CN109897829B - 分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。柑橘黄龙病叶脉粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9，其保藏号为CGMCC No.17285。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与病叶中56kDa的黄龙病菌蛋白有特异反应，与健康树叶不发生免疫反应。利用11H9单抗建立检测柑橘黄龙病菌的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue blot‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测黄龙病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗柑橘黄龙病菌单抗的制备及其检测方法的建立为柑橘黄龙病的诊断和检测、流行病学分析、无菌苗木生产及科学防控提供物质和技术支撑。

Description

分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗柑橘黄龙病菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

20世纪初，柑橘黄龙病已经相继在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50多个国家和地区爆发。我国于1919年在华南地区首次报导了柑橘黄龙病，目前该病陆续在我国广东、江西、海南、广西、福建、浙江、云南、贵州、湖南、重庆等省(自治区或直辖市)发生流行，我国柑橘栽培区均遭受柑橘黄龙病危害，受灾面积已达总面积的80％，产量损失85％。柑橘产业因为黄龙病的大范围爆发而面临着前所未有的危机。柑橘黄龙病是由原核生物薄壁菌门韧皮部杆菌属细菌(Candidatus Liberibacter sp.)在柑橘等芸香科果树上引起的系统性、毁灭性病害。在不同的地区和国家曾有不同的名称，如黄枯病、青果病、黄梢病等。柑橘黄龙病的病原属于革兰氏阴性细菌，寄生于筛管细胞，属于植物内生细菌，菌体大小约为350-550nm×600-1500nm,可通过筛孔进行移动，病原具两层外膜,厚约20-25nm。柑橘黄龙病的传播有3种方式，分别是昆虫木虱传播、嫁接传播和苗木交易，其中嫁接传播和病苗的交易是柑橘黄龙病远距离传播的主要途径，染病接穗和病苗是主要载体。昆虫传播媒介有亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)和非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)。

目前，对柑橘黄龙病菌的检测和诊断多采用低效率的症状观察、指示植物、电镜观察、PCR等方法进行检测，还没有快速实用、高通量的检测技术和方法。本发明以柑橘黄龙病叶脉粗提液作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株能分泌抗柑橘黄龙病菌特异性单抗的杂交瘤细胞株，并以分泌的单抗为核心建立检测柑橘黄龙病菌的快速实用、准确、高通量的血清学方法，从而为柑橘黄龙病菌的检测和诊断、流行病学的调查、无菌苗木的获得及科学防控体系的建立提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9，它能分泌抗柑橘黄龙病菌的特异性单抗，杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17285。

一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，抗柑橘黄龙病菌单抗腹水间接ELISA效价达10-⁷，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与柑橘黄龙病病叶中56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测黄龙病病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释。

抗柑橘黄龙病菌单抗能与来自中国各个地方的感染柑橘黄龙病病叶粗提液有特异性反应，而不与健康的树叶粗提液反应。

抗柑橘黄龙病菌单抗在该病害检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗柑橘黄龙病菌特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueblot-ELISA方法能高度特异、准确、灵敏地检测柑橘黄龙病菌；2)以本发明制备的单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue blot-ELISA方法能够检测到中国广西、江西、浙江以及重庆等中国各地的柑橘黄龙病病菌；3)利用本发明所制备的单克隆抗体及其血清学方法检测柑橘黄龙病菌，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体及其血清学检测技术可有效地用于我国果园柑橘黄龙病病菌的检测和诊断，也可用于柑橘黄龙病的流行病学调查、病原菌基因组功能分析、脱毒苗木生产、抗性育种、科学防控等方面。

附图说明

图1dot-ELISA方法检测柑橘黄龙病菌的特异性分析；

HLB-GX、HLB-JX、HLB-ZJ和HLB-CQ代表感染黄龙病菌的广西、江西、浙江和重庆柑橘病叶样品；Healthy citrus of GX、Healthy citrus of JX、Healthy citrus of ZJ和Healthy citrus of CQ分别代表健康的广西、江西、浙江和重庆柑橘叶片样品。

