CN104450623B

CN104450623B - 分泌抗番茄斑萎病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN104450623B
Application number: CN201410627331.8A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平; 谢艳; 李娜
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-11-10
Also published as: CN104450623A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用差速离心的方法提纯的番茄斑萎病毒病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，保藏号为CGMCC No.9343。杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价达10^‑8，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。1A5分泌的单抗仅与番茄斑萎病毒有特异性反应，与芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、鸢尾黄斑病毒、黄瓜花叶病毒等不反应。且该单抗能特异和灵敏地检测番茄斑萎病毒。该杂交瘤细胞株及其分泌的单抗为该番茄病毒病的诊断、检测及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗番茄斑萎病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是一种危害农业生产的重要病毒。它的寄主范围很广，可侵害160种双子叶植物与10种单子叶植物，尤其是茄科、菊科和豆科的部分植物。在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，热带、亚热带、温带地区均有发生。属于欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）A2类检疫性有害生物，同时也是中国进境植物检疫性有害生物。

番茄斑萎病毒最初是1919年在澳洲发现于番茄，Brillelebank将此病命名为斑萎病。TSWV在世界上温带和亚热带地区比较常见。1941年前后TSWV成为影响欧洲烟草种植者经济收入的一种重要病毒。TSWV在巴西东南部也广泛流行。

病毒粒体扁球状，直径80～96纳米，易变形，具包膜，存在于内质网和核膜腔里，有的具尾状挤出物，质粒含20%类脂，7%碳水化合物，5%RNA。致死温度40～46℃，10分钟；稀释限点100～1000倍，体外存活期3～4小时。

传播途径广泛，汁液可接种，种子也能传染，此外烟蓟马(Thrips tabaci)、豆蓟马(T．Setosus)、蓟马(Frankliniella schutzei)、烟草褐蓟马(F．Fusca)及苜蓿蓟马(F．Occidentatis)等均可进行持久性传毒。蓟马只能在幼虫期获得病毒。传毒需要在体内繁殖，葱蓟马经5～10天变为成虫后才能传毒，烟蓟马最短获毒期为15～30分钟，豆蓟马需30分钟，时间长传毒效率升高，蓟马一旦带毒，传毒达20天，具终生传毒能力。病毒接种多在番茄叶表细胞浅表皮吸食时获取，一般经4天潜育即发病。番茄、瓜叶菊等外种皮带毒，不进入胚胎。

该病症状变化大。苗期染病，幼叶变为铜色上卷，后形成许多小黑斑，叶背面沿脉呈紫色，有的生长点死掉，茎端形成褐色坏死条斑，病株仅半边生长或完全矮化或落叶呈萎蔫状，发病早的不结果。坐果后染病，果实上出现褪绿环斑，绿果略凸起，轮纹不明显，青果上产生褐色坏死斑，呈瘤状突起，果实易脱落。成熟果实染病轮纹明显，红黄或红白相间，褪绿斑在全色期明显，严重的全果僵缩，脐部症状与脐腐病相似，但该病果实表皮变褐坏死别于脐腐病。

此病毒可以通过一些野生植物品种来越冬。但是，病毒流行水平主要依赖于虫口密度。最主要的介体昆虫蓟马的成虫藏在土壤中，春季土壤温度上升后，害虫会迁移到杂草上。目前尚未育出抗TSWV的专用品种，防治困难。

针对抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的制备展开工作。当前监测体系尚不完善，甚至主要流行区也未开展相关预测预报的工作。目前用来检测这种病毒的方法主要是田间观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法。这几种方法都具有其局限性，而且不适合大批量的田间样品检测。而血清学的方法适用于田间样品批量检测，但必须依赖于特异性的病毒单抗。

以番茄斑萎病毒提纯病毒粒子为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗TSWV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞1A5，以其分泌的单抗为核心建立了检测TSWV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并成功应用于田间植物样品中番茄斑萎病毒的检测，从而为我国番茄斑萎病的诊断、早期监测和预警、科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9343；

抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体腹水的ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释；

抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体仅与番茄斑萎病毒有特异性反应，而不与鸢尾黄斑病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应

抗番茄斑萎病毒(TSWV)单克隆抗体在该病毒检测及检疫上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株分泌抗番茄斑萎病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测番茄斑萎病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测番茄斑萎病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间蔬菜作物中的番茄斑萎病毒的检测、诊断。

