを獲得した。段階希釈した後、ＰＫ−１５単層細胞を接種し、プラーク精製法によりＥＧＦＰを有する組み換えウイルスｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−／ＧＦＰを得た。１０ｕｇｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−／ＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを取り、２．５単位のＣｒｅ組み換え酵素を加入し、３７℃で１時間作用し、ＤＮＡを抽出して、ｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−のＤＮＡを製造した。ＰＫ−１５細胞をトランスフェクションし、プラーク精製でＥＧＦＰをノックオフした欠失株となるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−遺伝子欠失株を得た。
相同組み換え方法を利用して、分子クローン操作によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子をノックオフして、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ遺伝子欠失株を獲得した。具体的な操作方法は下記の通りで行った。
ＰＲＶ ＨＮ１２０１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーとしてＵＳ７−ＬＰ１／ＵＳ７−ＬＰ２、ＵＳ２−ＲＰ１／ＵＳ２−ＲＰ２を利用し、それぞれＵＳ７の前に位置する配列とＵＳ２の後に位置する配列、左と右の組み換えアームとなるＵＳ７ＬとＵＳ２Ｒを増幅した。その中でｇＩＬとＵＳ２Ｒの一端にはそれぞれ一つのｌｏｘＰサイトがあり、緑色蛍光タンパク質となるＥＧＦＰを選別標識として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫプラスミドによりｌｏｘＰサイトを有するｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰ導入ベクターを構築した。
ＤＮＡＺｏｌ法によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株を感染したＰＫ−１５細胞総ＤＮＡを抽出し、リポソームトランスフェクション法を利用して、細胞総ＤＮＡと導入ベクターｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰを１０ｕｇ：１ｕｇの量でＰＫ−１５細胞に共トランスフェクションし、８０％の細胞が病変する時にウイルスを獲得した。段階希釈した後、ＰＫ−１５単層細胞を接種し、プラーク精製法によりＥＧＦＰを有する組み換えウイルスｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−／ＧＦＰを得た。１０ｕｇｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−／ＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを取り、２．５単位のＣｒｅ組み換え酵素を加入し、３７℃で１時間作用し、ＤＮＡを抽出して、ｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−のＤＮＡを製造した。ＰＫ−１５細胞をトランスフェクションし、プラーク精製でＥＧＦＰをノックオフした欠失株となるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−遺伝子欠失株を得た。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−遺伝子欠失株の弱毒生ワクチンの製造）
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ遺伝子欠失株の弱毒生ワクチンを製造し、ワクチン含有量の具体的な配合比を表１２に示す。
表１２ ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの含有量配合比
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚１０匹を５匹／群でランダムに２群に分けて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒活ワクチンを接種した。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察する。具体的な結果を表１３に示す。
表１３ ＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
結果から分かるように、遺伝子工学手段で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚への保護率は８０％（４／５）であることに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ遺伝子欠失株の弱毒生ワクチンを製造し、ワクチン含有量の具体的な配合比を表１２に示す。
表１２ ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの含有量配合比
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚１０匹を５匹／群でランダムに２群に分けて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒活ワクチンを接種した。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察する。具体的な結果を表１３に示す。
表１３ ＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
結果から分かるように、遺伝子工学手段で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚への保護率は８０％（４／５）であることに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ−ｇＥ−１１Ｋ−２８Ｋ−株弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
実施例１２ （ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の獲得）
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株及びヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養してヘルペスウイルス弱毒株が得られ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株とヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株と命じる。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株及びヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養してヘルペスウイルス弱毒株が得られ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株とヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株と命じる。
（ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の生物学特性の検討）
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を５匹／組でランダムに６組（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｍ）に分け、また、空白対照群として１５匹を設置し、組分けと攻撃状況を表１４に示す。
表１４ ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の病原性試験動物の組分け
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を５匹／組でランダムに６組（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｍ）に分け、また、空白対照群として１５匹を設置し、組分けと攻撃状況を表１４に示す。
ウイルスを接種した後２８日観察し、毎日、子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１５に示す。
表１５ ７日齢の子ブタに対するＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の病原性
表１５ ７日齢の子ブタに対するＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の病原性
上記結果から、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は毒性が大幅に低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は毒性が大幅に低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨｅＮ１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨｅＮ１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察したところ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ各組４〜５匹の豚が体温上昇しただけであった。また、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。さらに、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ各組４〜５匹の豚が体温上昇しただけであった。また、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ各組４〜５匹の豚が体温上昇しただけであった。また、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
２．免疫原性試験
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
表１６ ７日齢子ブタに対するＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の免疫原性
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
上記結果から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。また、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株培養物で免疫し、免疫後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株培養物で免疫し、免疫後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康に生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康に生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康に生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
３．ウイルス毒力回復安全性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
その結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株感染実験豚、３０匹のＨｅＮ１−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＪＳ−２０１２−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この三つの弱毒株は毒力回復現象がないことが明確になった。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなく、安全性が高いことが示された。
その結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株感染実験豚、３０匹のＨｅＮ１−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＪＳ−２０１２−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この三つの弱毒株は毒力回復現象がないことが明確になった。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなく、安全性が高いことが示された。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＰＲＶ−ＺＪ０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨｅＮ１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
さらに、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＪＳ−２０１２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＰＲＶ−ＺＪ０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨｅＮ１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
さらに、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＪＳ−２０１２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
その結果、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物では、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は、共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物では、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は、共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。さらに、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物では、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は、共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株とヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、強毒親株に比べて、いずれもｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸に共通となる特徴性変化は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸における遺伝子欠失と完全に一致することが明確になった。また、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になり、更に、ヘルペスウイルスが連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することはその強毒親株の毒性低下の原因となることを明らかにした。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸に共通となる特徴性変化は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸における遺伝子欠失と完全に一致することが明確になった。また、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になり、更に、ヘルペスウイルスが連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することはその強毒親株の毒性低下の原因となることを明らかにした。
（ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンの製造）
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１７に示す。
表１７ ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチン含有量
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１７に示す。
表１７ ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチン含有量
（ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚３０匹を５匹／群でランダムに６群に分けて、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−ＺＪ０１−２０１２−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン６で免疫し、第３組はワクチン７で免疫し、第５組はワクチン８で免疫し、第２組と第４組と第６組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹とした。攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１８に示す。
表１８ 三つの弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚３０匹を５匹／群でランダムに６群に分けて、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−ＺＪ０１−２０１２−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン６で免疫し、第３組はワクチン７で免疫し、第５組はワクチン８で免疫し、第２組と第４組と第６組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹とした。攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１８に示す。
表１８ 三つの弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
上記結果から分かるように、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であったことに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であったことに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であったことに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。このように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示した。さらに、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさないことが示された。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性の広域性試験）
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚５０匹を５匹／群でランダムに１０群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組、第３組、第５組、第７組と第９組はワクチン１で免疫し、第２組、第４組、第６組、第８組、第１０組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であった。さらに、第７組、第８組の投与量がヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第９組、第１０組の投与量はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１９に示す。
表１９ ＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性の広域性試験結果
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚５０匹を５匹／群でランダムに１０群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組、第３組、第５組、第７組と第９組はワクチン１で免疫し、第２組、第４組、第６組、第８組、第１０組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であった。さらに、第７組、第８組の投与量がヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第９組、第１０組の投与量はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１９に示す。
