CN104614534A - 同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶a2和c反应蛋白的层析法快速检测卡及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)和C反应蛋白(CRP)的层析法快速检测卡，包括底衬及从左到右顺次相互搭接粘贴在底衬上方的样品垫、涂覆有胶乳微球标记抗体的试剂垫、包被垫和吸水纸，包被垫上还设有质控线及与质控线平行的两条检测线，两条检测线分别包被能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的单克隆抗体及与待检抗原CRP特异结合的单克隆抗体。本方法采用的标记物是胶体金颗粒或者彩色聚苯乙烯胶乳颗粒。本检测卡既可以实现双指标、半定量的检测，同时也可用于缺血性脑卒中发生后神经功能损伤程度和梗死体积的评价，提高了诊断的准确率，操作简便，易于推广使用。

Description

同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶A2和C反应蛋白的层析法快速检测卡及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用层析法同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)与C反应蛋白(CRP)含量的检测试剂盒，从而对缺血性脑卒中的分型、病情或预后评估进行辅助诊断的试剂盒。
背景技术
缺血性脑卒中是脑血管病中最常见者，其常见的病因为动脉粥样硬化导致管腔狭窄和脑血栓形成，造成局部脑供血区血流中断，发生脑组织缺血、缺氧、软化坏死。大量研究表明动脉粥样硬化本身是一个炎症的过程，持续的低水平炎症预示着心脑血管疾病发生的可能性。Lp-PLA2为新近发现的炎症标志物，属于磷脂酶A2超家族中的非钙离子依赖型磷酸酯酶，主要由炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)分泌，并受炎症介质的调节。CRP是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，是心脑血管疾病最强有力的预测因子之一，对心血管、脑血管以及外周血管疾病有着最好的预测及预后效果。
有研究表明，Lp-PLA2与CRP水平都升高者患缺血性脑卒中的风险最高，其水平随神经功能缺损程度增加而呈递增趋势，差异有统计学意义。高水平的Lp-PLA2、CRP对预测脑梗死风险有重要意义。尽管Lp-PLA2、CRP都是炎症形成的标志物，但它们在体内作用的机制不同，Lp-PLA2主要与脂类的代谢，特别是LDL代谢相关。CRP与炎症及血栓形成都存在密切的关系，标明炎症和血栓形成的交互关系。
目前对缺血性脑卒中的诊断与预测尚未出现将Lp-PLA2与CRP两个指标进行联合的检测方法，且对其单指标检测的方法主要有酶联免疫法和免疫比浊法，而这两种方法的前处理过程较为复杂，大规模推广存在局限性。
在免疫分析领域缺乏能够同时检测Lp-PLA2和CRP的技术及其应用。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术不足，本发明提供一种同时测定血浆中Lp-PLA2和CRP的层析法快速检测卡，其可以解决现有技术存在的不能在一个试纸条中同时检测Lp-PLA2和CRP的问题。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种同时测定血浆中Lp-PLA2和CRP的层析法快速检测卡，包括底衬以及从左到右顺次相互搭接粘贴在底衬上方的样品垫、涂覆有胶乳微球标记抗体的试剂垫、包被膜和吸水纸，所述包被膜上在靠近吸水纸的一端划有一条包被了兔抗鼠IgG单克隆抗体的质控线，所述包被膜上在靠近试剂垫的一端划有两条平行的第一检测线和第二检测线，其中，靠近试剂垫的第一检测线上包被有能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的单克隆抗体，第二检测线上包被有能与待检抗原CRP特异结合的单克隆抗体。包被膜上在靠近试剂垫的一端划有两条平行的检测线。其中，靠近试剂垫的第一检测线上包被有能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的单克隆抗体，另一条检测线(第二检测线)上包被有能与待检抗原CRP特异结合的单克隆抗体。所述的待检抗原Lp-PLA2是人Lp-PLA2，所述待检抗原CRP是人CRP。
优选地，所述的底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫为吸滤纸或滤油纸；所述试剂垫可为聚酯膜；包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明同时提出了上述层析法快速检测卡的制备方法，包括如下步骤：
