CN105675875B

CN105675875B - 一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN105675875B
Application number: CN201610096079.1A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平; 陈浙
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2036-02-22
Also published as: CN105675875A

Abstract

本发明公开了一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。一株能分泌抗SRBSDV单抗的杂交瘤细胞株15G6，其保藏号为CGMCC No.12006，将其分泌的单抗经胶体金标记后为金标抗体，并包被在聚酯膜制成的结合垫上，将保藏号为CGMCC No.5535的SRBSDV 3F1细胞株分泌的单抗和羊抗鼠IgG分别结合在硝酸纤维素膜的检测线(T线)和质控线(C线)上，然后分别将吸水滤纸制成的样品垫、SRBSDV免疫胶体金垫、结合有SRBSDV单抗和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到PVC胶板上，制成试纸条。本发明的试纸条能准确、特异、灵敏地检测田间水稻及白背飞虱样品中的SRBSDV。该试纸条在5‑10min内即可用肉眼直接观察结果，适用于田间大批量样品检测，对农业生产上监测和防治SRBSDV具有重要意义。

Description

一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法

技术领域

本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

背景技术

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)是近年在中国南方稻区新发现的由白背飞虱传播的一种新水稻病毒，它引起的南方水稻黑条矮缩病在我国造成了巨大的经济损失。SRBSDV自2001年首次在广东阳西县发现后，为害日趋严重。90年代以后，杂交水稻种植面积的大幅度增加和吡虫啉的大范围高强度施用，使白背飞虱逐渐取代褐飞虱而成为优势种群，导致近年来我国南方大部分稻区白背飞虱和SRBSDV连年爆发。2008年南方水稻黑条矮缩病毒病扩散至长江流域，2009年该病毒病在我国的发生面积约40万hm²，晚稻严重受害，超过0.67万hm²水稻基本失收。2010年该病害在我国广西、广东、江西、湖南、福建、贵州、云南、浙江、安徽、海南等13个南部省(区)爆发成灾。

SRBSDV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个新种，病毒粒体呈球状，直径70-75nm。病毒基因组为双链RNA(dsRNA)，共10个片段，由大到小分别命名为S1-S10，其中S10编码病毒的外壳蛋白。水稻的各个生育期均可受到SRBSDV侵染，但不同生育期的稻株感病后表现症状有所不同：初期感病的稻株明显矮缩，叶色深绿，上部叶的叶面可见凹凸不平的皱褶，拔节期地上数节节部有气生须根及高节位分枝，病株茎秆表面有乳白色大小约1-2mm的瘤状突起，瘤突呈蜡点状纵向排列成一短条形，早期乳白色，后期褐黑色，不抽穗或仅抽包颈穗；分蘖期和拔节期感病稻株矮缩不明显、能抽穗，但穗型小、实粒少、粒重轻。南方水稻黑条矮缩病毒由白背飞虱介体传毒，病毒可在白背飞虱体内繁殖，白背飞虱一旦获毒，即终身带毒，若虫及成虫均能传毒，且白背飞虱高效传毒，水稻病株上扩繁的二代高龄若虫可90％带毒。但该病毒不能经卵传播，植株间也不互相传毒。

近年来我国南方水稻黑条矮缩病毒病发生处于上升时期，爆发态势仍将延续，而简便、快速、准确的检测技术对于强化我国南方水稻黑条矮缩病的诊断及其预测预警和科学防控尤为重要。目前一般采用田间观测、RT-PCR检测、电镜观察和dot-ELISA血清学方法来检测该病毒，田间观测准确性低，RT-PCR和电镜观察均需要精密仪器和专业的操作人员，只有dot-ELISA血清学方法适用于田间大批量样品的检测，但其耗时较长，而胶体金免疫试纸条操作简单、不用任何仪器、完成样品检测仅需5min，检测结果用肉眼观察判断，更适于基层推广应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记单抗的聚酯膜，所述的单抗由保藏号为CGMCC No.12006的15G6杂交瘤细胞株分泌；硝酸纤维素膜的检测线即T线上结合有保藏号为CGMCC No.5535的3F1细胞株分泌的单抗，质控线即C线上结合有羊抗鼠IgG。

南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条能准确、特异、灵敏地检测水稻、玉米和白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，且其检测水稻病叶的灵敏度达到1:5,120倍稀释(w/v,g/mL)，检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1:51.2倍稀释(头/mL)。

南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻、玉米和白背飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染甘蔗花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒的玉米和健康玉米均呈阴性结果。

快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法的步骤：

1)南方水稻黑条矮缩病毒单抗的制备：用感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株15G6，其保藏号为CGMCC No.12006，该杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔，制备单抗腹水；

