CN102559602B

CN102559602B - 分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN102559602B
Application number: CN201210004180.1A
Authority: CN
Inventors: 周雪平; 吴建祥; 倪跃群; 刘欢; 饶黎霞
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102559602A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用与牛血清白蛋白偶联的南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）的衣壳蛋白的C端12个氨基酸的多肽为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV单抗的杂交瘤细胞株3F1，其保藏号为CGMCCNo.5535。3F1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。该株单抗与SRBSDV56kD的外壳蛋白亚基有特异反应。利用3F1单抗建立的检测稻飞虱和水稻中SRBSDV的dot-ELISA检测方法，当单头白背飞虱稀释到6400μL时，病叶1:320倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。抗SRBSDV单抗的制备及其检测方法的建立为该水稻病毒病的诊断、预报及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

南方水稻黑条矮缩病于2001年首次在广东阳西县发现，此后发生范围逐步扩大，为害日趋严重。2008年扩散至长江流域，2009年该病毒病在我国的发生面积约40万hm²，晚稻严重受害，超过0.67万hm²水稻基本失收。2010年该病害在我国广西、广东、江西、湖南、福建、贵州、云南、浙江、安徽、海南等13个南部省份暴发成灾，发病面积约133万hm²，中晚稻区出现多处点片绝收，给我国的水稻生产造成巨大损失。2011年该病毒病仍在湖南、贵州、安徽、云南等多个南方省份发生流行。近年来越南南方水稻黑条矮缩病在越南暴发成灾。南方水稻黑条矮缩病由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarfvirus，SRBSDV)引起，该病毒为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个新种。该病毒可侵染水稻、玉米、薏米、白草和稗草等多种禾本科作物和杂草，引起水稻和玉米南方黑条矮缩病。病毒粒体球状，直径70～75nm。病毒基因组为双链RNA(dsRNA)，共10个片段，由大到小分别命名为SI～S10，其中S10编码病毒的外壳蛋白。由于SRBSDV引起的水稻南方黑条矮缩病最明显的症状为植株矮缩，不同田块间发病率存在显著差异，而且杂交稻发病重于常规稻。水稻的各个生育期均可受到SRBSDV侵染，但不同生育期的稻株感病后表现症状有所不同：秧苗期感病的稻株严重矮缩，不能拔节，移栽大田后重病株死亡；大田初期感病的稻株明显矮缩，叶色深绿，上部叶的叶面可见凹凸不平的皱褶，拔节期地上数节节部有气生须根及高节位分枝，病株茎秆表面有乳白色大小约1～2mm的瘤状突起，瘤突呈蜡点状纵向排列成一短条形，早期乳白色，后期褐黑色，不抽穗或仅抽包颈穗；分蘖期和拔节期感病稻株矮缩不明显、能抽穗，但穗型小、实粒少、粒重轻。该病毒由白背飞虱传毒，不能经种传播，植株间也不互相传毒。病毒可在白背飞虱体内繁殖，白背飞虱一旦获毒，即终身带毒，若虫及成虫均能传毒，且白背飞虱高效传毒，水稻病株上扩繁的二代高龄若虫，可80％带毒。1990年代以后，杂交水稻种植面积的大幅度增加和吡虫啉的大范围高强度施用，使白背飞虱逐渐取代褐飞虱而成为优势种群，近年来我国南方大部稻区白背飞虱连年暴发，年均发生面积2亿亩左右。白背飞虱是一种典型的迁飞性害虫，早春白背飞虱随西南气流从中南半岛的越南等国家迁入我国，并在我国稻区降落繁殖，使SRBSDV随白背飞虱传入我国稻区并造成发生为害。白背飞虱大区域发生远距离迁飞特性使SRBSDV暴发并造成流行蔓延的风险大大增加。随着境外毒源积累，近年该病害发生处于上升时期，在耕作制度及气候无明显改变的条件下，我国南方水稻黑条矮缩病暴发态势仍将延续。白背飞虱带毒情况及发生数量成为南方水稻黑条矮缩病发病流行的重要因素。为了掌握白背飞虱自然种群带毒及水稻发病状况，强化我国南方水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测白背飞虱体内及水稻中SRBSDV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等方法进行小样本检测。本发明以合成的SRBSDV衣壳蛋白(CP)的多肽为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗SRBSDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，以制备的单抗为核心可建立检测SRBSDV的高通量的血清学方法及其试剂盒，从而为我国南方水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCCNo.5535，它能分泌抗水稻南方黑条矮缩病毒的单克隆抗体。

