MXPA06004234A - Metodo de pretratamiento de la muestra y metodo de ensayo inmunologico utilizando el mismo. - Google Patents

Abstract

La invencion provee un metodo para el pretratamiento de una muestra para medir convenientemente, rapidamente y de manera precisa la cantidad total de una adiponectina presente en una muestra biologica contaminada con diversos multimeros de adiponectina; el metodo para la medicion de una muestra para el ensayo inmunologico de la cantidad total de adiponectina presente en la muestra comprende hacer reaccionar, con una muestra que contiene adiponectina, al menos uno de un agente reductor, un acido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa.

Description

METODO PE PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA Y METODO DE ENSAYO 1NMUNOLOG1CO UTILIZANDO EL MISMO CAMPO DE LA TECNICA La presente invención se refiere a un método para el pretratamiento de una muestra para ensayar convenientemente, rápidamente y de manera precisa la cantidad total de adiponectina presente en la muestra, y a un método ¡nmunológico para ensayar la cantidad total de adiponectina utilizando dicho pretratamiento.

ANTECEDENTES DE LA TECNICA La adiponectina (véase los Documentos No Patente 1 a 4) es una proteína tipo de secreción expresada específicamente y abundantemente en el tejido adiposo blanco. La adiponectina es una proteína plasmática (aproximadamente 30 kDa) que pertenece a la familia C1 q y está compuesta de 244 aminoácidos. La adiponectina posee una estructura trimérica de triple hélice, en la cual cada monómero está formado de un dominio N-terminal semejante a colágena con múltiples repetidos Gly-X-Y y un dominio globular C-terminal. También, se ha reportado que, en la sangre, una pluralidad de trímeros están asociados entre sí para formar productos de un orden superior (en adelante se pueden referir como "diversos multímeros"). En años recientes, se reportado que la adiponectina se presenta en la sangre de humano a un nivel superior de 5 a 10 µg/ L·, y ejerce una variedad de actividades fisiológicas. En particular, la adiponectina suprime el crecimiento de células de músculo liso y previene que los monocitos se adhieran a las células endoteliales. A partir estos hallazgos, se consideró que la adiponectina tenía un efecto anti-arterioesclerosis (Documento No Patente 5). Además, a partir de los hallazgos en los cuales cuando la adiponectina se administra a un ratón que padece de diabetes tipo 2 o diabetes lipoatrópica, se revierte la resistencia a insulina y los hiper-FFA (ácidos grasos libres) en sangre son mitigados, se ha reportado que la adiponectina funciona como una hormona sensible a la insulina y exhibe efectos de mejoría en la diabetes (Documento No Patente 6). También se ha reportado que los pacientes con insuficiencia renal que muestran bajos niveles de adiponectina en sangre tienen un alto riesgo de complicaciones de enfermedades cardiovasculares y muestran bajas relaciones de supervivencia, y que, en un estudio que se realizó sobre americanos nativos de la tribu Pima los cuales se sabe que desarrollan resistencia a insulina y diabetes tipo 2 en una alta incidencia, el inicio de la diabetes tipo 2 se suprime entre los sujetos que muestran un elevado nivel de adiponectina en sangre (Documento No Patente 7). Los hallazgos anteriormente mencionados sugieren la posibilidad de que la adiponectina puede ser un factor endocrino responsable de la asociación de la acumulación excesiva de grasa visceral directamente con el inicio de la resistencia a insulina. Por lo tanto, el nivel de adiponectina en sangre se considera un factor predictivo para el inicio de la diabetes o de la arterioesclerosis, y se espera que las mediciones de dichos niveles sirvan como un indicador útil de las enfermedades relacionadas con el estilo de vida. De conformidad con un método para la determinación de la cantidad total de diversos multímeros de adiponectina contenidos en una muestra de sangre, una muestra se hierve en la presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) para exponer los sitios de reconocimiento del antígeno de diversos multímeros los cuales han sido ocultados estereoestructuralmente, y luego se lleva a cabo el inmunoensayo (Documento Patente 1 ). No obstante, este método tiene algunos problemas en tanto que requiere de un aparato para el tratamiento de ebullición (100X) y también es difícil actualmente hacerlo disponible a automatización de dos pasos; por ejemplo, tratamiento de ebullición y subsecuente inmunoensayo. Un equipo denominado "equipo RIA para adiponectina de humano" (Catálogo # HADP-61 HK) está comercialmente disponible (LINCO RESEARCH, INC.). No obstante, dado que el equipo utiliza el método de dos anticuerpos/PEG, en el cual la adiponectina de ratón marcada con 125l y la adiponectina de humano se hacen competir y se utiliza un anticuerpo policlonal anti-adiponectina para la captura, se debe mencionar que el manejo de este equipo es pesado, y además, aún permanecen ciertas dudas acerca de la seguridad, especificidad, y calidad de los reactivos. Con el objeto de hacer posible que la especificidad en el método anteriormente establecido con base en la reacción de competencia continúe siendo constante, existe la necesidad de condiciones bajo las cuales la reactividad del anticuerpo policlonal anti-adiponectina en contra de la adiponectina de ratón marcada con 125l y diversos multímeros de adiponectina de humano continúen siendo constante. No obstante, como se describió anteriormente, una muestra biológica contiene diversos multímeros en un estado mezclado, y las proporciones de los multímeros respectivos varían. Por lo tanto, este equipo esencialmente implica el problema de que la adiponectina total no puede ser medida de manera precisa. Además, existe un documento de la técnica precedente que describe un anticuerpo monoclonal el cual reconoce la adiponectina no desnaturalizada que tiene una estereoestructura específica que no ha sido modificada mediante ningún tratamiento de desnaturalización con, por ejemplo, SDS o calor (véase en Documento Patente 2, la adiponectina de este tipo se refiere como adiponectina nativa en esta referencia), y un método de ensayo utilizando la anticuerpo monoclonal (Documento Patente 2). No obstante, este método tiene el problema de que la adiponectina total de una muestra biológica no se puede medir de manera precisa y contiene varios multímeros en proporciones variables debido a la forma de la adiponectina presente en una muestra (por ejemplo, el número de trímeros y condición para agregación de trímeros) afecta la reactividad de la adiponectina con el anticuerpo monoclonal anteriormente mencionado.

