CN110423762A

CN110423762A - 一种PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建方法

Info

Publication number: CN110423762A
Application number: CN201910756897.3A
Authority: CN
Inventors: 崔红光; 胡巍耀; 秦丽; 杨柯
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110423762B

Abstract

本发明公开了一种PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建方法。本发明方法包括如下：利用密码子的简并性，将甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列的第2363位的A替换为C，得SEQ ID No.1；根据SEQ ID No.1中存在的两个单一限制性内切酶AatII和BamH I的识别位点，将SEQ ID No.1分成三段；制备得到三个片段并将其克隆到同一个植物表达载体中，得到含有SEQ ID No.1的重组表达载体即为甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆。利用该方法能以低成本，快速高效地构建出PVMV侵染性克隆，本发明为日后防治相关病害提供理论依据。

Description

一种PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建方法。

背景技术

目前，病毒与寄主的相互关系及其致病机理是病毒学研究领域的热门课题，而构建病毒的侵染性克隆是研究的有力工具。侵染性克隆是指病毒具有侵染性的cDNA克隆或是有侵染性的体外转录物(Boyer et al.，1994)。由于分子克隆是建立在DNA的水平之上的，因此DNA病毒的侵染性克隆最早被制备了出来。但是对于RNA病毒来说，在RNA水平对其进行遗传操作是相当困难的，很大程度上制约了RNA病毒与寄主的相互关系和致病机理研究。直到上个世纪90年代早期，逆转录酶的发现和商业化方便了我们对RNA病毒的研究，如在cDNA克隆的基础上，利用定点突变或基因敲除等技术可以对病毒的复制、移动、症状的形成、寄主范围、基因的功能及病毒与寄主的互作进行研究。雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)是第一种被构建成侵染性cDNA克隆并具有生物活性的植物病毒(Ahlquist,1984)。上世纪80年代以来，全世界范围内已报道多种植物病毒和类病毒的侵染性克隆被成功构建(Dawson et al.,1986；Rizzo et al.,1990；Flatken et al,2008；Gulati-Sakhuja etal.,2011；Ryu et al.,2012；Cui et al.,2013)。

甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)属马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，它是除红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)，红辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)，马铃薯病毒Y(Potato virus Y,PVY)，番茄蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)以外能侵染红辣椒的病毒(Moury et al.，2005)。甜椒脉斑驳病毒目前被认为是辣椒产量和质量的主要威胁(Fajinmi et al.，2010)。甜椒脉斑驳病毒粒子为线状，粒子内含有一条正义单链RNA作为遗传物质，基因组长度为9.7-10Kb，基因组的3’端有poly(A)尾，5’端与VPg蛋白共价结合。和其他的马铃薯Y病毒属的病毒一样，会在被侵染的细胞的细胞质中形成风轮状的内含体。

发明内容

本发明的目的是提供一种PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建方法。

第一方面，本发明要求保护一种构建甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的方法。

本发明所要求保护的构建甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的方法，可包括如下步骤：

(A1)利用密码子的简并性，将甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列的第2363位的A替换为C，得到改造后甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列；

所述改造后甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列如SEQ ID No.1所示；

(A2)根据SEQ ID No.1中存在的两个单一限制性内切酶AatII和BamH I的识别位点，将SEQ ID No.1分成三段，分别记为N段、M段和C段；

(A3)制备所述N段、所述M段和所述C段，然后将三个片段克隆到同一个植物表达载体中，得到重组表达载体；在所述重组表达载体中，所述N段、所述M段和所述C段无缝连接为SEQ ID No.1；所述重组表达载体即为甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆。

进一步地，在所述重组表达载体中，启动所述改造后甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列转录的启动子为35S启动子。终止所述改造后甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列转录的终止子为NOS终止子。

进一步地，所述植物表达载体的全序列如SEQ ID No.10所示。其质粒图谱如图1所示，在35S启动子和NOS终止子间依次含有酶切位点StuI、BamHI、PstI、AatII和SalI的识别序列。

其中，所述植物表达载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：以经修饰的pCB301载体(记载于“Hongguang Cui,et al.Plum Pox Virus 6K1Protein Is Requiredfor Viral Replication and Targets the Viral Replication Complex at the EarlyStage of Infection.J Virol.2016Apr 29；90(10):5119-5131”一文)为模板，以引物PCB301-F和引物PCB301-R进行PCR扩增，所述引物PCB301-F的序列如SEQ ID No.8所示，所述引物PCB301-R的序列如SEQ ID No.9所示；扩增产物经PstI酶切环化，得到所述植物表达载体。

进一步地，步骤(A3)中，所述N段和所述C段先于所述M段克隆到所述植物表达载体上。因为所述M段中含有P3基因，含有P3基因区域的克隆通常十分不稳定。

在本发明的具体实施方式中，所述(A3)是按照包括如下步骤的方法实现的：以甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列为模板，以引物N-F和引物N-R进行PCR扩增，得到扩增产物N；所述引物N-F的序列如SEQ ID No.2所示(5’端做磷酸化修饰)，所述引物N-R的序列如SEQ ID No.3所示；以甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列为模板，以引物M-F和引物M-R进行PCR扩增，得到扩增产物M；所述引物M-F的序列如SEQ IDNo.4所示，所述引物M-R的序列如SEQ ID No.5所示；以甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列为模板，以引物C-F和引物C-R进行PCR扩增，得到扩增产物C；所述引物C-F的序列如SEQ ID No.6所示，所述引物C-R的序列如SEQ ID No.7所示；所述甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列为将SEQ ID No.1的第2363位的C改为A后所得序列。将所述扩增产物N克隆到所述植物表达载体(SEQ ID No.10)的酶切位点StuI和BamHI之间，得到重组载体pCB301-N；将所述扩增产物C克隆到所述重组载体pCB301-N的酶切位点AatII和SalI之间，得到重组载体pCB301-NC；将所述扩增产物M克隆到所述重组载体pCB301-NC的酶切位点BamHI和AatII之间，即得所述重组表达载体(命名为pHNu，即所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆)。