結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、異なる由来のヘルペスウイルスの感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。
この結果から、本発明で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは優れた免疫広域性を備え、異なる由来の流行性ヘルペスウイルスの攻撃に対して完全に保護作用を有することが証明された。
この結果から、本発明で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは優れた免疫広域性を備え、異なる由来の流行性ヘルペスウイルスの攻撃に対して完全に保護作用を有することが証明された。
以上の記載はただ本発明の好ましい実施例を示しただけであり、本発明を限定するものではない。上記のように、好ましい実施例により本発明を開示したが、それらは本発明を限定しない。当業者は、本発明の主旨の範囲内に、上記の技術的内容を利用して修正や変更を行って等価置換して等価実施例を作成できる。また、本発明の技術態様の範囲内において、本発明の技術の主旨により、上記の実施例に対して行ういかなる簡単な修正、等価置換と修飾はいずれも本発明の技術方案に該当する。
本発明はヘルペスウイルス弱毒化方法、弱毒化ウイルス株及び当該ウイルス株を利用して製造するワクチン組成物に関し、獣用生物製品の分野に属する。
オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）アルファヘルペスウイルス亜科におけるヘルペスウイルスＩ型（Ｓｕｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １ ｓｔｒａｉｎ）を原因として、豚、牛、羊等の多種の家畜、家禽と野生動物で引き起こされ、発熱、かゆみ（豚を除く）及び脳脊髄炎を主症状とする急性伝染病である。豚オーエスキー病は、わが国で広く存在しており、被害が深刻化し、大規模養豚場の生産を阻害する主な疫病の一つである。感染すると、妊娠豚が流産、死産、ミイラ胎子を起こし、また、子豚が神経症状、まひを起こし、死亡率が高い。ＰＲＶは強い向汎性、神経向性、潜伏感染特性を有し、末梢神経系に長期にわたって潜伏して感染することができる。潜伏するウイルスが活性化されて、感染力を持つウイルスに転換した場合、潜伏感染している宿主は発病する。
最近の研究から、豚オーエスキー病が新しい特徴を有することが報じられている。目立つ表現として、どんな年齢の豚でも感染することがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲である。また、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲であり（子豚の死亡率は１００％と高い）、豚が感染すると、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがきを起こし、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠豚は流産（流産率が３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚の産出（弱い子豚が１４日齢になるまでに全例死亡）などの生殖障害症状を引き起こす。
従来のワクチンを接種した豚は、野生ウイルスの攻撃に完全には抵抗できず、依然として、高熱、意気消沈、食欲不振又は絶食などの症状を起こす。感染率は８０％を超え、発病率は３０％を超え、死亡率は１０％〜２０％の範囲である（ヘルペスウイルスの新しい流行株の分離・同定及び抗原多様性の解析、彭金美など、中国予防獣医学報、２０１３、３５（１）：１−４；免疫後発症した子ブタにおけるヘルペスウイルスの分離・同定、童武など、中国動物伝染病学報、２０１３，２１（３）：１−７；Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ，２０１２．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，
Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１４，２０（１）：１０２−１０４； Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｐｉｇｓ，Ｃｈｉｎａ，Ａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３．１９（１１）：１７４９−１７５５を参照）。従来技術において、ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病を解決できるワクチンは未だ存在しない。
Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１４，２０（１）：１０２−１０４； Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｐｉｇｓ，Ｃｈｉｎａ，Ａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３．１９（１１）：１７４９−１７５５を参照）。従来技術において、ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病を解決できるワクチンは未だ存在しない。
ヘルペスウイルス変異株によるオーエスキー病の有効な予防・制御方法はワクチンを接種することであり、開発されたワクチン製品は不活化ワクチンであってもよく、弱毒株から製造された生ワクチンであってもよい。しかし、不活化ワクチンはコストが高く、他方、生ワクチンは、一般的には、遺伝子工学手段により毒力遺伝子を人工的に欠失させてウイルス株を弱毒化して製造されるので、生物的安全性に問題がある。
上記の問題を解決するために、本発明は、細胞継代培養で、ウイルス株を自然に弱毒化し、完全な自然進化過程において変異させ、自然環境条件に完全に適応して、当該弱毒化ウイルス株の安定性を確保し、生物的安全性には危険性がない弱毒化方法を提供する。
本発明の第１の態様はヘルペスウイルスの弱毒化方法であり、前記方法は、（１）ヘルペスウイルスを哺乳動物継代細胞に接種して継代培養し、前記ヘルペスウイルスを５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適合株を得るヘルペスウイルスの適応培養工程と、（２）前記工程（１）の前記ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適合株を禽由来継代細胞に接種して継代培養し、前記ヘルペスウイルスを１代以上継代して、前記ヘルペスウイルス弱毒株を得るヘルペスウイルスの弱毒化工程と、を含む。
本発明の一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）におけるヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＨＥＢ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＰＲＶ ＴＪ株、ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ−ＺＪ０１、ヘルペスウイルス変異株ＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルス変異株ＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株を含む。
ヘルペスウイルス株ＪＳ−２０１２株は、「免疫後発症した子ブタにおけるヘルペスウイルスの分離・同定」（童武、張青占、鄭浩など、中国動物伝染病学報、２０１３，２１（３）：１−７）に開示される。ヘルペスウイルスＨｅＮ１株は、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタに寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣＮＯ．６６５６であり、中国特許出願ＣＮ１０２９９４４５８Ａに開示される。ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣＰＲＶ−ＨＥＢ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株は、Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，Ｘｉｕｌｉｎｇ Ｙｕ，Ｚｈｉ Ｚｈｏｕ，Ｄｏｎｇｍｅｉ
Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｎａ，２０１２ ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ ｏｌ．２０，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４に開示される。ＰＲＶ ＴＪ ｓｔｒａｉｎ（ＰＲＶ ＴＪ）株は、ＣｈｉｎａＣｈｕｎ−Ｈｕａ Ｗａｎｇ Ｊｉｎ Ｙｕａｎ１，Ｈｕａ−Ｙａｎｇ Ｑｉｎ１、ｅｔ ａｌ、Ａ ｎｏｖｅｌ ｇＥ−ｄｅｌｅｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＲＶ ｖａｒｉａｎｔｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎ Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｓｗｉｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｖａｃｃｉｎｅ ３２（２０１４）３３７９-３３８５に開示される。
Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｎａ，２０１２ ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ ｏｌ．２０，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４に開示される。ＰＲＶ ＴＪ ｓｔｒａｉｎ（ＰＲＶ ＴＪ）株は、ＣｈｉｎａＣｈｕｎ−Ｈｕａ Ｗａｎｇ Ｊｉｎ Ｙｕａｎ１，Ｈｕａ−Ｙａｎｇ Ｑｉｎ１、ｅｔ ａｌ、Ａ ｎｏｖｅｌ ｇＥ−ｄｅｌｅｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＲＶ ｖａｒｉａｎｔｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎ Ｂａｒｔｈａ−Ｋ６１−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｓｗｉｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｖａｃｃｉｎｅ ３２（２０１４）３３７９-３３８５に開示される。
ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ−ＺＪ０１は、受託番号がＣＧＭＣＣＮｏ．８１７０であり、ＣＮ１０３６２７６７８Ａに開示される。ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年５月２０日である。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ． Ｖ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が２０１３年８月２６日である。ヘルペスウイルスＦａ株は、ヘルペスウイルスＦａ株ｇＢ＿ｇＣ＿ｇＤ遺伝子のクローンと配列解析［Ｊ］．陳振海等、福建農業学報２００７、２２（２）：１２０−１２５に開示される。
本発明の好ましい一実施態様では、工程（１）におけるヘルペスウイルス株が、ＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、Ｆａ株、ＰＲＶ−ＺＪ０１株、ＨｅＮ１株、ＪＳ−２０１２株である。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）における前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはＩＢＲＳ−２、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５、ウシ精巣継代細胞ＢＴ或いはベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１を含み、前記工程（２）における前記禽由来継代細胞がＤＦ−１である。
前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４６）、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−３３）或いはＩＢＲＳ−２（たとえば、ＤＥＣＡＳＴＲＯ、Ｍ．Ｐ．１９６４．Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢ−ＲＳ−２ ｓｗｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ａｒｑｕｉｖｏｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ３１：６３−７８を参照）、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０６）、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２１９）、ウシ腎臓継代細胞ＭＤＢＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２）、ウシ精巣継代細胞ＢＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１３９０）、ベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０）である。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）における前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはＩＢＲＳ−２、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５、ウシ精巣継代細胞ＢＴ或いはベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１を含み、前記工程（２）における前記禽由来継代細胞がＤＦ−１である。
前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４６）、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−３３）或いはＩＢＲＳ−２（たとえば、ＤＥＣＡＳＴＲＯ、Ｍ．Ｐ．１９６４．Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢ−ＲＳ−２ ｓｗｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ａｒｑｕｉｖｏｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ３１：６３−７８を参照）、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０６）、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８１）、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２１９）、ウシ腎臓継代細胞ＭＤＢＫ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２）、ウシ精巣継代細胞ＢＴ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１３９０）、ベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１０）である。
本発明の好ましい一実施態様では、工程（１）に記載される哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはサル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５であり、好ましくは、工程（２）に記載される禽由来継代細胞はＤＦ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２２０３）である。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）のヘルペスウイルスの適応培養工程は、前記哺乳動物継代細胞がパンクレアチンで分散されて消化し、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成することと、前記ヘルペスウイルスを前記継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を収集して継続継代用ウイルス種として、次の継代を行い、５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を得ること、を含む。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞５代である。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞１８代である。
好ましくは、工程（１）は、更に以下の工程を含む。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）のヘルペスウイルスの適応培養工程は、前記哺乳動物継代細胞がパンクレアチンで分散されて消化し、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成することと、前記ヘルペスウイルスを前記継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を収集して継続継代用ウイルス種として、次の継代を行い、５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を得ること、を含む。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞５代である。
好ましくは、工程（１）において、ヘルペスウイルスが哺乳動物継代細胞で継代する継代数＞１８代である。
好ましくは、工程（１）は、更に以下の工程を含む。
（１ａ）ウイルス接種用細胞の継代・培養 前記継代細胞はパンクレアチンにより細胞分散して消化され、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成する。
（１ｂ）ウイルスの繁殖
前記ヘルペスウイルスを前記工程（１ａ）で得られた継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を継続継代用ウイルス種として獲得する。
工程（１ａ）、（１ｂ）において、細胞培養の温度が３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（１ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
（１ｂ）ウイルスの繁殖
前記ヘルペスウイルスを前記工程（１ａ）で得られた継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を継続継代用ウイルス種として獲得する。
工程（１ａ）、（１ｂ）において、細胞培養の温度が３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（１ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（１ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
その中で、ヘルペスウイルスを増殖しやすい継代細胞の培養を適する細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液からなる群から選ばれるいずれか１種を含むが、それらに限定されない。また、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含むが、それらに限定されない。
また、前記細胞培養液はＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清はウシ胎児血清であることが好ましい。
また、前記細胞培養液はＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清はウシ胎児血清であることが好ましい。