La forma estructural de la adiponectina ha sido investigada con respecto a una forma recombinante, aunque no en una muestra biológica. De conformidad con dicha investigación, cuando la adiponectina se trata con ditiotreitol (DTT) a pH bajo (Documento No Patente 8) o con tripsina (Documento No Patente 9), la forma estructural de la misma cambia. No obstante, no existe información acerca de los resultados de un inmunoensayo de la adiponectina sometida a dicho tratamiento. Como se describió anteriormente, con el objeto de determinar inmunológicamente el nivel de adiponectina total de una muestra, la muestra se debe someter a un proceso de pretrata miento para lograr así una reactividad uniforme entre cada una de las especies multímeras (un trímero y diversos multímeros compuestos de trímeros) y el anticuerpo empleado. No obstante, no se ha desarrollado un método conveniente cuyos dos pasos; el paso de pretratamiento y paso de inmunoensayo, puedan ser automatizados. [Documento Patente 1] Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (kokai) No. 2000-304748 [Documento Patente 2] Publicación Internacional PCT WO03/016 906 [Documento No Patente 1] Scherer P. E., et al., J. Biol. Chem. 270, 26746-27749, 1995 [Documento No Patente 2] Hu, E., et al., J. Biol. Chem. 271 , 10697- 0703, 1996 [Documento No Patente 3] Maeda, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-289, 1996 [Documento No Patente 4] Nakano, Y., et al., J. Biochem. 120, 803-812, 996 [Documento No Patente 5] Ouchi, N., et al., Circulation. 102, 1296-1301 , 2000 [Documento No Patente 6] Yamauchi, T., et al., Nature Med. 7, 941-946, 2001 [Documento No Patente 7] Lindsay, R. S., et al., Lancet, 360, 57-58, 2002 [Documento No Patente 8] Utpal B. Pajvani, et al., J. Biol. Chem. 278, 9073-9085, 2003 [Documento No Patente 9] Fruebis, J., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 98, 2005-2531, 2001 BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es proveer un método de pretratamiento de una muestra para ensayar convenientemente, rápidamente y de manera precisa la cantidad total de adiponectina en una muestra biológica la cual contiene trímeros y diversas especies multímeras compuestas de trímeros. Otro objetivo de la invención es proveer un método de ¡nmunoensayo para la determinación de la cantidad total de adiponectina mediante el uso de dicho método de pretratamiento. Los presentes inventores han hecho un investigación extensa con el objetivo de resolver los problemas anteriormente mencionados, y han encontrado que cuando los trímeros y diversos multímeros compuestos de trímeros se tratan con al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa, y luego se analiza mediante los métodos de electroforesis en gel de poliacrilamida (poliacrilamida: 2-15%; en adelante referido como PAGE (2-15%)), las bandas teñidas que se atribuyen a diversos multímeros que se presentaban antes del tratamiento desaparecieron o redujeron sus intensidades, y que, un producto convertido derivado de adiponectina (en adelante referido como un producto convertido) se detecta en una posición que corresponde a un menor peso molecular en comparación con las posiciones que corresponden a cualesquiera otras bandas que se presentaban antes del tratamiento. Los inventores también han confirmado que el producto convertido tiene reactividad con un anticuerpo anti-adiponectina, y que el producto convertido se puede medir mediante uso del anticuerpo anti-adiponectina. Con base en los hallazgos anteriormente mencionados, los presentes inventores han llevado a cabo investigación adicional, y han encontrado que cuando una muestra se trata con un agente para pretratamiento que contiene al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa, y luego se lleva a cabo e! inmunoensayo de la muestra, el nivel de adiponectina total de una muestra biológica que contiene diversos multímeros se puede determinar sin hervir la muestra junto con el agente para pretratamiento, llevando al término de la invención. Por consiguiente, la presente invención provee un método de pretratamiento de una muestra para la medición de adiponectina para ensayar inmunológicamente la cantidad total de adiponectina en la muestra, caracterizada por la adición, a una muestra que contiene adiponectina, de al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa, y permitiendo que el mismo reaccione con la muestra sin hervir junto con la muestra. La presente invención también provee un agente para pretratamiento requerido para el pretratamiento de una muestra para ensayo inmunológico de la cantidad total de adiponectina en la muestra, en donde el agente para pretratamiento contiene al menos uno de un agente reductor, un ácido o sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa; y, en uso, el agente para pretratamiento se deja reaccionar con la muestra sin llevar a cabo ebullición junto con la muestra. La presente invención también provee un método para determinar la cantidad total de adiponectina en una muestra, caracterizado por la adición, a una muestra que contiene adiponectina, al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa, permitiendo que el mismo reaccione con la muestra sin hervir junto con la muestra, y llevando a cabo un ensayo inmunológico de adiponectina. La presente invención además provee un reactivo para inmunoensayo para ensayar la cantidad total de adiponectina en una muestra, caracterizado por el reactivo incluyendo un primer reactivo y un segundo reactivo, el primer reactivo conteniendo al menos uno de un agente reductor, un ácido o sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa, y el segundo reactivo conteniendo un vehículo insoluble que porta un anticuerpo para determinación del nivel de adiponectina, en donde la muestra se deja reaccionar con el primer reactivo mientras que no se lleva a cabo ebullición. De conformidad con la presente invención, se puede determinar convenientemente, rápidamente, y de manera precisa la cantidad total de adiponectina en una muestra biológica en la cual diversas especies multímeras están presentes en el estado mezclado.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra resultados del Western blot de adiponectina en suero de humano. La figura 2 son gráficas que muestran la reactividad entre un reactivo LTIA y la adiponectina tratada con proteasa. La figura 3 son gráficas que muestran la reactividad entre un reactivo para ELISA y la adiponectina tratada con proteasa.