第二方面，本发明要求保护甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆。

本发明所要求保护的甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆，为含有SEQ ID No.1所示DNA片段的重组表达载体。

进一步地，所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆为利用前文所述方法制备得到的甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆。

更加具体的，所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆为将SEQ ID No.10所示的植物表达载体的酶切位点StuI和SalI之间的小片段替换为SEQ ID No.1所示DNA片段后得到的重组表达载体。

第三方面，本发明要求保护含有前文所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌。

进一步地，所述重组菌为含有所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌(如农杆菌GV3101)。

第四方面，本发明要求保护前文所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆或所述的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一病毒为甜椒脉斑驳病毒。

第五方面，本发明要求保护前文所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆或所述的重组菌在研究甜椒脉斑驳病毒致病机理中的应用。

第六方面，本发明要求保护前文所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆或所述的重组菌在研究甜椒脉斑驳病毒与宿主植物互作中的应用。

在上述各方面中，所述植物可为辣椒(如黄灯笼辣椒)或本生烟等。

本发明构建了PVMV的侵染性全长cDNA克隆，并能够成功侵染本生烟和黄灯笼辣椒。利用该方法，能够以很低的成本，并快速、高效地构建出PVMV的侵染性克隆，以该反向遗传学体系对PVMV的致病机理及其与寄主的相互关系进行研究，为日后防治相关病害提供理论依据。

附图说明

图1为本发明作为植物表达载体使用的改造后pCB301载体的结构示意图。

图2为本生烟和黄灯笼辣椒新叶样品RT-PCR的结果。

图3为发病本生烟的新叶上观察到的PVMV病毒粒子电镜图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建及生物活性检测

一、材料与方法

1、供试材料

供试植物：带PVMV病毒的田间黄灯笼辣椒植株、实验室接种的健康的黄灯笼辣椒和本氏烟。

主要试剂：多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Polysaccharides&Polyphenolics-rich RNAprep Pure)、快速质粒小提取试剂盒和2×Taq PCR Mastermix均为天根生物技术(北京)公司产品；限制性内切酶为NEB公司(NEW ENGLAND Biolabs)产品；RT-PCR扩增所需试剂与T4DNA连接酶主要来自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher)；CyclePure Kit纯化试剂盒与Gel Extraction Kit纯化试剂盒为OMEGA公司产品；克隆感受态细胞Trans5αChemically Competent Cell来自北京全式金生物技术有限公司，DH10B、GV3101来自上海唯地生物技术有限公司。经修饰的pCB301载体记载于“Hongguang Cui,etal.Plum Pox Virus 6K1Protein Is Required for Viral Replication and Targetsthe Viral Replication Complex at the Early Stage of Infection.J Virol.2016Apr29；90(10):5119-5131”一文(a modified mini-binary vector,pCB301)，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用。

主要仪器：Bio-Rad电击转化仪、Bio-Rad SmartSpec^TM Plus分光光度计，北京百泰克GT9612基因扩增仪、微量紫外分光光度计Micro Drop、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台、ZQZY-AF8型恒温振荡培养箱、JY600⁺型稳压电泳仪。

引物合成以及测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司。

2、植物总RNA提取

植物总RNA提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根)，具体操作方法如下：

(1)匀浆处理：50-100mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μl裂解液SL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)，立即涡旋剧烈震荡混匀；

(2)12,000rpm(～13,400×g)离心2min；

(3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；

(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(6)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD缓冲液，轻柔混匀；

(7)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min；

(8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(10)重复步骤9；

(11)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

3、PVMV基因组序列扩增引物及载体改造引物设计

基于前期对PVMV-HNu的全基因组测序，发现在7337nt存在一个单一的限制性内切酶位点AatII，并利用密码子的简并性，改造2363nt处的腺嘌呤可得到另一个单一的限制性内切酶位点BamHI(SEQ ID No.1为改造后的甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列)。基于这两个酶切位点，将PVMV-HNu全长cDNA分成N、M、C三段，并分别在两个酶切位点两端设计全长扩增引物N-F/N-R，M-F/M-R，C-F/C-R，N-F引物5’端做磷酸化修饰，C-R引物5’端引入SalI酶切位点和20个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(表1)。其次，设计一对载体引物，在植物双元表达载体pCB301的基础上，在设计的引物上引入StuI、BamHI、PstI、AatII、SalI多克隆位点(表1)。酶切位点旁均引入保护碱基。

表1 PVMV全长序列扩增引物和载体改造引物

注：*引物5’端进行磷酸化修饰，加下划线为突变的碱基，斜体为限制性内切酶位点。

4、RT-PCR扩增PVMV全长序列(N、M、C)及重组质粒构建

(1)RT-PCR扩增PVMV全长序列(N、M、C)

cDNA的合成是利用ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoScientific)，具体步骤如下：

将表2中试剂按顺序加入到无菌的、无核酸酶的离心管中，

表2试剂及加入顺序

将以上体系温和地混匀，瞬时离心后，在65℃下放置5min。然后放冰水1min，瞬间离心，再放置于冰上，准备下一步操作；

按表3顺序往上一步离心管添加试剂。

表3试剂及加入顺序

轻柔地混匀并瞬时离心；于25℃下放置5min，然后在42℃下反应1h；在70℃下放置5min可终止反应。

将cDNA放置于-20℃或-80℃保存，或直接进行PCR反应。

以上一步获得的cDNA为模板进行PCR反应，利用Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(Thermo Scientific)反应体系如表4所示。

