CN111855986A - 联合定量检测五项心脏标志物试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合型定量检测超敏C反应蛋白(hs‑CRP)、髓过氧化酶(MPO)、脂蛋白磷脂酶A2(Lp‑PLA2)、氧化低密度脂蛋白(ox‑LDL)、F2‑异前列腺素(F2‑isop)荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括干燥剂、密封袋和检测卡。所述检测卡包括五联体扣卡与试剂条；所述试剂条包括样品垫、结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述结合垫包被有hs‑CRP抗体、MPO抗体、Lp‑PLA2抗体、ox‑LDL抗体、F2‑isop抗体；所述抗体为单单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。本发明方法具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化、假阳性达到了最小化、检测效率高，检测成本低等突出优点，有重要的实用意义。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学检验领域，具体地说，涉及一种联合定量检测超敏C反应蛋白、髓过氧化酶脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白和F2-异前列腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
心血管性疾病是临床上常见的急危重症，病死率高、病情凶险，严重威胁着人类的健康与生命。有资料表明，心血管病的基本病理变化是动脉粥样硬化，近年来的研究显示炎症反应是动脉粥样硬化及心血管疾病的基础，尤其是慢性炎症被认为能增加动脉损伤疾病风险，使动脉粥样硬化斑块易于破裂，在动脉粥样硬化的形成中起了关键作用。动脉损伤是全身心血管系统的一种慢性炎症反应结果。但由于动脉损伤早期缺乏明显的临床表现，所以确诊时多处于疾病的中晚期，导致患者的预后差和过多的医疗花费。于是寻找有效的监测早期动脉病变、预测严重心脑血管病风险的心脑血管标志物具有重要的临床意义。
hs-CRP是炎症病变的敏感标志物，能准确的检测低浓度C反应蛋白。临床试验表明，血清hs-CRP水平随着冠心病病情呈渐进性升高趋势。hs-CRP是反映炎性过程的敏感、精确的指标，体内轻微的炎症就可以导致hs-CRP升高，流行病学研究显示增高的Hs—CRP可以预示10年内的CHD发生。Lp-PLA2是钙离子非依赖性的分子量为45KDa的分泌型蛋白。Lp-PLA2由巨噬细胞产生，是血管内皮炎症的标记物，不受其他炎症性疾病影响。可以特异性检测早期血管炎症的发生。多项临床试验研究表明，基础Lp-PLA2水平较高者以后发生心血管事件的比例较基础Lp-PLA2水平较低者显著升高。MPO是一种中性溶酶体酶，由活化的中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞产生，参与人体内多种炎症反应和氧化应激过程。MPO升高提示患者可能存在冠状动脉炎症，但血管未完全堵塞，并未引起心肌坏死，可以用于预测早期不良心血管事件发生的可能性。冠心病患者血浆中ox-LDL水平是正常对照者的2倍。血液F2-isop水平与冠心病的病变范围和严重程度密切有关。本发明一种联合定量检测hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop荧光免疫层析检测试剂盒将以上五者结合，通过联合检测患者血液hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop水平，可以更加准确有效地预测患者严重心脑血管病风险的可能，实现严重心血管事件早期诊断、风险预测和严重性评估。
中国发明专利CN201810746660.2公开了一种联合定量检测炎症标志物血清淀粉样蛋白A、超敏C反应蛋白与降钙素原检测试纸，该方法仅涉及炎症标志物，一般是产生验证了，才会检测出来，无法实现风险评估。目前临床应用的单一指标检测产品只能同时检测一个指标，五个指标需要五个检测试剂才能完成，具有检测效率低、成本高、耗材浪费等缺陷。
近年来，心血管事件已成为我国人口病死原因的第一位，故早期识别诊断及对其进行风险分级具有重要的临床意义。因此，发明一种对心脑血管性疾病早期诊断和风险分级准确度高的检测试剂盒很有必要。本发明联合应用心血管标志物Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop的荧光免疫层析法对心血管疾病进行预测和诊断，与传统指标相比，Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop的联合应用在严重心血管事件早期诊断和风险预测方面准确性更高，优势明显，预计可降低30％的死亡率。且本发明采用荧光免疫层析法，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化、阳性检出率达90％以上、假阳性达到了最小化、检测效率高、检测成本低等突出优点，有重要的实用意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种灵敏度高、准确性强、操作简便的联合定量检测Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop荧光免疫层析检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种联合定量检测Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。
本发明的目的可通过采用以下技术方案予以实现：
一种联合定量检测Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop荧光免疫层析检测试剂盒包括检测卡、干燥剂和密封袋，所述检测卡包括扣卡和试剂条；所述试剂条包括样品垫、结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述结合垫分别包被有hs-CRP抗体、MPO抗体、Lp-PLA2抗体、ox-LDL抗体、F2-isop抗体。
所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。
所述的荧光微球选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