图2dot-ELISA方法检测柑橘黄龙病菌的灵敏度分析；

图3dot-ELISA(A)和PCR(B)方法果园检测柑橘黄龙病菌代表性结果。

M是1kb DNA marker；a1-7，b1-7，c1-7，d1-7，e1-4是检测样品，e6是感染黄龙病菌的阳性对照，e7是健康的柑橘叶片的阴性对照。

生物保藏

分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.17285。

具体实施方式

分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17285，它能分泌抗柑橘黄龙病菌的单抗。

一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，抗柑橘黄龙病菌单抗腹水间接ELISA效价达10-⁷，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与柑橘黄龙病病叶中约56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测黄龙病病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释。

抗柑橘黄龙病菌单抗能与来自中国各个地方的感染柑橘黄龙病病叶粗提液有特异性反应，而不与健康的树叶粗提液反应。

抗柑橘黄龙病菌单抗在该病害检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗柑橘黄龙病菌单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测柑橘黄龙病菌的高通量的血清学方法可成功应用于果园柑橘黄龙病样品的检测和诊断、脱毒苗木的生产、科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

将感染黄龙病菌中国菌株的柑橘叶片粗提液作为免疫原，选取病原菌分布较多的叶脉组织进行研磨，方法如下：称取2g感染柑橘黄龙病的叶片叶脉组织，液氮研磨后用含有适量青霉素和链霉素的2mL生理盐水匀浆，再经4层纱布过滤，取过滤液即粗提液作为免疫原及检测抗原。

2.免疫动物

用柑橘叶片叶脉组织粗提液免疫8周龄BALB/c雌性小鼠：柑橘叶片粗提液100μL与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹部皮下多点注射0.2mL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2mL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3d后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按6:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1 500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1 500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5d后，用HAT培养基换液一次，第10d用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-20％时，以感染柑橘黄龙病菌中国菌株的柑橘病叶组织粗提液为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获264个阳性孔。对264个孔进行特异性分析，筛选出12个呈特异性的细胞株，进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌抗柑橘黄龙病菌中国菌株特异性单抗的杂交瘤细胞株11H9。经4个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

8周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射0.3mL降植烷，7-10d后腹腔注入约7×10⁵个杂交瘤细胞，7-10d后可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。

取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边加边搅拌加辛酸(30μl/mL腹水)，4℃澄清1h，12 000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3 000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃透析24h后即获纯化的单抗，-70℃保存。6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体进行双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)，结果发现11H9单抗抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10-⁷。

7.单克隆抗体的特异性分析

用四川、云南、贵州、福建、海南、湖南、江西、浙江及重庆等地感染柑橘黄龙病菌的柑橘病叶粗提液包被ELISA板，以广西、江西、浙江及重庆地区的健康柑橘叶片粗提液作阴性对照，以感染柑橘黄龙病菌的广西柑橘病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。ACP-ELISA方法的步骤：上述病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，纱布过滤，上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入1:5 000倍稀释的单抗100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤3次后加:1:10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30-60min，2M氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，与阴性OD值比值大于2.1的样品为阳性。结果发现，11H9单抗对广西、四川、云南、贵州、福建、海南、湖南、江西、浙江及重庆等中国各地的柑橘黄龙病叶片粗提液有强阳性免疫反应，而与健康柑橘叶片粗提液无任何免疫反应。

二、检测柑橘黄龙病菌免疫学方法及其试剂盒的建立

1.检测柑橘黄龙病菌的ACP-ELISA检测方法

1.1ACP-ELISA方法的步骤：

1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，5 000rpm离心3min后上清100μL/孔包被聚苯乙烯板，以感染柑橘黄龙病菌的叶片组织作为阳性对照，以健康柑橘叶片组织作阴性对照，4℃过夜或37℃2h；

2)PBST洗板3次，每次3min，每孔加入250μL含3％脱脂奶粉的PBST封闭液，37℃封闭0.5h；

3)PBST洗涤3次后用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃1-2h；

4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃1-2h；

5)PBST洗涤4次后加PNPP底物于室温显色30-60min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或2M氢氧化钠终止反应后用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。

1.2 ACP-ELISA检测方法的建立：

采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用1:20倍稀释的(w/v,g/mL)柑橘黄龙病病叶粗提液作为抗原包被ELISA板；ELISA板纵向从上而下加入用抗体稀释液从1:100至1:12800倍比稀释的柑橘黄龙病菌检测单抗，纵向从左到右加入用抗体稀释液从1:1000至1:512000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康柑橘叶片粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，以P/N>2.1作为阳性判断标准，确定ACP-ELISA的最适抗体工作浓度，结果显示11H9单抗以1:6400倍稀释，而AP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:8000倍稀释为最适工作浓度，根据抗体最适工作浓度建立检测柑橘黄龙病菌的ACP-ELISA方法。