表4反应体系

cDNA	2μL
		上游引物(10mM)	1μL
下游引物(10mM)	1μL
		Phusion DNA Polymerase	0.5μL
5×HF Buffer	10μL
		dNTP Mix(10mM)	1μL
去离子水	34.5μL
		总量	50μL

PCR反应循环参数：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，Tm退火30sec，72℃延伸1min 30sec(M、C段分别延伸2min 30sec和2min)，循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在JY600⁺型稳压电泳仪，120V下电泳30min左右，电泳胶于凝胶成像分析仪中照相，并切下目的条带，使用OMEGA公司Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒进行扩增产物的纯化回收。于-20℃保存。

当然，在制备N、M、C各片段的时候，也可以直接人工合成带有相应酶切位点的三个片段。

(2)PCR改造载体

该实验所使用低拷贝载体经修饰的pCB301载体作为侵染性克隆的骨架，设计相应的引物，通过PCR的方法在载体上引入StuI、BamHI、PstI、AatII、SalI多克隆位点。PCR体系和反应循环参数见上一步操作，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在JY600⁺型稳压电泳仪，120V下电泳30min左右，电泳胶于凝胶成像分析仪中照相，并切下目的条带，使用OMEGA公司Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒进行扩增产物的纯化回收。

(3)pCB301改造载体的环化

将上述步骤(2)凝胶回收后的产物利用NEB(NEW ENGLAND Biolabs)公司的限制性内切酶PstI进行酶切，酶切反应体系如表5所示。

表5酶切反应体系

DNA	40μL
		Cutsmart	5μL
PstI	2.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	2.5μL
总量	50μL

按照该反应体系将试剂添加到1.5mL离心管中，轻轻用枪头吸打混匀，放置于37℃中反应2h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，电泳胶于凝胶成像分析仪中照相，观察是否酶切完整，并切下目的条带，纯化回收。将回收的产物利用T4DNA Ligase(ThermoScientific)作自我环化，连接体系如表6所示。

表6连接体系

线性化载体	5μL
		10×T4DNA Ligase Buffer	1μL
T4DNA Ligase(5U/uL)	0.25μL
		ddH<sub>2</sub>O	3.75μL
总量	10μL

将体系轻轻混匀后，瞬时离心，至于22℃反应1h，取5μL连接产物转化入50μL DH5α感受态细胞，涂于含有卡那霉素的平板上，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行菌落PCR验证，将正确的克隆接种于10ml(含卡那霉素，100mg/L)LB液体培养基中，37℃振荡摇菌16h后，将10ml菌液全部用于质粒提取，质粒提取使用快速质粒小提取试剂盒(北京，天根)，具体方法如下：

1)取1-4ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；

2)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1(请先检查是否已加入RNase A和TIANRed)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；

3)向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；

4)向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12,000rpm离心2min；

5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

6)向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

7)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；

8)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl灭菌的ddH₂O，12,000rpm离心30sec将质粒溶液收集到离心管中。

最后将获得的质粒进行酶切并跑胶验证，以判断酶切位点是否成功加入，并经测序验证正确后备用。改造后的pCB301载体的全序列如SEQ ID No.10所示。其质粒图谱如图1所示，在35S启动子和NOS终止子间依次含有酶切位点StuI、BamHI、PstI、AatII和SalI的识别序列。

(4)N段的整合

先将上一步所获得正确的pCB301改造载体(SEQ ID No.10)进行StuI和BamHI双酶切，然后将回收的N段利用BamHI酶切，两者均放置于37℃反应16h，保证酶切充分。酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析，切下正确的条带，并纯化回收。回收产物利用T4DNA Ligase连接，取5μL连接产物转化入50μL DH5α感受态细胞，涂板，培养。挑取单克隆做菌落PCR验证，将正确的克隆接种至液体培养基中待大量提取质粒。将质粒做酶切验证，酶切结果正确的克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。待测序正确后将得到的pCB301-N做下一步的试验。pCB301-N结构描述：在改造后pCB301载体(SEQ ID No.10)的酶切位点StuI和BamHI之间插入SEQ ID No.1的第1-2357位所示DNA片段后得到的重组质粒。

(5)C段的整合

将pCB301-N和保存的C段同时用AatII和SalI做双酶切，产物利用琼脂糖凝胶电泳分析并回收。产物利用T4DNA Ligase连接，取5μL连接产物转化入50μL DH5α感受态细胞，涂板，培养。挑取单克隆做菌落PCR验证，将正确的克隆接种至液体培养基中待大量提取质粒。提取的质粒做双酶切验证克隆的正确性。将正确的克隆进行测序。并保存质粒pCB301-NC。pCB301-NC结构描述：在pCB301-N载体的酶切位点AatII和SalI之间插入SEQ ID No.1的第7338-9795位所示DNA片段后得到的重组质粒。

(6)pHNu的构建及农杆菌介导接种寄主

将保存的pCB301-NC与M段同时用BamHI和AatII双酶切，产物利用琼脂糖凝胶电泳分析并回收。产物利用T4DNA Ligase连接，取2μL连接产物，利用Bio-Rad公司电击转化仪，转化到GV3101农杆菌电转感受态中。具体转化方法如下：

1)0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温；

2)取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入2μL连接产物，用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μL枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用；

3)启动电转仪，设置参数：T＝5.8mS V＝2400V，将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μL无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2小时；