所述所述hs-CRP抗体为抗hs-CRP单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、MPO抗体为抗MPO单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、Lp-PLA2抗体为抗Lp-PLA2单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、ox-LDL抗体为抗ox-LDL单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、F2-isop抗体为抗F2-isop单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。
联合定量检测hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL和F2-isop荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)样品垫的制备：将玻璃纤维素膜用含有2％BSA、0.1MNaCl和表面活性剂，pH7-8的缓冲液浸泡，于4℃浸泡4小时，然后置于烘箱中，37℃干燥8小时即可。如上制备5份样品垫。
(2)结合垫的制备：在步骤(1)制得的5份样品垫上分别均匀的铺上荧光微球标记的Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL或F2-isop抗体溶液，真空冷冻干燥后密封，室温保存备用。
(3)滤血膜的制备：将滤血膜裁剪成10cm×5mm每条。
(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：
a.检测线制备：将羊抗人标记抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释液划线得到检测线；
b.质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释液划线得到质控线。
c.检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后将硝酸纤维素膜置于37℃干燥8小时即得。
(5)吸水纸的制备：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条。
(6)组装：将上述处理好的样品垫、微球标记结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，贴好后裁剪成4mm宽的试纸条，并置于五联体扣卡内，加入干燥剂封装即得。
所述的样品垫的制备的缓冲液选自Tris、PBS或甘氨酸中的一种，所述表面活性剂选自Tween20或TritonX-100中的一种。
所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。
所述的荧光微球选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
所述的氧化低密度脂蛋白抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。
本发明具有的积极效果：本发明的联合定量荧光免疫层析试剂盒对血液样品中的Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL或F2-isop进行定量检测，解决了传统指标仅可以用于心脏病类型检测，对风险预测无意义的不足，与传统指标相比，本发明的Hs-CRP、MPO、Lp-PLA2、ox-LDL或F2-isop联合应用在严重心血管事件早期诊断和风险预测方面准确性更高，优势明显。另本发明采用荧光免疫层析法，与传统方法相比，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化、阳性检出率达90％以上、假阳性达到了最小化等突出优点，有重要的实用意义。
附图说明
图1为本发明试剂条结构的示意图。
图2为组合扣卡结构示意图。
图3为五联体扣卡结构示意图。
图4是超敏C反应蛋白检测标准工作曲线图。
图5是髓过氧化酶检测标准工作曲线图。
图6是脂蛋白磷脂酶A2检测标准工作曲线图。
图7是氧化低密度脂蛋白检测标准工作曲线图。
图8是F2-异前列腺素检测标准工作曲线图。
图9是超敏C反应蛋白线性标准工作曲线图。
图10是髓过氧化酶线性标准工作曲线图。
图11是脂蛋白磷脂酶A2线性标准工作曲线图。
图12是氧化低密度脂蛋白线性标准工作曲线图。
图13是F2-异前列腺素线性标准工作曲线图。
具体实施方式
下述实施例结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下说明。
如图1、图2、图3所示，本发明检测试剂盒除所述干燥剂和密封袋外，主要结构检测卡包括扣卡7或扣卡10和试剂条1，其中试剂条1包括样品垫5、结合垫3、硝酸纤维素膜2、吸水纸4和PVC底板6；扣卡包括组合扣卡7和五联扣卡10，扣卡均包括加样孔8和观察窗9，试剂条1安置于扣卡1或五联扣卡10内。
实施例1：
(1)样品垫的制备
用pH8.0碳酸氢钠缓冲液溶解BSA和NaCl，至BSA终浓度为2％，NaCl终浓度为0.1M，然后加入表面活性剂Tween20至终浓度为0.5％，调节pH到8.0，按玻璃纤维素膜吸水量60uL/cm2，将以上缓冲液均匀铺于玻璃纤维素膜上，置于37℃干燥8小时即得样品垫。置于4℃保存，备用。
(2)结合垫的制备
将荧光微球标记的单克隆抗体均匀铺在步骤(1)制得的样品垫上，真空冷冻干燥后密封，置于室温保存，备用。其中荧光微球标记的单克隆抗体制备过程如下：
a.荧光微球标记的hs-CRP单克隆抗体制备
取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5mL，用50mM，pH6.0的MES缓冲液2mL清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mM，pH6.0的MES缓冲液溶解微球至2mL，再用500uL10mg/mL活化剂EDC和500uL 50mg/mL稳定剂NHS进行活化，然后用50mM，pH6.0的MES清洗，去除剩余的活化剂，10mMPBS重新溶解微球，将活化好的荧光微球与hs-CRP单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/mL，最终体积为2mL，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2mL进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5mL，即得荧光微球标记的hs-CRP单克隆抗体。
b.荧光微球标记的MPO单克隆抗体制备
