CN106546750A - 一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法，试纸条包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、双面胶和底板，样品垫及胶体金结合垫均进行了封闭处理和免疫反应加强处理，缩短了胶体金标记物的层析时间以及检测反应所需时间，有效避免因胶体金标记垫中残留的金颗粒的影响而导致加强之后产生的假阳、背景差等现象，明显提高胶体金免疫层析检测微量白蛋白的灵敏度和检测线性范围，具有准确、快速、能够定量检测的特点。

Description

一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法
技术领域
本发明涉及医学检验领域，尤其涉及一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法。
背景技术
20世纪70年代，Faulk和Taylor首次将胶体金作为示踪物用于免疫电镜检测技术，后来该技术发展成了多种分析方法，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。胶体金免疫层析技术已经成为快速诊断的一个重要发展方向，随着纳米技术和单克隆抗体技术的完善、成熟，该技术也得到了迅速的发展，并在多个领域得到广泛地应用，如临床医学、农业应用、环境检测、兽医学应用、食品安全等。目前虽然某些胶体金检测产品的灵敏度很高，达到使用要求，但是还是有很多产品因为灵敏度原因无法投入应用，使胶体金免疫层析技术应用受到限制。无疑灵敏度的提高能拓宽胶体金免疫层析检测法的应用范围。随着免疫分析技术的发展，人们对产品的性能要求也越来越高，高灵敏度也是胶体金免疫层析技术发展的一个趋势。
微量白蛋白(又名微量尿白蛋白，Micoralbuminuria，MAU)是指尿中出现的微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白，在正常生理条件下尿液中也会出现极少微量白蛋白，排泄量一般在30mg/天(或20mg/L)之内。人尿液中的白蛋白达到在30～300mg/天或20～200mg/L浓度称为微量白蛋白，白蛋白浓度大于300mg/天或200mg/L时称大量白蛋白。微量白蛋白(MAU)的非正常出现，通常被认为是肾功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并发症等重要临床标志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的检测对肾病、糖尿病和心血管病的早期诊断、早期治疗和减小风险由重要的参考价值和临床意义。
目前，临床检测微量白蛋白诊断早期肾损害的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附实验法(ELISA)等，这些检查较为繁琐、历时较长、费用较高，不利于临床医生的及时诊断和疗效观察。专利CN200810305085.9公开了一种半定量检测尿微量白蛋白胶体硒试纸，该试纸条能够检测含量不低于20μg/ml尿液中白蛋白。此法虽然简单，但是准确度不高，且不能定量检测。
发明内容
本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述试纸条包括样品垫(1)、金标结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)、双面胶(5)和底板(6)，
所述微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
①制备胶体金溶液
将氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为100：1.4，待颜色稳定后继续煮沸10min，制备出胶体金溶液，然后冷却，并在4℃保存备用；
②制备胶体金标记抗体
采用梯度试验法分别确定胶体金最小蛋白标记量和胶体金最佳标记PH，然后调节胶体金溶液至最佳pH，按最适标记蛋白量缓慢向胶体金溶液中添加标记抗体，通过磁力搅拌器混合均匀后，加入BSA即牛血清白蛋白溶液，使BSA终浓度为0.5％～2％，储存于4℃备用；
对上步得到的胶体金标记抗体进行离心纯化，先低速离心20～40min，去除聚合凝集杂质，再高速离心20～40min，加入10mM含有1％BSA的PB溶液，高速离心重复2～3次，最终用10mM含有1％BSA的PB溶液将胶体金标记抗体复溶至原体积的1/10，即得胶体金标记抗体；
③金标结合垫(2)预处理