抗南方水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与南方水稻黑条矮缩病毒56kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

抗南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测南方水稻黑条矮缩病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测南方水稻黑条矮缩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物及白背飞虱中的南方水稻黑条矮缩病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测水稻SRBSDV的灵敏度分析；

图2是dot-ELISA方法检测水稻田间样品中SRBSDV的结果；

图3是dot-ELISA方法检测白背飞虱体内SRBSDV的灵敏度分析；

图4是dot-ELISA方法检测田间白背飞虱体内SRBSDV的结果。

具体实施方式

分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞，于2011年11月28日，保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.5535，它能分泌抗水稻南方黑条矮缩病毒的单克隆抗体。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测SRBSDV的高通量的血清学方法及其试剂盒，可成功应用于田间SRBSDV的检测，从而为我国南方水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

根据GenBank中报道的南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的衣壳蛋白基因(CP基因)序列(登陆号：EU523360)由上海波泰生物科技有限公司合成SRBSDV CP蛋白的C端多肽(CHGQKIVLNKVTR，其中C为额外加入)，并由上海波泰生物科技有限公司合成多肽与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联的免疫原SRBSDV CP-C-BSA和SRBSDVCP-C-OVA检测抗原。

2.免疫动物

用免疫原SRBSDV CP-C-BSA免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠：1mg/ml免疫原SRBSDV CP-C-BSA 0.5ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma，分子量1500)作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，以SRBSDV CP-C-OVA检测抗原为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获56多个阳性孔。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗SRBSDV的特异性单抗的杂交瘤细胞株3F1。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体的特异性检测

用感染芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)、水稻矮缩病毒(RDV)、水稻条纹病毒(RSV)、水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的病叶汁包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以南方水稻黑条矮缩病毒为阳性对照，用间接ELISA法测定单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1∶30(w/v，g/mL)加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入单抗100ul/孔，37℃1-2小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，3F1单抗对SRBSDV有特异性反应，而与TuMV、TMV、ToMV、CMV、PVY、PVX、RDV、RSV、RRSV其他病毒均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为3F1单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价在10^-6以上。

二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒

1.用单抗建立抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤

(1)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)按1∶30(w/v，g/mL)倍稀释的病叶汁液或按150ul碳酸盐缓冲液每头白背飞虱加入后捣烂的上清100ul/孔加入ELISA板，SRBSDV病叶或携带SRBSDV白背飞虱为阳性对照，相应健叶或非带毒白背飞虱为阴性对照，37℃2h，或4℃过夜；

(2)PBST洗涤后用5％脱脂奶粉封闭30min；

(3)单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃1h；

(4)PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100ul/孔，37℃，1h；

(5)用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物或TMB底物100ul/孔，室温30min；

(6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，或用2mol/L氢氧化钠或硫酸终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405或450值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法检测灵敏度检测

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1∶10至5120作倍比稀释或单头白背飞虱进行倍比稀释50uL/头至12800uL/头，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1∶10～640倍稀释的病叶汁液及单头白背飞虱稀释到3200uL/头均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶640，对白背飞虱的检测灵敏度达到3200uL/头，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2.检测SRBSDV的TAS-ELISA检测方法

2.1.TAS-ELISA方法的操作流程：

1)抗SRBSDV的兔抗血清1∶3000倍稀释后(合成的免疫原免疫兔子获得)100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min；

3)加入检测样品100ul/孔。以SRBSDV病叶或携带SRBSDV的白背飞虱为阳性对照，以相应的健康样品或非带SRBSDV的SRBSDV作阴性对照，37℃1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP或HRP标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h

6)PBST洗涤后加PNPP底物或TMB底物于室温显色5-30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，2mol/L氢氧化钠或硫酸终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm或450nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。

2.2.TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1∶100至1∶102400倍比稀释的兔抗SRBSDV血清(合成的免疫原免疫兔子获得)；加入SRBSDV病叶汁或白背飞虱匀浆液；纵向分别加用封闭液从1∶5至1∶2048000倍比稀释单抗腹水；AP标或HRP记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1∶10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为SRBSDV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1∶5000、1∶8000。