1)包被膜的制备：用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的抗体、能与待检抗原CRP特异结合的抗体和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于包被膜上对应的第一检测线、第二检测线和控制线，待三种抗体渗入包被膜后分别形成第一检测线、第二检测线和控制线；
2)喷涂有胶乳颗粒标记抗体的聚酯膜(试剂垫)的制备：分别制备连接了Lp-PLA2特异性抗体的胶乳颗粒与连接了CRP特异性抗体的胶乳颗粒，这两种颗粒可以具有相同或者不同的颜色，利用这两种胶乳颗粒的混合物喷涂聚酯膜；
3)组装试纸条：在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、喷涂有胶乳颗粒标记抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸。
其中，所述抗体与胶乳颗粒连接可通过如下方法实现：物理吸附法和化学偶联法，其中，物理吸附法主要适用于胶体金标记抗体；化学偶联法主要适用于彩色胶乳颗粒标记抗体包括碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法及重氮盐偶联法等。
具体地，上述的胶乳微球是自制的胶体金颗粒或者彩色聚苯乙烯胶乳颗粒，颗粒的粒径在50nm-75nm之间。其中，胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备，具体步骤为：用三蒸水将1～4wt％氯金酸稀释成0.01～0.04wt％，置于95～100℃反应10～15分钟，加入1～2mL柠檬酸三钠，继续反应15～20分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入2～3mL 1％碳酸钾溶液备用；彩色聚苯乙烯胶乳颗粒购自默克公司。
具体地，标记抗体的制备包括如下步骤：用1％碳酸钾溶液调节制备的标记物颗粒的pH值至7.5，按照10μg链霉亲和素每毫升标记物颗粒的量加入链亲和素溶液并充分混匀，置于25℃水浴反应30～40分钟后再加入5wt％BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度为1wt％，4℃保存备用，按50μg单抗-生物素每mL标记物的量加入标记物中，37℃搅拌反应40～45分钟，加入5wt％BSA，封闭20分钟，6000r/min离心20～25分钟，弃上清，沉淀以标记抗体保存液恢复体积，得到标记抗体，4℃保存。
本发明进一步提出了一种同时测定血浆中Lp-PLA2和CRP的试剂盒，包括上述的层析法快速检测卡、说明书和外包盒，每单人份层析法检测卡由铝箔袋密封包装，每个包装内另配有一根塑料滴管和一小袋干燥剂。所述试剂盒的检测灵敏度为：1)Lp-PLA2100ng/mL；2)CRP 100ng/mL。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)CRP为反应炎症的急性时相反应蛋白，与损伤关系密切，可作为预测脑梗死体积大小与严重程度的指标；Lp-PLA2参与了急性脑梗死的病理生理过程，是缺血性脑卒中的独立预测指标，也可反映病情的严重程度；同时已有研究发现，Lp-PLA2反映动脉病变的严重程度的价值明显高于CRP。因此，检测血浆Lp-PLA2活性可以更佳地识别高危个体，而联合检测两种指标，即Lp-PLA2和CRP则可有助于判断病情严重程度，判断梗死的面积大小。
(2)本发明采用了现代POCT(即时检验)检测中最流行的层析法技术，通过试纸条上同时设置包被有Lp-PLA2单克隆抗体或Lp-PLA2多克隆抗体检测线、包被有CRP单克隆抗体或CRP多克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线来实现。
(3)本发明的试剂盒具有敏感度高、检测指标多、成本低、操作简单、便于携带、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性。
(4)用本发明试剂盒能够同步检测两个指标(待测抗原或蛋白)，并且两种抗原不会相互干扰，结果准确、快速、操作简便，可以广泛用于急性脑梗死等疾病的检测，可省时、省力、节省样本消耗量等。
附图说明
图1为本发明的快速检测试剂条的横断面结构示意图，
其中：1、底衬；2、样品垫；3、试剂垫；4、包被膜；5、吸水纸；6、包被Lp-PLA2抗体的检测线(T2线，即第一检测线)；7、包被CRP抗体的检测线(T1线，即第二检测线)；8、包被兔抗鼠IgG抗体的控制线(C线)。
图2为试剂条检测结果判定图，其中：
a.对照试剂条；
b.Lp-PLA2与Lp-PLA2阳性；
c.CRP阳性，Lp-PLA2阴性；
d.CRP阴性，Lp-PLA2阳性；
e.试剂条无效的实例之一，若C线不显色，则试剂条无效。
具体实施方式
实施例1：本发明提供了一种同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶A2和C反应蛋白的层析法快速检测卡及试剂盒。