2)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热沸腾，加入1mL 1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾25min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

3)南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金溶液制备：取100mL胶体金溶液，用0.1MK2CO3将其pH值调至8.0，边搅拌边加入3mL 2mg/mL的抗南方水稻黑条矮缩病毒15G6单抗腹水，搅拌20min；再逐滴加入2mL 25M分子量为20,000的聚乙二醇溶液，搅拌15min；4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4含0.4M PEG 20,000的PBS缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清，沉淀悬浮、离心重复1次，用5mL pH 7.4含2％BSA的PBS缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液4℃保存备用；

4)将上述南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01M pH7.4PBS缓冲液稀释11倍，用喷金机按3.0μL/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫；

5)将1.5mg/mL南方水稻黑条矮缩病毒3F1单抗用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释10倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即T线上；1mg/mL羊抗鼠IgG用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即C线)上，使T线和C线相距5mm；

将吸水滤纸制成的样品垫、南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫、点有T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到PVC胶板上，切割成60mm×3mm的条子后组装成试纸条。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)本发明专利国内外首次开发成SRBSDV的胶体金免疫试纸条，且该胶体金免疫试纸条能准确、特异、灵敏地检测水稻、玉米及白背飞虱样品中的SRBSDV；2)利用本发明所述的胶体金免疫试纸条检测SRBSDV，不需要任何仪器，且操作简单、快速，仅需5min即可完成样品的检测，且检测结果用肉眼直接观察，更适于基层推广应用。

附图说明

图1南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的结构示意图。

图中：1：样品垫，2：胶体金结合垫，3：硝酸纤维素(NC)膜，4：检测线(T线)，5：控制线(C线)，6：吸水纸，7：不干胶，8：PVC底板。

图2南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测结果判断图。

图3南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测田间水稻样品中SRBSDV的灵敏度分析。

图4南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测白背飞虱体内SRBSDV的灵敏度分析。

生物保藏

杂交瘤细胞株3F1和15G6分别于2011年11月28日和2016年1月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号分别为CGMCC No.5535和No.12006，分类命名分别为“分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞”和“分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)单抗杂交瘤细胞”。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

如图1所示，快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条由样品垫1、胶体金结合垫2、硝酸纤维素(NC)膜、检测线(T线)4、控制线(C线)5、吸水纸6、不干胶7和PVC底板8组成。其中：免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记单抗的聚酯膜，所述的单抗由保藏号为CGMCC No.12006的15G6杂交瘤细胞株分泌；硝酸纤维素膜的检测线(即T线)上结合有保藏号为CGMCC No.5535的3F1细胞株分泌的单抗，质控线(即C线)上结合有羊抗鼠IgG。

2)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热沸腾，加入1mL的1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾25min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

5)将1.5mg/mL南方水稻黑条矮缩病毒3F1单抗用含2％蔗糖的0.01M pH7.4PBS缓冲液稀释10倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即T线上；1mg/mL羊抗鼠IgG用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即C线)上，使T线和C线相距5mm；

6)将吸水滤纸制成的样品垫、南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫、点有T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水纸根据图1依次粘贴到PVC胶板上，切割成60mm×3mm的条子后组装成试纸条。

本发明提供的试纸条能准确、特异、灵敏地检测田间水稻、玉米及白背飞虱样品中的SRBSDV，且操作简单、快速，不需要任何仪器，完成样品的检测时间仅需5min，且用肉眼直接观察判断结果，非常适用于基层应用，从而为我国南方水稻黑条矮缩病毒病的早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、胶体金免疫试纸条的制备步骤

一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)SRBSDV单克隆抗体的制备：用感染SRBSDV的水稻粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，参照申请人发表的论文(Development and use of three monoclonal antibodiesfor the detection of Rice black-streaked dwarf virus in field plants andplanthopper vectors.Virology Journal.2013,10:114)方法，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV单抗的杂交瘤细胞株15G6，其保藏号为CGMCC No.12006；

(2)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热沸腾，加入1mL的1％柠檬酸三钠混匀，再保持沸腾25min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

(3)SRBSDV免疫胶体金溶液制备：取100mL胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃将其pH值调至8.0，边搅拌边加入3mL 2mg/mL 15G6杂交瘤细胞分泌的单抗，搅拌20min；再逐滴加入2mL25M聚乙二醇(PEG 20,000)，搅拌15min；4℃ 20,000rpm离心15min，弃上清液；加入10mL pH7.4含0.4M PEG 20,000的PBS缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清，沉淀悬浮、离心重复1次，用5mL pH 7.4含2％BSA的PBS缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤，滤液即为免疫胶体金，4℃保存备用；

