CN107653230A

CN107653230A - 一种ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN107653230A
Application number: CN201710776002.3A
Authority: CN
Inventors: 周继勇; 邢刚; 顾金燕; 金玉兰; 尹笛; 廖敏; 颜焰; 范春梅; 周赟; 郑肖娟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2018-02-02

Abstract

本发明公开了一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用。所述伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV‑DX，保藏号为CGMCC No.14326。本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV‑DX从经免疫过疫苗的猪场里出现的伪狂犬病病猪身上分离纯化到的一株新的猪伪狂犬病毒，该毒株属于II型伪狂犬病毒，对猪的致病力要远远强于经典的PRV标准强毒株SC株，该病毒在Vero细胞传代后，毒价逐渐升高至第8代后趋于稳定，最高可达10⁹ TCID50/mL。本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV‑DX对我国猪伪狂犬病毒流行病学调查及新流行强毒株的防控具有重要的意义。

Description

一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。已经给世界养猪业带来巨大的经济损失。目前，有很多欧洲国家宣布通过免疫基因缺失疫苗并结合相关的血清学诊断技术根除了伪狂犬病。我国也通过基因缺失疫苗以及弱毒疫苗有效控制了伪狂犬病的流行趋势。但是，2012年来，我国部分免疫过疫苗的猪场出现了伪狂犬病的返强。

伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。

PRV对环境的抵抗力较其他疱疹病毒略强一些，夏季时在猪舍干草上存活时间能达到30天，冬天可达46天。对热的抵抗力较强，在煮沸的水中还可存活一分钟。常温和低温时也都能保持其稳定性，但是存活时间不同，其中4℃时病毒能存活20周，-40℃或-70℃可存活数年，而-20℃时只能存活3个月。将组织病料经50％甘油盐水处理后保存于4℃150天，其感染力只略微减弱。PRV在不同pH条件下也较稳定，可适应pH 4.0～12，甚至在极端pH中还能存活至少2小时。PRV对乙醚、氯仿、1％NaOH等试剂较敏感，可用这些试剂杀灭容器中的病毒。同时，病毒也对福尔马林和紫外照射敏感。

PRV基因组为一条双链DNA，全长约150kb，G+C含量约70％，含有至少70个基因，编码约100种病毒蛋白。其基因组有一部分为共线性排列，这些共线性排列的基因具有相类似的功能。根据PRV感染细胞后的转录翻译情况，可以将PRV基因分为立早期基因、早期基因和晚期基因，这三类基因依次以级联的方式进行调节。

PRV核衣壳主要由UL19基因、UL35基因编码的蛋白构成，衣壳直径约125nm。PRV病毒粒子核衣壳与囊膜之间存在被膜蛋白，其中至少有14种蛋白来自病毒基因组编码，同时被膜层还含有宿主细胞的肌动蛋白。PRV的囊膜蛋白几乎能在所有感染的细胞上发现。对蛋白质功能确定的有11种糖蛋白，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。其中gB、gD、gH、gL是病毒体外复制和感染所必需的糖蛋白，与PRV的神经传导有关；gC、gE、gG和gM是病毒复制的非必需糖蛋白，其中gC、gE与gI与PRV在神经细胞间的传导方向有关。这些基因的表达产物既是诱导机体产生体液免疫的主要病毒抗原，也是病毒作用于细胞的重要成分。PRV的毒力受到多个基因的联合控制，个别毒力基因的缺失能不同程度降低病毒的毒力。与其毒力有关的基因有UL区的UL10、UL13、UL21、UL23(TK)、UL39/40、UL44、UL50，US区的US3(PK)、US7、US8。其中TK或PK的缺失能导致病毒毒力的显著下降。

发明内容

本发明从经免疫过疫苗的猪场里出现的伪狂犬病病猪身上分离纯化到一株新的伪狂犬病毒毒株，为一种新的Ⅱ型伪狂犬病毒，对该毒株进行蚀斑纯化、基因组测定和生物学特性测定，确认为一株新流行的Ⅱ型伪狂犬病毒。

猪伪狂犬病是OIE认定的B类传染病，该病历史较久，此前许多国家通过实施严格的清除计划，包括大规模使用gE缺失疫苗和DIVA(区分野毒感染和疫苗免疫)策略，在很大程度上控制了该病，北美和欧洲许多国家已经基本将PRV在猪群中净化，我国在上世纪90年代开始，通过接种Bartha-K61疫苗来防控该病，并取得了一定的效果。但2011年末开始，华北以及华东地区许多伪狂犬疫苗免疫合格的猪场又开始出现了典型的伪狂犬病病毒感染现象，2013年，疫情开始扩散到南方多省，以广东、广西等地区表现最为明显。2014年，福建、山西、云南等地猪场也出现新型伪狂犬病病毒感染，到目前为止，这种现象已基本遍布我国主要养猪区域。因此，本发明中新流行毒株的分离鉴定及应用对我国猪伪狂犬病毒流行病学调查及新流行强毒株的防控具有重要的意义。