试剂来源：本发明中Lp-PLA2抗体(货号CLM0019006，购买自深圳市常量医学工程有限公司)；鼠抗Lp-PLA2单克隆抗体(货号CLM0019005，购买自深圳市常量医学工程有限公司)；CRP抗体(货号CLM0032003，购买自深圳市常量医学工程有限公司)；抗CRP单克隆抗体(货号CLM0032005，购买自深圳市常量医学工程有限公司)；兔抗鼠IgG抗体(购买自深圳市常量医学工程有限公司)。
制备步骤：
(一)快速检测卡的制备
(1)包被膜的制备：
a)包被缓冲液的制备：将0.025M、pH 7.4的PBS用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天；
b)封闭液的制备：将含1％BSA，1％蔗糖，0.025M、pH 7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天；
c)T2线(第一检测线)的制备：将鼠抗Lp-PLA2的单克隆抗体按2mg/mL的浓度，蠕动泵授液量0.4mL/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
d)T1线(第二检测线)的制备：将CRP单克隆抗体按4.5mg/mL的浓度，蠕动泵授液量0.4mL/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜中部上划线，该线与T2线平行，两线相隔4mm，细致均匀在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
e)C线的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/mL的浓度，蠕动泵授液量0.4mL/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上部划线，该线与T1、T2线平行，两线相隔4mm，细致均匀，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
f)用上述封闭液将含有T1线、T2线和C线的硝酸纤维素膜于37℃封闭60分钟，取出后置37℃烘干处理两个小时，封袋备用。
(2)喷涂有胶乳颗粒标记抗体的聚酯膜(试剂垫)的制备
a)氯金酸水溶液的配制：将10g氯金酸1000mL的三蒸水溶解，配制成1％的水溶液，置于4℃备用，有效期3个月；
b)柠檬酸三钠的配制：用三蒸水溶解柠檬酸三钠，配制1％的水溶液，用0.22μ膜滤过，置于4℃备用，有效期7天；
c)1％碳酸钾水溶液的配制：将1g碳酸钾用100mL用三蒸水溶解，用0.22μ膜滤过，置于4℃备用，有效期7天；
d)胶乳微球标记抗体保存液的配制：将15g的蔗糖，20μL的叠氮钠，在100mL pH 7.4的1％BSA溶解，用0.22μ膜滤过，置于4℃备用，有效期7天；
e)胶乳颗粒的制备：上述的胶乳颗粒是胶体金颗粒或者彩色聚苯乙烯胶乳颗粒，颗粒的粒径在50nm-75nm之间。其中，胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备，具体步骤为：用三蒸水将1～4wt％氯金酸稀释成0.01～0.04wt％，置于95～100℃反应10～15分钟，加入1～2mL柠檬酸三钠，继续反应15～20分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入2～3mL1％碳酸钾溶液备用；彩色聚苯乙烯胶乳颗粒购自默克公司。
f)胶乳微球标记抗体的制备：用1％碳酸钾溶液调节胶体金pH值至7.5，按照10μg链亲和素每mL标记物的量加入链亲和素溶液充分混匀，置于25℃水浴反应30分钟后再加入5％BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度为1％，4℃保存备用。按50μg单抗-生物素每mL标记物的量加入标记物中，37℃搅拌反应40分钟，加入5％BSA，封闭20分钟，6000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀以标记抗体保存液恢复体积，4℃保存。标记物标记的CRP单克隆抗体按上述方法制备。将两种标记抗体按1∶1混合，4℃保存；
g)将混合好的标记物均匀的铺在试剂垫上，喷量为1.0μL/cm*3道，干燥，封袋，备用。
(3)样品垫的处理
将样品垫用100mM PBS缓冲液浸泡数小时，取出后干燥。
(4)快速检测试纸条的组装：
底衬、样品垫和吸水纸是本领域通用的部件。将上述样品垫和涂覆有胶乳微球标记抗体的试剂垫、包被膜及吸水纸顺次相互搭接粘贴得到试纸条，最后将试纸条切割成不同宽度的试纸条即可。
(二)试剂盒的组装
将制好的检测试剂条，另配一根塑料滴管，一个干燥剂统一由铝箔袋密封包装，加上一份说明书，包装在配套的外包盒内，构成试剂盒。
本试剂盒的检测卡可以用来检测Lp-PLA2和CRP液体样品，操作时，将全血或血浆、血清按一定的量滴加在本试纸条的样品垫上，当出现的结果是在试纸条的Lp-PLA2检测线(T2线)、CRP(T1线)检测线和控制线(C线)位置上各出现一条色带时，表现为两者都是阳性。T2线和C线各出现一条色带，说明Lp-PLA2为阳性；T1线和C线各出现一条色带，说明CRP为阳性；仅试纸条的C线位置显色时，为阴性结果；在试纸条的C线位置上未显色时，为无效结果。如图2。