本発明の一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（２）の前記ヘルペスウイルスの弱毒化工程は、前記禽由来継代細胞がパンクレアチンにより細胞分散されて消化され、細胞培養液を用いて継続培養され、継代細胞単層を形成することと、前記工程（１）で得られた前記ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を前記禽由来継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養することと、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得することと、或いは、前記獲得したウイルス液は次の継代を行い、１代以上継代して、前記ヘルペスウイルス弱毒株を得ることと、を含む。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞１代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が引き続いて禽由来継代細胞で継代する継代数は３〜１１０代であることが好ましい。
好ましくは、工程（２）は、更に以下の工程を含む。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞１代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代であることが好ましい。
工程（２）において、ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が引き続いて禽由来継代細胞で継代する継代数は３〜１１０代であることが好ましい。
好ましくは、工程（２）は、更に以下の工程を含む。
（２ａ）ウイルス接種用細胞の継代・培養
前記継代細胞は、パンクレアチンにより細胞分散して消化され、細胞培養液を用いて継続培養され、継代細胞単層を形成する。
（２ｂ）ウイルスの繁殖
前記工程（１）で得たヘルペスウイルスを、前記工程（２ａ）で得た継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得する。
工程（２ａ）、（２ｂ）で、細胞培養の温度は、３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（２ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
その中で、ヘルペスウイルスを増殖しやすい禽由来継代細胞の培養に適する細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液からなる群から選ばれるいずれか１種を含むが、それらに限定されない。また、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含むが、それらに限定されない。
また、前記細胞培養液は、ＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であることが好ましい。
前記継代細胞は、パンクレアチンにより細胞分散して消化され、細胞培養液を用いて継続培養され、継代細胞単層を形成する。
（２ｂ）ウイルスの繁殖
前記工程（１）で得たヘルペスウイルスを、前記工程（２ａ）で得た継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得する。
工程（２ａ）、（２ｂ）で、細胞培養の温度は、３６℃〜３８℃であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、ヘルペスウイルスを接種する時の接種量がヘルペスウイルス維持液に対して１体積％〜２体積％であることが好ましい。
工程（２ａ）において、細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であることが好ましい。
工程（２ｂ）において、細胞維持液は、９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であることが好ましい。
その中で、ヘルペスウイルスを増殖しやすい禽由来継代細胞の培養に適する細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液からなる群から選ばれるいずれか１種を含むが、それらに限定されない。また、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含むが、それらに限定されない。
また、前記細胞培養液は、ＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であることが好ましい。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）では、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）では、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）では、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）に、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数が３〜１１０代である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０である。前記細胞維持液は９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であり、前記細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液を含む。前記ウシ血清はウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含み、前記細胞培養の温度は３６℃〜３８℃である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記工程（１）では、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）に、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数が３〜１１０代である。
本発明の好ましい一実施態様として、本発明に係るヘルペスウイルスの弱毒化方法において、前記細胞培養液は、９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０である。前記細胞維持液は９５体積％〜９９体積％の細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であり、前記細胞培養液は、ＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液を含む。前記ウシ血清はウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含み、前記細胞培養の温度は３６℃〜３８℃である。
本発明の最も好ましい一実施態様として、前記細胞培養液がＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であり、前記細胞培養の温度が３６℃〜３８℃である。
本発明の他の態様は、前記ヘルペスウイルスの弱毒化方法により弱毒化されたヘルペスウイルス弱毒株を提供し、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋの四つのタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子にはｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失する。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株において、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続する遺伝子を欠失する。
好ましくは、前記ヘルペスウイルス株がヘルペスウイルス変異株であり、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を含む。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失する。
本発明の他の態様は、前記ヘルペスウイルスの弱毒化方法により弱毒化されたヘルペスウイルス弱毒株を提供し、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋの四つのタンパク質を発現できない。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ウイルス遺伝子にはｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失する。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株において、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続する遺伝子を欠失する。
好ましくは、前記ヘルペスウイルス株がヘルペスウイルス変異株であり、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を含む。
好ましくは、工程（２）で得られたヘルペスウイルス弱毒株は、強毒親株に比べて、ｇＩ遺伝子の第８９０位のヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失する。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ
ＨＮ１２０１−Ｒ）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１５１６であり、寄託単位が中国典型培養物寄託センタであり、寄託日が２０１５年３月１７日であり、寄託場所が中国武漢・武漢大学である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株である。
ＨＮ１２０１−Ｒ）であり、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１５１６であり、寄託単位が中国典型培養物寄託センタであり、寄託日が２０１５年３月１７日であり、寄託場所が中国武漢・武漢大学である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株である。
本発明の最も好ましい一実施態様では、本発明に係るヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株である。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、これをヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株に比べて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、欠失配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｇＩタンパク質アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるｇＥタンパク質アミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示される１１Ｋタンパク質アミノ酸配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示される２８Ｋタンパク質アミノ酸配列を含む。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒株の攻撃に抵抗できる。同時に、ＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなくので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０１強毒株の攻撃に抵抗できる。同時に、ＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなくので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株は本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、これをヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株に比べて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨＮ１２０２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性が回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＦａ株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＦａ株に比べて、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＦａ強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＦａ強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、Ｆａ−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＦａ株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスは、ヘルペスウイルスＦａ強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下し、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＦａ強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、Ｆａ−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＦａ株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に比べて、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に比べて、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨｅＮ１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変換して発病させることがないので、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化は認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＨｅＮ１強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＨｅＮ１−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変換して発病させることがないので、安全性を有する。
本発明の好ましい一実施態様では、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株は、本発明の弱毒化手段で弱毒化されてヘルペスウイルス弱毒株として得られ、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株と命名する。ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に比べて、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子から合計で３４５５ｂｐの連続するウイルス遺伝子を欠失し、遺伝子の欠失部位、長さはヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒと完全に一致する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＪＳ−２０１２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を有する。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の１代〜１１０代の培養物は、豚に対する病原力が顕著に低下する傾向がある。接種後の豚を２８日間観察した結果、臨床症状が現れず、解剖で組織器官の変化が認められなかった。従って、当該ウイルスはヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒親株に比べて、病原力が顕著に低下するので、人工的に弱毒化されたウイルス株である。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、第１１０代まで培養されても、よい免疫原性を有する。接種から２１日後、豚はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２強毒株の攻撃に抵抗できる。このとき、ＪＳ−２０１２−Ｒ株の培養物を接種しない豚は、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株の攻撃に抵抗できず、全例発病する。
ウイルス毒性回復試験から分かるように、１代〜１１０代培養したウイルスは、接種された後、豚群において連続接触して複数回継代しても、毒性を回復しない。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を有する。
「ヘルペスウイルス変異株」という用語は、高病原性ヘルペスウイルス株とも呼ばれ、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短い（１〜２日）。発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲である（子豚の死亡率は１００％と高い）。感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがきを起こし、最後に不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠豚は流産（３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚の産出（弱い子豚が１４日齢になるまでに全例死亡）などの生殖障害症状を引き起こす。
前記ヘルペスウイルス変異株は、分離された前記豚ヘルペスウイルス変異株であって、前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状を引き起こすウイルス株であることが好ましい。
前記ヘルペスウイルス変異株は、好ましくは、ｇＥタンパク質アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３であり、或いは配列相同性が９５％以上のタンパク質配列であるウイルス株である。
前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来のｇＥ、ＴＫ、ｇＩ遺伝子の１及び１以上の遺伝子を欠失したヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として豚オーエスキー病に感染し、かつ前記ヘルペスウイルス変異株が９〜１０日齢の子ブタを意気消沈と食欲不振にさせるウイルス株を含むことが好ましい。
前記ヘルペスウイルス変異株は、分離された前記豚ヘルペスウイルス変異株であって、前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状を引き起こすウイルス株であることが好ましい。
前記ヘルペスウイルス変異株は、好ましくは、ｇＥタンパク質アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３であり、或いは配列相同性が９５％以上のタンパク質配列であるウイルス株である。
前記ヘルペスウイルス変異株による伝染を再現する時に、従来のｇＥ、ＴＫ、ｇＩ遺伝子の１及び１以上の遺伝子を欠失したヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚が、依然として豚オーエスキー病に感染し、かつ前記ヘルペスウイルス変異株が９〜１０日齢の子ブタを意気消沈と食欲不振にさせるウイルス株を含むことが好ましい。
本発明における「相同性」という用語は、本出願では、二本のアミノ酸配列或いは二本のヌクレオチド配列の類似度を意味する。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の相同性は、本分野で既知のあらゆる適当な方法によって算出される。たとえば、目標となるアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列を参照アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列に配列照合して、必要な場合には、欠失を入れて、照合する二本の配列の間で同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）の数を最適化させ、それに基づいて二本のアミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の間における同じアミノ酸（或いはヌクレオチド）どうしの百分率を算出することができる。アミノ酸（或いはヌクレオチド）配列の照合と相同性の計算は、本分野で既知のソフトウェアによって実現され、たとえば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能である。または、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０） ；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェア（ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）から入手可能である。或いは、たとえば、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ
ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）を参照）；及びＴＣｏｆｆｅｅソフトウェア等（スイスバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）から入手可能である。或いは、たとえば、Ｐｏｉｒｏｔ Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）ご参照）が挙げられるが、それらに限定されない。ソフトウェアを使って配列を照合するときに、ソフトウェアの既定パラメーターを使用し、或いは実際の状況によってソフトウェアのパラメーターを調整することができ、それは当業者の知識範囲内にある。
ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）を参照）；及びＴＣｏｆｆｅｅソフトウェア等（スイスバイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｔｃｏｆｆｅｅ／ｔｃｏｆｆｅｅ＿ｃｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ）から入手可能である。或いは、たとえば、Ｐｏｉｒｏｔ Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）ご参照）が挙げられるが、それらに限定されない。ソフトウェアを使って配列を照合するときに、ソフトウェアの既定パラメーターを使用し、或いは実際の状況によってソフトウェアのパラメーターを調整することができ、それは当業者の知識範囲内にある。
「ｇＩタンパク質」という用語は、ＵＳ７によってコードされ、３６６個アミノ酸を含むことを意味する。
「ｇＥタンパク質」という用語は、ＵＳ８によってコードされ、５７９個アミノ酸を含むことを意味する。
「１１Ｋ」という用語は、ＵＳ９によってコードされ、９８個アミノ酸を含むことを意味する。
「２８Ｋ」という用語は、ＵＳ２によってコードされ、２５６個アミノ酸を含むことを意味する。
本発明の「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋを意味するとともに、「／」は本発明において「及び」という意味である。従って、「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質を不活性化させる」とは、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
別段の指摘がない限り、本発明の「ＰＲＶ−ｇＩ − −ｇＥ − −１１Ｋ − −２８Ｋ − 」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋ遺伝子を欠失させることを意味する。
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子の連続欠失による相応の機能不活性化は、本技術分野の既知の方式で行われてもよい。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はＯＲＦ全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
「ｇＥタンパク質」という用語は、ＵＳ８によってコードされ、５７９個アミノ酸を含むことを意味する。
「１１Ｋ」という用語は、ＵＳ９によってコードされ、９８個アミノ酸を含むことを意味する。
「２８Ｋ」という用語は、ＵＳ２によってコードされ、２５６個アミノ酸を含むことを意味する。
本発明の「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋを意味するとともに、「／」は本発明において「及び」という意味である。従って、「ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋタンパク質を不活性化させる」とは、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ、２８Ｋの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
別段の指摘がない限り、本発明の「ＰＲＶ−ｇＩ − −ｇＥ − −１１Ｋ − −２８Ｋ − 」という用語は、ｇＩ、ｇＥ、１１Ｋ及び２８Ｋ遺伝子を欠失させることを意味する。
ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子の連続欠失による相応の機能不活性化は、本技術分野の既知の方式で行われてもよい。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はＯＲＦ全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
本発明の他の態様では、ワクチン組成物を製造する方法を提供する。前記方法は、（１）前記ヘルペスウイルス弱毒株或いは培養物を増幅培養して、増幅した前記ヘルペスウイルス弱毒株を獲得する工程と、（２）前記工程（１）で得られた前記増幅したヘルペスウイルス弱毒株にベクターを加入する工程と、を含む。本発明の好ましい一実施態様では、本発明に係るワクチン組成物の製造方法において、前記ヘルペスウイルス弱毒株培養物はヘルペスウイルス弱毒株の１〜１１０代培養物を含む。
本発明の好ましい一実施態様では、前記ワクチン組成物の製造方法において、前記方法は、（１）ヘルペスウイルス弱毒株を培養する工程と、（２）前記培養したヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を加入する工程と、を含む。
本発明の他の態様は、製造したワクチン組成物を提供し、その中で、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量＞１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明により製造したワクチン組成物において、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量が１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様では、前記ワクチン組成物の製造方法において、前記方法は、（１）ヘルペスウイルス弱毒株を培養する工程と、（２）前記培養したヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を加入する工程と、を含む。
本発明の他の態様は、製造したワクチン組成物を提供し、その中で、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量＞１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明により製造したワクチン組成物において、前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量が１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は凍結乾燥保護剤をさらに含有する。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株抗原である。
本発明の好ましい一実施態様として、ヘルペスウイルス弱毒株抗原がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は凍結乾燥保護剤をさらに含有する。
ワクチンにアジュバント活性を有する１種以上の化合物を添加しても良い。本発明に係る生きている弱毒化のヘルペスウイルスは、必ずしもこのようなアジュバントで効果を実現するわけではないが、特に本発明に係る生きている弱毒化のヘルペスウイルスと他の病原ウイルス或いは病原微生物（詳しくは後述する）の抗原性物質との組み合わせワクチンには、アジュバントを添加してもよい。アジュバントは免疫システムの非特異的刺激剤であり、宿主のワクチンへの免疫応答を補強するものである。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全アジュバント及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体、ヨーロッパ特許ＥＰ１０９９４２を参照すること）、サポニン、鉱油、植物油、Ｃａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。 更に、本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例を含有してもよく、ＳＰＧＡなどの安定化剤、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに加入する場合、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適するようになる。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。 更に、本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例を含有してもよく、ＳＰＧＡなどの安定化剤、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに加入する場合、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適するようになる。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
本発明の好ましい一実施態様として、前記ワクチン組成物には、更に豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群抗原、豚サーコウイルス抗原、ブタパラインフルエンザ菌抗原、豚肺炎マイコプラズマ抗原、豚パルボウイルス抗原、豚日本脳炎ウイルス抗原が含まれる。また、本発明のヘルペスウイルスワクチンを他の不活性化病原体或いは抗原と組み合わせて使用することで、豚オーエスキー病をはじめる各種類の疾病を抵抗する混合ワクチン或いは複合ワクチンを製造できる。
本発明における「混合ワクチン」という用語は、本発明のヘルペスウイルスと、少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンを意味する。
本発明における「複合ワクチン」という用語は、ウイルスと細菌から製造したワクチンを意味する。たとえば、本発明のヘルペスウイルスを、豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと混合し又は組み合わせることができる。
本発明における「混合ワクチン」という用語は、本発明のヘルペスウイルスと、少なくとも１種の異なるウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンを意味する。
本発明における「複合ワクチン」という用語は、ウイルスと細菌から製造したワクチンを意味する。たとえば、本発明のヘルペスウイルスを、豚コレラウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、豚サーコウイルス及び／又はブタパラインフルエンザ菌、マイコプラズマと混合し又は組み合わせることができる。
本発明の一実施態様として、前記ワクチンは、更に不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含むことができる。
好ましくは、上記の抗原は、豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び／又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
本発明の一実施態様として、本発明の弱毒株に外来遺伝子を挿入でき、前記外来遺伝子は、豚を感染するいろいろな病原体の１種以上の抗原をコードするものである。前記病原体は、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、豚サーコウイルス１型又は２型、大腸菌、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉ ｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブタパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、豚肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）からなる。
本発明の一実施態様として、前記抗原を外来遺伝子として本発明の弱毒株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に挿入する。
好ましくは、前記ワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。 本発明の組成物の成分或いは組成成分の量は、治療的有効量であることが好ましい。前記治療的有効量とは、組成物が投与された宿主においてそれらの免疫的作用をもたらして、過度な副作用を引き起こさないのに必要な量である。用いられる成分と投与しようとする組成物の正確な量は、様々な要素、例えば治療するべく疾患の類型、治療される動物の類型と年齢、投与方式、及び組成物における他の成分によって異なる。 本発明の他の態様は、ヘルペスウイルス関連疾病の予防・治療薬を製造するための上記のワクチン組成物の使用を提供する。
本発明の一実施態様として、上記のヘルペスウイルス関連疾病は、ヘルペスウイルス変異株に起因する豚オーエスキー病である。
好ましくは、上記の抗原は、豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び／又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
本発明の一実施態様として、本発明の弱毒株に外来遺伝子を挿入でき、前記外来遺伝子は、豚を感染するいろいろな病原体の１種以上の抗原をコードするものである。前記病原体は、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、豚サーコウイルス１型又は２型、大腸菌、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉ ｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブタパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、豚肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）からなる。
本発明の一実施態様として、前記抗原を外来遺伝子として本発明の弱毒株ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に挿入する。
好ましくは、前記ワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び／又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。 本発明の組成物の成分或いは組成成分の量は、治療的有効量であることが好ましい。前記治療的有効量とは、組成物が投与された宿主においてそれらの免疫的作用をもたらして、過度な副作用を引き起こさないのに必要な量である。用いられる成分と投与しようとする組成物の正確な量は、様々な要素、例えば治療するべく疾患の類型、治療される動物の類型と年齢、投与方式、及び組成物における他の成分によって異なる。 本発明の他の態様は、ヘルペスウイルス関連疾病の予防・治療薬を製造するための上記のワクチン組成物の使用を提供する。
本発明の一実施態様として、上記のヘルペスウイルス関連疾病は、ヘルペスウイルス変異株に起因する豚オーエスキー病である。
本文に用いられる「ヘルペスウイルス関連疾病」という用語は、以下の症状を示す意味として用いられることがある。即ち、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（１〜２日）、発病率は１０％〜１００％の範囲であり、発病した豚の死亡率は１０％〜１００％の範囲であり（子豚の死亡率は１００％と高い）、感染した豚は、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に不全による死亡に至る症状を引き起こす。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠豚は流産（流産率が３５％と高い）、早産、死産、弱い子豚の産出（弱い子豚が１４日齢になるまでに全部死亡）などの生殖障害症状を引き起こすが、それらに限定されない。
上記の症状と従来技術において普通のヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染した成熟豚（体重５０ｋｇ以上の豚）の主な症状が、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に不全による死亡に至ることである。他方、初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上と上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることであり、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などの呼吸系症状を引き起こす。 本文に用いられる「予防」という用語は、本発明のワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。「治療」という用語は、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染による症状を緩和し又は改善するあらゆる行為を意味する。
上記の症状と従来技術において普通のヘルペスウイルスを感染して生じた症状との相違点として、感染した成熟豚（体重５０ｋｇ以上の豚）の主な症状が、高熱（４０〜４２℃、３日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に不全による死亡に至ることである。他方、初生豚及び４週齢以下の子豚は突然に発病し、多量に死亡し、死亡率が９０％以上となり、発病した子豚の主な症状は、体温が４１℃以上と上昇し、食欲がなくなると伴い、明らかな神経症状と下痢があることであり、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などの呼吸系症状を引き起こす。 本文に用いられる「予防」という用語は、本発明のワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。「治療」という用語は、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染による症状を緩和し又は改善するあらゆる行為を意味する。
本発明は、以下のような際立つ効果を有する。
（１）本発明のウイルス株は、自然継代手段で天然的に毒性遺伝子を欠失し、自然によく適応できて、毒力が回復する恐れがなく、生物的安全性が高い。
（２）本発明に係る野生ウイルス弱毒化方法は、方法を行った結果の安定性、取り扱い性、再現性に優れ、異なる強毒株の弱毒化手段を提供する。
（３）本発明に係るウイルス株は、毒性が低く、より良い免疫保護が得られ、早期に抗体を誘導できる。
（４）本発明のウイルス株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に、通常の生物学技術により異なる外来遺伝子を挿入して対応する組み換えウイルスを構築できるので、有益な潜在能力を期待できる。
（１）本発明のウイルス株は、自然継代手段で天然的に毒性遺伝子を欠失し、自然によく適応できて、毒力が回復する恐れがなく、生物的安全性が高い。
（２）本発明に係る野生ウイルス弱毒化方法は、方法を行った結果の安定性、取り扱い性、再現性に優れ、異なる強毒株の弱毒化手段を提供する。
（３）本発明に係るウイルス株は、毒性が低く、より良い免疫保護が得られ、早期に抗体を誘導できる。
（４）本発明のウイルス株は、ｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子欠失区域に、通常の生物学技術により異なる外来遺伝子を挿入して対応する組み換えウイルスを構築できるので、有益な潜在能力を期待できる。
（配列表）
配列１はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株が弱毒化されて断片を欠失したヌクレオチド配列である。
配列２はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列３はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＥタンパク質のアミノ酸配列である。
配列４はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における１１Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
配列５はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における２８Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
