CN103642804A - 一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯y病毒属病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’；反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。本发明还公开了利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-downRT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在约1700bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。本发明引物通用性好，检测方法快速准确。

Description

一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法。

背景技术

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）最大的一个属。根据2012年国际病毒分类委员会公布的分类标准，目前该属已报导确定种146个、暂定种32个。马铃薯Y病毒属病毒对农业生产安全可造成严重威胁，该属病毒以蚜虫的非持久性传播为主要传播途径，一般寄主范围较窄，但多数病毒分布很广；另有少数病毒具有十分广泛的寄主范围，并可造成多种作物明显减产。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该Y病毒属中被列为检疫性病毒的种类有：马铃薯A病毒(Potato virus A, PVA)、马铃薯V病毒(Potato virus V， PVV)、李痘病毒(Plum pox virus，PPV)、香蕉苞叶花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)，共4种。目前尚未见到用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的Touch-down PCR检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，

正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’（如SEQ ID NO. 1所示）；

反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’（如SEQ ID NO. 2所示）；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。

利用上述简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其包括如下步骤：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增所得的DNA片段位置判定结果，阳性样品中均能检出约1700bp的DNA片段。也就是说，若在1600－1800bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。

具体的，所述的Touch-down RT-PCR反应包括反转录和Touch-down PCR扩增两个过程。

进一步的，所述反转录的反应温度为42℃；所述Touch-down PCR扩增时，第一个循环退火温度为55℃，以后每个循环退火温度降低1℃，共进行15个循环，然后用退火温度40℃进行20个循环，延伸温度为72℃。

此外，对扩增得到的DNA片段进行序列测定后，可鉴定马铃薯Y病毒属病毒的种类。

将上述简并引物应用于马铃薯Y病毒属病毒Touch-down RT-PCR通用检测试剂盒。

本申请在现有技术基础上重新寻找马铃薯Y病毒属NIb、CP基因上的保守区域，根据保守区域序列设计一对简并引物，通过反转录(reverse transcription，RT)和Touch-down聚合酶链式反应技术(Touch-down polymerase chain reaction，Touch-down PCR)建立了马铃薯Y病毒属的通用Touch-down RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，并根据序列测定结果进行病毒种类鉴定。本发明设计的简并引物简并度低，并且利用Touch-down PCR，在高温时积累特异扩增，低温时对特异产物进行大量扩增，与已报道的现有方法相比，获得的条带更加单一，特异性更强。采用本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否含有马铃薯Y病毒属病毒，引物通用性好，检测方法快速准确，为基础研究和进出口安全提供了保证。

附图说明

图l为利用本发明方法对该马铃薯Y病毒属病毒的通用性试验结果；图中，l为番木瓜环斑病毒(PRSV)病叶、2为番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)病叶、3为辣椒环斑病毒(ChiRSV)病叶、4为辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)病叶、5为甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、6为烟草脉带花叶病毒(TVbMV)病叶、7为甘蔗花叶病毒(ScMV)病叶、8为高粱花叶病毒(SrMV)病叶、9为水茄花叶病毒(WTMV)病叶、10为茉莉花T病毒(MVT)病叶，M为2000bp的DNA Mark；

图2为利用本发明方法检测健康寄主植物的结果；图中1至10分别为三角梅、长春花、扶桑、黄瓜、辣椒、水稻、棉花、番木瓜、香蕉、甘蔗的健康叶片；

图3为利用本发明方法检测辣椒病叶的结果；图中，1为健康对照，2、3、4和5为发病辣椒叶片，6为空白对照，M为2000 bp的DNA Mark；

图4为利用本发明方法检测茉莉病叶的结果；图中，1为健康对照，2为发病茉莉叶片，3为空白对照，M为2000 bp的DNA Mark；

图5为利用本发明方法检测颠茄、水茄病叶的结果；图中，1为发病颠茄叶片，2为发病水茄叶片，3为空白对照，M为2000 bp的DNA Mark；

图6为利用本发明方法检测长春花病叶的结果；图中，1为健康对照，2、3和4为发病长春花叶片，5为空白对照，M为2000 bp的DNA Mark。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例l