取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5mL，用50mM，pH6.0的MES缓冲液2mL清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mM，pH6.0的MES缓冲液溶解微球至2mL，再用500uL10mg/mL活化剂EDC和500uL 50mg/mL稳定剂NHS进行活化，然后用50mM，pH6.0的MES清洗，去除剩余的活化剂，10mMPBS重新溶解微球，将活化好的荧光微球与MPO单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/mL，最终体积为2mL，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2mL进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5mL，即得荧光微球标记的MPO单克隆抗体。
c.荧光微球标记的Lp-PLA2单克隆抗体制备
取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5mL，用50mM，pH6.0的MES缓冲液2mL清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mM，pH6.0的MES缓冲液溶解微球至2mL，再用500uL10mg/mL活化剂EDC和500uL 50mg/mL稳定剂NHS进行活化，然后用50mM，pH6.0的MES清洗，去除剩余的活化剂，10mMPBS重新溶解微球，将活化好的荧光微球与Lp-PLA2单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/mL，最终体积为2mL，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2mL进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5mL，即得荧光微球标记的Lp-PLA2单克隆抗体。
d.荧光微球标记的ox-LDL单克隆抗体制备
取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5mL，用50mM，pH6.0的MES缓冲液2mL清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mM，pH6.0的MES缓冲液溶解微球至2mL，再用500uL10mg/mL活化剂EDC和500uL 50mg/mL稳定剂NHS进行活化，然后用50mM，pH6.0的MES清洗，去除剩余的活化剂，10mMPBS重新溶解微球，将活化好的荧光微球与ox-LDL单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/mL，最终体积为2mL，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2mL进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5mL，即得荧光微球标记的ox-LDL单克隆抗体。
e.荧光微球标记的F2-isop单克隆抗体制备
取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5mL，用50mM，pH6.0的MES缓冲液2mL清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mM，pH6.0的MES缓冲液溶解微球至2mL，再用500uL10mg/mL活化剂EDC和500uL 50mg/mL稳定剂NHS进行活化，然后用50mM，pH6.0的MES清洗，去除剩余的活化剂，10mMPBS重新溶解微球，将活化好的荧光微球与F2-isop单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/mL，最终体积为2mL，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2mL进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5mL，即得荧光微球标记的F2-isop单克隆抗体。
(3)滤血膜的制备：将滤血膜裁剪成10cm×4mm每条。
(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
a.包被Hs-CRP硝酸纤维素膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上端C线标注位置划线得到质控线，将羊抗人Hs-CRP多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上T线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的NC膜。
b.包被MPO硝酸纤维素膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上端C线标注位置划线得到质控线，将羊抗人MPO多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上T线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的NC膜。
c.包被Lp-PLA2硝酸纤维素膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上端C线标注位置划线得到质控线，将羊抗人Lp-PLA2多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上T线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的NC膜。
d.包被ox-LDL硝酸纤维素膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上端C线标注位置划线得到质控线，将羊抗人ox-LDL多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上T线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的NC膜。
e.包被F2-isop硝酸纤维素膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上端C线标注位置划线得到质控线，将羊抗人F2-isop多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上T线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的NC膜。