将玻璃纤维膜或聚酯纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含有2％BSA、2％海藻糖和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
④样品垫(1)预处理
将玻璃纤维膜或聚酯纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含1％BSA和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
⑤试纸条制备
用喷膜仪于硝酸纤维素膜(3)上喷捕获线(T/C)试剂，所述捕获线(T/C)试剂分别为人白蛋白和羊抗鼠二抗，喷金系数为1.2μL/cm；
用喷金仪将胶体金标记抗体溶液喷于预处理后的金标结合垫(2)的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上，得到金标结合垫(2)，按2.5μL/cm喷入，并进行干燥；
底板(6)采用PVC板，将样品垫(1)、金标结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)顺次搭接粘贴在PVC底板(6)上，按照设定的规格切条，制成微量白蛋白快速定量检测试纸条。
特别的，所述步骤②中采用梯度试验法确定胶体金最小蛋白标记量的方法为：用1％KC2O3调节步骤①制备的胶体金溶液的pH至8.2～9.2，取多个2mL离心管标序号，每管中加入1mL胶体金溶液，依序加入不同蛋白量，使之呈梯度变化，混匀静置2小时，然后加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变的离心管中的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％作为最适蛋白标记量。
特别的，所述步骤②中采用梯度试验法确定最佳标记pH值的方法为：取多个2mL离心管标序号，每管中加入1mL胶体金溶液，用质量分数为1％的K2CO3容易依次调节每个管号的pH，使之呈梯度变化，每个离心管都加入最适标记量蛋白，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值。
特别的，所述步骤⑤中制备的试纸条的结构为：双面胶(5)粘贴于底板(6)的上下两面，硝酸纤维素膜(3)通过双面胶(5)粘于底板(6)上方，金标结合垫(2)和吸水垫(4)分别位于硝酸纤维素膜(3)前端和尾端的上方，且金标结合垫(2)的尾端搭在硝酸纤维素膜(3)的前端处，吸水垫(4)的底面完全与硝酸纤维素膜(3)尾端上表面相接触，样品垫(1)位于所述金标结合垫上方。
本发明还提供一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的检测方法，其特征在于，其方法为：
首先使用该试纸条进行若干不同标准浓度的微量白蛋白的检测，微量白蛋白的浓度范围为10mg/L至160mg/L，并测试检测后得到的T线和C线的荧光反射值，以检测后试纸条上的T线/C线的反射率比值为Y坐标，以微量白蛋白浓度的对数值为X坐标绘制标准工作曲线，并拟合得到函数；然后使用该试纸条正式进行测试，检测后得到试纸条上的T线/C线的反射率比值，并通过标准浓度下测试得到的函数计算得到该反射率比值相对应的微量白蛋白浓度，即为该试纸条测试的到的微量白蛋白浓度值。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种微量白蛋白快速定量检测试纸条制备及检测方法，样品加样垫及胶体金结合垫均进行了封闭处理和免疫反应加强处理，缩短了胶体金标记物的层析时间以及检测反应所需时间，有效避免因胶体金标记垫中残留的金颗粒的影响而导致加强之后产生的假阳、背景差等现象，明显提高胶体金免疫层析检测微量白蛋白的灵敏度，具有准确、快速、能够定量检测的特点。
附图说明
图1为本发明的检测试纸条的结构示意图；
图2为实施例3中微量白蛋白检测剂量-反应曲线；
图中：1-样品垫；2-金标结合垫；3-硝酸纤维素膜；4-吸水垫；5-双面胶；6-底板；
以下将结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
如图1所示，一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，所述试纸条包括样品垫1、金标结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4、双面胶5和底板6，
所述微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
①制备胶体金溶液