La figura 4 muestra los perfiles de electroforesis obtenidos mediante la tinción con CBB de adiponectina purificada derivada de suero de humano separada a través de PAGE (2-15%) en el ejemplo de referencia 3.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como se describió anteriormente, en una muestra biológica, la adiponectina se presenta en la forma de diversos multímeros, y las proporciones de multímeros respectivos no son siempre las mismas. Por lo tanto, cuando se llevó a cabo el inmunoensayo, se postuló que la reactividad entre el anticuerpo a ser empleado en la medición y cada especie de los diversos multímeros difiere de especie a especie. Específicamente, los multímeros particulares pueden ser difíciles de ensayar. Además, si se considera una situación hipotética en la cual un sistema de ensayo intercalado se lleva a cabo sobre una muestra que contiene una molécula de un hexámero y una molécula de un trímero - lo cual significa que existen 9 monómeros en la muestra - a partir de la interpretación de los resultados del ensayo, este caso puede no distinguirse de, por ejemplo, el caso en donde existen dos molécula de un trímero o el caso en donde existen dos moléculas de un hexámero. En cualquier caso, los resultados del ensayo no reflejan correctamente la adiponectina total. Incidentalmente, un método empleando un pretratamiento de multímeros degradadores mediante la ebullición de la muestra en la presencia de SDS proveerá resultados del ensayo que reflejan correctamente la adiponectina total; no obstante, el pretratamiento en este método es pesado y, además, difícilmente se encuentra para la automatización de los dos pasos de pretratamiento y el inmunoensayo subsecuente. Con base en los hallazgos anteriormente mencionados, los presentes inventores han concebido que el problema se puede resolver cuando el ensayo inmunológico se lleva a cabo después de que varios multímeros han sido convertidos, aunque no se lleva a cabo ebullición, hacia una cierta forma específica que alcanza una reactividad uniforme entre el anticuerpo utilizado en el ensayo y los diversos multímeros contenidos en la muestra y por lo tanto provee resultados del ensayo los cuales reflejan correctamente la adiponectina total. Como un método para pretratamiento que satisface el propósito anteriormente mencionado para un ensayo de diversas especies de adiponectina contenidas en una muestra, al menos un miembro seleccionado a partir de entre un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa se añade a una muestra que contiene adiponectina, y el uno o más miembros seleccionados se deja reaccionar con adiponectina sin ebullición de la muestra. Los productos convertidos obtenidos a partir de cualquiera de estos métodos de pretratamiento puedan tener la misma propiedad o diferentes propiedades de método a método. En la presente invención, los diversos multímeros pueden estar compuesto de monómeros solos, trímeros solos, o multímeros específicos. Además, los productos convertidos obtenidos a partir del preíratamiento puedan tener pesos moleculares que caen dentro de un cierto intervalo de peso molecular. En otras palabras, cualquier método de preíratamiento será útil siempre y cuando los producios convertidos tengan dicha propiedad y configuración que asegura la unión de un anticuerpo seleccionado para el establecimiento de un sistema inmunoensayo a cierta reactividad. No se impone ninguna limitación particular en la muestra biológica a ser empleada