(5)吸水纸的制备：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条。
(6)组装：将步骤(1)所得样品垫、步骤(2)所得的结合垫、步骤(3)所得的滤血膜、步骤(4)所得的NC膜和步骤(5)所得吸水纸依次粘贴于PVC底板上，贴好后用切条机切成宽4mm的试纸条，并置于五联体扣卡内，加入干燥剂封装即得。
实施例2：
超敏C反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白和F2-异前列腺素荧光免疫层析检测试剂盒的检测。
(1)绘制标准曲线
在按实施例1制备好的试剂盒样品垫上分别加入不同浓度超敏C反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白和F2-异前列腺素抗原标准品(各取7个不同浓度，超敏C反应蛋白抗原标准品分别为0、0.5、5、10、40、100、150ng/mL，髓过氧化酶抗原标准品分别为0、10、50、100、200、500、1000ng/mL，脂蛋白磷脂酶A2抗原标准品分别为0、50、100、200、500、1000和1500ng/mL，氧化低密度脂蛋白抗原标准品分别为0、0.5、1、2、4、8、16和20μg/mL，F2-异前列腺素抗原标准品分别为0、30、50、200、400、800和1500pg/mL。每个浓度设3个重复)，15分钟后，置于荧光定量免疫层析仪中获取荧光信号强度，根据检测线与质控线荧光信号比值，由标准曲线求所检样品的浓度。实验结果及分析见表1～5：
表1超敏C反应蛋白标准品检测结果
表2髓过氧化酶标准品检测结果
表3脂蛋白磷脂酶A2标准品检测结果
表4氧化低密度脂蛋白标准品检测结果
表5 F2-异前列腺素标准品检测结果
分别以超敏C反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白、F2-异前列腺素抗原标准液浓度与测定的信号比值平均值绘制标准曲线，如附图4～8所示。
(2)检测线性范围
采用本发明实施例1制备的试剂盒，做检测线性范围实验。
取超敏C反应蛋白标准品，用生理盐水分别稀释成6个浓度，超敏C反应蛋白浓度范围是0.5ng/mL-150ng/mL，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y＝0.9957X+0.4789，相关系数r＝0.999，表明本试剂盒在0.5ng/mL-150ng/mL线性范围内相关性较好(见附图9)。
取髓过氧化酶标准品，用生理盐水稀释成6个浓度，其浓度范围是10-1000ng/mL，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y＝0.9986X+5.2168，相关系数r＝0.999，表明本试剂盒在10-1000ng/mL线性范围内相关性较好(见附图10)。
取脂蛋白磷脂酶A2标准品，用生理盐水稀释成6个浓度，其浓度范围是50-1500ng/mL，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y＝1.0346X-9.3357，相关系数r＝0.999，表明本试剂盒在50-1500ng/mL线性范围内相关性较好(见附图11)。
取氧化低密度脂蛋白标准品，用生理盐水稀释成6个浓度，其浓度范围是0-20μg/mL，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y＝1.0144X-0.0444，相关系数r＝0.999，表明本试剂盒在1-16μg/mL线性范围内相关性较好(见附图12)。
取F2-异前列腺素标准品，用生理盐水稀释成6个浓度，其浓度范围是0-1500pg/mL，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y＝1.0669x-19.818，相关系数r＝0.997，表明本试剂盒在30-1500ng/mL线性范围内相关性较好(见附图13)。
(3)灵敏度(最低检测限)
以人血浆为空白样本，用本发明实施例1制备的试纸条进行测定，重复20次，计算超敏C反应蛋白结果均值为0.0208，标准差为0.0024，根据空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪测定度数变化量为0.025，代入标准曲线中得到最低检出限为0.12ng/mL；计算髓过氧化酶结果均值为0.0306，标准差为0.0035，根据空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪测定度数变化量为0.0375，代入标准曲线中得到最低检出限为5.13ng/mL；计算脂蛋白磷脂酶A2结果均值为0.015，标准差为0.0096，根据空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪测定度数变化量为0.0342，代入标准曲线中得到最低检出限为20.5ng/mL；计算氧化低密度脂蛋白结果均值为0.030，标准差为0.0055，根据空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪测定度数变化量为0.041，代入标准曲线中得到最低检出限为0.25μg/mL；计算F2-异前列腺素结果均值为0.025，标准差为0.0013，根据空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪测定度数变化量为0.0276，代入标准曲线中得到最低检出限为27.91pg/mL。
(4)重复性和准确性
配制1.0ng/mL和10ng/mL的超敏C反应蛋白标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试剂盒进行测定，各浓度分别重复测定5次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为5.6％和0.9％；以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为4％和6％。
配制50ng/mL和200ng/mL的髓过氧化酶标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试剂盒进行测定，各浓度分别重复测定5次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为9.5％和6.3％；以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为8.3％和4.6％。
