CN103103288A

CN103103288A - 一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

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Publication number: CN103103288A
Application number: CN2013100004328A
Authority: CN
Inventors: 缪倩; 季英华; 任春梅; 魏利辉; 周益军; 程兆榜
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-01-05
Filing date: 2013-01-05
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2033-01-05
Also published as: CN103103288B

Abstract

本发明公开了一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法，根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物反向引物CWWY-R2为：5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′。正向引物CW1-F2：5′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′，WY1-F2：5′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′，植物总RNA为模板，以CWWY-R2为引物，反转录合成cDNA。然后通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系：cDNA1.6μL、引物(10μmol/L)各0.4μL、10×PCR Buffer(不含Mg²⁺)2μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL、MgCl₂(25mmol)0.8μL、ddH₂O 13.2μL合计20μL；PCR反应条件：94℃预变性5min、94℃50s、50℃50s、72℃90s共30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增预期目的片段分别为WYMV 508bp、CWMV 918bp。利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测，分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染。

Description

一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

技术领域：

本发明涉及一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。

背景技术：

小麦是全世界最主要的粮食作物之一，其中麦类病毒病是影响其生产的主要因子之一。迄今为止由禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)传播的小麦类病毒主要有真菌传杆状病毒属(Furovirus)的中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaicvirus，CWMV)、小麦土传花叶病毒(Soil-bome wheat mosaic virus，SBWMV)、土传禾谷类花叶病毒(Soil-bome cereal mosaic virus，SBCMV)和大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)和小麦梭条斑花叶病毒(Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV)。其中SBWMV主要分布于美国、法国、意大利和日本，SBCMV分布于法国、英国和美国，WSSMV分布于加拿大、美国和法国等欧美国家，在中国小麦上发生的主要是WYMV和CWMV，其中WYMV在日本亦有分布。

WYMV基因组由2条单链RNA(single-stranded RNAs，ssRNA)组成，分别是RNA1(7636 nt)和RNA2(3659 nt)。WYMV在中国的冬小麦种植区如江苏、河南、陕西、四川、湖北、安徽、浙江和山东等地广泛分布，一般造成小麦产量损失20％-70％，甚至绝收。CWMV是近年来在中国新发现的一种小麦病毒，该病毒基因组为RNA1(7147nt)和RNA2(3569nt)组成。该病毒早期被误认为是SBWMV，经全基因组测序发现CWMV和SBWMV的RNA1和RNA2核苷酸序列同源性分别为75％和63％，编码蛋白氨基酸序列的同源性分别为84％和62％，两者存在明显差异。在中国目前主要分布于山东、江苏，常与WYMV复合感染。

目前对WYMV和CWMV主要采用血清学方法和分子生物学方法对两种病毒单独检测，如型怡明用间接酶联和直接DAS酶联法检测WYMV，张宗英利用RT-PCR、ELISA和Western blotting等检测河南驻马店小麦样上的WYMV，尚巧霞利用ELISA+RT-PCR方法对四川小麦中的WYMV进行检测，耿波用双抗夹心方法检测WYMV，刘晓军初步建立CWMV的RT-LAMP检测体系。为简化试验步骤，近年来在植物上利用多重RT-PCR同时检测多种病毒的方法发展较快，如岳红妮成功从复合侵染的小麦材料中检测大麦条纹花叶病毒(Barleystripe mosaic virus，BSMV)、大麦黄矮病毒PAV株系(Barley yellow dwarf virus，BYDV-PAV)、WYMV及小麦蓝矮植原体(Wheat blue dwarf，WBD)，Mahua Deb建立一种多重RT-PCR同时检测大麦小麦黄矮病毒(Barley and Cereal yellowdwarf virus，B/CYDV)5个株系、WSSMV、SBWMV和小麦线条花叶病毒(Wheatstreak mosaic virus，WSMV)8种麦类病毒，而从复合侵染样品中同时检测WYMV和CWMV两种病毒尚未有报道。

WYMV和CWMV侵染小麦的症状主要为叶片黄化或花叶，植株矮化，进一步发展直至枯萎死亡，均由禾谷多黏菌传播，其生物学特性十分相似，难以从经验观察的角度有效区分，且CWMV常与WYMV复合侵染，增加了病害诊断的难度。为了能快速准确诊病害类型，本研究试图建立一种能从小麦病叶中同步检测WYMV和CWMV的方法，以方便快捷诊断田间小麦的侵染状况，为病害科学防治提供依据。

发明内容：

本发明提供了一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法。许多学者利用传统生物学接种鉴定、分子生物学和血清学方法单独检测小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)，本发明是首次利用多重RT-RCR从复合侵染样品中同时检测WYMV和CWMV两种病毒。