1.3 ACP-ELISA方法灵敏度和特异性的确定

在抗体最适工作浓度下，将柑橘黄龙病病叶粗提液用ELISA包被液倍比稀释后进行ACP-ELISA测定，结果表明，ACP-ELISA检测柑橘黄龙病病叶粗提液的灵敏度达到1:20480倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。该方法检测柑橘黄龙病病叶粗提液呈很强的阳性反应，检测健康的柑橘叶片组织呈阴性反应，且阴阳性样品的OD₄₀₅值对比差异极显著，说明该建立的ACP-ELISA检测方法和单抗的特异性很好。

2.检测黄龙病菌Tissue blot-ELISA方法的建立

2.1 Tissue blot-ELISA操作步骤:

1)样品准备：取柑橘叶片叶柄或叶脉用手术刀片切一个横切面；

2)点样：将横切面在硝酸纤维素膜(NC)上按压5-10sec，同时将健康和感病组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

3)封闭：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭1h；

4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的柑橘黄龙病菌单抗中室温孵育1h；

5)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；

6)PBST洗膜4-5次，每次3min；

7)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中加入66μl NBT和33μl BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，直至特异性条带显色明显、阴性对照没有背景时将膜在去离子水中漂洗终止反应，记录显色结果。

b.Tissue blot-ELISA最适抗体工作浓度的确定

通过常规方阵实验确定单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、酶标二抗稀释度组合为Tissue blot-ELISA的最适工作浓度。结果发现单抗11H9和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5000和1:8000倍时Tissue blot-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立检测柑橘等病树中柑橘黄龙病菌的Tissue blot-ELISA方法。

3.dot-ELISA方法的建立及果园检测应用

3.1 dot-ELISA检测柑橘黄龙病菌方法的建立及其果园样品检测

检测柑橘黄龙病菌dot-ELISA方法的步骤：将柑橘叶叶或叶脉组织在研钵中用液氮研磨成粉末后按1:10-30(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)，继续研磨匀浆3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和柑橘黄龙病叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含3％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果，待阳性对照显色紫色明显而阴性没有任何显色时在自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明11H9单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8 000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测柑橘黄龙病菌的dot-ELISA方法。特异性分析表明，该方法检测中国各地的柑橘黄龙病病叶呈特异性阳性反应，而检测健康的柑橘叶片均呈阴性反应(代表性的结果如图1所示)。灵敏度分析表明，当柑橘黄龙病病叶粗提液稀释到1:10240倍(w/v,g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:10240倍稀释(图2)。

用建立的dot-ELISA方法对采自广西、江西、浙江和重庆等地果园疑似发病柑橘样品进行检测，结果发现，33个柑橘检测样品中有22个样品产生紫色的阳性斑点(图3)。样品同时用PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA阳性样品中均扩增到柑橘黄龙病菌特异性的基因片段，而所有dot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段(图3)，PCR产物核酸测序和序列比对分析表明阳性样品确实感染柑橘黄龙病菌。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于柑橘黄龙病菌的检测。

4.柑橘黄龙病菌dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃

硝酸纤维素膜(NC)10张

2)检测步骤：

a.柑橘等叶脉组织称重、在研钵中用液氮研磨成粉末，按1:10-30比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后继续研磨匀浆3min；

b.取2.5μl匀浆液点样于NC膜上，同时设置健康叶片和柑橘黄龙病病叶分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

c.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

d.NC膜放入1:4 000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

e.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:5 000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

f.PBST洗膜4-5次，每次3min；

g.66μl NBT和33μl BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期：

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)：

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

ELISA洗涤液(0.01M PBST)：1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20

ELISA封闭液：0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v,g/mL)。

Claims (4)

1.一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株11H9，其特征在于能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗，所述的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 17285。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与柑橘黄龙病病叶中56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测黄龙病病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释。

3.一种如权利要求2所述的抗柑橘黄龙病菌单抗在柑橘黄龙病菌检测上的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于以权利要求2所述的抗柑橘黄龙病菌单抗为核心建立各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

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