CN105018432A - 分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用不连续密度梯度离心法提纯的小麦黄花叶病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗小麦黄花叶病毒特异、灵敏的单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4，其保藏号为CGMMC？No.10296。该杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价10^-7。抗体类型及亚类为IgG2b，kappa链。6F4分泌的单抗与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、黄瓜花叶病毒等反应。该杂交瘤细胞株及其分泌的单抗为小麦病毒病的诊断、检测及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用，属于生物技术领域。

背景技术

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)是一种由禾谷多黏菌(Polymyxa graminis L.)传播的麦类土传病毒，禾谷多黏菌是一种专性寄生于植物根部的真核低等生物，该介体分布范围广，可在30多种禾谷类作物和杂草上寄生，且拥有抗逆性很强的休眠孢子和完成侵染循环的游动孢子，只要条件适宜，即可激发游动孢子携带病毒侵染寄主的根系，造成严重的病害。小麦黄花叶病由日本的Sawada在1927年首次发现并描述，至今仍是麦类生产上的一种重要病害。在自然条件下WYMV常与中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaicvirus，CWMV)复合侵染小麦，导致严重的田间病害，这两类病毒都属于真菌传棒状病毒组，电镜下观察病毒粒子为直棒状二分体。

小麦黄花叶病主要分布在日本、韩国和中国。我国目前主要分布于长江、黄河中下游和淮河流域，包括四川、陕西、江苏、浙江、安徽、湖北、山东和河南等省，其中江苏省的里下河地区和宁镇扬丘陵地区、湖北省东北沿大别山地区、陕西省渭河流域关中地区发生较重。该病害已经成为我国冬小麦产区的一种重要的病毒病，对小麦的产量和品质有严重影响。一般病田发病减产10％-30％，严重的达70％-80％，甚至绝收。田间小麦发病的典型症状为叶片上产生黄色花叶，叶片褪绿，严重感病植株扭曲畸形，老病叶逐渐变黄枯死。一般感病植株分蘖少、根系发育不良；重者明显矮化，扭曲畸形，分藥萎缩枯死，整株死亡。为了监测和防控小麦黄花叶病的发生和扩散，急需建立该病害的高通量的检测方法。

目前，对病害的检测方法主要有直接观察法、分子生物学法和血清学方法。症状观察是判断田间发病情况的一种比较常用和直观的方法。但由于发病症状的相似性，隐症现象，以及复合侵染的情况，所以这种方法一般情况下判断不够准确。RT-PCR的检测方法虽然比较灵敏且特异性好，但由于它的花费成本大且仪器要求高，一般局限于实验室用。综合而言，血清学方法操作简便、特异性好、灵敏度高且成本低，更适用于田间大规模样品的检测，并易于在基层进行推广。WYMV的血清学检测方法是通过制备抗血清，利用ELISA或Westernblot对病毒进行检测和研究。向荣等和韩成贵等分别制备了WYMV P1和CP的抗血清，可以通过ELISA或Western blot等血清学手段检测病毒；尚巧霞等建立了WYMV ELISA检测系统。但这些以多抗建立的血清学方法未见其在田间样品大规模检测中应用的报道。因此本研究利用提纯的WYMV病毒粒子为免疫原，经杂交瘤技术共获得了1株能够高效分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用该杂交瘤细胞制备了腹水单抗。以制备的单抗为核心建立了能准确可靠特异性地检测小麦中WYMV的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA血清学方法和免疫检测试剂盒，并成功应用于田间小麦黄花叶病毒的检测，为WYMV田间大规模快速检测的实现提供了物质和技术支撑，从而推动了小麦黄花叶病的预报预警和科学防控体系的建立。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗小麦黄花叶病毒(WYMV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4，能分泌抗小麦黄花叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6F4于2014年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.10296；

抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG2b、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗体检测病叶的灵敏度达到1∶20480倍稀释。

抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体仅与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒反应。

抗小麦黄花叶病毒(WYMV)单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：

1)提供的杂交瘤细胞株分泌抗小麦黄花叶病毒(WYMV)特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA和TAS-ELISA等免疫学方法能高度特异、准确、灵敏的检测小麦黄花叶病毒；

2)以本发明所制备的单克隆抗体为核心建立的检测小麦黄花叶病毒的各种ELISA方法，既不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备，又可以一次性检测大量样品，不但节约了检测成本，还达到了简便、快速、稳定的检测效果。

3)以本发明所制备的单克隆抗体为核心建立的免疫学检测试剂盒，因其操作简便、适用性强等特点，可有效地作用于田间作物中小麦黄花叶病毒的大规模检测，且可在基层推广应用，为该病毒病的预测预警和科学防控提供了物质和技术支撑。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测小麦黄花叶病毒的灵敏度分析；

