CN117192134A - 一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒、检测方法，检测试剂盒包括：试剂1和试剂2；试剂1包括：缓冲液，稳定物质，氯化钠，防腐剂，包被有抗载脂蛋白B100单克隆抗体的纳米微球一；试剂2包括：缓冲液，稳定物质，防腐剂，包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛‑赖氨酸抗体、抗7‑酮基胆固醇‑9‑羧基壬烷‑赖氨酸抗体的纳米微球二。本发明解决了现有均相检测技术直接检测样本中ox‑LDL的存在灵敏度低的技术问题，实现了提高ox‑LDL检测灵敏度的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒、检测方法。
背景技术
血浆中的脂质包括甘油三酯、磷脂、胆固醇及胆固醇酯。血浆脂类不溶于水或微溶于水，脂类与载脂蛋白，以溶解度较大的脂蛋白复合物形式在血液循环中运输。脂蛋白根据其密度不同可分为乳糜微粒（Chylomicrons，CM）、极低密度脂蛋白（Verylow-densitylipoprotein，VLDL）、低密度脂蛋白（Low-densitylipoprotein，LDL）、中密度脂蛋白（Intermediatedensitylipoprotein，IDL）和高密度脂蛋白（Highdensitylipoprotein，HDL）。LDL是运送胆固醇的主要载体，由富含胆固醇酯的核、载脂蛋白B100及磷脂外壳组成。LDL中含有大量的多不饱和脂肪酸（Poly-unsaturatedfattyacid，PUFA），约占LDL总脂肪酸含量的35%-70%，极易被氧化。LDL主要被体内的活性氧、过渡金属、细胞及物理因素等氧化修饰形成氧化型低密度脂蛋白（Oxidized-statelow-densitylipoprotein，ox-LDL）。
研究表明氧化应激是动脉粥样硬化的重要发病机制之一，而LDL氧化为ox-LDL被认为是引发动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因子。目前ox-HDL免疫学检测方法多为酶联免疫吸附法、化学发光法等，但是存在步骤复杂，操作繁琐，检测灵敏度低等缺陷。
发明内容
本发明解决了现有均相检测技术直接检测样本中ox-LDL的存在灵敏度低的技术问题，实现了提高ox-LDL检测灵敏度的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括：试剂1和试剂2；试剂1包括：缓冲液，稳定物质，氯化钠，防腐剂，包被有抗载脂蛋白B100单克隆抗体的纳米微球一；试剂2包括：缓冲液，稳定物质，防腐剂，包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球二。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：具体的，利用LDL主要成分为载脂蛋白B100的特点，通过将检测样本中的LDL与抗载脂蛋白B100单克隆抗体接触，实现了ox-LDL富集到纳米微球上的目的，从而解决了现有均相检测技术直接检测样本中ox-LDL存在的灵敏度低的问题。由于试剂1中的抗载脂蛋白B100单克隆抗体相对于不同个体样本中LDL是过量的，因此所有个体样本中的LDL均被富集到试剂1中的纳米微球上，当对富集后的LDL中的ox-LDL进行检测时，相当于检测样本中ox-LDL在LDL中所占比例，从而间接实现了ox-LDL/LDL相对比值的测定，检测方便。当检测样本中存在ox-LDL时，由于不同个体血液内ox-LDL上存在氧化磷脂酰胆碱、丙烯醛和7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷中的一种或几种，均能被上述试剂2中抗体识别而检测到，而不受个体差异导致的氧化物不同引起的被测量的ox-LDL量的差异，因此检测过程中不易受到个体差异影响。
在本发明的一个实例中，缓冲液包括：三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三乙醇胺、哌嗪-1，4-二羟基丙磺酸水合物、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸、2-(环已胺)-1-乙磺酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、硼酸盐、醋酸盐、巴比妥盐缓冲液中的一种或多种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用上述缓冲液，能够维持试剂的pH值相对稳定。
在本发明的一个实例中，稳定物质包括：牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、卵清蛋白、丙三醇中的一种或多种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：稳定物质为生物大分子、高分子聚合物中的一种或多种，采用上述稳定物质，能够保持抗体分子结构和活性的稳定。
在本发明的一个实例中，防腐剂包括：Proclin300、叠氮化钠、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮中的一种或多种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用上述防腐剂，能够防止试剂受到微生物的污染。