一种伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX，保藏号为CGMCC No.14326。经基因测序及序列比对以及相关性能的检测得出本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX为一种全新的猪伪狂犬病毒毒株，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.14326，保藏时间为：2017年7月6日。

本发明又提供了所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX可以用来制备相应的猪伪狂犬病疫苗，比如通过灭活的方法制备疫苗或通过基因工程方法通过敲除相关基因获得减毒疫苗等。

优选的，所述疫苗为基因工程减毒疫苗。

本发明还提供了所述的伪狂犬病毒毒株在作为伪狂犬病疫苗的检验用毒种中的应用。由于本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX致病力强、毒价高，可以作为猪伪狂犬病疫苗的检验用毒种，用于检测猪伪狂犬病疫苗的效果。

本发明还提供了所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病毒感染模型中的应用。所述的伪狂犬病毒毒株可以用于制备伪狂犬病毒感染的动物模型。

本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX从经免疫过疫苗的猪场里出现的伪狂犬病病猪身上分离纯化到的一株新的猪伪狂犬病毒，该毒株属于II型伪狂犬病毒，毒力比经典的伪狂犬病毒强2倍(小鼠)～20倍(猪)，100％致死小鼠和不同发育阶段的猪。该病毒在Vero细胞传代后，毒价逐渐升高至第8代后趋于稳定，最高可达10⁹TCID50/mL。根据基因组特征和致病性特征分析确认本发明猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX为一种新型的伪狂犬病毒，对我国猪伪狂犬病毒流行病学调查及新流行强毒株的防控具有重要的意义，可作为猪伪狂犬病毒相关研究与防控产品开发的毒种。

附图说明

图1为实施例1中病料上清接种vero细胞结果图，其中A为实验组，B为阴性对照组。

图2为实施例1中病料上清抽取DNA后gE特异性基因片段扩增结果图，其中泳道M：DNA Marker，泳道1：实验组，泳道2：阴性对照组。

图3为本发明毒株的生长曲线图。

图4为gB基因进化树分析结果图。

图5为gC基因进化树分析结果图。

图6为gE基因进化树分析结果图。

图7为全基因组核苷酸序列进化分析结果图。

具体实施方式

材料：

临床上疑似猪伪狂犬病患病仔猪脑组织病料：来源于浙江湖州某猪场。

Vero细胞系为实验室保存；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自上海生工有限公司；PrimeSTAR聚合酶、dNTP mix、2×GC buffer、100bp Marker、pMD18-T Kit均购自宝生物工程(大连)有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；MEM培养基购自Invitrogen；PCR产物清洁回收试剂盒、低熔点琼脂粉购自Sigma公司。

PRV-SC病毒为传统的猪伪狂犬病毒株，购自中国兽医药品监察所。

5-6周龄雌性Balb/c小鼠购自浙江省实验动物中心。

60日龄实验猪购自宁波宁海跃龙街道元红农庄，经抗原抗体检测，实验猪PRV、PPV、PCV2、PRRSV及CSFV抗原阴性，PRV及PRRSV抗体阴性。

实施例1

采集临床上疑似猪伪狂犬病患病仔猪脑组织病料，进行病料处理，抽提组织总DNA，用PCR的方法筛选PRV阳性病料，取PRV筛选阳性病料研磨液，经无菌处理后，上清接种Vero细胞传代培养，观察接种了疑似猪伪狂犬病病料上清的细胞折光性变化、圆缩、脱落病变情况。

根据GenBank中PRV的gB、gE序列，设计两对分别扩增gB和gE比较保守区域的鉴别引物gB300F、gB300R和gE300F、gE300R。同时根据GenBank中PRV全基因组参考序列NC_006151设计三对扩增gB、gC、gE全长序列的引物gB-F/R、gC-F/R、gE-F/R，引物交由北京六合华大基因科技有限公司合成，各引物序列如表1所示。

表1

在长满Vero细胞的六孔板中，弃去培养基，用新鲜的培养基清洗一次，加入疑似病料上清液1mL，37℃感作60分钟。感作完成后，弃去上清液，加入含2％胎牛血清的MEM培养基2mL，于37℃含5％CO₂的培养箱中培养，每天观察细胞病变情况。直到细胞出现80％病变，将其冻融三次后，离心取上清，获得的病毒称为第一代。