图2是dot-ELISA方法检测田间小麦样品中小麦黄花叶病毒的结果。

具体实施方式

分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4，能分泌抗小麦黄花叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6F4于2014年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMC No.10296；

抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG2b、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗体检测病叶的灵敏度达到1∶20480倍稀释。

抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体仅与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒反应。

抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本发明提供的杂交细胞瘤细胞株能大量分泌抗小麦黄花叶病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测WYMV的高通量血清学方法和检测试剂盒，并可应用于田间WYMV的检测，从而为我国小麦黄花叶病毒早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提供纯病毒粒子：

1)将组织搅拌器预冷；

2)取小麦病叶400g，剪碎加3×抽提缓冲液(0.5M磷酸盐缓冲液，含0.1％巯基乙醇，0.01M Na-EDTA)，搅拌器搅碎，两层纱布过滤；

3)滤液加1/4四氯化碳，冰浴搅拌5min，静置10min；

4)8000rpm离心15min，取上清；

5)上清，加入6％ PEG(6000)，3％ NaCl和1％ Triton.X-100，冰浴搅拌至全部溶解，4℃下放置6h或过夜；

6)所有溶液8000rpm离心20min，取沉淀；

7)沉淀用1/2(v/v)悬浮缓冲液(0.2M磷酸盐缓冲液，含0.5M尿素、0.1％巯基乙醇、0.01M Na-EDTA)悬浮，10000rpm离心15min，取上清；

8)上清加5mL，30％蔗糖垫(含0.3％ Triton.X-100)，用Beckman OptimaL-100XP Type 70Ti型转头25000rpm，离心2h；

9)沉淀继续用悬浮缓冲液悬浮，12000rpm离心10min，取上清。

10)进一步纯化采用蔗糖硫酸铯不连续密度梯度离心法，用BeckmanOptima L-100XP SW32型转头22000rpm，离心3h；

11)取离心管上端1/3处为病毒层，用样品缓冲液稀释，用Beckman OptimaL-100XP Type 70Ti型转头40000rpm，离心1h；

12)沉淀用0.5mL样品缓冲液(0.05M磷酸盐缓冲液)悬浮，即为所提纯病毒溶液。

2.免疫动物

用提纯的小麦黄花叶病毒的病毒粒子免疫4-5周龄体重18-20g BALB/c雌性小鼠。初次免疫：提纯的WYMV病毒粒子用生理盐水加以稀释，与等体积弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FC)混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射；3周后再次免疫：免疫原仍用生理盐水稀释，再与等体积的弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)充分乳化后，进行腹腔注射；之后每隔3周进行2次加强免疫：取2倍剂量的抗原进行腹腔注射。第四次免疫3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma，分子量1500)作为融合剂，在37℃下水浴下加入1mL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％ CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，以感染WYMV的小麦叶片和提纯病毒为检测抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获42个阳性孔。选择7个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗WYMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株6F4。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体的特异性检测

用感染小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以小麦黄花叶病毒(WYMV)为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELJSA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1∶30(w/v，g/mL)加入ELISA包被液研磨后100uL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时使其吸附于ELISA板孔；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉或1％ BSA封闭30-60min：加入适当稀释的单抗100uL/孔，37℃ 1.5-2小时；PBST洗涤3次后加入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记的兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100uL/孔，37℃ 1.5-2小时；PBST洗涤4次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应，最后用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，6F4单抗对小麦黄花叶病毒(WYMV)的病叶有特异性反应，而与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒及健康植物的样品均无免疫反应。

6.单克隆抗体腹水的制备及纯化

取对数生长期的杂交瘤细胞，1500rpm离心1min，细胞沉淀悬浮于加适量链霉素和青霉素生理盐水中，悬浮细胞浓度约为10⁶个/mL。取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL阵植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入0.2mL杂交瘤细胞悬浮液，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，针头刺入小鼠腹部采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/mL腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清液，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2a.，IgG2b，IgG3、lgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果6F4单抗亚类为IgG2b、kappa链。用间接ELISA方法检测单抗腹水的效价，检测结果表明上述单抗腹水的效价在10^-7。

二、病毒免疫学检测方法

1.dot-ELISA方法的建立及其检测应用

将小麦病叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1∶10-30(w/v，g/mL)加入0.01mol/L PBS(pH7.4)的后研磨；病汁液5000rpm离心3min；取3μl上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感病小麦叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的0.01mol/L PBST(含0.05％Tween-20)封闭液中，37℃封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中，37℃孵育60-90min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗中，37℃孵育60-90min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10mL底物缓冲液(0.1mol/L TrisCl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中室温反应5-10min，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时用自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测小麦病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明6F4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1∶5000和1∶10000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测WYMV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当小麦叶片稀释到1∶10240倍(w/v，g/mL)时，以6F4单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1∶10240倍稀释(图1)。