4)将全部菌液均匀涂布在含利福平和卡那霉素的LB平板上(100ug/mL kan，20ug/mL rif)，倒置放于28℃培养箱培养2天。

挑取单克隆，做菌落PCR验证，将正确的克隆做农杆菌浸润接种本氏烟，具体步骤如下：

1)将单克隆接种于含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃恒温摇床中过夜摇菌；

2)取2mL浑浊呈黄色的菌液加入2mL的离心管中，5000rpm离心5min，倒掉上清液；

3)配制农杆菌接种缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES pH 5.7，200μMAcetosyringone)，取1.5mL缓冲液重悬菌体，以洗涤菌体，5000rpm离心5min，倒掉上清液。再以同样方法洗涤菌体1次；

4)取1mL农杆菌接种缓冲液重悬菌体，调OD₆₀₀至1.0左右，室温静置1h；

5)注射本氏烟幼苗，以不注射本氏烟作为对照。

五天后，观察本氏烟症状。取发病植株对应的克隆提取质粒，然后将质粒转化DH10B大肠杆菌感受态细胞中，以扩繁该质粒。遂将转化后的克隆测序，并提取质粒pHNu保存。pHNu结构描述：在pCB301-NC载体的酶切位点BamHI和AatII之间插入SEQ ID No.1的第2364-7331位所示DNA片段后得到的重组质粒。

然后利用同样的接种方法接种健康的黄灯笼辣椒幼苗，以不注射黄灯笼辣椒作为对照。

5、PVMV侵染性cDNA克隆生物活性检测

(1)RT-PCR法检测接种本氏烟和黄灯笼辣椒

利用特异性引物PVMV-F(+)和PVMV-R(-)检测接种本氏烟和黄灯笼辣椒，反应体系如表7所示。

PVMV-F(+)：5’-GAAGCGTACATTGAGAAGCGCA-3’；

PVMV-R(-)：5’-CGTCCAGTCCGAACATTCGA-3’。

表7反应体系

cDNA	1
		2×Taq mix	12.5
PVMV-F(10mM)	0.5
		PVMV-R(10mM)	0.5
ddH<sub>2</sub>O	10.5
		总量	25

PCR反应循环参数：94℃预变性3min，94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在JY-600⁺型稳压电泳仪，120V下电泳30min左右，电泳胶凝胶成像分析仪中拍照。

(2)电子显微镜观察病毒粒子

取接种20天的本氏烟叶片，在日立(HITACHI)HT7700型透射电镜下观察病毒粒子，具体操作方法如下：

1)将感病的嫩叶组织与灭菌纯水以1:10(g/mL)的比例混合，放入置于冰上的无菌研钵中；

2)使用研杵研磨后立刻吸取混合物上清液滴入1.5mL离心管中，12000rpm 2min，吸取离心管内上清液滴加在200目铜网上，2min后用滤纸吸干铜网上的液体，再向铜网上滴加1％磷钨酸进行负染色，2min后用滤纸吸干染料；

3)将铜网置于钨丝灯下干燥约30min后，使用透射电子显微镜(Hitachi HT-7700)进行观察。通过Adobe Photoshop CS6软件对病原物进行30次测量。

二、结果与分析

1、RT-PCR法检测接种本氏烟

利用PVMV特异性引物，对接种PVMV侵染性cDNA克隆20d后的本氏烟新叶和黄灯笼辣椒新叶进行RT-PCR检测。

结果如图2所示。图中左四个为本氏烟新叶样品RT-PCR的结果，其中1为健康本氏烟，2、3、4为农杆菌介导接种并发病的本氏烟；图右四个为黄灯笼辣椒新叶样品RT-PCR的结果，其中1为健康黄灯笼，2、3、4为农杆菌介导接种并发病的黄灯笼辣椒。结果表明，该侵染性克隆对本氏烟侵染率达100％(8/8)；对黄灯笼辣椒侵染率达100％(8/8)。

2、透射电镜下观察病毒粒子

取农杆菌介导接种20天的发病本氏烟的新叶，利用磷坞酸负染色法在投射电镜下观察病毒粒子，发现了大量线状病毒粒子，长度大约为700-900nm，宽度约为13-15nm。图3为其中一个病毒粒子的代表，图中显示一个长度为853nm，宽度为13.1nm的线状病毒粒子。

三、讨论

本发明从DNA病毒的侵染性克隆到RNA病毒侵染性cDNA克隆的构建，体现了DNA水平操作病毒的便捷性。逆转录酶的普及和商业化，促进了RNA病毒的研究，实现了RNA病毒侵染性cDNA克隆的构建。

酶切酶连，就是利用酶切位点将病毒基因组划分为数个片段，再利用这些位点依次将整个基因组连接到一个载体中，该方法被普遍地应用到植物病毒cDNA克隆的构建中，可极大地降低构建侵染性克隆的成本。

本发明为了构建PVMV的侵染性cDNA克隆，我们对其海南大学分离物PVMV-HNu全基因组序列分析，在7337bp的位置发现了一个单一的酶切位点AatII，而另外一个酶切位点BamHI在基因组中并不存在，是通过改造密码子的第三个核苷酸获得的，并不影响该位置的氨基酸。利用此方法，可以有更多酶切位点供我们选择，并不会被病毒原本的基因组所限制，提高了酶切酶连构建植物病毒侵染性cDNA克隆的可行性。

本次实验利用了含有35S启动子和NOS终止子的植物双元表达载体PCB301。载体上35S启动子的末端含有一个平末端酶切位点StuI，酶切后，既保证了35S启动子的完整性，还能与经过5’端磷酸化修饰的扩增产物连接，精准地将表达序列插入到35S启动子的下游，排除了多余序列的干扰。且pCB301是低拷贝载体，有效提高侵染性克隆的稳定性。