病毒的蚀斑纯化同样采用Vero细胞。将所得病毒液按10倍倍比稀释，依次加入到长满Vero细胞的六孔板中，37℃感作60分钟。同时配置浓度为2％的低熔点琼脂糖并高压灭菌，待感作完后，将高压好的2％低熔点琼脂糖液与2×MEM培养基等体积混合，加入2％胎牛血清，混合液无菌保存于37℃水浴中。弃去细胞板中的感作上清液，用新鲜培养基洗一次后，加入已经配好的琼脂糖培养基混合液，室温待其凝固后，放入37℃培养箱中培养3天。待出现肉眼可见空斑后在显微镜下用枪头挑取，溶于1mL MEM中，反复冻融三次后收毒，再接种于Vero细胞中进行扩繁以备下一轮蚀斑纯化。如此重复蚀斑纯化操作5次，扩大培养所挑蚀斑，标记为PRV-DX F1。

将PRV-DX F1代以较合适的稀释度稀释后接种于长满单层的Vero细胞中，同样在感作后盖上琼脂，待蚀斑长到合适大小时，用5％结晶紫染色1小时，小心弃去琼脂，观察蚀斑形态并拍照。

将病料上清接种Vero细胞后，24小时后可观察到明显的细胞病变，即原本梭形的细胞开始变圆和透亮，随后会脱落形成一块空斑(图1A)，阴性细胞没有变化(图1B)。将病料上清抽提DNA后进行PCR检测，可扩增得到332bp的gE特异性部分序列(图2)，说明分离到的为猪伪狂犬病毒，将其命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX。

实施例2

病毒TCID₅₀测定及生长曲线绘制。

待96孔板中Vero细胞长满单层时，将经过传代的适应细胞毒PRV-DX株F5代倍比稀释10^-1～10^-10接种于96孔板1至10列，每孔100μL。最后两列加入等体积的MEM作为阴性对照。96孔板放入37℃培养箱中培养，96小时后统计出现细胞病变的孔数，用两氏法计算病毒TCID₅₀，TCID₅₀＝10^-8.0/0.1mL。

待25cm²细胞瓶中的Vero细胞长满单层后，换成含2％胎牛血清的新鲜胚MEM培养基，并接种100个TCID50的PRV-DX F5。然后分别在接毒后12、24、36、48、60、72、84、96和108小时取500μL细胞上清，同时加入500μL含2％胎牛血清的新鲜胚MEM培养基。将不同时间点所获得的细胞上清-70℃反复冻融3次后收毒，并按照以上方法分别测定不同时间点的TCID₅₀，绘制其生长曲线，结果如图3所示。

PRV-DX毒株经Vero细胞传代，每代测定其TCID50，结果表明，该病毒在Vero细胞传代后，毒价逐渐升高至第8代后趋于稳定，最高可达10⁹TCID50/mL。

实施例3

猪伪狂犬病病毒PRV-DX株gB、gC、gE基因的克隆与分析。

用纯化后的病毒液PRV-DX F5代按前述方法进行病毒DNA的抽提，用所得DNA溶液作为PCR模板进行进行PCR扩增，体系(25μL)如下：2×GC buffer 12.5μL，dNTPmix 2μL，引物各1μL，模板1μL，PrimeSTAR酶0.25μL，最后加水补足25μL。PCR反应程序为95℃预变性5分钟，98℃变性10秒，57℃退火20秒，72℃延伸2分钟进行30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用Sigma公司的PCR产物清洁回收试剂盒说明书进行回收。具体如下：

在PCR产物中，加入3倍产物体积的Buffer PCR-A(若加入的Buffer小于100μL，则补足至100μL)，用枪头吹打直至混匀。然后将混合液转移至试剂盒提供的制备管中，并将制备管置于2mL收集管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；将制备管放回收集管，加入700μL已经加过乙醇的Buffer W2，12000rpm离心1分钟，弃滤液；再将制备管放回收集管，加入400μL上述Buffer W2，12000rpm离心1分钟，弃滤液；制备管放回收集管后，12000rpm空离1分钟；将制备管置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加30-50μL TE或去离子水，室温洗脱2min，然后12000rpm离心1分钟，收集管底溶液。

回收的产物用rTaq酶加poly A粘性末端，72℃10分钟，体系如下：10×PCR buffer2μL，rTaq酶0.25μL，dNTPmix 0.5μL，PCR产物400ng，最后加水补足20μL。将上述加上A尾的产物与pMD18T连接，16℃1小时，体系如下：Solution I 10μL，pMD18T 1μL，加A尾的PCR产物9μL。

将上述连接产物全部转化DH5α大肠杆菌感受态，然后涂于含有氨苄的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。待菌落长至合适大小时，挑取单菌落，进行PCR菌液鉴定后将阳性的单克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。