配制100ng/mL和500ng/mL的脂蛋白磷脂酶A2标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试剂盒进行测定，各浓度分别重复测定5次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为10.6％和3.6％；以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为8.6％和10.6％。
配制3.21μg/mL和8.36μg/mL的氧化低密度脂蛋白标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试剂盒进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为9.5％和4.2％；以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为4.6％和11.5％。
配制100pg/mL和200pg/mL的F2-异前列腺素标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试剂盒进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为4.7％和6.6％；以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为1.6％和2.2％。
Claims (10)
1.一种联合定量检测超敏C反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白、F2-异前列腺素荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测卡、干燥剂和密封袋，所述检测卡包括扣卡和试剂条；所述试剂条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述结合垫分别包被有超敏C反应蛋白、髓过氧化酶抗体、脂蛋白磷脂酶A2抗体、氧化低密度脂蛋白、F2-异前列腺素抗体；所述硝酸纤维素膜包被固定有与所述检测抗体具有对人敏C反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白、F2-异前列腺素配对结合特性的抗人敏C反应蛋白、髓过氧化酶、脂蛋白磷脂酶A2、氧化低密度脂蛋白、F2-异前列腺素捕获抗体。
2.根据权利要求1所述联合检测试剂盒，其特征在于，所述荧光物质包括荧光素和荧光微球的至少一种，所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。
3.根据权利要求1所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光物质选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
4.根据权利要求1所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括样品垫和滤血膜至少一种。
5.根据权利要求1所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述超敏C反应蛋白抗体为抗超敏C反应蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、髓过氧化酶抗体为抗髓过氧化酶单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、脂蛋白磷脂酶A2抗体为抗脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、氧化低密度脂蛋白抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合、F2-异前列腺素抗体为抗F2-异前列腺素单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。
6.一种如权利要求1所述的联合检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)样品垫的处理：将玻璃纤维素膜用含有2％BSA、0.1MNaCl和表面活性剂，pH7-8的缓冲液浸泡，于4℃浸泡4小时，然后置于烘箱中，37℃干燥8小时即可。如上制备5份；
(2)结合垫的制备：在步骤(1)制得的5份样品垫上分别均匀的铺上荧光微球标记的hs-CRP抗体、MPO抗体、Lp-PLA2抗体、ox-LDL抗体或F2-isop抗体溶液，真空冷冻干燥后密封，室温保存备用；
(3)滤血膜的制备：将滤血膜裁剪成10cm×4mm每条；
(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：
a.检测线制备：将羊抗人标记抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释抗体液划线得到检测线；
b.质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释液划线得到质控线；
c.检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后将硝酸纤维素膜置于37℃干燥8小时即得；
(5)吸水纸的制备：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条；
(6)组装：将上述处理好的样品垫、微球标记结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，贴好后裁剪成4mm宽的试纸条，并置于五联体扣卡内，加入干燥剂封装即得。
7.根据权利要求6所述联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的样品垫的制备的缓冲液选自Tris、PBS或甘氨酸中的一种，所述表面活性剂选自Tween20或TritonX-100中的一种。
8.根据权利要求6所述的联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。
9.根据权利要求6所述的联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的荧光微球选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。
10.根据权利要求6所述的联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗体为抗超敏C反应蛋白、抗髓过氧化酶、抗脂蛋白磷脂酶A2、抗氧化低密度脂蛋白或抗F2-异前列腺素单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。
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