马铃薯Y病毒属的病毒有一个特性，编码P3蛋白区域的基因通常对大肠杆菌有潜在的毒性，使含有P3蛋白基因区域的克隆十分不稳定，这可能是由于该区域含有隐藏的启动子，表达了有生物活性的毒性物质。在编码P3蛋白的基因区域插入内含子是解决该问题最常用的手段。而在本发明中，我们将含有编码P3蛋白序列的M段作为最后整合的片段，将连接产物直接转化农杆菌GV3101，将接种后能使本氏烟发病的克隆提取质粒pHNu，转化大肠杆菌DH10B，使pHNu大量扩繁，将从DH10B扩繁的pHNu再次转化GV3101，接种本氏烟，依然能使其发病。事实证明，pHNu能够在农杆菌GV3101和大肠杆菌DH10B中稳定存在。

利用该方法，能够以很低的成本，并高效、快速地构建出PVMV的侵染性cDNA克隆，以该反向遗传学体系对PVMV的致病机理及其与寄主的相互关系进行研究，为日后防治相关病害提供理论依据。

<110> 海南大学

<120> 一种PVMV侵染性全长cDNA克隆的构建方法

<130> GNCLN191882

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9795

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

aaaattaaac atctcataca aacaaatacg aaagcaaaca agtttacaag caatcaagca 60

ttcaagcatt tatagtttga tacagcagtt ctgcaagtaa cttattcctt tccgctaagc 120

ctactcaacg tgaaattagt tcattttgaa acgcagctta acgttattta tttcttaaaa 180

ctattcatca caaaatggca atccgcgttt ctttcccgtg cttctacaat actcacaact 240

ctacactatc tgagtgcaaa tcggtaacta tgggcatatg ctttggtagt ctgaagccaa 300

agcagattga ttggaatgaa gcatccaaca atttactgga ggagtatgat gataagatgg 360

atgcctttga aaaggattgt gaaaagtttg ctcgtgaaat gagtggacaa agggcagttc 420

tcaaaggggg tgtttataaa tatgctccaa aaacaagagc gcaacttcgc aaagagagga 480

agcacaatcg catacttgag gaaagagctg aattcctcaa tgggaaggac tcaatcatta 540

cagaaatggt cttccctgtt gaagctagga aggcacaaac agaagaagtt ccattcaaat 600

atcctcccat tgttcagaga aaaccgagga aaacaccaca catgaactat gtcacactga 660

atgacactca gttcgaccaa tttaccaggg agctaattaa cgcttgcgaa gcagcctcgc 720

aaccaatgga gataattggt aaaaggaagg ttagagtaca agcacgggtc acacgcctgt 780

tctcaaatac caggtgcctt caggtggtga caaaacacca caaaggcaag ctatgtgaaa 840

tcgatgtccc taatatgcgt gggatagaga attcacttgg ccatttagca caagctgcgt 900

ggaagggcgg ttttgtgaat gaagagagac ttggatatgg gactagtggt tgctgcatac 960

ctcatggctt gctcaaaggt agaactctcg atggtggctt cgatttcttc attgtgcgtg 1020

gtagatatgg gccactttta atggattcga ctaggtatac accaaaacag gtgcttgcag 1080

atatccaaca ctactcagct ggagataagt tttggagtgg atttgatcag gcattccgag 1140

cacaccgcac aacaccagtg atacacagcg gaatgaacac acttgacgtt acacagtgtg 1200

gtgaagttgc ggcaatcctt tgtcaagctc taatgccctg ttgtcgcata acatgcactg 1260

tctgtgccac cactaacgcg gatatcactc aacttgaatt gcgtgagcgc attgcacatt 1320

caatcaaagg aagcatttca gagttgagtg agaaatatcc agcttttcca cacgctgtta 1380

gatttctaaa ggattattta atctctctaa acaattttaa tccaaataga gaggctagtg 1440

gtaaagttca ctttttgatt ggagacagga aggaacaacc cttctcccac atactagcag 1500

tgaatgaaac attgatcaag ggaggaagag caacaagtga cgagtttgca catgcctccg 1560

atgaattact ccaattggca aggtttcaca agaatcgggt tgagtcactc aagaagggct 1620

cgctccattt atttagaaac aaagcagctt caaaagcgca cattaatcca tctttgatgt 1680

gtgataatca gctcgatgcg aatgggaact ttgtgtgggg aaaacgtggt taccacgcaa 1740

aaagattctt tgcgaattat ttcgatcgaa tcgaacctac aagtggttat gataagtacg 1800

taattcgcaa atttccaaat ggttcaagaa agctggctat tggtaattta attctctcca 1860

cgaacttgga tgaacttaga aagcagctcg aaggagagag tattcaaaca tatcctttga 1920

ctcagcaatg tgtaagcaag aggaatgaga catttattta tccatgctgc tgtgtcacat 1980

atgatgatgg aagcccaatg ctctctgaat ataaagctcc aacgaagaat catttagttc 2040

ttggtaattc aggagattct aaatatcttg atctaccgac agagataagt gaaaatttgt 2100

acatagcaaa ggaaggctat tgctacatca atattttctt atcaatgttg gttgaagttg 2160

atgaaaatga agccaaggac tatactaagt gggtcagaga catagtggtg cagcaacttg 2220

gacagtggcc gacaatgact gatgtggctt tagcttgcta ccagctctca gtgttgtttc 2280

catcgacacg ctctgctgag ctacccagaa ttttagttga ccacaagact aaaacgatgc 2340

atgttatcga ttcatttgga tccctaacaa ctgggtacca catcctcaaa gctaacactg 2400

ttagtcaatt attgatgttc gcaagtgaca cattagagtc agagatgaaa atgtaccgtg 2460

ttggaggcag tgacccacga actctcaccg actatagaaa gcggcttttt caatcagtgt 2520

acaaaccagc agtttttaaa caattaatgc ttgaagaacc tgtcatcctc acactagcaa 2580

taacttcacc aacactgcta agtgagtttt accacaatgg tagcttacac agagccatgg 2640

gcctcgttgg gcaagcagag atgccagtga gaattgcagt aactcatatt gttgaattgg 2700

ctaagaaggt aactcgagct gaatcattat acgagcaatc tgcaattatt gagtcaaatg 2760