配列１はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株が弱毒化されて断片を欠失したヌクレオチド配列である。
配列２はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列３はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片におけるｇＥタンパク質のアミノ酸配列である。
配列４はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における１１Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
配列５はヘルペスウイルス弱毒株ＨＮ１２０１−Ｒ株欠失断片における２８Ｋタンパク質のアミノ酸配列である。
以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例を結合して、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は例示にすぎないが、本発明の範囲を限定しない。当業者は、本発明の主旨と範囲から外れない限り、本発明の技術方案の詳細や形式に対して修正又は変更を行うことができるが、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入ると理解すべきである。
本発明の実施例では、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、Ｆａ株、ＰＲＶ−ＺＪ０１株、ＨｅＮ１株、ＪＳ−２０１２株を例として本発明を説明する。
本発明における「／匹」という用語は、１匹豚当たりのワクチン注射量を意味する。
本明細書に記載される「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）という用語は、細胞培養物の５０％を感染させることができるウイルス量を意味し、ウイルス感染力を表す手段の一つである。
本明細書に記載されるＤＭＥＭ培地は、アメリカＧｉｂｃｏ会社から購入したＤＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、その説明書にしたがって調製したものである。
本明細書に記載される「ＰＢＳ」とは、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を用い、《分子クローン》第三版に従って調製した。
ウシ胎児血清はＰＡＡ会社より購入された。
本発明の実施例では、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株、ＨＮ１２０２株、Ｆａ株、ＰＲＶ−ＺＪ０１株、ＨｅＮ１株、ＪＳ−２０１２株を例として本発明を説明する。
本発明における「／匹」という用語は、１匹豚当たりのワクチン注射量を意味する。
本明細書に記載される「ＴＣＩＤ５０」（５０％ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）という用語は、細胞培養物の５０％を感染させることができるウイルス量を意味し、ウイルス感染力を表す手段の一つである。
本明細書に記載されるＤＭＥＭ培地は、アメリカＧｉｂｃｏ会社から購入したＤＭＥＭ乾燥粉末培地を用いて、その説明書にしたがって調製したものである。
本明細書に記載される「ＰＢＳ」とは、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）の英語イニシャルであり、本発明では、０．０１ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を用い、《分子クローン》第三版に従って調製した。
ウシ胎児血清はＰＡＡ会社より購入された。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３１１であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年５月２０日である。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年８月２６日である。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１−Ｒ）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１５１６であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１５年３月１７日である。
ＰＲＶは、ヘルペスウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）の英語の略語である。
Ｍａｒｃ−１４５細胞はＡＴＣＣより購入された。
ＤＦ−１細胞はＡＴＣＣより購入された。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０２株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０２）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１３３５であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１３年８月２６日である。
本実施例に用いられるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ ＨＮ１２０１−Ｒ）は、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ ２０１５１６であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は２０１５年３月１７日である。
ＰＲＶは、ヘルペスウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）の英語の略語である。
Ｍａｒｃ−１４５細胞はＡＴＣＣより購入された。
ＤＦ−１細胞はＡＴＣＣより購入された。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の獲得）
１．良好に成長するＭａｒｃ−１４５細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
２．ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を上記の良好に成長する継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞維 持液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が確認された時に、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株として獲得し、継代用ウイルス種として用いた。獲得した異世代のウイルス液Ｐ１代、Ｐ２代、Ｐ３代、Ｐ４代、Ｐ５代、Ｐ６代、Ｐ７代、Ｐ８代、Ｐ９代、Ｐ１０代、Ｐ１５代、Ｐ２０代、Ｐ３０代、Ｐ５０代、Ｐ７０代、Ｐ９０代、Ｐ１１０代、Ｐ１３０代、Ｐ１５０代、Ｐ２００代をそれぞれ配列決定した結果、各世代のウイルスは遺伝子欠失が認められなかった。
３．良好に成長するＤＦ−１細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
４．工程２で得られたヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株の異世代のウイルス液をそれぞれ工程３で得られた良好に成長したＤＦ−１継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞維持液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養た。４０〜４８時間後、それぞれ細胞培養ウイルス液、即ち、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代のウイルスに遺伝子欠失は認められなかった。一方、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代のウイルスはいずれも遺伝子を欠失し、且つ各世代のウイルスはいずれもｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続した遺伝子を欠失した。
１．良好に成長するＭａｒｃ−１４５細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
２．ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を上記の良好に成長する継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞維 持液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が確認された時に、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株として獲得し、継代用ウイルス種として用いた。獲得した異世代のウイルス液Ｐ１代、Ｐ２代、Ｐ３代、Ｐ４代、Ｐ５代、Ｐ６代、Ｐ７代、Ｐ８代、Ｐ９代、Ｐ１０代、Ｐ１５代、Ｐ２０代、Ｐ３０代、Ｐ５０代、Ｐ７０代、Ｐ９０代、Ｐ１１０代、Ｐ１３０代、Ｐ１５０代、Ｐ２００代をそれぞれ配列決定した結果、各世代のウイルスは遺伝子欠失が認められなかった。
３．良好に成長するＤＦ−１細胞を取り、パンクレアチンを用いて消化し、細胞ボトル内に接種し、９０体積％〜９７体積％ＤＭＥＭ培養液と３体積％〜１０体積％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ｐＨ７．０〜８．０に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養した。こうして形成された良い単層をウイルスの接種に用いた。
４．工程２で得られたヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株の異世代のウイルス液をそれぞれ工程３で得られた良好に成長したＤＦ−１継代細胞単層に接種し、９５体積％〜９９体積％ＤＭＥＭ培養液と１体積％〜５体積％ウシ胎児血清を含む細胞維持液（ｐＨ７．１〜７．５に調整した）を用いて３６℃〜３８℃の条件で継続培養た。４０〜４８時間後、それぞれ細胞培養ウイルス液、即ち、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代のウイルスに遺伝子欠失は認められなかった。一方、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代のウイルスはいずれも遺伝子を欠失し、且つ各世代のウイルスはいずれもｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐの連続した遺伝子を欠失した。
Ｐ１−１代、Ｐ２−１代、Ｐ３−１代、Ｐ４−１代のウイルスが遺伝子を欠失しないこととＤＦ−１での継代数との関係を検証するために、引き続いて継代培養を行った。この結果、それぞれ、Ｐ１−２代、Ｐ１−３代、Ｐ１−４代、Ｐ１−５代、Ｐ１−６代、Ｐ１−７代、Ｐ１−８代、Ｐ１−９代、Ｐ１−１０代、Ｐ２−２代、Ｐ２−３代、Ｐ２−４代、Ｐ２−５代、Ｐ２−６代、Ｐ２−７代、Ｐ２−８代、Ｐ２−９代、Ｐ２−１０代、Ｐ３−２代、Ｐ３−３代、Ｐ３−４代、Ｐ３−５代、Ｐ３−６代、Ｐ３−７代、Ｐ３−８代、Ｐ３−９代、Ｐ３−１０代、Ｐ４−２代、Ｐ４−３代、Ｐ４−４代、Ｐ４−５代、Ｐ４−６代、Ｐ４−７代、Ｐ４−８代、Ｐ４−９代、Ｐ４−１０代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、異世代のウイルスはいずれも遺伝子欠失が認められなかった。ヘルペスウイルスをＭａｒｃ−１４５細胞で４代以下継代する場合、遺伝子の欠失はＤＦ−１での継代数と関係がないが、遺伝子の欠失はＭａｒｃ−１４５細胞での対応代数と関係があった。
遺伝子を欠失したウイルスがＤＦ−１細胞で引き続いて継代する際の安定性を検証するために、Ｐ５−１代、Ｐ６−１代、Ｐ７−１代、Ｐ８−１代、Ｐ９−１代、Ｐ１０−１代、Ｐ１５−１代、Ｐ２０−１代、Ｐ３０−１代、Ｐ５０−１代、Ｐ７０−１代、Ｐ９０−１代、Ｐ１１０−１代、Ｐ１３０−１代、Ｐ１５０−１代、Ｐ２００−１代を引き続いて継代培養した。この結果、それぞれＰ５−２代、Ｐ５−３代、Ｐ５−４代、Ｐ５−５代、Ｐ５−６代、Ｐ５−７代、Ｐ５−８代、Ｐ５−９代、Ｐ５−１０代、Ｐ６−２代、Ｐ６−３代、Ｐ６−４代、Ｐ６−５代、Ｐ６−６代、Ｐ６−７代、Ｐ６−８代、Ｐ６−９代、Ｐ６−１０代、Ｐ７−２代、Ｐ７−３代、Ｐ７−４代、Ｐ７−５代、Ｐ７−６代、Ｐ７−７代、Ｐ７−８代、Ｐ７−９代、Ｐ７−１０代、Ｐ８−２代、Ｐ８−３代、Ｐ８−４代、Ｐ８−５代、Ｐ８−６代、Ｐ８−７代、Ｐ８−８代、Ｐ８−９代、Ｐ８−１０代、Ｐ９−２代、Ｐ９−３代、Ｐ９−４代、Ｐ９−５代、Ｐ９−６代、Ｐ９−７代、Ｐ９−８代、Ｐ９−９代、Ｐ９−１０代、Ｐ１０−２代、Ｐ１０−３代、Ｐ１０−４代、Ｐ１０−５代、Ｐ１０−６代、Ｐ１０−７代、Ｐ１０−８代、Ｐ１０−９代、Ｐ１０−１０代、Ｐ１５−２代、Ｐ１５−３代、Ｐ１５−４代、Ｐ１５−５代、Ｐ１５−６代、Ｐ１５−７代、Ｐ１５−８代、Ｐ１５−９代、Ｐ１５−１０代、Ｐ２０−２代、Ｐ２０−３代、Ｐ２０−４代、Ｐ２０−５代、Ｐ２０−６代、Ｐ２０−７代、Ｐ２０−８代、Ｐ２０−９代、Ｐ２０−１０代、Ｐ３０−２代、Ｐ３０−３代、Ｐ３０−４代、Ｐ３０−５代、Ｐ３０−６代、Ｐ３０−７代、Ｐ３０−８代、Ｐ３０−９代、Ｐ３０−１０代、Ｐ５０−２代、Ｐ５０−３代、Ｐ５０−４代、Ｐ５０−５代、Ｐ５０−６代、Ｐ５０−７代、Ｐ５０−８代、Ｐ５０−９代、Ｐ５０−１０代、Ｐ７０−２代、Ｐ７０−３代、Ｐ７０−４代、Ｐ７０−５代、Ｐ７０−６代、Ｐ７０−７代、Ｐ７０−８代、Ｐ７０−９代、Ｐ７０−１０代、Ｐ９０−２代、Ｐ９０−３代、Ｐ９０−４代、Ｐ９０−５代、Ｐ９０−６代、Ｐ９０−７代、Ｐ９０−８代、Ｐ９０−９代、Ｐ９０−１０代、Ｐ１１０−２代、Ｐ１１０−３代、Ｐ１１０−４代、Ｐ１１０−５代、Ｐ１１０−６代、Ｐ１１０−７代、Ｐ１１０−８代、Ｐ１１０−９代、Ｐ１１０−１０代、Ｐ１３０−２代、Ｐ１３０−３代、Ｐ１３０−４代、Ｐ１３０−５代、Ｐ１３０−６代、Ｐ１３０−７代、Ｐ１３０−８代、Ｐ１３０−９代、Ｐ１３０−１０代、Ｐ１５０−２代、Ｐ１５０−３代、Ｐ１５０−４代、Ｐ１５０−５代、Ｐ１５０−６代、Ｐ１５０−７代、Ｐ１５０−８代、Ｐ１５０−９代、Ｐ１５０−１０代、Ｐ２００−２代、Ｐ２００−３代、Ｐ２００−４代、Ｐ２００−５代、Ｐ２００−６代、Ｐ２００−７代、Ｐ２００−８代、Ｐ２００−９代、Ｐ２００−１０代を獲得した。獲得した各ウイルス液をそれぞれ配列決定した結果、異世代のウイルス遺伝子の欠失は変わらず、依然としてｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから連続した３４５５ｂｐの欠失であった。ヘルペスウイルス遺伝子欠失株は、ＤＦ−１で安定して継代することが認められた。
こうして得られたヘルペスウイルス弱毒株Ｐ３０−１０代を、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と命名した。
こうして得られたヘルペスウイルス弱毒株Ｐ３０−１０代を、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株と命名した。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の生物学特性の検討）
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である７日齢の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組（Ａ、Ｂと空白対照組）に分け、組分けと攻撃状況を表１に示す。
表１ 病原性試験動物の組分け
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表２に示す。
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である７日齢の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組（Ａ、Ｂと空白対照組）に分け、組分けと攻撃状況を表１に示す。
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表２に示す。
上記結果から、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株は７日齢子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ２匹の豚が体温上昇するだけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０１親株に比べて、病原力が顕著に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を、それぞれ一組のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は毒性が大幅低減した。つまり、ただ１〜２匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められかなった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低かった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０１親株に比べて、病原力が顕著に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を、それぞれ一組のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は毒性が大幅低減した。つまり、ただ１〜２匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められかなった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低かった。
２．免疫原性試験
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹剤量で攻撃された。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表３に示す。
表３ ７日齢の子ブタに対するＨＮ１２０１−Ｒ株の免疫原性
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹剤量で攻撃された。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表３に示す。
上記結果から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、それぞれ第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を免疫した。免疫後２１日目、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、他方、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、それぞれ第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を免疫した。免疫後２１日目、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、他方、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株に対して良い保護作用をもたらした。
３．ウイルス毒力回復安全性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
結果から分かるように、同居伝染試験を第４代まで行ったところ、３０匹の実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかったことから、当該弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を確保できる。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
その結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物は、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸が共に連続してｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ欠失した。即ち、ｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐ連続して欠失した。欠失配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す。
なお、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸共通性として示される特徴変化は、その強毒親株の毒力が低下する原因となる可能性が高い。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
結果から分かるように、同居伝染試験を第４代まで行ったところ、３０匹の実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかったことから、当該弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないため、安全性を確保できる。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