在本发明的一个实例中，纳米微球一和纳米微球二为聚苯乙烯微球或胶体金微球。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：聚苯乙烯微球和胶体金微球都能够与抗体进行结合，结合效果好，且便于后续检测。
本发明还提供一种氧化型低密度脂蛋白的检测方法，采用上述任一检测试剂盒，检测方法包括以下步骤：S10：将检测样本加入试剂1，得到混合溶液，并进行孵育；S20：将试剂2加入混合溶液中，孵育；S30：检测反应体系中纳米微球的凝集程度。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：检测样本与试剂1一起孵育时，因检测样本中的LDL（包括ox-LDL）与试剂1中的抗载脂蛋白B100单克隆抗体形成抗原抗体复合物，而被识别并被富集到纳米微球一上；当加入试剂2时，试剂2中抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体，分别与试剂1中纳米微球一上富集的ox-LDL特异性结合，纳米微球一和纳米微球二发生级联聚集作用，通过检测纳米微球凝集引起的浊度或透光率变化，能够完成对检测样本中ox-LDL的高灵敏度检测，并且上述检测方法操作简便。
在本发明的一个实例中，检测样本为血清或血浆或组织液。
在本发明的一个实例中，检测反应体系中纳米微球的凝集程度包括检测反应体系中的浊度或透光率或荧光信号或发光信号变化。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过检测反应体系中的浊度或透光率或荧光信号或发光信号变化，能够对ox-LDL进行定量分析，测定高效便捷，检测结果直观。
在本发明的一个实例中，孵育的温度为37℃，时间为3-5min。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在上述孵育条件下进行孵育，反应体系反应充分，进而能够提高检测灵敏度。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的检测试剂与质谱法检测试剂的检测结果对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例1：
本发明提供一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括：试剂1和试剂2；试剂1包括：缓冲液，稳定物质，氯化钠，防腐剂，包被有抗载脂蛋白B100单克隆抗体的纳米微球一；试剂2包括：缓冲液，稳定物质，防腐剂，包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球二。
具体的，利用LDL主要成分为载脂蛋白B100的特点，通过将检测样本中的LDL与抗载脂蛋白B100单克隆抗体接触，实现了ox-LDL富集到纳米微球上的目的，从而解决了现有均相检测技术直接检测样本中ox-LDL存在的灵敏度低的问题。由于试剂1中的抗载脂蛋白B100单克隆抗体相对于不同个体样本中LDL是过量的，因此所有个体样本中的LDL均被富集到试剂1中的纳米微球上，当对富集后的LDL中的ox-LDL进行检测时，相当于检测样本中ox-LDL在LDL中所占比例，从而间接实现了ox-LDL/LDL相对比值的测定，检测方便。当检测样本中存在ox-LDL时，由于不同个体血液内ox-LDL上存在氧化磷脂酰胆碱、丙烯醛和7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷中的一种或几种，均能被上述试剂2中抗体识别而检测到，而不受个体差异导致的氧化物不同引起的被测量的ox-LDL量的差异，因此检测过程中不易受到个体差异影响。
进一步的，试剂1中包被有抗人载脂蛋白B100多肽（N端1-1000pb）单克隆抗体的纳米微球与检测样本接触，检测样本中的LDL颗粒（与LDL上的载脂蛋白B100反应）被选择性的富集到纳米微球一上，而不形成微球聚集。试剂2中包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球二与试剂1接触后，会形成纳米微球的凝集反应，因此，检测反应体系中纳米微球的凝集程度，可以间接反映ox-LDL的浓度水平。
具体的，试剂1中的抗人载脂蛋白B100单克隆抗体，通过人载脂蛋白B100的N端1-1000pb多肽片段作为免疫原免疫动物获得，包括但不限于鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、羊单克隆抗体及其Fab片段。也可以使用商业化抗体。
具体的，试剂2中的抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体，包括但不限于鼠抗体、羊抗体、兔抗体及其Fab片段。抗氧化磷脂酰胆碱抗体可以通过氧化磷脂酰胆碱与载体蛋白连接成完全抗原后，通过免疫动物获得。抗丙烯醛-赖氨酸抗体可以通过丙烯醛-赖氨酸与载体蛋白连接成完全抗原后，通过免疫动物获得。抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体可以通过7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸与载体蛋白连接成完全抗原后，通过免疫动物获得。也可以使用商业化抗体。
进一步的，缓冲液包括：三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三乙醇胺、哌嗪-1，4-二羟基丙磺酸水合物、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸、2-(环已胺)-1-乙磺酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、硼酸盐、醋酸盐、巴比妥盐缓冲液中的一种或多种。
