CN111855988A - 一种氧化低密度脂蛋白荧光检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒及制备方法，包括干燥剂、密封袋和检测卡。所述检测卡包括扣卡与试剂条；所述试剂条包括样品垫、结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述结合垫包被有氧化低密度脂蛋白抗体；所述氧化低密度脂蛋白抗体为氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。本发明方法具有操作简便、检测效率高，检测成本低、灵敏度高、特异性强等突出优点，有重要的实用意义。

Description

一种氧化低密度脂蛋白荧光检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及临床医学检验领域，具体地说，涉及一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

心血管类疾病已成为人类“第一杀手”，目前全球每年有1700万人死于心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3，预计到2020年这个数字将突破2000万。由于心血管疾病患者人数众多，因此相关诊断产品的市场空间很大，及时和早期的诊断对患者的预后将产生积极的影响。

氧化低密度脂蛋白是天然低密度脂蛋白经氧化修饰形成的。通常情况下，低密度脂蛋白以非氧化状态存在，当人体内氧化修饰的低密度脂蛋白过量时，它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，久了容易引起动脉硬化。众多研究表明氧化低密度脂蛋白可作为心血管疾病风险预测和早期诊断的独立生物标记物。因此，准确检测血液中氧化低密度脂蛋白含量对心血管疾病的预防、检测及早期诊断意义重大。

目前，现有技术存在以下不足：(1)心血管病患病风险预测通常采用传统指标为血糖、血脂和血压相关指标，采用传统方法包括心脏超声检查、X光片检查等进行检测，这些一定是患者情况非常严重了，才会被检测到，无法达到早期诊断和预测疾病的效果。(2)中国发明专利CN201610219116.3公开了一种人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫法检测试剂盒，该检测方法次存在在判断准确度不高、易出现假阳性、检测耗时长、操作复杂的问题。(3)中国实用新型专利CN201520050545.3公开了一种人氧化低密度脂蛋白的免疫比浊检测试剂盒，该检测方法存在需要特制仪器，造成仪器投资成本高、试剂成本高、测试速度慢、灵敏度低等缺点。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。

本发明的目的可通过采用以下技术方案予以实现：

一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒包括检测卡、干燥剂和密封袋，所述检测卡包括扣卡和试剂条；所述试剂条包括样品垫、结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述结合垫包被有荧光微球标记的氧化低密度脂蛋白抗体。

所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。

所述的荧光微球选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。

所述氧化低密度脂蛋白抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。

氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)样品垫的制备：将玻璃纤维素膜用含有2％BSA、0.1MNaCl和表面活性剂，pH7-8的缓冲液浸泡，于4℃浸泡4小时，然后置于烘箱中，37℃干燥8小时即可。

(2)结合垫的制备：在步骤(1)制得的样品垫上均匀的铺上荧光微球标记的氧化低密度脂蛋白抗体溶液，真空冷冻干燥后密封，室温保存备用。

(3)滤血膜的制备：将滤血膜裁剪成10cm×5mm每条。

(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：

a.检测线制备：将羊抗人标记抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释液划线得到检测线；

b.质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释液划线得到质控线。

c.检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后将硝酸纤维素膜置于37℃干燥8小时即得。

(5)吸水纸的制备：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条。

(6)组装：将上述处理好的样品垫、微球标记结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，贴好后裁剪成宽4mm每条的试纸条，置于扣卡内，加入干燥剂封装即得。

所述的样品垫的制备的缓冲液选自Tris、PBS或甘氨酸中的一种，所述表面活性剂选自Tween20或TritonX-100中的一种。

所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。

所述的荧光微球选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。

所述的氧化低密度脂蛋白抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。

本发明具有的积极效果：

(1)氧化低密度脂蛋白是新一代心脏标志物，一旦心脏受损，就回立刻体现出来，并被检测到，达到早期诊断的目的，为患者赢得宝贵的治疗时间。

(2)本发明采用荧光免疫层析检测方法制备试剂盒，解决了传统胶体金法、免疫比浊法、酶联免疫法存在判断准确度不高、易出现假阳性、检测耗时长、操作复杂的问题。项目方法具有特异、敏感、快速、准确、重复性好、易自动化、假阳性达到了最小化、检测效率高、检测成本低、操作简便等突出优点。

附图说明

图1为本发明试剂条结构的示意图。

图2为组合扣卡结构示意图。

图3为氧化低密度脂蛋白检测标准工作曲线图。

图4为氧化低密度脂蛋白线性标准工作曲线图。

具体实施方式

下述实施例结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下说明。

如图1、图2所示，本发明检测试剂盒除所述干燥剂和密封袋外，主要结构检测卡包括扣卡7和试剂条1，其中试剂条1包括样品垫5、结合垫3、硝酸纤维素膜2、吸水纸4和PVC底板6；扣卡包括组合扣卡7，扣卡均包括加样孔8和观察窗9，试剂条1安置于扣卡1内。

实施例1：

氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备。

(1)样品垫的制备

用pH8.0碳酸氢钠缓冲液溶解BSA和NaCl，至BSA终浓度为2％，NaCl终浓度为0.1M，然后加入表面活性剂Tween20至终浓度为0.5％，调节pH到8.0，按玻璃纤维素膜吸水量60uL/cm2，将以上缓冲液均匀铺于玻璃纤维素膜上，置于37℃干燥8小时即得样品垫。置于4℃保存，备用。