本发明所提供的一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法，是通过以下方法获得的：

1)根据NCBI已报道的小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒核苷酸序列，通过软件Primer Premier 5.0设计引物；

2)Trizol reagent法提取植株总RNA；

3)以CWWY-R2为引物，参照M-MuLV反转录酶使用说明反转录合成cDNA；

4)优化多重RT-PCR反应体系(dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度和Mg²⁺浓度)和反应条件(退火温度、循环次数和延伸时间)；

5)在最佳反应参数条件下，以江苏省农科院植保所病害室保存的WYMV和CWMV提纯病毒为阳性对照验证这一方法的准确性。

本发明提供的引物序列如下：

反向引物CWWY-R2：5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′；

正向引物CW1-F2：5′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′；

正向引物WY1-F2：5′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′。

附图说明：

图1提纯CWMV和WYMV标样的检测结果(M：Marker 3；1：引物CWWY-R2+CW1-F2扩增CWMV；2：引物CWWY-R2+WY1-F2扩增CWMV；3：引物CWWY-R2+WY1-F2扩增WYMV；4：引物CWWY-R2+CW1-F2扩增WYMV)

图2多重RT-PCR反应体系优化(M：Marker 3；A1-A5：dNTP(0.025，0.05，0.1，0.2和0.4mmol/L)；B1-B5：Taq DNA聚合酶(0.025，0.05，0.1，0.2和0.4U/μL)；C1-C5：MgCl₂(1.0，1.5，2.0，2.5和3.0mmol/L))。

图3多重RT_RCR反应条件优化(M：Marker 3；A1-A5：退火温度(42℃，46℃，50℃，54℃和58℃)；B1-B5：循环次数(25，30，35，40和45次)；C1-C5：延伸时间(75，90，105，115和125s))。

图4样品检测结果(注：1：CWMV；2：WYMV；3：1和2混合样品；4：健康小麦；5-9：大丰样品；10-12：高邮样品；13-14：扬州样品。)。

具体实施方法：

实施例1，快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

①根据已报道的小麦黄花叶病毒标样和中国小麦花叶病毒RNA1基因核苷酸序列设计简并引物。其中反向引物CWWY-R2为： 5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′，以CWMV的6855 bp-6872bp和WYMV的3501 bp-3518 bp序列为模板。正向引物CW1-F2：5′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′，以CWMV的5955bp-5974bp序列为模板，与CWWY-R2配对用于检测CWMV，预期目的片段918bp；正向引物WY1-F2：5′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′，以WYMV的3010bp-3029bp序列为模板配对，与CWWY-R2配对用于检测WYMV，预期目的片段508bp。

②总RNA提取参考Invitrogen公司TRizol试剂盒说明，从新鲜的材料中提取的总RNA直接用于RT-PCR扩增，剩余部分保存于-80℃备用。

③RT以提纯病毒或植物总RNA为模板，以CWWY-R2为引物，参照M-MuLV反转录酶使用说明反转录合成cDNA。

④单重PCR以RT合成的cDNA为模板，根据合成引物的理论反应循环进行PCR扩增，反应体系(如下：cDNA1.6μL，引物(10μmol/L)各0.4μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2μL，dNTPs(10mmol/L each)0.4μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 14.8μL，合计20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃50s、53℃50s、72℃80s，共35个循环，72℃延伸10min。)。用QIAquick Gel Extraction Kit从胶中回收目的DNA片段，与pMD18-T Vector连接，转化DH5α大肠杆菌。在LB平板上筛选阳性克隆，然后随机挑选经PCR确认的重组质粒并测序，测序工作由金斯瑞生物科技公司完成。测序结果在NCBI中经BLAST进行同源性比对分析。扩增产物与设计的PCR产物大小相同，登陆NCBI GenBank，所得WYMV的核苷酸序列与小麦黄花叶病毒(D86634.1) 病原分离物相对应的核苷酸序列同源性为98％，CWMV的核苷酸序列与中国小麦花叶病毒(AJ271838.1)病原分离物相对应的核苷酸序列的同源性为98％。证明所设计引物可扩增到预期病毒的目的片段。CWMV目的片段只能由正向引物CW1-F2+CWWY-R2扩增得到，WYM目的条带只能由正向引物WY1-F2+CWWY-R2扩增得到，说明正向引物具有对各自病毒的特异性。