ctcaggaact gtatgcgata ctagattcag taccctacaa aacagaagct cttgaacata 2820

tcctggcgta cttgctgacc gttgtacttg atgccgacag tgacgcaacg ttggaggaca 2880

ttggtttcag aacgttaaaa tttaagtccc ttagtgtgct tgaaaaaatc tgcagggacg 2940

atttggatgc acaatggaga gatttaagct tgtctgcaaa atctcgtata acttggcaat 3000

cattaagatc aagaaagtca tgtacaggcg gtttgcgcga caccgcttgc agcattttca 3060

agaaagtttt cgagtcttcc acagcatatg tacagggcaa ggctcagaag ataccagtgc 3120

cttttatgta catgttatct aagacaagta aatctgctag ttacattcgt tcttcagtgc 3180

ttaataggat gtacagctac atagcttata gctttcgtga tgcattccaa tttatacaca 3240

cccttgctat ccttagtatt ttgctaacca tatatactaa catattaaac atcaggaatc 3300

agaataagaa gagagctttg ctactcatga aggaggcaga taggttgaag agtgagcgta 3360

ttgagcgttg cttcgaagaa attagcaaga aattgaatgg cgcaccaaca gaacagcaat 3420

tcatccagtt cattcaagag aaagatccgc aagctcttca atactattcg gaacagaaca 3480

atgatgtgaa gcatcaagcg agcaagagac cagccgaagc taagcttgaa cagatcgtag 3540

cttttgtcgc acttatgatg atggtttttg atactgatag aagcgactgt gtctacaaag 3600

tgctcaataa gctcaagaat gtcatgggag ttgttgataa tgacgcagtt aatcatcaga 3660

gcattgacac gattttggat gattttgaga gcaagaatga aatgatcgag ttcgagctca 3720

cggcacctga tgcaaaatcc cttgcatata aatcatcgac attccagaag tggtgggaca 3780

atcagatcag cacgaataat gttatatcac actatagaac tgaggggcat ttcattcagt 3840

tcacacggga gacttcggcc caagttgcta gtgatattag cagtagtgaa atccgtgatt 3900

ttctgatcag aggtccagtg ggttctggaa aatcaactgg tctgcctagt ctattatgca 3960

agaagggaag ggttctattg cttgagccaa caaggccatt agctgaaaat gtgcatgctc 4020

aactcagttc agcaccattt cacttaaatc caactttgat gatgaggaat aaatccgtgt 4080

ttggttccac tccgatctct gtaatgacaa gtggctatgc cttgcattat cttgcaaaca 4140

acgcacatag gctcaaagag tttagtttca ttatattcga tgaatgccat gtgttagatg 4200

ctagtgctat ggcattcaga agtttacttg ctgatcgtgc gtttgaaggt aagatattga 4260

aagtgtcagc aacaccaccg gggagagaaa ctgaattcac aactcaattt ccagtgaaac 4320

tcagaacaga ggatcacctg agtttccaac aatttgtgga cgcacaagga acaggatcaa 4380

atgctgatgt aataagtgat gcagacaaca tattagtgta tgttgcgagt tacaacgaag 4440

tggatcaatt gtcgaaaatg ctagttgagc gacatcacaa ggtcacaaaa gtggatgggc 4500

gaacaatgaa gtctggcgct gtggagataa agactgttgg aacaaagcaa cgaaagcact 4560

tcattgttgc aacaaatatc attgagaatg gtgtgactct ggacattgaa gctgttgtgg 4620

actttggtca aaaagttgga gctgatgtac gatctgatga acgcatgatc tgctatacaa 4680

aaggagctat taactatgga gaaagagtgc agcgtcttgg aagagttggg cgaacaaagc 4740

ctggttgtgc cctgcggatt gggcacacga acaaaggaat tgaggcaata ccaaccgtta 4800

ttgctaatga agcggcgttt ctttgcttca tctatgggtt accagtcatg acagcacagg 4860

ttagcaccag cttgcttagc tcctgtacag ttcaacaagc gcggactcta gcattgtttg 4920

agctgccatt ttacttcttg caggactttg tcgcggctga cggctctatg cacccagcag 4980

tgcatgcact tgtgaagaag tttaaactgc gcgagagtga agtgatattg aacaaattgg 5040

caattcctca cgcagctgtt aacaaatgga tgtcagtccg tgaatacaat caatgctcaa 5100

agcagatgga tctagatcct gatgtcaagt tgtcgttcct cgtaaaggaa gtgcctgaga 5160

gtttgtacga aaagttgtgg cactgtgttc aatcacatag aggagatgct ggttttaaga 5220

agatagctac acataatgca gcaaaaattg ctcataaact gagagctgat aatgcatcta 5280

tccaaagaac agtattgctt atcgatcaat tgattgctgc agagatgcaa aagaaggagc 5340

acttcgactc gcttgtcaat gctaatacta catcactaag cttttcactg cagtcaatta 5400

gtaacatgat cagatcgagg tatgctaagg actattcagt tcagaatctc agcatattgc 5460

acgaagcaag agcccaacta gttgaattca acaatctcta ttcagaggac ataatcagtg 5520

gggcggcatc aatatggaca atgcgtgaca gtattgtcga gtgcggtgct atggaaactg 5580

tcatgcatca gagtacagaa gagattggga agttccttgg tttgaaaggc ttctggaaca 5640

agaagttgct cactcgcgat gtgttgattg gtgctggtgt ggcttgtgga ggtgcttgga 5700

tgctatacca gtttgttatg gattcatttg gagatgacgt gtcacaccag gcgcagggca 5760

gaaacaagag acagaagcaa aaactaaagt ttagagatgc gcgagatgca aagcttggga 5820

gagttgtcat tgacgatgat tcaggtgcaa ttgaacactt ctttgggagc gcatacacaa 5880

agaagggtaa atcgaaagga aagacccatg gtatgggaaa gaagaatcgc agatttgtca 5940

acatgtatgg ctttgatcct actgaatatt cctttatccg atttgttgat ccaatcactg 6000