利用MEGA5.0软件，将DX株扩增所得基因序列与GenBank上下载所得的不同毒株基因序列进行进化树分析。分析采用邻并法进行计算，Bootstrap值为1000次。同时利用MEGA5.0软件，将之前一起比对的序列都翻译为氨基酸序列，并进行比对分析。

基因进化树结果(图4、图5、图6)显示，本研究中分离到的DX株gC(SEQ ID No.15)基因序列与国内最近分离到的一些毒株的gC基因序列比较接近，都离一些经典毒株如Kaplan、Becker株较远，gB(SEQ ID No.14)和gE(SEQ ID No.16)基因序列分析结果也一样。

相应的氨基酸序列比对结果表明，DX株的gB基因与国内新流行的毒株一样较经典欧洲株有75-77位SPG三个氨基酸插入，以及313位(V>M)、915位(S>N)、921位(L>P)的突变。gC基因则是63-69位连续AAASTPA7个氨基酸的插入。DX株的gE基因与这些参考序列比较明显的区别即在48位和494位有天冬氨酸(D)的插入。54位为天冬氨酸(D)而非甘氨酸(G)、448位为异亮氨酸(I)而非缬氨酸(V)、510位为丝氨酸(S)而非甘氨酸(G)。

实施例4

培养PRV-DX病毒，然后抽提病毒的全基因组，进行PacBio平台测序，获得病毒的全基因组序列。

上述病毒全基因组抽提及测序的方法为：

采用QIAGEN Genomic-tip 500G对浓缩纯化后的病毒液进行DNA提取，具体步骤如下：

(1)将样品与预冷的等体积的buffer C1和3倍体积的双蒸水进行混合，冰上孵育10分钟；超速离心2小时后，弃上清；

(2)再加入预冷的2倍体积的buffer C1和6倍体积的双蒸水，翻转混匀，超速离心后，弃上清；

(3)加入10倍体积的buffer G2，涡旋震荡，将沉淀进行重悬；

(4)加入200μL的Protease K，50℃孵育1小时；

(5)充分孵育后，将液体加入到提前已经用10mL Buffer QBT平衡好的柱子中，让其自然流下；

(6)加入15mL Buffer QC到柱子中，进行洗杂，重复2遍；

(7)加入50℃预热的15mL Buffer QF进行洗脱，并用收集管收集液体；

(8)加入0.7倍体积的异丙醇到收集管中，沉淀，去上清，并干燥5-10分钟；

(9)用4mL 70％预冷的乙醇洗涤沉淀，翻转混匀，离心后，轻柔的吸去上清，并干燥5-10分钟，待沉淀干燥后用pH＝8.0的10mM Tris-HCl溶解沉淀，并进行OD260/OD280和核酸含量检测；同时用0.6％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压为170V，时长60min。

将检测合格的基因组DNA样品送深圳华大基因科技服务有限公司进行测序及组装。采用genewise软件基于参考序列JQ809328.1进行同源基因预测，预测出各ORF。软件版本：genewise 2.2.0，参数：genewise、-tfor、-sum、-genesf、-gff。

本发明分离鉴定纯化获得的猪伪狂犬病病毒PRV-DX株DNA经PacBio平台测序后，进行数据组装，最终获得1条全基因组序列。结果显示PRV-DX株基因组全长为143754bp，比经典的伪狂犬病毒(I型伪狂犬病毒)的基因组长5990bp，GC含量为73.59％，共编码69个开放阅读框，其中US1和IE180为内部重复序列。将PRV-DX全基因组与NCBI上21条分离得到的已知全长的参考毒株进行全基因组进化分析，结果如图7，进化分析显示PRV各毒株可以划分为两个明显的分支，欧美株单独属于同一分支，命名为基因I型；包括PRV-DX株在内的中国株属于另一分支，命名为基因II型。对中国毒株进一步分析发现：PRV-DX株与我国2012年以来分离的流行毒株亲缘关系最近，其次为Ea，Fa，Sc毒株，与LA株进化距离最远。

对全基因组序列分析说明本发明分离的猪伪狂犬病病毒PRV-DX株为基因II型。

实施例5

将5-6周龄雌性Balb/c小鼠70只，随机分成7组，10只/组。1-3组分别背部皮下注射0.1mL各含有10⁴TCID₅₀/mL，10⁵TCID₅₀/mL，10⁶TCID₅₀/mL的PRV-DX株(实验组)病毒液；4-6组分别背部皮下注射0.1mL各含有10⁴TCID₅₀/mL，10⁵TCID₅₀/mL，10⁶TCID₅₀/mL的PRV-SC株(对照组，传统的猪伪狂犬病毒株)病毒液。第7组皮下接种0.1mL DMEM作为阴性对照。攻毒后2周内连续观察记录小鼠的临床症状、病理剖检及死亡情况等。