用建立的dot-ELISA方法对2014-2015年来自田间小麦样品进行检测，结果发现，70个样品中有38个样品产生紫色的阳性斑点(图2)。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到WYMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染WYMV。说明dot-ELISA方法能准确、可靠地用于小麦样品中WYMV的检测。

2.以单抗为核心建立的抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤：

1)包被：用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)按1∶30(w/v，g/mL)倍稀释的病叶汁液100uL/孔加入到ELISA板中，以WYMV小麦病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，37℃ 2h或4℃过夜；

2)封闭：0.01mol/L PBST洗涤3次，每次静置3min，然后用3％脱脂奶粉封闭30min；

3)一抗：封闭完后，用0.01mol/L PBST洗涤3次，单抗腹水用3％脱脂奶粉以5000倍稀释后，每孔加入100uL，37℃温育1h；

4)二抗：弃一抗后用0.01mol/L PBST洗涤3次，再加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100uL/孔，37℃温育1h；

5)显色：弃二抗后用0.01mol/L PBST洗涤5次，拍干后每孔加入显色底物100uL(显色底物：PH9.8的10％乙二醇胺底物缓冲液和PNPP按1mL∶1mg比例配制)，置室温下待其显色；

6)检测：大约30min待其显色完全(用肉眼观察，阳性孔底物颜色变成黄绿色)，用2mol/L氢氧化钠终止反应后，在酶联免疫检测仪上检测测OD405值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法的检测灵敏度

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对WYMV病叶从1∶10至10240作倍比稀释，以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法的检测。结果表明ACP-ELISA方法对1∶10～5120倍稀释的病叶汁液呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶20480，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

3.检测WYMV的TAS-ELISA检测方法

TAS-ELISA方法的操作流程：

1)5000倍稀释的抗WYMV的兔抗血清(自提纯的WYMV病毒粒子免疫兔子制备)100uL/孔包被聚苯乙烯板，37℃ 2-4h或4℃过夜；

2)0.01mol/L PBST洗涤3次，每次静置3min，然后加5-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA封闭，200ul/孔，37℃封闭30-60min；

3)加入检测样品100uL/孔，同时以WYMV病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，37℃ 1-2h；

4)0.01mol/LPBST洗涤3次后，加入封闭液稀释5000倍的单抗腹水，100uL/孔，37℃ 1-2h；

5)0.01mol/L PBST洗涤3次后，加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma)，100uL/孔，37℃ 1-2h；

6)0.01mol/L PBST洗涤5次，拍干后每孔加入显色底物100uL(显色底物：PH9.8的10％乙二醇胺底物缓冲液和PNPP按1mL∶1mg比例配制)，室温显色30min，肉眼观察阳性孔底物颜色变成黄绿色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。

TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1∶100至1∶102400倍比稀释的兔抗WYMV血清；加入WYMV病汁液；纵向分别加用封闭液在从1∶5至1∶20480倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)按1∶10000倍稀释；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果表明WYMV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1∶10000和1∶5000。

TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将WYMV病叶汁液用0.01mol/LPBS液进行倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，测定结果为：TAS-ELISA检测病叶的灵敏度达到1∶20480倍稀释(w/v，g/mL)，说明本方法具有很好的灵敏度。

三、小麦黄花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2)检测小麦样品的操作步骤：

A.将小麦叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1∶10～30(w/v，g/mL)加入0.01mol/L PBS(pH7.4)后研磨；

B.病汁液5000rpm离心3min；

C.取3μL上清点到NC上，同时设置健康和感病小麦叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

D.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的0.01mol/L PBST(含0.05％ Tween-20的0.01mol/L PBS)封闭液中室温封闭30min；

E.NC膜浸入用抗体稀释液以3000倍稀释的单抗中，室温孵育60～90min；

F.NC膜用0.01mol/L PBST洗涤3次，每次静置3min；NC膜放入用抗体稀释液以8000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中，室温孵育60～90min；

G.0.01mol/L PBST洗膜4～5次，每次3min；66μLNBT和33μLBCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/LMgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

H.待阳性对照显色明显(紫色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期

于2～8℃避光保存，有效期12个月。

4)缓冲液配方：

磷酸缓冲液(PBS，0.01mol/L pH7.4)：

加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

ELISA洗涤液(0.01mol/L PBST)：

1000mL 0.01mol/L PBS中加入0.5mLTween-20

ELISA封闭液：

0.01mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(W/V)。

Claims (4)

1.一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4，其特征在于能分泌小麦黄花叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6F4于2014年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMCNo.10296。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株6F4分泌的抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG2b、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1∶20480倍稀释。

3.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株6F4分泌的抗小麦黄花叶病毒的单克降抗体，其特征在于所述的单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒反应。

4.一种如权利要求2所述的抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体在该病毒检测上的应用，其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。