gtgaaatgct tgatgaaagt gtcatggcag atatcatgtt ggtgcaggag cacttcaatg 6060

atttacgcca tgagtacata tcagaagaca aaattgagat gcaggcactc tataaaaatc 6120

ctggaatcca agcatatttt gttaaggata aagtttcgcc cgttctcaaa gtggacttga 6180

cacagcatga gcctcttaaa atgtgtgata attcagcaac catagctggt tttccagaac 6240

acaaaggaat gttgagacag acgggtcaag caactctagt tacacatgca gaactcccaa 6300

atttagagaa ggttgagcat gaggcaaaat ctctgaacaa gggtttgcgt gatcacaatc 6360

agatctccaa agtagtgtgc agactcgaaa atgaatcaga ttcttatgtt acatcgatac 6420

atggggttgg atttggatcg gtgattatta caaatcggca tttgatgaaa cgcaacaatg 6480

gtcagcttcg ggtgagaact gcgcatggtg actttaagat tgcaaacact aaggagatgc 6540

gtatacaccc agtggataaa catgacctga ttcttgtgag actgccaaag gacttcccac 6600

ctttccccac aaagattaag tttagagaac ctaagctcac tgattcaatt tgtttggtag 6660

gctcgaactt tcaagaacga ttccttagca gcctagtatc agcatcaagt gaaacttcac 6720

cagttgagaa ttctaagttt tggcgacact ggatcgacac taaggatggt cattgtggtt 6780

tgcctcttgt ttcaactaat gatggtgcaa tagttgggtt ccacagttta acaagtatga 6840

acacagatca aaactacttc gcatccgttc caagtgatct ggcacaaatg atcaaggatt 6900

ttgaaacatt ggaatggaga aagtgctggg tctataatcc aaacgaaatt ggctggggct 6960

ctctgaaact gcaacaagat aagcctggtg ggatgtttaa agttgataaa ctcattgagg 7020

accttcaatc cacatttgtg caggagcaag gagaagaaaa atggttgtat gcacagcttt 7080

atggtaactt gaaagctgtt ggaaaaagtg agagccagtt agtgactaag catgtggtga 7140

aaggacagtg cccattgttc cagctgtatc tctcgacaca taaagaagca aaagagtatt 7200

tcaagccact tatgggagca tacgcaaaaa gcaggcttaa tcgaattgca tatgcaaagg 7260

atattcttaa gtatgcaacg gaaattgaag tgggcaaagt tggatgtgac atgtttgaat 7320

tggcagtcga ggacgtcata tgtgatttgc atgctgtgaa cttcacaaca tgtgaataca 7380

taacagatga ggaacagata tttcaatctc tcaacatgaa atcggctgtt ggagcaatgt 7440

acagaggtaa gaagcgggac tacttcgaga catacacaac tgaggacaaa gaaagaattc 7500

tttatgaaag ttgtttcaga ctgtacacag gtaaacttgg gatttggaac ggttcaatca 7560

aggccgaact tcgcccaatg gagaaagttc aagcaaacaa gacgaggaca ttcacagctg 7620

ctccaattga tacgcttttg gctggaaagg tgtgtgttga tgacttcaac aatcaatttt 7680

actcaaagca cacaatagca ccctggagtg tgggtatttc taagttctct ggcggctggg 7740

ataagcttct cagaaaatta cctgatggtt ggatctattg cagtgccgat gggagccgtt 7800

ttgatagctc gttgacccct tatttgatta acgctgttgc acagatcagg ttagcattca 7860

tggagaagtg ggacataggt gaacaaatga tcaagaacct ctatgccgaa atcatttata 7920

cacctatact tacagctgat ggcacaattg tgaagaagtt caaaggtaat aactctgggc 7980

agccgtcaac tgttgttgat aacactctca tggtcttaat tgctatgaga tattcattaa 8040

ggcggcttgg catgaactac aaggatcaaa tcaaaaggtg tgtcttcttt gcaaatggag 8100

atgacctcat agtggctgtc agacatgagg acgaatgggt acttgactct ttacaagcac 8160

ccttccaaga gcttggatta tcatataatt ttgatgatag aaccacgaat agatcagaac 8220

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<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atatagtcga cttttttttt tttttttttt tagcgccaat tatgaaaccg c 51

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

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<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

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cgccagaaac gccgtcgaag ccgtgtgcga gacaccgcgg ccgccggcgt tgtggatacc 120

tcgcggaaaa cttggccctc actgacagat gaggggcgga cgttgacact tgaggggccg 180

actcacccgg cgcggcgttg acagatgagg ggcaggctcg atttcggccg gcgacgtgga 240

gctggccagc ctcgcaaatc ggcgaaaacg cctgatttta cgcgagtttc ccacagatga 300

tgtggacaag cctggggata agtgccctgc ggtattgaca cttgaggggc gcgactactg 360

acagatgagg ggcgcgatcc ttgacacttg aggggcagag tgctgacaga tgaggggcgc 420

acctattgac atttgagggg ctgtccacag gcagaaaatc cagcatttgc aagggtttcc 480

gcccgttttt cggccaccgc taacctgtct tttaacctgc ttttaaacca atatttataa 540

accttgtttt taaccagggc tgcgccctgt gcgcgtgacc gcgcacgccg aaggggggtg 600

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gtttcaaaat cggctccgtc gatactatgt tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa 720