その結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物は、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸が共に連続してｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ欠失した。即ち、ｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから３４５５ｂｐ連続して欠失した。欠失配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す。
なお、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸共通性として示される特徴変化は、その強毒親株の毒力が低下する原因となる可能性が高い。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの製造）
１．ウイルスの増殖
実施例１で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス種を５×１０４倍で希釈した後、単層に成長したＳＴ細胞に接種し、１時間吸着した後、２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液１０００ｍｌを加入し、３７℃温室に６回転／時間の回転速度で回転培養した。８０％の細胞が病変した後、２回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定し、低温で保存した。
２．保護剤の調製
１００ｍｌ脱イオン水にショ糖４０ｇ、ゼラチン８ｇを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０ｍｉｎ）を行った。
３．ワクチンの製造
このように製造して保存しているウイルス液と保護剤を１：１（体積比）で混合し、凍結乾燥した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表４に示す。
表４ ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの含有量の配合比
１．ウイルスの増殖
実施例１で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス種を５×１０４倍で希釈した後、単層に成長したＳＴ細胞に接種し、１時間吸着した後、２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液１０００ｍｌを加入し、３７℃温室に６回転／時間の回転速度で回転培養した。８０％の細胞が病変した後、２回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定し、低温で保存した。
２．保護剤の調製
１００ｍｌ脱イオン水にショ糖４０ｇ、ゼラチン８ｇを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０ｍｉｎ）を行った。
３．ワクチンの製造
このように製造して保存しているウイルス液と保護剤を１：１（体積比）で混合し、凍結乾燥した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表４に示す。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚１５匹を５匹／群でランダムに３群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒活ワクチンを接種した。第１組は免疫ワクチン１とし、第２組は免疫ワクチン２とし、第３組は対照組とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表５に示す。
表５ ＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状は現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であるのに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
二つの試験群でのヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有することを証明した。また、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した後でも、依然として良い免疫原性を保持した。
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚１５匹を５匹／群でランダムに３群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒活ワクチンを接種した。第１組は免疫ワクチン１とし、第２組は免疫ワクチン２とし、第３組は対照組とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表５に示す。
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状は現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であるのに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
二つの試験群でのヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有することを証明した。また、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した後でも、依然として良い免疫原性を保持した。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性対比試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組に分けた。第１組は実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンワクチン１で免疫した。第２組は対照ワクチンとして、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ ＨＩＰＲＡ， Ｓ．Ａ．のヘルペスウイルス生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ Ｋ−６１株）、バッチ番号４２ＲＨで免疫し、第３組は空白対照群とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量は、ヘルペスウイルスが１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表６に示す。
表６ ＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンの免疫原性対比試験結果
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れず）、子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡し、従来のワクチン商品はブタを完全に保護できなかった。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有し、従来のワクチン商品より良い免疫保護と安全性を示すことが証明された。
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子ブタ１５匹を５匹／組でランダムに３組に分けた。第１組は実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンワクチン１で免疫した。第２組は対照ワクチンとして、スペインＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯＳ ＨＩＰＲＡ， Ｓ．Ａ．のヘルペスウイルス生ワクチン（Ｂａｒｔｈａ Ｋ−６１株）、バッチ番号４２ＲＨで免疫し、第３組は空白対照群とした。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行った。投与量は、ヘルペスウイルスが１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表６に示す。
上記結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンで子豚を免疫した場合、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れず）、子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡し、従来のワクチン商品はブタを完全に保護できなかった。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは、優れた保護力を有し、従来のワクチン商品より良い免疫保護と安全性を示すことが証明された。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の獲得）
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株及びヘルペスウイルスＦａ株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養し、ヘルペスウイルス弱毒株を得た。それぞれ、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株と命名した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株及びヘルペスウイルスＦａ株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養し、ヘルペスウイルス弱毒株を得た。それぞれ、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株と命名した。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の生物学特性の検討）
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ２０匹を５匹／組でランダムに４組（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に分け、また、空白対照群として１０匹を設置した。組分けと攻撃状況を表７に示す。
表７ ＨＮ１２０２−Ｒ株及Ｆａ−Ｒ株の病原性試験動物の組分け
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表８に示す。
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ２０匹を５匹／組でランダムに４組（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に分け、また、空白対照群として１０匹を設置した。組分けと攻撃状況を表７に示す。
ウイルス接種後２８日観察し、毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表８に示す。
上記結果から、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ３匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、ヘルペスウイルスＦａ株は７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、他方、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０２親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＦａ親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物及び第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ２〜３匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなかった。解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は毒性が大幅低減し、組ごとにただ３〜４匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨＮ１２０２親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＦａ親株に比べて、病原力が有意に低下し、弱毒化ウイルス株である。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物及び第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種後２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ２〜３匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなかった。解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は毒性が大幅低減し、組ごとにただ３〜４匹の豚が体温上昇しただけであり、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
２．免疫原性試験
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
表９ ７日齢の子ブタに対するＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の免疫原性
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタを、いずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表９に示す。
上記結果から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに。ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株も良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７ ．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の異世代の培養物もいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに。ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株も良い免疫原性を有し、ルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＨＮ１２０２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物で免疫した後の２１日目に、各免疫組と対照組をいずれもヘルペスウイルスＦａ株を用いて１×１０７ ．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃した。攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
この結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康で生きており、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらに、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の異世代の培養物もいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＦａ株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
３．ウイルス毒力回復安全性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
また、ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
この結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＨＮ１２０２−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＦａ−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この二種類の弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性が高い。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
また、ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育てた。このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
この結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＨＮ１２０２−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＦａ−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この二種類の弱毒株は毒力回復現象がないことが明確である。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがないので、安全性が高い。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
併せて、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型Ｆａ親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
この結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒親株に比べて、いずれもｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸において共通となる特徴性変化は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸の特徴性変化と完全に一致す ることが明確になった。また、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子に よりコードされるアミノ酸の特徴性変化は、遺伝子欠失によるものであることが明確にな った。さらに、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になった。また、ヘルペスウイルスにおいて、連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することは、その強毒親株の毒性低下の原因となることが明確になった。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨＮ１２０２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
併せて、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型Ｆａ親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
この結果、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物において、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株は、強毒親株に比べて、いずれもｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸において共通となる特徴性変化は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸の特徴性変化と完全に一致す ることが明確になった。また、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子に よりコードされるアミノ酸の特徴性変化は、遺伝子欠失によるものであることが明確にな った。さらに、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になった。また、ヘルペスウイルスにおいて、連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することは、その強毒親株の毒性低下の原因となることが明確になった。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株弱毒生ワクチンの製造）
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１０に示す。
表１０ ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの含有量配合比