附图说明

图1 是dot-ELISA方法检测番茄斑萎病毒的灵敏度分析；

图2 是dot-ELISA方法检测田间植物样品中番茄斑萎病毒的结果。

具体实施方式

分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.9343；

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗番茄斑萎病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测TSWV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并可应用于田间作物中TSWV含量的检测，从而为我国番茄斑萎病毒的检测、检疫、早期监测和预警、科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

1)将大研钵和组织搅拌器预冷；

2)称取500g本氏烟病叶，每100g病叶中加入 pH 7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即PB缓冲液）200ml（含0.01M Na-EDTA和0.1%巯基乙醇），匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心（6000r/min, 20min）去植物组织残渣；

3)所得上清液边搅拌边滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG（分子量为6000）和0.1mol/L NaCl, 4℃搅拌4h以上；

4)离心（11000r/min, 15min）得沉淀；

5)沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂和0.5M脲)充分洗涤，离心（6000r/min, 15min）后吸出上清置于离心管，沉淀再洗涤，离心反复3次；

6)合并上清液，超速离心（33000r/min，100min）所得沉淀悬浮后离心（8000r/min,15min）；

7)合并上清液再超速离心（33000r/min，100min），离心管底部加有20%-30%蔗糖垫；

8)所得沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂）悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；

2.免疫动物

用提纯的番茄斑萎病毒的病毒粒子免疫四周龄体重18-20g BALB/c 雌性小鼠。即番茄斑萎病毒的病毒粒子100µL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按6：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO₂的细胞培养箱中培养。

杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，以感染TSWV病毒的番茄叶片和提纯病毒为检测抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获32个阳性孔。选择5个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗TSWV的特异性单抗的杂交瘤细胞株1A5。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

单克隆抗体的特异性检测

用感染鸢尾黄斑病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以番茄斑萎病毒的感染病叶为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃ 2小时使其吸附于ELISA板孔；PBST洗涤三次后用3％的脱脂奶粉或1％ BSA或3％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃1-2 小时；PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时；PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，1A5单抗对TSWV有特异性反应，而与鸢尾黄斑病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系及健康植物均无免疫反应。

单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06 M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为1A5单抗亚类为IgG1、kappa链。用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，检测结果表明上述单抗腹水效价在10^－8。

二、病毒免疫学检测方法及其检测试剂盒

1. dot-ELISA方法的建立及其田间植物样品检测应用

将番茄叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/LPBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病番茄叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3 min;66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测番茄病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明1A5单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测TSWV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当番茄叶片稀释到1:10240倍（w/v, g/mL）时，以1A5单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:10240倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对2013年采自田间样品进行检测，结果发现，532个样品中有35个样品产生紫色的阳性斑点（图2）。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到TSWV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染TSWV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中TSWV的检测。

2.以单抗为核心建立的抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测植物样品中的TSWVV

ACP-ELISA方法的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，以TSWV番茄病叶和健康番茄分别为阳性和阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，用2mol/L 氢氧化钠酸终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法检测灵敏度检测

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至81920作倍比稀释，以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：10～20480倍稀释的病叶汁液仍呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：20480，，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

检测TSWV的TAS-ELISA检测方法

TAS-ELISA 方法的操作流程：

1) 1:5000倍稀释的抗TSWV的兔抗血清（由纯化的原核表达TSWV-CP免疫兔子制备）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min

3)加入检测样品100ul/孔。以TSWV病叶为阳性对照，以相应的健康样品为阴性对照， 37℃ 1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃1-2h

6) PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。。

TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的兔抗TSWV血清；加入TSWV 病叶汁；纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1﹕10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为TSWV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕5000、1﹕8000。

TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将TSWV病叶汁用PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA 检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释（w/v, g /mL），说明本方法具有很好的灵敏度。

番茄斑萎病毒dot-ELISA检测试剂盒

1）试剂盒主要成分：

TSWV 单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

阳性对照（含TSWV 番茄叶汁）1管 2 ml

阴性对照（健康番茄叶汁）1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测番茄样品的操作步骤：

a.将叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/LPBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3μl上清点到NC上，同时设置健康和感病番茄叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:3000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

f. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

g. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）保存及有效期

于2～8℃避光保存，有效期12个月。

4）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄•12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1.一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，其特征在于能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9343。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A5分泌的抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释。

3.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株1A5分泌的抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体仅与番茄斑萎病毒有特异性反应，而不与鸢尾黄斑病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应。

4.一种如权利要求2所述的抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体在该病毒检测及检疫上的应用，其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。