用含有不同浓度的PRV-DX株和PRV-SC株分别接种5-6周龄Balb/c小鼠，攻毒后第3-7天，DX 10⁶TCID₅₀/mL组，DX 10⁵TCID₅₀/mL组，SC 10⁶TCID₅₀/mL组和SC 10⁵TCID₅₀/mL组实验小鼠均出现不同程度的精神萎靡，被毛粗乱，食欲下降等临床症状，严重的还会出现不断啃咬接种部位，导致皮肤出血，最终死亡。DX 10⁴TCID₅₀/mL组和SC 10⁴TCID₅₀/mL组在攻毒后第4天才开始出现精神萎靡等轻微临床症状，并有小鼠死亡。7天后上述各组小鼠基本恢复正常，无明显临床症状出现。阴性对照组小鼠在整个实验期均表现正常。

经统计，小鼠死亡时间主要集中在攻毒后第3-7天。DX 10⁶、10⁵、10⁴TCID₅₀/mL攻毒组小鼠死亡数量分别是9、6、1只；而SC 10⁶、10⁵、10⁴TCID₅₀/mL攻毒组小鼠死亡数量分别是9、4、1只；阴性对照组10只小鼠全部正常存活。根据实验结果计算得出PRV-DX株对小鼠的LD₅₀为：10^4.84TCID₅₀/mL，我国经典强毒株SC株对小鼠的LD₅₀为10^5.16TCID₅₀/mL。说明新分离鉴定获得的PRV-DX毒株对小鼠的致病力要强于经典强毒株PRV-SC两倍以上。

实施例6

将15头60日龄实验猪随机分成3组，第一组接种4mL 10^7.0TCID50/mL PRV-DX株病毒液，第二组接种4mL 10^7.0TCID50/mL PRV-SC株病毒液，阴性对照组接种4mL DMEM，接种方式为滴鼻接种，隔离饲养，自由采食，连续观察14天，记录体温、临床症状；并对死亡猪及时进行剖检。组织样品采集，组织切片及病毒载量检测。

攻毒后第2天，DX毒株10^7.0TCID₅₀/mL组和SC毒株10^7.0TCID₅₀/mL组实验动物即出现明显体温升高，其平均体温分别为：41.7℃，41.9℃。DX毒株10^7.0TCID₅₀/mL组在攻毒后第3天实验猪出现食欲废绝，呼吸困难等临床症状，攻毒后第4天该组实验动物全部死亡，致死率为100％。而SC毒株10^7.0TCID₅₀/mL组在攻毒后第3天仅表现出食欲下降临床症状，直到攻毒后14天，仅一头猪死亡，致死率为20％。阴性对照组均在整个实验期内均表现正常。

实验过程死亡的实验猪或试验结束后剖杀耐过实验猪，观察大体病变：PRV-DX株攻毒组实验猪脑膜增厚，充血，较难剥离；脑组织严重充血；肺脏充血，淤血，肋间压迹明显；肝脏有轻微淤血现象，扁桃体增厚，淤血。PRV-SC株攻毒组实验猪除脑组织和肺稍有充血、肿胀外，肝脏和扁桃体无肉眼可见明显病变。取脑，肺，肝，扁桃体组织固定后，做石蜡切片，并进行HE染色。显微镜下观察病理切片，PRV-DX株攻毒组脑可见毛细血管淤血，且在血管周围有炎性细胞浸润，形成典型的“血管套”现象；肺脏可见局灶性肺泡腔变小，且有红细胞渗出，肺泡壁上有多量炎性细胞浸润；肝脏可见小叶间动脉充血；扁桃体可见炎性细胞重度浸润。PRV-SC株攻毒组脑组织也出现毛细血管淤血现象，且有极少量神经元坏死，胞核固缩浓染，胞浆深染；肺脏可见肺泡壁增厚，炎性细胞增多；该组肝脏和扁桃体无明显病变。

采用以gD基因为目的片段的荧光定量PCR方法进行检测：上游引物gDP-F：CACGCCGATGTGGTGGA，下游引物gDP-R：GGTACTGGCCCTCGTTGAA，探针Probe：CY5-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2，反应体系为：Premix Ex Taq(Pro qPCR)：10μL，gDP-F：0.4μL，gDP-R：0.4μL，Probe：0.4μL，ddH₂O：6.8μL，模板：2μL。反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火30s，60℃延伸1min进行40个循环，同时设定阴性对照，阳性对照采用pMD18T-gD标准质粒，通过倍比稀释后作为模板，按同样方法扩增后，绘制标准曲线，根据样品CT值和标准曲线计算出相应的拷贝数，计算出PRV-DX株和SC株攻毒后各脏器中的病毒载量，结果表明：病毒含量相同的PRV-DX和SC株攻毒后，扁桃体和脑的病毒载量高于肺和肝脏；且DX株攻毒组中脑和肺病毒载量显著高于SC株攻毒组，其中肺脏的病毒载量极显著高于PRV-SC组。