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１０に示す。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚２０匹を５匹／群でランダムに４群に分けて、実施例８で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン３を免疫し、第３組はワクチン４を免疫し、第２組と第４組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻撃後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１１に示す。
表１１ ＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚２０匹を５匹／群でランダムに４群に分けて、実施例８で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン３を免疫し、第３組はワクチン４を免疫し、第２組と第４組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻撃後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１１に示す。
上記結果から分かるように、実施例８で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。また、ヘルペスウイルスＦａ−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚へ保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株の構築）
相同組み換え方法を利用して、分子クローン操作によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子をノックオフして、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株を獲得した。具体的な操作方法は下記の通りで行った。
ＰＲＶ ＨＮ１２０１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーとしてＵＳ７−ＬＰ１／ＵＳ７−ＬＰ２、ＵＳ２−ＲＰ１／ＵＳ２−ＲＰ２を利用し、それぞれＵＳ７の前に位置する配列とＵＳ２の後に位置する配列、左と右の組み換えアームとなるＵＳ７ＬとＵＳ２Ｒを増幅した。その中でｇＩＬとＵＳ２Ｒの一端にはそれぞれ一つのｌｏｘＰサイトがあり、緑色蛍光タンパク質となるＥＧＦＰを選別標識として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫプラスミドによりｌｏｘＰサイトを有するｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰ導入ベクターを構築した。
ＤＮＡＺｏｌ法によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株を感染したＰＫ−１５細胞総ＤＮＡを抽出し、リポソームトランスフェクション法を利用して、細胞総ＤＮＡと導入ベクターｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰを１０ｕｇ：１ｕｇの量でＰＫ−１５細胞に共トランスフェクションし、８０％の細胞が病変する時にウイルスを獲得した。段階希釈した後、ＰＫ−１５単層細胞を接種し、プラーク精製法によりＧＦＰを有する組み換えウイルスｒＰＲＶ−ＵＳ７−２ − ／ＧＦＰ ± を得た。１０ｕｇｒｒＰＲＶ−ＵＳ７−２ − ／ＧＦＰ ＋ 遺伝子ＤＮＡを取り、２．５単位のＣｒｅ組み換え酵素を加入し、３７℃で１時間作用し、ＤＮＡを抽出して、ｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−のＤＮＡを製造した。ＰＫ−１５細胞をトランスフェクションし、プラーク精製でＥＧＦＰをノックオフした欠失株となるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株を得た。
相同組み換え方法を利用して、分子クローン操作によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株のｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子をノックオフして、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株を獲得した。具体的な操作方法は下記の通りで行った。
ＰＲＶ ＨＮ１２０１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーとしてＵＳ７−ＬＰ１／ＵＳ７−ＬＰ２、ＵＳ２−ＲＰ１／ＵＳ２−ＲＰ２を利用し、それぞれＵＳ７の前に位置する配列とＵＳ２の後に位置する配列、左と右の組み換えアームとなるＵＳ７ＬとＵＳ２Ｒを増幅した。その中でｇＩＬとＵＳ２Ｒの一端にはそれぞれ一つのｌｏｘＰサイトがあり、緑色蛍光タンパク質となるＥＧＦＰを選別標識として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫプラスミドによりｌｏｘＰサイトを有するｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰ導入ベクターを構築した。
ＤＮＡＺｏｌ法によりＰＲＶ ＨＮ１２０１株を感染したＰＫ−１５細胞総ＤＮＡを抽出し、リポソームトランスフェクション法を利用して、細胞総ＤＮＡと導入ベクターｐＳＫＵＳ７−２−ＧＦＰを１０ｕｇ：１ｕｇの量でＰＫ−１５細胞に共トランスフェクションし、８０％の細胞が病変する時にウイルスを獲得した。段階希釈した後、ＰＫ−１５単層細胞を接種し、プラーク精製法によりＧＦＰを有する組み換えウイルスｒＰＲＶ−ＵＳ７−２ − ／ＧＦＰ ± を得た。１０ｕｇｒｒＰＲＶ−ＵＳ７−２ − ／ＧＦＰ ＋ 遺伝子ＤＮＡを取り、２．５単位のＣｒｅ組み換え酵素を加入し、３７℃で１時間作用し、ＤＮＡを抽出して、ｒＰＲＶ−ＵＳ７−２−のＤＮＡを製造した。ＰＫ−１５細胞をトランスフェクションし、プラーク精製でＥＧＦＰをノックオフした欠失株となるヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株を得た。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株の弱毒生ワクチンの製造）
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株の弱毒生ワクチンを製造し、ワクチン含有量の具体的な配合比を表１２に示す。
表１２ ヘルペスウイルスＨＮ１２０２−Ｒ株及びＦａ−Ｒ株の弱毒生ワクチンの含有量配合比
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚１０匹を５匹／群でランダムに２群に分けて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 株弱毒活ワクチンを接種した。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察する。具体的な結果を表１３に示す。
表１３ ＨＮ１２０１−ｇＩ − −ｇＥ − −１１Ｋ − −２８Ｋ − 株弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
結果から分かるように、遺伝子工学手段で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇ Ｉ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 株弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚への保護率は８０％（４／５）であることに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 株弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 遺伝子欠失株の弱毒生ワクチンを製造し、ワクチン含有量の具体的な配合比を表１２に示す。
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚１０匹を５匹／群でランダムに２群に分けて、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 株弱毒活ワクチンを接種した。免疫後２１日目ウイルスチャレンジ実験を行い、投与量として、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株が２×１０７．０ＴＣＩＤ５０／匹であり、ウイルスチャレンジ実験後、毎日子豚の体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察する。具体的な結果を表１３に示す。
結果から分かるように、遺伝子工学手段で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇ Ｉ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 株弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制でき（臨床症状が現れる）、子豚への保護率は８０％（４／５）であることに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験４日後全部死亡した。
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−ｇＩ − ／ｇＥ − ／１１Ｋ − ／２８Ｋ − 株弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示すと共に、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさない。
実施例１２ （ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の獲得）
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株及びヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養して弱毒化してヘルペスウイルス弱毒株が得られ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株とヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株と命じる。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株及びヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株をそれぞれ実施例１の方法により継代培養して弱毒化してヘルペスウイルス弱毒株が得られ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株とヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株と命じる。
（ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の生物学特性の検討）
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を５匹／組でランダムに６組（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｍ）に分け、また、空白対照群として１５匹を設置し、組分けと攻撃状況を表１４に示す。
表１４ ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の病原性試験動物の組分け
１．病原性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を５匹／組でランダムに６組（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｍ）に分け、また、空白対照群として１５匹を設置し、組分けと攻撃状況を表１４に示す。
ウイルスを接種した後２８日観察し、毎日、子豚の体温を側定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１５に示す。
表１５ ７日齢の子ブタに対するＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の病原性
上記結果から、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株は、７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株は、７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は毒性が大幅に低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株は、７日齢の子ブタを死亡させた（１００％、５／５）が、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は毒性が大幅に低減し、ただ４匹の豚が体温上昇しただけであった。さらに、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨｅＮ１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。
同時に、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７ ．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＨｅＮ１親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、強毒型ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２親株に比べて、病原力が有意に低下したので、弱毒化ウイルス株である。
同時に、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の病原力の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物と、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物をそれぞれ一組の７日齢のヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の子ブタ（５匹）に接種し、１ｍｌ（１０７ ．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）／匹で点鼻接種し、５匹の豚を対照群とした。接種２８日まで、毎日観察して豚の臨床表現を記録した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察したところ、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ各組４〜５匹の豚が体温上昇しただけであった。また、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。さらに、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ各組４〜５匹の豚が体温上昇しただけであった。また、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の培養物を接種した後、２８日観察した結果、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は毒性が大幅低減し、ただ各組４〜５匹の豚が体温上昇しただけであった。また、他の臨床症状がなく、解剖検査したところ、組織器官には変化が認められなかった。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
世代別の病原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも毒性がより低いことが示された。
２．免疫原性試験
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７ ．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７． ０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
表１６ ７日齢子ブタに対するＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の免疫原性
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７ ．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
免疫後２１日目、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株を接種した子ブタ５匹と対照組の５匹の子ブタは、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７． ０ ＴＣＩＤ５０／匹の量で攻撃され、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。結果を表１６に示す。
上記結果から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きたが、対照組の子ブタは全て死亡た。また、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株を接種した子ブタは全て健康で生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株培養物で免疫し、免疫後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
併せて、異世代のヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の免疫原性の安定性を検証するために、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株培養物で免疫し、免疫後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＨｅＮ１株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物で免疫した後２１日目、各免疫組と対照組を、いずれもヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株を用いて１×１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹の剤量で攻撃し、攻撃後毎日子ブタの体温を測定して、臨床症状と死亡状況を観察した。
その結果、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代的ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康に生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。また、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康に生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。さらにまた、第１代、３０代、６０代、８５代、１１０代のヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株培養物を接種した子ブタは全て健康に生きたが、対照組の子ブタは全て死亡した。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
世代別の免疫原性試験から分かるように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。さらにまた、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代の培養物はいずれも良い免疫原性を有し、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株に対して良い保護作用をもたらすことが示された。
３．ウイルス毒力回復安全性試験
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７． ０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７． ０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
ヘルペスウイルス抗原・抗体陰性の７日齢の子ブタ３０匹を６匹／組でランダムに５組に分け、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株（１代、３０代、６０代、８５代、１１０代と１＋３０＋６０＋８５＋１１０代）培養物を、第１組の６匹の陰性豚（１０７．０
ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