⑤多重PCR以混合病毒总RNA为模板，反转录合成cDNA，混合反转录所得模板进行PCR扩增，为了摸索出经济高效的多重RT-RCR反应体系，本研究将dNTP浓度从0.025mmol/L到0.4mmol/L设计5个处理，Taq DNA聚合酶浓度从0.025U/μL到0.4U/μL设计5个处理，Mg²⁺浓度从1.0mmol/L到3.0mmol/L设计5个处理。结果如图2，当dNTP浓度达到0.1mmol/L时条带清晰度最合适，低于0.1mmol/L的靶条带亮度不够，甚至没有条带，高于0.1mmol/L则条带有拖尾现象；当Taq DNA聚合酶浓度为0.1U/μL时，2条靶条带同时最清晰；Mg²⁺浓度从1.0-3.0mmol/L的5个处理都能同时产生较好的靶条带。因此反应体系各参数最终确定为：cDNA1.6μL，引物(10μmol/L)各0.4μL，10×PCR Buffer(不含Mg²⁺)2μL，dNTPs(10mmol/L each)0.4μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL，MgCl₂(25mmol)0.8μL，ddH₂O 13.2μL，合计20μL。本研究对PCR反应条件如退火温度、循环次数和延伸时间进行了摸索。结果如图3，退火温度在42-54℃范围内都能同时扩增到目的条带，以50℃扩增的结果最理想；循环次数高于30次才可出现较强亮度的靶条带，循环次数增多条带亮度增大，低于30次扩增效果差；延伸时间低于90s能同时获得较理想目的条带，延伸时间加长目的条带扩增效果下降，其中CWMV的扩增表现更为明显。综合上述结果，多重PCR反应条件最终选择退火温度50℃，循环次数30次，延伸时间90s。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃ 50s、50℃ 50s、72℃ 90s，共30个循环，72℃延伸10min。

⑥利用多重RT-PCR对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测，结果如图4所示，高邮和扬州样品中检测到的是小麦黄花叶病毒，从大丰样品中检测到的是中国小麦花叶病毒。这一结果显示分别为WYMV或CWMV单一侵染，另一方面说明本研究建立的快速检测方法能有效的鉴别这两种病毒。

目前由WYMV引起的小麦黄花叶病是我国小麦生产上主要病害之一，2005年江苏发病面积达4.64万hm²，2008-2010年全国年发病面积50万hm²以上，一般受害区减产10％-30％，严重高达80％。由CWMV引起的中国小麦花叶病(旧称小麦土传花叶病)是我国新命名的一种小麦病毒病，其病原与WYMV同由禾谷多粘菌传播。CWMV常与WYMV复合侵染小麦，导致病害症状加重。在小麦土传病毒病的防治上，采用抗病品种是主要防治措施，但我们研究发现小麦品种对两种病毒的抗性基本上是不相同的，如郑麦9023是小麦黄花叶病抗病品种，却是中国小麦花叶病感病品种，准确区分病害种类对于病害识别和采用何种类型的抗病品种进行病害防治是至关重要的。两种病毒侵染小麦引发的症状类型、传播途径和寄主范围等方面都有较高的相似性，难以从常规经验诊断法进行准确区分，这增加了病害诊断的难度。本发明试图建立一种同步检测两种病毒的方法，在一次PCR中就可准确鉴定是何种病毒侵染、存在不存在复合侵染，既节约了时间又节省了成本，省却了分别检测两种病毒需两次检测的麻烦。对田间样品初步检测结果表明该方法是准确可靠的，可有效应用于病害的精准鉴定，科学指导田间病害的防治。

上述实施不以任何形式限定本发明。

<110>江苏省农业科学院

<120>一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

<140>201310000432.8

<141>2013-01-05

<160>3

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>中国小麦花叶病毒

<400>1

ggttccmgtt atcgtact 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>中国小麦花叶病毒

<400>2

ggaagggatg ccatacaact 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>小麦黄花叶病毒

<400>3

accctacaaa caaactctgc 20

Claims

1.一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法，其特征在于：利用简并引物，在优化的多重RT-PCR反应系统中同时检测这两种病毒。

2.1中所述的简并引物是指：

反向引物CWWY-R2：5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′；

正向引物CW1-F2：5′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′；

正向引物WY1-F2：5′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′。

3.1中所述优化的多重RT-PCR反应系统是指：cDNA1.6μL、引物(10μmol/L)各0.4μL、10×PCR Buffer(不含Mg²⁺)2μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL、MgCl₂(25mmol)0.8μL、ddH₂O 13.2μL合计20μL，PCR反应条件：94℃预变性5min、94℃ 50s、50℃ 50s、72℃ 90s共30个循环，72℃延伸10min。