1．引物设计与合成

根据马铃薯Y病毒属中芹菜Y病毒(AVY)、颠茄斑驳病毒(BeMV)、鬼针草花叶病毒(BiMV)、菜豆黄斑花叶病毒(BYMV)、芹菜花叶病毒(CeMV)、辣椒环斑病毒(ChiRSV)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、三叶草黄脉病毒(CYVV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、魔芋花叶病毒(KoMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、马铃薯A病毒(PVA)、人参Y病毒(PaVY)、马铃薯V病毒(PVV)、辣椒重型花叶病毒(PepSMV)、秘鲁番茄花叶病毒(PTV)、甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、大豆花叶病毒(SMV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、烟草脉带花叶病毒(TVbMV)、水茄花叶病毒(WTMV)的NIb、CP基因序列设计引物，引物序列为：

正向引物：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’（ 如SEQ ID NO. 1所示）；

反向引物：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’（ 如SEQ ID NO. 2所示）；其中，Y=C/T，K=G/T,，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。

2. 样品总 RNA的提取

1）取0.1g植物发病叶片，用液氮充分研磨，加入l mL的Trizol（美国Invitrogen公司），然后移入灭菌的1.5 mL离心管中，室温下孵育5 min；

2）加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，在室温下孵育5 min后，4℃，12000 rpm离心15 min；

3）将上层水相转移到新的1.5 mL离心管中，加0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀15 min；

4）4℃，12000 rpm离心10 min，慢慢倒掉上清液（此时RNA在离心管底形成沉淀）；

5）用75%的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，12000 rpm离心5 min，弃去乙醇；

6）沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μL DEPC水中，-20℃保存备用。

3．Touch-down RT-PCR反应的建立

以待检测植物样品总RNA为模板，利用上述正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应。反转录反应为20μL反应体系，具体为：在0.2 mL的PCR管中加入3μL DEPC水，5μL总RNA，lμL的oligo(d T)18引物(10μM)，lμL dNTP混合物(10 mM)，混匀后于65℃保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向管中加入4μL 5×反转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.25μL反转录酶(200 U/μL)，DEPC水补足20μL（以上试剂均购于大连宝生物工程有限公司），42℃反应60 min；72℃15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

Touch-down PCR扩增：反应体系为20μL，具体为：在0.2 mL的PCR管中加入14.3μL DEPC水，0.5μL cDNA，0.5μL正向引物SEQ ID No. 1(10μM)、0.5μL反向引物SEQ ID No.2(10μM)，10×PCR缓冲液2μL，2μL dNTP混合物(2.5 mM)，0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)。反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90s，15个循环，每循环退火温度降低1℃；接着94℃变性30 s、40℃退火50 s、72℃延伸90 s，20个循环；最后72℃延伸10 min。PCR扩增试剂购于大连宝生物工程有限公司，实验在PCR仪上完成。

Touch-down PCR扩增反应结束后取7μL 进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物是否含有约1700bp的DNA片段来判定样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒；即若在约1700bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。

实施例2

本发明方法的通用性检测

取番木瓜环斑病毒(PRSV)、番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)、辣椒环斑病毒(ChiRSV)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、烟草脉带花叶病毒(TVbMV)、甘蔗花叶病毒(ScMV)、高粱花叶病毒(SrMV)、水茄花叶病毒(WTMV)和茉莉花T病毒(MVT) 10种病毒叶片，按照实施例l所述方法分别提取各叶片总RNA，再按实施例l方法利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示（见图1，图中1至10均在约1700bp位置处出现电泳条带）感染病毒的10种叶片中均检出约1700bp的DNA片段。由此证明本发明方法可用于马铃薯Y病毒属中不同病毒种类的通用检测，具有良好的通用性。

实施例3

本发明方法的的特异性检测

取三角梅、长春花、扶桑、黄瓜、辣椒、水稻、棉花、番木瓜、香蕉、甘蔗的健康叶片，按实施例l所述方法分别提取各叶片总RNA，再按实施例l方法进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示（见图2，图中1至10在约1700bp位置处均未出现电泳条带）10种叶片中均未检出约1700bp的DNA片段。由此证明本发明方法并不会与病毒的寄主植物产生交叉反应，具有良好的特异性，符合检测的要求。