2.3.TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将SRBSDV病叶汁或白背飞虱匀浆液用PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA检测病叶和白背飞虱的灵敏度分别达到1∶2000倍稀释(w/v，g/mL)和6400uL/头，说明本方法具有很好的灵敏度。

3.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

3.1dot-ELISA检测水稻中SRBSDV方法的建立及其田间样品检测

将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1∶10～30(w/v，g/mL)加入0.01mol/L PBS(pH7.4)后研磨；病汁液5000rpm离心3min；取3μl上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10～20min；NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30～60min；用PBST洗膜3～4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60min；PBST洗膜4～5次，每次3min；66μLNBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测水稻病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明3F11单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1∶5000和1∶8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测SRBSDV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当水稻叶片稀释到1∶320倍(w/v，g/mL)时，以3F1单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1∶320倍稀释(图1)。

用建立的dot-ELISA方法对2010、2011年采自福建福州、贵州荔波、浙江金华、云南施甸县等水稻田间疑似发病水稻样品进行检测，结果发现，50个水稻检测样品中有41个样品产生紫色的阳性斑点(图2)，阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到SRBDV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染SRBSDV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于水稻样品中南方水稻黑条矮缩病毒的检测。

3.2dot-ELISA检测白背飞虱体内SRBSDV方法的建立及其田间样品检测单头白背飞虱放入1.5mL的eppendorf的离心管中，并加入100μL PBS(0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂白背飞虱后、5000rpm离心3min，取3μL上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测水稻中SRBSDV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，显色底物是HRP的显色底物，即如TMB沉淀型显色底物等。同时设非带毒和带毒的白背飞虱作为阴性和阳性对照。

用方阵试验确定检测白背飞虱的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明3F1单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1∶4000和1∶5000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测飞虱体内SRBSDV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带SRBSDV的白背飞虱呈现蓝色斑点，而无毒的白背飞虱没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测白背飞虱体内的SRBSDV。灵敏度分析表明，当单头白背飞虱加6400μL PBS时，以3F1单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现蓝色的阳性斑点，即其检测白背飞虱的灵敏度达到1∶6400稀释(头/μL)(图3)。

用建立的dot-ELISA方法对2010、2011年采自福建福州、贵州荔波、浙江金华、云南施甸县等水稻发病田间的白背飞虱、人工饲喂获毒的和无毒的白背飞虱进行检测。结果发现，110头白背飞虱检测样品中有61头产生蓝色的阳性斑点，而无毒的白背飞虱没有产生任何蓝色斑点(图4)。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到SRBDV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染SRBSDV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于白背飞虱样品中南方水稻黑条矮缩病毒的检测。

3.3南方水稻黑条矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒(水稻和白背飞虱样品)

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2)检测水稻样品的操作步骤：

a.将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1∶10～30(w/v，g/mL)加入0.01mol/L PBS(pH7.4)后研磨；

b.病汁液5000rpm离心3min；

c.取3μl上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS)封闭液中室温封闭30min；

e.NC膜放入1∶2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

f.用PBST洗膜3～4次，每次3min；NC膜放入1∶3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60min；

g.PBST洗膜4～5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h.待阳性对照显色明显(紫色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

)检测白背飞虱样品的操作步骤：

a.单头白背飞虱放入1.5mL的eppendorf的离心管中，并加入50-100μL PBS(0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂白背飞虱后、5000rpm离心3min，取3μL上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的白背飞虱分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

b.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS)封闭液中室温封闭30min；

c.NC膜放入1∶3000倍稀释的单抗中室温孵育30～60min；

d.用PBST洗膜3～4次，每次3min；NC膜放入1∶3000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60min；

e.PBST洗膜4～5次，每次3min；膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；

f.待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

)保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

)缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)：

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000ml

ELISA洗涤液(0.01mol/L PBST)：

1000ml 0.01mol/L PBS中加0.5ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(W/V)。

Claims

1.一种分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5535，其特征在于能分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗南方水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与南方水稻黑条矮缩病毒56kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

3.一种如权利要求2所述的抗南方水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体在该病毒检测上的应用，其特征是以单克隆抗体为核心建立各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。