(2)结合垫的制备

取粒径大小为300nm的荧光微球溶液0.5mL，用50mM，pH6.0的MES缓冲液2mL清洗去除微球溶液中的表面活性剂，然后50mM，pH6.0的MES缓冲液溶解微球至2mL，再用500uL10mg/mL活化剂EDC和500uL 50mg/mL稳定剂NHS进行活化，然后用50mM，pH6.0的MES清洗，去除剩余的活化剂，10mM PBS重新溶解微球，将活化好的荧光微球与氧化低密度脂蛋白单克隆抗体混合，抗体终浓度为120ug/mL，最终体积为2mL，室温下，充分搅拌反应2h，离心去除上清，然后用1％酪蛋白溶液2mL进行封闭反应1个小时，然后用缓冲液清洗、溶解定容至5mL，即得荧光微球标记的氧化低密度脂蛋白单克隆抗体。将荧光微球标记的氧化低密度脂蛋白单克隆抗体均匀铺在步骤(1)制得的样品垫上，真空冷冻干燥后密封，即得结合垫。置于室温保存，备用。

(3)滤血膜的制备：将滤血膜裁剪成10cm×5mm每条。

(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上端C线标注位置划线得到质控线，将羊抗人氧化低密度脂蛋白多克隆抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在NC膜上T线标注位置划线得到检测线，检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后置于37℃干燥8小时即得包被有检测线和质控线的NC膜。

(5)吸水纸的制备：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条。

(6)组装：将步骤(1)所得样品垫、步骤(2)所得的结合垫、步骤(3)所得的滤血膜、步骤(4)所得的NC膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，贴好后用切条机切成宽4mm每条的试纸条，置于扣卡内，加入干燥剂封装即得。

实施例2：

氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的检测。

(1)绘制标准曲线

在按实施例1制备好的试剂盒样品垫上分别加入不同浓度氧化低密度脂蛋白抗原标准品(各取7个不同浓度，氧化低密度脂蛋白抗原标准品分别为0、0.5、1、2、4、8、16和20μg/mL，每个浓度设3个重复)，15分钟后，置于荧光定量免疫层析仪中获取荧光信号强度，根据检测线与质控线荧光信号比值，由标准曲线求所检样品的浓度。实验结果及分析见表1：

表1氧化低密度脂蛋白标准品检测结果

以氧化低密度脂蛋白抗原标准液浓度与测定的信号比值平均值绘制标准曲线，如附图3所示。

(2)检测线性范围

采用本发明实施例1制备的试剂盒，做检测线性范围实验。

取氧化低密度脂蛋白标准品低浓度1μg/mL和高浓度16μg/mL，用血浆稀释液按一定比例稀释成5个浓度，其浓度范围是1-16μg/mL，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y＝1.0144X-0.0444，相关系数r＝0.999，表明本试剂盒在1-16μg/mL线性范围内相关性较好(见附图4)。

(3)灵敏度(最低检测限)

以人血浆为空白样本，用本发明实施例1制备的试纸条进行测定，重复20次，计算氧化低密度脂蛋白结果均值为0.030，标准差为0.0055，根据空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪测定度数变化量为0.041，代入标准曲线中得到最低检出限为0.25μg/mL。

(4)重复性和准确性

配制3.21μg/mL和8.36μg/mL的氧化低密度脂蛋白标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试剂盒进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为9.5％和4.2％；以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为4.6％和11.5％。

Claims (10)

1.一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测卡、干燥剂和密封袋，所述检测卡包括扣卡和试剂条；所述试剂条包括结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述结合垫包被有由荧光物质标记的抗人氧化低密度脂蛋白的检测抗体，所述硝酸纤维素膜包被固定有与所述检测抗体具有对人氧化低密度脂蛋白配对结合特性的抗人氧化低密度脂蛋白捕获抗体。

2.根据权利要求1所述的一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述荧光物质包括荧光素和荧光微球的至少一种，所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。

3.根据权利要求1所述的一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光物质选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括样品垫和滤血膜至少一种。

5.根据权利要求1所述的一种氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述氧化低密度脂蛋白抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。

6.一种如权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)样品垫的处理：将玻璃纤维素膜用含有2％BSA、0.1MNaCl和表面活性剂，pH7-8的缓冲液浸泡，于4℃浸泡4小时，然后置于烘箱中，37℃干燥8小时即可；

(2)结合垫的制备：在步骤(1)制得的样品垫上均匀的铺上荧光微球标记的氧化低密度脂蛋白抗体溶液，真空冷冻干燥后密封，室温保存备用；

(3)滤血膜的制备：将滤血膜裁剪成10cm×4mm每条；

(4)包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：

a.检测线制备：将羊抗人氧化低密度脂蛋白抗体用稀释包被液稀释至1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释抗体液划线得到检测线；

b.质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体用50mM/L pH7.2的PB缓冲液稀释到1.0mg/mL的浓度，0.8ul/cm的划线速率在硝酸纤维素膜上用以上稀释液划线得到质控线；

c.检测线和质控线间隔为5mm，划线完毕后将硝酸纤维素膜置于37℃干燥8小时即得；

(5)吸水纸的制备：将吸水纸裁剪成30cm×2.7cm每条；

(6)组装：将上述处理好的样品垫、微球标记结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，贴好后裁剪成4mm宽的试纸条，置于扣卡内，加入干燥剂封装即得。

7.根据权利要求6所述的氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的样品垫的制备的缓冲液选自Tris、PBS或甘氨酸中的一种，所述表面活性剂选自Tween20或TritonX-100中的一种。

8.根据权利要求6所述的氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的荧光微球的粒径范围为50nm-500nm。

9.根据权利要求6所述的氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的荧光微球选自荧光素cy5、荧光素cy7、含铕聚苯乙烯微球、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、藻红蛋白中的一种。

10.根据权利要求6所述的氧化低密度脂蛋白荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的氧化低密度脂蛋白抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体的一种或多种配对组合。

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