その結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株感染実験豚、３０匹のＨｅＮ１−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＪＳ−２０１２−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この三つの弱毒株は毒力回復現象がないことが明確になった。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなく、安全性が高いことが示された。
ＴＣＩＤ５０／匹）に点鼻接種した。１４日目それらを第２組の６匹の陰性豚と同じ檻で育て、１４日後、第１組の６匹の豚を取り、第３組の６匹の陰性豚を第２組と再び同じ檻で１４日育て、このようにして、４代まで継代した。取った豚を全て死亡させて、病変の有無を観察した。
その結果、同居伝染試験を第４代まで行い、３０匹のＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株感染実験豚、３０匹のＨｅＮ１−Ｒ株感染実験豚と３０匹のＪＳ−２０１２−Ｒ株感染実験豚は、臨床観察と解剖検査において異常が認められなかった。このことから、この三つの弱毒株は毒力回復現象がないことが明確になった。従って、ウイルスを豚群に接種した後、再び強毒型に変化して発病させることがなく、安全性が高いことが示された。
４．遺伝子配列分析
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＰＲＶ−ＺＪ０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨｅＮ１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
さらに、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＪＳ−２０１２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＰＲＶ−ＺＪ０１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＨｅＮ１親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
さらに、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物をＲＴ−ＰＣＲ方法によりゲノム増幅した（異世代の培養物をそれぞれ増幅した）。獲得する遺伝子増幅産物を回収して精製し、配列決定用プラスミドベクターに接続し、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列を測定し、且つコンピューターソフトウェアによりウイルスのアミノ酸配列に転換した。配列分析用ソフトウェアを用いて、獲得するアミノ酸配列とその強毒型ＪＳ−２０１２親株のアミノ酸配列とを比較し、ウイルスのアミノ酸配列特徴を描いた。
その結果、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物では、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は、共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。また、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物では、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は、共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。さらに、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の第１代〜第１１０代培養物では、ウイルスの各遺伝子によりコードされるアミノ酸は、共にｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失し、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の欠失部位及び大きさと全く同じであった。ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株とヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株は、強毒親株に比べて、いずれもｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失した。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸に共通となる特徴性変化は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸の 特徴性変化と完全に一致することが明確になった。また、ヘルペスウイルスＮＨ１２０１ −Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸の特徴性変化は遺伝子欠失によるも のであることが明確になった。また、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になり、更に、ヘルペスウイルスが連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することはその強毒親株の毒性低下の原因となることを明らかにした。
ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の異世代培養物のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸に共通となる特徴性変化は、ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸の 特徴性変化と完全に一致することが明確になった。また、ヘルペスウイルスＮＨ１２０１ −Ｒ株のウイルス遺伝子によりコードされるアミノ酸の特徴性変化は遺伝子欠失によるも のであることが明確になった。また、本発明のヘルペスウイルスの継代弱毒化方法は安定であることが明確になり、更に、ヘルペスウイルスが連続した３４５５ｂｐのｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を欠失することはその強毒親株の毒性低下の原因となることを明らかにした。
（ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンの製造）
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１７に示す。
表１７ ＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチン含有量
実施例３の方法を参考して、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンを製造した。ワクチン含有量の具体的な配合比を表１７に示す。
（ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性試験）
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚３０匹を５匹／群でランダムに６群に分けて、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−ＺＪ０１−２０１２−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン６で免疫し、第３組はワクチン７で免疫し、第５組はワクチン８で免疫し、第２組と第４組と第６組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹とした。攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１８に示す。
表１８ 三つの弱毒生ワクチンの免疫原性試験結果
９日齢のＰＲＶ抗原・抗体陰性の子豚３０匹を５匹／群でランダムに６群に分けて、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＰＲＶ−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−ＺＪ０１−２０１２−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組はワクチン６で免疫し、第３組はワクチン７で免疫し、第５組はワクチン８で免疫し、第２組と第４組と第６組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹とした。攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１８に示す。
上記結果から分かるように、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であったことに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。また、実施例１４で製造したヘルペスウイルスＨｅＮ１−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であったことに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。さらにまた、実施例１４で製造し たヘルペスウイルスＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、ウイルス感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であったことに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。 このように、ヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１−Ｒ株、ＨｅＮ１−Ｒ株及びＪＳ−２０１２−Ｒ株の弱毒生ワクチンは優れた保護力を有することを証明し、優れた免疫保護と安全性を示した。さらに、ヘルペスウイルスがｇＩ／ｇＥ／１１Ｋ／２８Ｋ遺伝子を合計で３４５５ｂｐ連続して欠失することは、免疫原性に影響を及ぼさないことが示された。
（ヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性の広域性試験）
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚５０匹を５匹／群でランダムに１０群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組、第３組、第５組、第７組と第９組はワクチン１で免疫し、第２組、第４組、第６組、第８組、第１０組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であった。さらに、第７組、第８組の投与量がヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第９組、第１０組の投与量はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１９に示す。
表１９ ＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒生ワクチンの免疫原性の広域性試験結果
ＰＲＶ抗原・抗体陰性の９日齢の子豚５０匹を５匹／群でランダムに１０群に分けて、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株の弱毒活ワクチンを接種した。第１組、第３組、第５組、第７組と第９組はワクチン１で免疫し、第２組、第４組、第６組、第８組、第１０組は対照組とした。免疫後２１日目に攻撃し、第１組、第２組の投与量はヘルペスウイルスＨＮ１２０２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第３組、第４組の投与量はヘルペスウイルスＦａ株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第５組、第６組の投与量がヘルペスウイルスＰＲＶ−ＺＪ０１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であった。さらに、第７組、第８組の投与量がヘルペスウイルスＨｅＮ１株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、第９組、第１０組の投与量はヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、攻毒後毎日子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察した。具体的な結果を表１９に示す。
結果から分かるように、実施例３で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒活ワクチンで子豚を免疫した後、異なる由来のヘルペスウイルスの感染を抑制できた（臨床症状が現れた）。子豚への保護率は１００％（５／５）であった。これに対して、対照群の子豚はウイルスチャレンジ実験５日後全例死亡した。
この結果から、本発明で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは優れた免疫広域性を備え、異なる由来の流行性ヘルペスウイルスの攻撃に対して完全に保護作用を有することが証明された。
この結果から、本発明で製造したヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株弱毒生ワクチンは優れた免疫広域性を備え、異なる由来の流行性ヘルペスウイルスの攻撃に対して完全に保護作用を有することが証明された。
以上の記載はただ本発明の好ましい実施例を示しただけであり、本発明を限定するものではない。上記のように、好ましい実施例により本発明を開示したが、それらは本発明を限定しない。当業者は、本発明の主旨の範囲内に、上記の技術的内容を利用して修正や変更を行って等価置換して等価実施例を作成できる。また、本発明の技術態様の範囲内において、本発明の技術の主旨により、上記の実施例に対して行ういかなる簡単な修正、等価置換と修飾はいずれも本発明の技術方案に該当する。
Claims (13)
- ヘルペスウイルスの弱毒化方法であって、前記方法は、
（１）ヘルペスウイルスを哺乳動物継代細胞に接種して継代培養し、前記ヘルペスウイルスを５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適合株を得るヘルペスウイルスの適応培養工程と、
（２）前記工程（１）の前記ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適合株を禽由来継代細胞に接種して継代培養し、前記ヘルペスウイルスを１代以上継代して、前記ヘルペスウイルス弱毒株を得るヘルペスウイルスの弱毒化工程と、
を含むヘルペスウイルスの弱毒化方法。 - 前記工程（１）におけるヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスＪＳ−２０１２株、ヘルペスウイルスＨｅＮ１株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＢＪ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＨＥＢ株、ＮＶＤＣ−ＰＲＶ−ＳＤ株、ＰＲＶ ＴＪ株、ヘルペスウイルス変異株ＰＲＶ−ＺＪ０１、ヘルペスウイルス変異株ＨＮ１２０１株、ヘルペスウイルス変異株ＨＮ１２０２株、ヘルペスウイルスＦａ株を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。
- 前記工程（１）における前記哺乳動物継代細胞は、ブタ睾丸継代細胞ＳＴ、ブタ腎臓継代細胞ＰＫ１５或いはＩＢＲＳ−２、ウサギ腎臓継代細胞ＲＫ、アフリカミドリザル腎臓継代細胞ｖｅｒｏ、サル胎児腎臓上皮継代細胞Ｍａｒｃ−１４５、ウシ精巣継代細胞ＢＴ或いはベビーハムスター腎臓継代細胞ＢＨＫ−２１を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。
- 前記工程（２）において、前記禽由来継代細胞はＤＦ−１であることを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。
- 前記工程（１）のヘルペスウイルスの適応培養工程は、
前記哺乳動物継代細胞はパンクレアチンで分散されて消化し、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成することと、
前記ヘルペスウイルスを前記継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、８０％以上の細胞に病変が認められた時に、細胞培養ウイルス液を収集して継続継代用ウイルス種として、次の継代を行い、５代以上継代して、ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を得ること、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。 - 前記工程（２）のヘルペスウイルスの弱毒化工程は、
前記禽由来継代細胞をパンクレアチンにより細胞分散して消化し、細胞培養液を用いて継続培養し、継代細胞単層を形成することと、
前記工程（１）で得られた前記ヘルペスウイルス哺乳動物継代細胞適応株を、前記禽由来継代細胞単層に接種し、細胞維持液を用いて継続培養し、４０〜４８時間後、細胞培養ウイルス液をヘルペスウイルス弱毒株として獲得し、或いは、前記獲得したウイルス液は次の継代を行い、１代以上継代して、前記ヘルペスウイルス弱毒株を得ることと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。 - 前記工程（１）において、前記ヘルペスウイルス株が哺乳動物細胞で継代培養する継代数＞１８代であり、前記工程（２）において、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数＞３代であり、好ましくは、前記ヘルペスウイルス哺乳動物細胞適応株が禽由来継代細胞で継代する継代数が３〜１１０代であることを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。
- 前記細胞培養液は９０体積％〜９７体積％の細胞培養液と３体積％〜１０体積％のウシ血清を含み、前記細胞培養液のｐＨ値が７．０〜８．０であり、
前記細胞維持液は９５体積％〜９９体積％細胞培養液と１体積％〜５体積％のウシ血清を含み、前記細胞維持液のｐＨ値が７．１〜７．５であり、
前記細胞培養液はＭＥＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＥＭＥＭ培養液、１９９培養液、１６４０培養液とα−ＭＥＭ培養液を含み、前記ウシ血清は、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清或いは仔ウシ血清を含み、好ましくは、前記細胞培養液がＤＭＥＭ培養液であり、前記ウシ血清がウシ胎児血清であり、
前記細胞培養に用いられる温度が３６℃〜３８℃であることを特徴とする請求項５又は６に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法。 - 請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘルペスウイルスの弱毒化方法により弱毒化されたヘルペスウイルス弱毒株であって、前記ヘルペスウイルス弱毒株はｇＩ、ｇＥ、１１Ｋと２８Ｋタンパク質を発現できず、好ましくは、前記ヘルペスウイルス弱毒株遺伝子はｇＩ遺伝子の第８９０位ヌクレオチドから連続した３４５５ｂｐを欠失したことを特徴とするヘルペスウイルス弱毒株。
- 前記ヘルペスウイルス弱毒株がヘルペスウイルスＨＮ１２０１−Ｒ株であり、受託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１５１６であり、寄託単位が中国典型培養物寄託センタであり、寄託日が２０１５年３月１７日であり、寄託場所が中国武漢・武漢大学であることを特徴とする請求項９に記載のヘルペスウイルス弱毒株。
- ワクチン組成物の製造方法であって、前記方法は
（１）請求項９に記載のヘルペスウイルス弱毒株或いは培養物を増幅培養して、増幅した前記ヘルペスウイルス弱毒株を獲得する工程と、
（２）前記工程（１）で得られた前記増幅したヘルペスウイルス弱毒株にベクターを加入する工程と、
を含むことを特徴とするワクチン組成物の製造方法。 - 請求項１１に記載のワクチン組成物の製造方法により製造したワクチン組成物であって、
前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量＞１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹であり、好ましくは前記ヘルペスウイルス弱毒株の含有量が１０６．０ ＴＣＩＤ５０／匹〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０／匹であることを特徴とするワクチン組成物。 - 前記ワクチン組成物には、更に豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群抗原、豚サーコウイルス抗原、ブタパラインフルエンザ菌抗原、豚肺炎マイコプラズマ抗原、豚パルボウイルス抗原、豚日本脳炎ウイルス抗原の少なくとも1つが含まれることを特徴とする請求項１２に記載のワクチン組成物。
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