将100mL氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液1.4mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，制备出胶体金溶液，然后冷却，并在4℃保存备用；
②制备胶体金标记抗体
a确定最小蛋白标记量
采用梯度试验法确定胶体金最小蛋白标记量，用1％KC2O3调节步骤①制备的胶体金溶液的pH至8.5，置于标序的离心管中，依序加入不同蛋白量，使之呈梯度变化，混匀静置2小时，然后加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变的离心管中的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％作为最适蛋白标记量，在本实施例中，最适蛋白标记量为30μg/mL；
b确定最佳标记pH值
取2mL离心管标序号，每管中加入1mL胶体金溶液，用质量分数为1％的K2CO3溶液依次调节每个管号的pH值，使之呈梯度变化，在每个离心管都加入最适标记量蛋白，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值，在本实施例中，最佳标记pH为8.2；
c标记
取100mL胶体金溶液用质量分数1％的KC2O3的溶液调节至最佳pH值8.2，缓慢加入最小蛋白量并在磁力搅拌器下混合10min后，加入BSA(牛血清白蛋白)溶液，使终浓度为0.5％，即得胶体金标记抗体，储存于4℃过夜备用；
d离心纯化
首先将标记好的胶体金标记抗体溶液，以2000r/min的转速离心40min，去除聚合凝集杂质，再置于10000r/min的转速中离心40min，加入重悬液复溶，所述重悬液为10mM含1％BSA的PB溶液，高速离心重复2次，最终用重悬液复溶至原体积的1/10，储存于4℃备用；
③金标结合垫2预处理
将玻璃纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含有2％BSA、2％海藻糖和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
④样品垫1预处理
将玻璃纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含1％BSA和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
⑤试纸条制备
用喷膜仪于硝酸纤维素膜3上喷捕获线(T/C)试剂，所述捕获线(T/C)试剂分别为人白蛋白和羊抗鼠二抗，喷金系数为1.2μL/cm；
用喷金仪将胶体金标记抗体溶液喷于预处理后的金标结合垫2的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上，得到金标结合垫2，按2.5μL/cm喷入，喷入量共为2.5ng，并进行干燥；
底板6采用PVC板，将样品垫1、金标结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫顺次搭接粘贴在PVC底板6上，具体结构为：底板6的上下两面均粘有双面胶5，硝酸纤维素膜3通过双面胶5粘于底板6上方，金标结合垫2和吸水垫4分别位于硝酸纤维素膜3前端和尾端的上方，且金标结合垫2的尾端搭在硝酸纤维素膜3的前端处，吸水垫4的底面完全与硝酸纤维素膜3尾端上表面相接触，样品垫1位于所述金标结合垫2上方；
按照4mm宽、8cm长的规格切条，制成微量白蛋白快速定量检测试纸条。
实施例2
如图1、2所示，一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，所述试纸条包括样品垫1、金标结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4、双面胶5和底板6，
所述微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
①制备胶体金溶液
将100mL氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液，1.4mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，制备出胶体金溶液，然后冷却，并在4℃保存备用；
②制备胶体金标记抗体
a确定最小蛋白标记量