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cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc acctatgatg tggaacggga 1020

aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt ccaaaggtcc tgcactttga 1080

acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc gatggcgtcc tttgctcgga 1140

agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag ctgtatgcgg agtgcatcag 1200

gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg aatagcttag acagccgctt 1260

agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat gtggattgcg aaaactggga 1320

agaagacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat tttttaaaga cggaaaagcc 1380

cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga cctgggagac agcaacatct ttgtgaaaga 1440

tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc agggcggaca agtggtatga 1500

cattgccttc tgcgtccggt cgatcaggga ggatatcggg gaagaacagt atgtcgagct 1560

attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa ataaaatatt atattttact 1620

ggatgaattg ttttagtacc tagatgtggc gcaacgatgc cggcgacaag caggagcgca 1680

ccgacttctt ccgcatcaag tgttttggct ctcaggccga ggcccacggc aagtatttgg 1740

gcaaggggtc gctggtattc gtgcagggca agattcggaa taccaagtac gagaaggacg 1800

gccagacggt ctacgggacc gacttcattg ccgataaggt ggattatctg gacaccaagg 1860

caccaggcgg gtcaaatcag gaataagggc acattgcccc ggcgtgagtc ggggcaatcc 1920

cgcaaggagg gtgaatgaat cggacgtttg accggaaggc atacaggcaa gaactgatcg 1980

acgcggggtt ttccgccgag gatgccgaaa ccatcgcaag ccgcaccgtc atgcgtgcgc 2040

cccgcgaaac cttccagtcc gtcggctcga tggtccagca agctacggcc aagatcgagc 2100

gcgacagcgt gcaactggct ccccctgccc tgcccgcgcc atcggccgcc gtggagcgtt 2160

cgcgtcgtct cgaacaggag gcggcaggtt tggcgaagtc gatgaccatc gacacgcgag 2220

gaactatgac gaccaagaag cgaaaaaccg ccggcgagga cctggcaaaa caggtcagcg 2280

aggccaagca ggccgcgttg ctgaaacaca cgaagcagca gatcaaggaa atgcagcttt 2340

ccttgttcga tattgcgccg tggccggaca cgatgcgagc gatgccaaac gacacggccc 2400

gctctgccct gttcaccacg cgcaacaaga aaatcccgcg cgaggcgctg caaaacaagg 2460

tcattttcca cgtcaacaag gacgtgaaga tcacctacac cggcgtcgag ctgcgggccg 2520

acgatgacga actggtgtgg cagcaggtgt tggagtacgc gaagcgcacc cctatcggcg 2580

agccgatcac cttcacgttc tacgagcttt gccaggacct gggctggtcg atcaatggcc 2640

ggtattacac gaaggccgag gaatgcctgt cgcgcctaca ggcgacggcg atgggcttca 2700

cgtccgaccg cgttgggcac ctggaatcgg tgtcgctgct gcaccgcttc cgcgtcctgg 2760

accgtggcaa gaaaacgtcc cgttgccagg tcctgatcga cgaggaaatc gtcgtgctgt 2820

ttgctggcga ccactacacg aaattcatat gggagaagta ccgcaagctg tcgccgacgg 2880

cccgacggat gttcgactat ttcagctcgc accgggagcc gtacccgctc aagctggaaa 2940

ccttccgcct catgtgcgga tcggattcca cccgcgtgaa gaagtggcgc gagcaggtcg 3000

gcgaagcctg cgaagagttg cgaggcagcg gcctggtgga acacgcctgg gtcaatgatg 3060

acctggtgca ttgcaaacgc tagggccttg tggggtcagt tccggctggg ggttcagcca 3120

gcgctttact gagatctcct gtggttggca tgcacataca aatggacgaa cggataaacc 3180

ttttcacgcc cttttaaata tccgattatt ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac 3240

ccgccaatat atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg 3300

agctcgtcaa catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag 3360

tctcagaaga ccagagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc 3420

tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg 3480

gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg 3540

acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 3600

caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg 3660

cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg 3720

agaggcctaa aggatccctg caggacgtct ttgtcgacga tcgttcaaac atttggcaat 3780

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 3840

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 3900

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 3960

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggtaccaaa 4020

accaccccag tactttaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt 4080

gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag ctccccgacc ggcagctcgg 4140

cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagtccac taga 4184

Claims

1.一种构建甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述重组表达载体中，启动所述改造后甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列转录的启动子为35S启动子；和/或

终止所述改造后甜椒脉斑驳病毒的基因组RNA对应的全长cDNA序列转录的终止子为NOS终止子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体的全序列如SEQ IDNo.10。

4.甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆，为含有SEQ ID No.1所示DNA片段的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆，其特征在于：所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆为利用权利要求1-3中任一所述方法制备得到的甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆；

进一步地，所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆为将SEQ ID No.10所示的植物表达载体的酶切位点StuI和SalI之间的小片段替换为SEQ ID No.1所示DNA片段后所得的重组表达载体。

6.含有权利要求4或5所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为含有所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌。

8.权利要求4或5所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆或权利要求6或7所述的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一病毒为甜椒脉斑驳病毒。

9.权利要求4或5所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆或权利要求6或7所述的重组菌在研究甜椒脉斑驳病毒致病机理中的应用。

10.权利要求4或5所述甜椒脉斑驳病毒侵染性全长cDNA克隆或权利要求6或7所述的重组菌在研究甜椒脉斑驳病毒与宿主植物互作中的应用。