实施例4

本发明方法在辣椒叶片检测中的应用

取健康辣椒叶片、具有类似病毒症状的4个辣椒叶片样品（依次计为1、2、3、4和5号样品），按照实施例l方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示（见图3），只有2号病样叶片在约1700bp位置处出现电泳条带，由此判定2号辣椒叶片中含有马铃薯Y病毒属病毒，其余的1、3至5号辣椒叶片样品均不含马铃薯Y病毒属病毒。

对扩增得到的DNA片段进行回收并连于pMD18T载体（大连宝生物工程有限公司）上，转化大肠杆菌感受态细胞后，挑取阳性克隆3个以上提取质粒测序。利用NCBI的在线序列比对工具对获得的3条序列分别进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，并根据马铃薯Y病毒属分种标准（CP氨基酸同源性小于80%，核苷酸同源性小于76%），初步确定2号样品为辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和辣椒环斑病毒(ChiRSV)复合侵染样品。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于辣椒等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。

实施例5

本发明方法在茉莉叶片检测中的应用

取健康茉莉叶片、具有类似病毒症状的茉莉叶片样品（依次计为1和2号样品），按照实施例l方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示（见图4），只有2号病样叶片在约1700bp位置处出现电泳条带，由此判定2号茉莉叶片中含有马铃薯Y病毒属病毒。

按照实施例4方法，对2号样品扩增得到的DNA片段进行克隆测序。对测序结果的比对分析初步确定2号茉莉样品为感染茉莉T病毒样品。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于茉莉等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。

实施例6

本发明方法在颠茄、水茄叶片检测中的应用

取具有类似病毒症状的颠茄和水茄叶片样品（依次计为1和2号样品），按照实施例l方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示（见图5），1号、2号病样叶片在约1700bp位置处均出现电泳条带，由此判定1号和2号叶片中均含有马铃薯Y病毒属病毒。

按照实施例4方法，对1号和2号样品扩增得到的DNA片段分别进行克隆测序。对测序结果的比对分析初步确定1号颠茄样品为感染水茄花叶病毒样品，2号水茄样品为感染烟草脉带花叶病毒样品。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于颠茄、水茄等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。

实施例7

本发明方法在长春花叶片检测中的应用

取健康长春花叶片、具有类似病毒症状的3个茉莉叶片样品（依次计为1、2、3和4号样品），按照实施例l方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示（见图6），3号和4号病样叶片在约1700bp位置处出现电泳条带，由此判定3号和4号长春花叶片中均含有马铃薯Y病毒属病毒。 

按照实施例4方法，对3号和4号样品扩增得到的DNA片段分别进行克隆测序。对测序结果的比对分析表明，两样品扩增得到的片段源于同一病毒，与已知的约翰草花叶病毒的同源性最高，仅为70%，初步确定感染3号和4号长春花样品的病毒为一种新的马铃薯Y病毒属病毒。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于长春花等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国热带农业科学院热带生物技术研究所

 

<120>  一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (3)..(3)

<223>  n为次黄嘌呤

 

<400>  1

gtntgygtkg aygayttyaa yaa                                             23

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (12)..(12)

<223>  n为次黄嘌呤

 

<400>  2

gtrtgbckyt cngtrtyytc                                                 20

 

 

 

Claims (6)

1.一种简并引物，其特征在于，由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’；反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。

2.利用权利要求1所述简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在1600－1800bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。

3.如权利要求2所述利用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，所述的Touch-down RT-PCR反应包括反转录和Touch-down PCR扩增两个过程。

4.如权利要求3所述利用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，所述反转录的反应温度为42℃；所述Touch-down PCR扩增时，第一个循环退火温度为55℃，以后每个循环退火温度降低1℃，共进行15个循环，然后用退火温度40℃进行20个循环，延伸温度为72℃。

5.如权利要求4所述利用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，对扩增的DNA片段进行序列测定后，可鉴定马铃薯Y病毒属病毒的种类。

6.权利要求1所述简并引物应用于马铃薯Y病毒属病毒Touch-down RT-PCR通用检测试剂盒。

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