采用梯度试验法确定胶体金最小蛋白标记量，用1％KC2O3调节步骤①制备的胶体金溶液的pH至8.5，置于标序的离心管中，依序加入不同蛋白量，使之呈梯度变化，混匀静置2小时，然后加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变的离心管中的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％作为最适蛋白标记量，在本实施例中，最适蛋白标记量为30μg/mL；
b确定最佳标记pH值
取2mL离心管标序号，每管中加入1mL胶体金溶液，用质量分数为1％的K2CO3溶液依次调节每个管号的pH值，使之呈梯度变化，在每个离心管都加入最适标记量蛋白，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值，在本实施例中，最佳标记pH为8.2；
c标记
取100mL胶体金溶液用质量分数1％的KC2O3的溶液调节至最佳pH值8.2，缓慢加入最小蛋白量并在磁力搅拌器下混合10min后，加入BSA(牛血清白蛋白)溶液，使终浓度为2％，即得胶体金标记抗体，储存于4℃过夜备用；
d离心纯化
首先将标记好的胶体金标记抗体溶液，以2000r/min的转速离心20min，去除聚合凝集杂质，再置于10000r/min的转速中离心20min，加入重悬液复溶，所述重悬液为10mM的含1％BSA的PB溶液，高速离心重复3次，最终用重悬液复溶至原体积的1/10，储存于4℃备用；
③金标结合垫2预处理
将聚酯纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含有2％BSA、2％海藻糖和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
④样品垫1预处理
将聚酯纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含1％BSA和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
⑤试纸条制备
用喷膜仪于硝酸纤维素膜3上喷捕获线(T/C)试剂，所述捕获线(T/C)试剂分别为人白蛋白和羊抗鼠二抗，喷金系数为1.2μL/cm；
用喷金仪将胶体金标记抗体溶液喷于预处理后的金标结合垫2的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上，得到金标结合垫2，按2.5μL/cm喷入，喷入量共为2.5ng，并进行干燥；
底板6采用PVC板，将样品垫1、金标结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫顺次搭接粘贴在PVC底板6上，具体结构为：双面胶5粘贴在底板6的上下两面，硝酸纤维素膜3通过双面胶5粘于底板6上方，金标结合垫2和吸水垫4分别位于硝酸纤维素膜3前端和尾端的上方，且金标结合垫2的尾端搭在硝酸纤维素膜3的前端处，吸水垫4的底面完全与硝酸纤维素膜3尾端上表面相接触，样品垫1位于所述金标结合垫2上方；
按照4mm宽、8cm长的规格切条，制成微量白蛋白快速定量检测试纸条。
本发明工作时，样品垫1位于试纸条的前端，用于进样，控制测试液的流速，待测液可能是全血，血清，血浆，尿液或唾液，以保证测试液以均匀的速度流入金标结合垫2，本发明的样品垫1经过缓冲液预处理后，可以更好地使金标结合垫2上的显色标记物标记过的待测物的受体如抗体或抗原与测试液中的待测物特异性地结合；金标结合垫2是胶体金标记过的待测物的受体的承载体，待测液经样品垫1流经金标结合垫2时，胶体金结合物从金标结合垫2上释放出来并与待测液中的待测物特异性结合形成免疫复合物，然后随测试液一起流向硝酸纤维素膜3；硝酸纤维素膜3直接显示最终检测结果，硝酸纤维素膜3上设有检测线T线，用来判定检测结果；对照线C线，用来判定本次检测是否有效；吸水垫4位于试纸条的末端，用吸水滤纸制成，它使尽可能多的待测液流过硝酸纤维素膜3，同时冲洗掉多余的金标抗体结合物，消除背景干扰。
当进行检测时，首先在样品垫1上滴入待测液，样品通过层析作用进入金标结合垫2，与金标结合垫2上的胶体金受体结合形成免疫复合物，该复合物继续流过硝酸纤维素膜，并与膜上的抗体结合形成红色条带，多余的金标抗体结合物则流向吸水垫4。
实施例3
采用实施例2制备的试纸条对人尿液中的微量白蛋白标准品进行检测，检测方法为：将样品滴加到样品垫1，样品加入体积为60～80μL，进行免疫层析反应，反应结束后，观察结果，结果表明：经过1分钟左右，试纸条出现红色条带，
通过微量白蛋白快速定量检测试纸条进行若干不同标准浓度的微量白蛋白的检测，标准微量白蛋白的浓度范围为10mg/L至160mg/L，并测试检测后得到的T线和C线的荧光反射值，每个样品分别检测10次并取平均值后列于表1。
表1不同浓度下的T/C值
浓度(mg/L) 10 20 40 80 160.