说明本发明新分离鉴定获得的II型伪狂犬病毒DX毒株(PRV-DX)对猪的致病力要远远强于经典的PRV标准强毒株SC株。

将本发明猪伪狂犬病病毒PRV-DX毒株送到保藏机构进行保藏，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.14326，保藏时间为：2017年7月6日。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggcaagtgc gtctccaag 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggcgaagg agtcgtaggg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctgcgtg ctgtgctcc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgtcacttc cggtttctcc 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttttatctcc gtccgcgccg ttt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgctgtag tagcagtccg agt 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acagggcgtc ggggtcctcg ctctc 25

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgaggcgtca tgcccgct 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgtcgccat gtgtgccact 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acaaacaacc ggacgcgat 19

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacgccgatg tggtgga 17

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtactggcc ctcgttgaa 19

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actacatgtt ccccacggag gacgag 26

<210> 14

<211> 2745

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病病毒PRV-DX(Pseudorabies virus strain PRV-DX)

<400> 14

ctagggggcg tcggggtcct cgttctcgag gcgctggtag tgccggcggc gcgtggccat 60

cgccccgacg cggctggcca gcagcgcggg cccgctgttc ttcttgcgcg ccttgtgctc 120

ctgctgctcg agggccgaca cgatggacat gtaccggatc atgtcccggg cctggtccag 180

cttggcctcg tccacgtcgt cctcttcgac gccgtcctcc ttgagcgcct tcgtcgtgac 240

ggggtacagg gccttcatgg ggttgcggcg caggcgcgag atgtgccggt aggccaggaa 300

ggccgcgacc aggccggcca gcaccagcag cccgatggcg agcgccccga aggggttgga 360

caggaaggac accatgccgc cgacggccga gatcacggcc cccgtggcgc ccaggaccac 420

cttgccgacg gcggcgccca cgtcgccgag gccctggaag aagttggcga tgccgcgcag 480

cagcaccacg ttgtggtcca ccttgaccac gcggtcaatg tcgtagaact tgagcgcgtg 540

cagctggttg cggcgctgga tctcgctgta gtccaggagg cccgtgtcgg cgagctcctc 600

gcgcgtgtac acctcgaggg gcaggaactc gcggtcctcg agcagcgtca ggttcagggt 660

cacccgcgtg ctgatcgtct cgggcacctc caccatgcgc acgtagctgt agtcctcgta 720

gtacacgtac ccgccgccca gcttaaagta gcgccggtgg ttgccggtgc agggctcgat 780

gaggtcgcgc gagatgagga gctcgttgtc gtcgccgagc tggccctcga tcacgcccgt 840

gccgttgtgc tcgaaggtca ccagcgggcg gctgtagcac gtgccgcgct cgccgggcac 900

gcgcatggag ttctgcacgt acacgccgcc gcgcacctcc acgcaccgcg agatggccat 960

cacgtcgccg agcatgcgcg ccgagacgcg ctggcccagc gcggccgtgg ccacggcgct 1020

ggggttcagg cgcgacatct cgccccacag ggtgcggtcc ttgttctgca gctcgcacca 1080

ggcggccgcg atgcggctca gcatgtcgtt cacgtgcgcc tggatgtggt cgtaggtgaa 1140

ctgcaggcgc gcaaactcgg ccgagcccgt ggtgatgcgc aggtgccccg tgccgttgac 1200

ggccggcggc tcgggcgtcc ccgccgggcc gggggagcgc cgggcccgac gggcggccgc 1260

gggggacgcg gggcccacga cgccggcgag gccgaggcgc tcgagctcgc gcgcgtacag 1320

ctgcgccagc tcgttcgaga tcagcgggcg gaaggccacc acgaagcccc cgcgggcgag 1380

gtacacctcg ggcttgtcgc cggccagcac gtgcgtgttg ttgtagcgcc gccggtagat 1440

ggcgtcgatg gcctccgagg cctcgcggag gacgcagtcg cccaggtgca cgcgctgcag 1500

gtcgagctgc gtgacgtcgc tgacgaagga ggcgcccagg gcccgcgacg tgaagcggaa 1560

ggacccgtcg cgcgtctcgt cgcggatcat ctcctcggcc tcgcgccact tggccaggct 1620

gcacacgcgc cgcgtcttgg gggcccagtc ccaggccacc gtgaagtgcg gcgtgcgcag 1680