具体的，采用上述缓冲液，能够维持试剂的pH值相对稳定。
进一步的，稳定物质包括：牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、卵清蛋白、丙三醇中的一种或多种。
具体的，稳定物质为生物大分子、高分子聚合物中的一种或多种，采用上述稳定物质，能够保持抗体分子结构和活性的稳定。
进一步的，防腐剂包括：Proclin300、叠氮化钠、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮中的一种或多种。
具体的，采用上述防腐剂，能够防止试剂受到微生物的污染。
进一步的，纳米微球一和纳米微球二为聚苯乙烯微球或胶体金微球。
具体的，聚苯乙烯微球和胶体金微球都能够与抗体进行结合，结合效果好，且便于后续检测。
具体的，采用物理吸附或化学交联法将抗载脂蛋白B100单克隆抗体包被到纳米微球一上，可以得到包被有抗人载脂蛋白B100单克隆抗体的纳米微球一。
进一步的，包被有抗载脂蛋白B100单克隆抗体的纳米微球一（10g/L）的制备方法包括以下步骤：
活化：取100μL聚苯乙烯微球（固含量10%）加入到2mL离心管中，加入1mL包被缓冲液（20mM MES pH6.5），混匀；加入30μLEDAC（10mg/mL），25℃孵育30分钟；
包被：加入1mg抗载脂蛋白B100单克隆抗体，混匀，25℃孵育120分钟；离心，去上清，用1mL包被缓冲液（50mM Tris pH7.4）重悬，超声分散。
封闭：加入100μL BSA（2%），混匀，25℃孵育60分钟；离心，去上清，用1mL保存液重悬，超声分散，保存液组分如下：50mM Tris（pH7.4）、2g/L BSA（牛血清白蛋白）、50g/L蔗糖、1g/L Proclin300。
具体的，可以采用物理吸附或化学交联法将抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体包被到纳米微球二上，可以得到包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球二。
进一步的，包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球二（10g/L）的制备方法包括以下步骤：
活化：取100μL聚苯乙烯微球（固含量10%）加入到2mL离心管中，加入1mL包被缓冲液（20mM MES pH6.5），混匀；加入30μLEDAC（10mg/mL），25℃孵育30分钟；
包被：分别加入0.5mg氧化磷脂酰胆碱、0.5mg丙烯醛-赖氨酸、0.5mg7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体，混匀，25℃孵育120分钟；离心，去上清，用1mL包被缓冲液（50mM Tris pH7.4）重悬，超声分散。
封闭：加入100μL BSA（2%），混匀，25℃孵育60分钟；离心，去上清，用1mL保存液重悬，超声分散，保存液组分如下：50mM Tris（pH7.4）、2g/L BSA、50g/L蔗糖、1g/LProclin300。
进一步的，纳米微球的直径为300nm。
实施例2：
本发明还提供一种氧化型低密度脂蛋白的检测方法，采用上述任一检测试剂盒，检测方法包括以下步骤：
S10：将检测样本加入试剂1，得到混合溶液，并进行孵育；
S20：将试剂2加入混合溶液中，孵育；
S30：检测反应体系中纳米微球的凝集程度。
具体的，检测样本与试剂1一起孵育时，因检测样本中的LDL（包括ox-LDL）与试剂1中的抗载脂蛋白B100单克隆抗体形成抗原抗体复合物，而被识别并被富集到纳米微球一上；当加入试剂2时，试剂2中抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体，分别与试剂1中纳米微球一上富集的ox-LDL特异性结合，纳米微球一和纳米微球二发生级联聚集作用，通过检测纳米微球凝集引起的浊度或透光率变化，能够完成对检测样本中ox-LDL的高灵敏度检测，并且上述检测方法操作简便。
进一步的，检测样本为血清或血浆或组织液。
进一步的，检测反应体系中纳米微球的凝集程度包括检测反应体系中的浊度或透光率或荧光信号或发光信号变化。
具体的，通过检测反应体系中的浊度或透光率或荧光信号或发光信号变化，能够对ox-LDL进行定量分析，测定高效便捷，检测结果直观。
进一步的，孵育的温度为37℃，时间为3-5min。
具体的，在上述孵育条件下进行孵育，在上述孵育条件下进行孵育，反应体系反应充分，进而能够提高检测灵敏度。
实施例3：
本实施提供一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂1和试剂2；
试剂1包括：100mmol/L HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），2.0g/L聚乙二醇6000，2.0g/L牛血清白蛋白，9.0g/氯化钠，1g/L Proclin300，2g/L包被有抗载脂蛋白B100单克隆抗体的聚苯乙烯微球；
试剂2包括：20mmol/L HEPES，2.0g/L牛血清白蛋白，1g/LProclin300，2g/L包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的聚苯乙烯微球。
在一个具体实施例中，采用实施例3提供的氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒对氧化型低密度脂蛋白进行检测，包括以下步骤：