实施例2：快速检测卡准确度、精确度及稳定性测试
(1)试剂盒准确度与精确度测试
选择高、中、低三个浓度的标准品，各含有Lp-PLA2和CRP浓度为800ng/mL和1000ng/mL，300ng/mL和450ng/mL，50ng/mL和100ng/mL。用本发明设计的层析法快速检测试剂盒和市场上的常规检测试剂盒(检测Lp-PLA2用ELISA法，检测CRP用胶乳增强免疫比浊法)进行同时检测，每个浓度检测10次，将所得结果进行比较，确定本试剂盒的准确度和精密度，得到的检测结果如下表：
表1 Lp-PLA2检测结果比较
对本组数据做配对样本的T检验，得P＞0.05，得出两组结果之间的差别无统计学意义，说明两种方法无论在高、中或者低浓度的Lp-PLA2检测中，均有较好的一致性，本专利设计的检测方法的准确度与市售检测试剂盒相似。
表2 CRP检测结果比较
对本组数据做配对样本的T检验，得P＞0.05，得出两组结果之间的差别无统计学意义，说明两种方法无论在高、中或者低浓度的CRP检测中，均有较好的一致性，本专利设计的检测方法的准确度与市售检测试剂盒相似。
综上，本发明方法的快速检测试剂盒有较好的准确度。同时，本方法在多浓度下两指标的重复检测结果的变异系数均小于10％，具有较好精密度。
(2)试剂盒稳定性试验：
试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的各项指标，发现均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。
以上所述尽是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种同时测定血浆中脂蛋白磷脂酶A2和C反应蛋白的层析法快速检测卡，包括底衬及从左到右顺次相互搭接粘贴在底衬上方的样品垫、涂覆有胶乳微球标记抗体的试剂垫、包被膜和吸水纸，所述包被膜上在靠近吸水纸的一端划有一条包被了兔抗鼠IgG单克隆抗体的质控线，所述包被膜上在靠近试剂垫的一端划有两条平行的第一检测线和第二检测线，其中，靠近试剂垫的第一检测线上包被有能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的单克隆抗体，第二检测线上包被有能与待检抗原CRP特异结合的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的快速检测卡，其特征在于，所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫为吸滤纸或滤油纸；所述试剂垫为聚酯膜；所述包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的快速检测卡，其特征在于，所述的胶乳微球为胶体金颗粒或彩色聚苯乙烯胶乳微球。
4.根据权利要求3所述的快速检测卡，其特征在于，所述乳胶微球的粒径为50-75nm。
5.权利要求1所述的快速检测卡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)包被膜的制备：用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原Lp-PLA2特异性结合的抗体、能与待检抗原CRP特异结合的抗体和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于包被膜上对应的第一检测线、第二检测线和质控线，待三种抗体渗入包被膜后分别形成第一检测线、第二检测线和质控线；
2)喷涂有胶乳颗粒标记抗体的试剂垫的制备：分别制备连接了Lp-PLA2特异性抗体的胶乳颗粒和连接了CRP特异性抗体的胶乳颗粒，利用这两种胶乳颗粒的混合物喷涂聚酯膜得到试剂垫；
3)组装试纸条：在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、喷涂有胶乳颗粒标记抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的两种颗粒具有相同或者不同的颜色。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗体与胶乳颗粒的连接方法为物理吸附法或化学偶联法。
8.一种同时测定血浆中Lp-PLA2和CRP的试剂盒，包括权利要求1所述的层析法快速检测卡、说明书和外包盒，每单人份金标检测卡由铝箔袋密封包装，每个包装内另配有一根塑料滴管和一小袋干燥剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测灵敏度为：1)Lp-PLA2100ng/mL；2)CRP 100ng/mL。
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