aaagttgcgc gtcacgctct cggaggcgcg gaggcgcgag tccaggtcga tggggtagta 1740

gtgctccacc tgctggaagc gcccgggcgc gtagccgatg tgctccccgt gggccccctc 1800

gcgcaggccg tagaaggggg acatgtacat gatgtccccc gtggacaggg cgaaggagtc 1860

gtaggggtac acggagcgcg cctccacctc ctcgacgatg cagttgacgg aggtgcccgt 1920

gtggtagaag cccgcggcgc cgatcttggt gtaggtgtcg ttggtggtgt gccagccgcg 1980

ggtgccgagc gcgttcaggc gcgaggggcg caggtccacc tcgacggggt tctcgtcgcg 2040

gtcgaaggcg gtcaccttgt ggttgttgcg cacgtactcg gccttggaga cgcacttgcc 2100

gcggcggtcg atcacgtccg tgatctcctg cacggggacg ggcacgcggt ccgtgaagcg 2160

gttcgtgatg gccgcgtacg tgctcccgga ccacacggtc gtgacgatga cgttcttgta 2220

gtagatgtgg gccttgaact tgtgcggggc gatgttctcc ttgaagagca cggcgatccc 2280

ctccgtgaag ttgcgcccct gcgagtactc ggggcaggcc tgctcgggct ccaggcgcac 2340

caccgtggag ccggacggcg gcgggcagac gtagaagcgg tcccgctcgg tcgcggccgc 2400

gcgcacggcc gtgcgcgcgt ccaggtcgcc gtactcgccg tcgggggcgt ccgaggggcc 2460

gggggagacg gccccgtcga tctcctcgag ggactcctcc gcggagaagc cgtctggggt 2520

ggcgcccgtc ccgggcgcgg gcgaggccga ggcggcccgc gtcacggccg ccgcgccgca 2580

cgtcggggtc gcggcgagcg ccagcagcag cagcgctagc gcgacggcgc cccgcgcagc 2640

tgcagcgtgg tgtggagcag gccaaagacg tccgaggcca gcaccgccgt ggtgcccggg 2700

ccgatgcccg cggggcccgc gccaaagacc gccaccagcg ggcat 2745

<210> 15

<211> 1464

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病病毒PRV-DX(Pseudorabies virus strain PRV-DX)

<400> 15

atggcctcgc tcgcgcgtgc gatgctcgcg ctgctggcgc tctacacggc ggccatcgcc 60

gcggcgccgt cgtccacgac ggcgctcggc acgacgccca acgggggcgg gggcggcaac 120

agcagcgcgg gcgagctctc gccctcgccg ccctcgacgc ccgagcccgt ctcggggacg 180

acgggggccg cggcctccac gcccgccgcc gtctcgacgc cccgggtccc gccgccctcg 240

gtctcgcgcc ggaagcccca gcggaacggc aacaggacgc gcgtccacgg cgacaaggcc 300

acctcgcacg ggcgcaagcg catcgtgtgc cgcgagcggc tgttctcggc gagggtgggg 360

gacgcggtca gcttcgggtg cgccgtcgtc ccgcgcgccg gggagacctt cgaggtccgc 420

ttctgccgcc gcgggcgctt ccgctcgccc gacgccgacc ccgagtactt tgacgagccc 480

ccgcgcccgg agctcccgcg ggagcggctc ctcttcagct ccgccaacgc ctccctcgcc 540

cacgcggacg cgctcgcctc cgccgtcgtc gtcgagggcg agcgcgcgac cgtcgccaac 600

gtctcgggcg aggtgtccgt gcgcgtggcc gcggcggacg ccgagaccga gggcgtctac 660

acgtggcgcg tgctgtccgc caacggcacc gaggtccgca gcgccaacgt ctcgctcgtc 720

ctgtaccacc agcccgagtt cggcctgagc gcgccgcccg tcctcttcgg cgagcccttc 780

cgggcggtgt gcgtcgtccg cgactactac ccgcggcgca gcgtgcgcct gcgctggttc 840

gcggacgagc acccggtgga cgccgccttc gtgaccaaca gcaccgtggc cgacgagctc 900

gggcgccgca cgcgcgtctc cgtggtgaac gtgacgcgcg cggacgtccc gggcctcgcg 960

gccgcggacg acgcggacgc gctcgcgccg agcctgcgct gcgaggccgt gtggtaccgc 1020

gacagcgtgg cctcgcagcg cttctccgag gccctgcgcc cccacgtcta ccacccggcg 1080

gcggtctcgg tgcgcttcgt cgagggcttc gccgtctgcg acggcctctg cgtgcccccg 1140

gaggcgcgcc tcgcctggtc cgaccacgcc gccgacaccg tctaccacct cggcgcctgc 1200

gccgagcacc ccggcctgct caacgtgcgg agcgcccgcc cgctgtcgga cctcgacggg 1260

cccgtcgact acacctgccg cctcgagggc atgccctcgc agctgcccat cttcgaggac 1320

acgcagcgct acgacgcctc ccccacgtcc gtgagctggc ccgtcgtgac cagcatgatc 1380

accgtcatcg ccggcatcgc catcctagcc atcgtgctgg tcatcatggc gacgtgcgtc 1440

tactaccgcc ggtccgcgct gtga 1464

<210> 16

<211> 1902

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病病毒PRV-DX(Pseudorabies virus strain PRV-DX)