将人血清/校准品加入试剂1，37℃孵育5min，读测第1点样本A1；
加入试剂2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2；
人血清/校准品A=人血清A2-人血清A1；分析参数为：主波长600nm、副波长800nm，人血清或校准品8μl，试剂1（R1）：160μl，试剂2（R2）：40μl。
按照上述方法制作校准曲线，根据校准曲线计算样本浓度，测试精密度和样本。
上述检测方法可以应用到全自动化分析仪中进行自动化检测。
对比例1：
一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES（pH7.4）、2.0g/L聚乙二醇20000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/LProclin300；
试剂2：20mmol/L HEPES（pH7.4）、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、2g/L包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球。
采用对比例1提供的检测试剂，检测氧化型低密度脂蛋白，检测方法同实施例3，仅在试剂1的组分上有区别。
对比例2：
一种氧化型低密度脂蛋白均相检测试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES（pH7.4）、2.0g/L聚乙二醇20000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300、0.2g/L抗载脂蛋白B100单克隆抗体；
试剂2：20mmol/L HEPES（pH7.4）、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、2g/L包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球。
采用对比例2提供的检测试剂，检测氧化型低密度脂蛋白，检测方法同实施例3，仅在试剂1的组分上有区别。
进一步的，对实施例3、对比例1和对比例2的检出限进行了评价，结果参见表1至表3，以某一浓度样本重复测试10次的平均值-2.6SD刚好略大于空白样本重复10次的平均值+2.6SD对应的浓度值判定为检出限。
表1 实施例3的检出限
表2 对比例1的检出限
表3 对比例3的检出限
根据表1至表3，可以看出实施例3、对比例1和对比例2的检出限分别为0.11mg/L、1.88mg/L、2.24mg/L，因此，实施例3检出限最低，灵敏度最高，比对比例的灵敏度提高了10倍以上。
采用实施例3提供的检测方法和质谱法分别检测人血清样本中ox-LDL，检测结果参见图1，可以清楚知道，两种方法相关性较好，说明本发明提供的检测方法能更特异性地检测ox-LDL。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (9)
1.一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂1和试剂2；
所述试剂1包括：缓冲液，稳定物质，氯化钠，防腐剂，包被有抗载脂蛋白B100单克隆抗体的纳米微球一；
所述试剂2包括：缓冲液，稳定物质，防腐剂，包被有抗氧化磷脂酰胆碱抗体、抗丙烯醛-赖氨酸抗体、抗7-酮基胆固醇-9-羧基壬烷-赖氨酸抗体的纳米微球二。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三乙醇胺、哌嗪-1，4-二羟基丙磺酸水合物、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸、2-(环已胺)-1-乙磺酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、硼酸盐、醋酸盐、巴比妥盐缓冲液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稳定物质包括：牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、卵清蛋白、丙三醇中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂包括：Proclin300、叠氮化钠、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述纳米微球一和所述纳米微球二为聚苯乙烯微球或胶体金微球。
6.一种氧化型低密度脂蛋白的检测方法，其特征在于，采用权利要求1至5中任一项所述的检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：
S10：将检测样本加入试剂1，得到混合溶液，并进行孵育；
S20：将试剂2加入所述混合溶液中，孵育；
S30：检测反应体系中纳米微球的凝集程度。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测样本为血清或血浆或组织液。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测反应体系中纳米微球的凝集程度包括检测所述反应体系中的浊度或透光率或荧光信号或发光信号变化。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃，时间为3-5min。
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