Log(浓度) 1 1.30103 1.60206 1.90309 2.20412
T平均值 1530.53 952.49 683.17 332.56 215.67
C平均值 1308.15 1341.54 1485.15 1583.62 1659.00
T/C(％) 117 71 46 21 13
以检测后试纸条上的T线/C线的反射率比值为Y坐标，以微量白蛋白浓度的对数值为X坐标绘制标准工作曲线，并拟合得到函数y＝59.905x2–277.65x+333.8(R2＝0.9969)
然后使用该试纸条正式进行测试，检测后得到试纸条上的T线/C线的反射率比值，并通过标准浓度下测试得到的函数计算得到该反射率比值相对应的微量白蛋白浓度，即为该试纸条测试的到的微量白蛋白浓度值。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述试纸条包括样品垫(1)、金标结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)、双面胶(5)和底板(6)，
所述微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
①制备胶体金溶液
将氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为100：1.4，待颜色稳定后继续煮沸10min，制备出胶体金溶液，然后冷却，并在4℃保存备用；
②制备胶体金标记抗体
采用梯度试验法分别确定胶体金最小蛋白标记量和胶体金最佳标记PH，然后调节胶体金溶液至最佳pH，按最适标记蛋白量缓慢向胶体金溶液中添加标记抗体，通过磁力搅拌器混合均匀后，加入BSA即牛血清白蛋白溶液，使BSA终浓度为0.5％～2％，储存于4℃备用；
对上步得到的胶体金标记抗体进行离心纯化，先低速离心20～40min，去除聚合凝集杂质，再高速离心20～40min，加入含有1％BSA的PB溶液，高速离心重复2～3次，最终用含有1％BSA的PB溶液将胶体金标记抗体复溶至原体积的1/10，即得胶体金标记抗体；
③金标结合垫(2)预处理
将玻璃纤维膜或聚酯纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含有2％BSA、2％海藻糖和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
④样品垫(1)预处理
将玻璃纤维膜或聚酯纤维膜放入pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中浸泡30min，所述缓冲液含1％BSA和0.1％TritonX-100，然后37℃烘干备用；
⑤试纸条制备
用喷膜仪于硝酸纤维素膜(3)上喷捕获线(T/C)试剂，所述捕获线(T/C)试剂分别为人白蛋白和羊抗鼠二抗，喷金系数为1.2μL/cm；
用喷金仪将胶体金标记抗体溶液喷于预处理后的金标结合垫(2)的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上，得到金标结合垫(2)，按2.5μL/cm喷入，并进行干燥；
底板(6)采用PVC板，将样品垫(1)、金标结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)顺次搭接粘贴在PVC底板(6)上，按照设定的规格切条，制成微量白蛋白快速定量检测试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤②中采用梯度试验法确定胶体金最小蛋白标记量的方法为：用1％KC2O3调节步骤①制备的胶体金溶液的pH至8.2～9.2，取多个2mL离心管标序号，每管中加入1mL胶体金溶液，依序加入不同蛋白量，使之呈梯度变化，混匀静置2小时，然后加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变的离心管中的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％作为最适蛋白标记量。
3.根据权利要求1所述的一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤②中采用梯度试验法确定最佳标记pH值的方法为：取多个2mL离心管标序号，每管中加入1mL胶体金溶液，用质量分数为1％的K2CO3容易依次调节每个管号的pH，使之呈梯度变化，每个离心管都加入最适标记量蛋白，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100μL，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值。
4.根据权利要求2或3所述的一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤⑤中制备的试纸条的结构为：双面胶(5)粘贴于底板(6)的上下两面，硝酸纤维素膜(3)通过双面胶(5)粘于底板(6)上方，金标结合垫(2)和吸水垫(4)分别位于硝酸纤维素膜(3)前端和尾端的上方，且金标结合垫(2)的尾端搭在硝酸纤维素膜(3)的前端处，吸水垫(4)的底面完全与硝酸纤维素膜(3)尾端上表面相接触，样品垫(1)位于所述金标结合垫上方。
5.如权利要求4所述的一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的检测方法，其特征在于，其方法为：
首先使用该试纸条进行若干不同标准浓度的微量白蛋白的检测，微量白蛋白的浓度范围为10mg/L至160mg/L，并测试检测后得到的T线和C线的荧光反射值，以检测后试纸条上的T线/C线的反射率比值为Y坐标，以微量白蛋白浓度的对数值为X坐标绘制标准工作曲线，并拟合得到函数；然后使用该试纸条正式进行测试，检测后得到试纸条上的T线/C线的反射率比值，并通过标准浓度下测试得到的函数计算得到该反射率比值相对应的微量白蛋白浓度，即为该试纸条测试的到的微量白蛋白浓度值。
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