<400> 16

gcacacaccg gggttgagac catgcggccc tttctgctgc gcgccgcgca gctcctggcg 60

ctgctggccc tggcgctctc caccgaggcc ccgagcctct ccgccgagac gaccccgggc 120

cccgtcaccg aggtcccgag tccctcggcc gaggtctggg acgacctctc caccgaggcc 180

gacgacgatg acctcaacgg cgacctcgac ggcgacgacc gccgcgcggg cttcggctcg 240

gccctcgcat ccctgaggga ggcgcccccg gcccatctgg tgaacgtgtc cgagggcgcc 300

aacttcaccc tcgacgcgcg cggcgacggc gccgtgctgg ccgggatctg gacgttcctg 360

cccgtccgcg gctgcgacgc cgtgtcggtg accacggtgt gcttcgagac cgcgtgccac 420

ccggacctgg tgctgggccg cgcctgcgtc cccgaggccc cggagatggg catcggcgac 480

tacctgccgc ccgaggtgcc gcggctccgg cgcgagccgc ccatcgtcac cccggagcgg 540

tggtcgccgc acctgagcgt cctgcgggcc acgcccaacg acacgggcct ctacacgctg 600

cacgacgcct cggggccgcg ggccgtgttc tttgtggcgg tgggcgaccg gccgcccgcg 660

ccggcggacc cggtgggccc cgcgcgccac gagccccgct tccacgcgct cggcttccac 720

tcgcagctct tctcgcccgg ggacacgttc gacctgatgc cgcgcgtggt ctcggacatg 780

ggcgactcgc gcgagaactt taccgccacg ctggactggt actacgcgcg cgcgcccccg 840

cggtgcctgc tgtactacgt gtacgagccc tgcatctacc acccgcgcgc gcccgagtgc 900

ctgcgcccgg tggacccggc gtgcagcttc acctcgccgg cgcgcgcgcg gctggtggcg 960

cgccgcgcgt acgcctcgtg cagcccgctg ctcggggacc ggtggctgac cgcctgcccc 1020

ttcgacgcct tcggcgagga ggtgcacacg aacgccaccg cggacgagtc ggggctgtac 1080

gtgctcgtga tgacccacaa cggccacgtc gccacctggg actacacgct cgtcgccacc 1140

gcggccgagt acgtcacggt catcaaggag ctgacggccc cggcccgggc cccgggcacc 1200

ccgtggggcc ccggcggcgg cgacgacgcg atctacgtgg acggcgtcac gacgccggcg 1260

ccgcccgcgc gcccgtggaa cccgtacggc cggacgacgc ccgggcggct gtttgtgctg 1320

gcgctgggct ccttcgtgat gacgtgcgtc gtcggggggg ccatctggct ctgcgtgctg 1380

tgctcccggc gccgggcggc ctcgcggccg ttccgggtgc cgacgcgggc gcggacgcac 1440

atgctctctc cggtgtacac cagcctgccc acgcacgagg actactacga cggcgacgac 1500

gacgacgacg aggaggcggg cgtcatccgc cggcggcccg cctcccccag cggagacagc 1560

ggctacgagg ggccgtacgc gagcctggac cccgaggacg agttcagcag cgacgaggac 1620

gacgggctgt acgtgcgccc cgaggaggcg ccccgctccg gcttcgacgt ctggttccgc 1680

gatccggaga aaccggaagt gacgaatgga cccaactatg gcgtgaccgc caaccgcctg 1740

ttgatgtccc gccccgctta aataccggga gaaccggtcc gcccgcattc cgacatgccc 1800

ggcgccgcct ccgtcgacat ggacacgttt gaccccagcg cccccgtccc gacgagcgtc 1860

tcgaacccgg ccgccgacgt cctgctggcc cccaaggacc cc 1902

Claims

1.一种伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX，保藏号为CGMCC No.14326。

2.如权利要求1所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为基因工程减毒疫苗。

4.如权利要求1所述的伪狂犬病毒毒株在作为伪狂犬病疫苗的检验用毒种中的应用。

5.如权利要求1所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病毒感染模型中的应用。