(4)将上述的SRBSDV免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01M PBS缓冲液(pH 7.4)1:10倍稀释(v/v)，混匀，用喷金机按3.0μL/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成SRBSDV免疫胶体金垫；

(5)将SRBSDV 3F1单抗(1.5mg/mL)用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液1:9倍稀释(v/v)，用划膜机点在NC膜检测线(T线)上，羊抗鼠IgG(1mg/mL)用含2％蔗糖的0.01MpH 7.4PBS缓冲液1:4倍稀释(v/v)，用划膜机点在NC膜质控线(C线)上，T线和C线相距5mm；

(6)将吸水滤纸制成的样品垫、SRBSDV免疫胶体金垫、点有T线和C线的NC膜和吸水纸根据图1依次粘贴到PVC胶板上，切割成60mm×3mm的条子后组装成试纸条。

二、南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测SRBSDV的步骤及其灵敏度分析

1.样品制备：

1)植物样品的制备：水稻、玉米植物样品称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加4mL的比例加入0.01M PBS(pH 7.4)后研钵中继续研磨匀浆，匀浆液移至离心管中，5,000rpm离心3min，或静置5min；

2)白背飞虱样品的制备：一头白背飞虱放入一个0.5ml的eppendorf离心管中后加入200-300ul 0.01M PBS，用牙签粗端或200μl枪头捣烂飞虱呈匀浆液；

2.点样：取1根胶体金免疫试纸条平放，用吸管吸取植物样品上清液或白背飞虱匀浆液滴3滴(约200-300μL)于加样孔中；

3.肉眼观察判断结果：5min内根据图2判断结果，即T线和C线同时出现红色条带的样品为阳性，C线出现红色条带而T线未出现红色条带样品为阴性。若C线和T线均未出现红色条带，或仅在T线出现红色条带而对C线不出现红色条带时说明试纸条失效(图2)。

2.南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测水稻和白背飞虱体内SRBSDV的灵敏度分析

将感染SRBSDV的水稻植物组织粗提液上清按1:20-1:5,120倍比稀释(w/v,g/mL),以对应稀释度的水稻健康植物粗提液上清为阴性对照；或将携带SRBSDV的白背飞虱按1:200-1:51,200(头/μL)倍比稀释,以对应稀释度的无毒白背飞虱为阴性对照，用吸管吸取植物样品提取液上清和白背飞虱匀浆液，滴3滴于试纸条加样孔中，结果显示当水稻病叶稀释至1:5,120(w/v,g/mL)、单头带毒白背飞虱稀释到51.2mL时，该试纸条检测T线仍能出现红色的条带，即该检测试纸条对于水稻病组织的检测灵敏度达1:5,120倍稀释(w/v,g/mL)，对于带毒白背飞虱的检测灵敏度达1:51.2倍稀释(头/mL)，表明本发明的检测试纸条具有高度的灵敏性和可靠性。

Claims

1.一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于，免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记单抗的聚酯膜，所述的单抗由保藏号为CGMCC No.12006的15G6杂交瘤细胞株分泌；硝酸纤维素膜的检测线即T线上结合有保藏号为CGMCC No.5535的3F1细胞株分泌的单抗，质控线即C线上结合有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述的快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于能准确、特异、灵敏地检测水稻、玉米和白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，且其检测水稻病叶的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为克/mL，检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1:51.2倍稀释，单位为头/mL。

3.如权利要求1所述的快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于该试纸条检测感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻、玉米和白背飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染甘蔗花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒的玉米和健康玉米均呈阴性结果。

4.一种如权利要求1所述的快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)南方水稻黑条矮缩病毒单抗的制备：用感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、细胞克隆杂交瘤技术获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株15G6，其保藏号为CGMCC No.12006，该杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔，制备单抗腹水；

3)南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金溶液制备：取100mL胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃将其pH值调至8.0，边搅拌边加入3mL 2mg/mL的抗南方水稻黑条矮缩病毒15G6单抗，搅拌20min；再逐滴加入2mL 25M分子量为20,000的聚乙二醇溶液，搅拌15min；4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4含0.4M PEG 20,000的PBS缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清，沉淀悬浮、离心重复1次，用5mL pH 7.4含2％BSA的PBS缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液4℃保存备用；

4)将上述南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释11倍，用喷金机按3.0μL/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫；

5)将1.5mg/mL抗南方水稻黑条矮缩病毒3F1单抗用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释10倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即T线上；1mg/mL的羊抗鼠IgG用含2％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即C线上，使T线和C线相距5mm；

6)将吸水滤纸制成的样品垫、南方水稻黑条矮缩病毒免疫胶体金垫、点有T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到PVC胶板上，切割成60mm×3mm的条子后组装成试纸条。