en la presente invención, siempre y cuando la muestra biológica coníenga diversos mulfímeros de adiponectina tales como fluidos corporales (por ejemplo, sangre y orina), extractos tisulares, y sobrenadantes de cultivo de células derivadas del tejido obtenidas a partir de un mamífero tal como humano, mono, cabra, oveja, conejo, ratón, rata, conejillo de Indias, etc. De estos, se prefiere la sangre (suero, plasma), debido a que provee información relacionada con la diabetes o con la arterieesclerosis y por lo tanto se ha vuelto de interés en estos días. No se impone ninguna limitación particular sobre el método para la obtención de una muestra, siempre y cuando el método no afecte a la adiponectina presente en la muestra en términos del propósito de llevar a cabo el ensayo de adiponectina total. No se impone ninguna limitación particular sobre la agente reductor que se puede utilizar en el método de preíratamiento, el agente de preíratamiento, el inmunoensayo, o el reactivo inmunoensayo de la presente invención, siempre y cuando el agente reductor exhiba reducción de energía capaz de romper el enlace disulfuro de la adiponecíina y no provea sustancialmente ningún efecto sobre el inmunoensayo. Por ejemplo, se puede hacer mención de los compuestos tiol tales como DTT (ditiotreitol), 2-mercaptoetanol, cisteamina, y tioglicerol; compuestos de hidruro de boro; y fosfinas. La concentración a la cual se utiliza el reactivo se determina apropiadamente de manera que se puede obtener un producto convertido de interés. Por ejemplo, cuando se utiliza un compuesto tiol, preferiblemente se utiliza DTT o 2-mercaptoetano(. El tratamiento con un agente reductor preferiblemente se lleva a cabo de 4 a 60°C por 5 a 24 horas. No se impone ninguna limitación particular sobre el ácido o una sal del mismo, y cualquier ácido orgánico o ácido inorgánico se puede emplear siempre y cuando éste pueda romper el enlace entre diversos multímeros de adiponectina. Por ejemplo, se pueden emplear ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido tartárico, y ácido oxálico. La concentración a la cual se utiliza el ácido o una sal del mismo se selecciona apropiadamente de manera que se pueda obtener un producto convertido de interés. Preferiblemente los intervalos de concentración de 1 a 1000 mM, más preferiblemente de 10 a 200 mM. El ácido o una sal del mismo también se puede utilizar como un regulador de pH, y en tal caso, el pH del regulador de pH preferiblemente es 4 o menos. El tratamiento con el ácido o con una sal del mismo preferiblemente se lleva a cabo de 4 a 60°C por 5 a 24 horas.

No se impone ninguna limitación particular sobre la elección del agente tensioactivo, y iónico, no iónico, y se pueden emplear otros tipos de agentes tensioactivos siempre y cuando el agente tensioactivo pueda actuar sobre una variedad de multímeros, pueda transformar diferentes formas de adiponectina hacia dicha forma que permite la medición de la cantidad de adiponectina para inmunoensayo, y pueda mantener la reactividad entre la adiponectina y un anticuerpo específico a adiponectina. En particular, se prefieren los agentes tensioactivos aniónicos, y específicamente, los sulfatas de alquilo tales como dodecilsulfato y se prefieren más los sultanatos de alquilbenceno tales como sultanatos de dodecilbenceno. Estos agentes tensioactivos se pueden utilizar particularmente o en combinación. La concentración a la cual se utiliza dicho agente tensioactivo generalmente tiene un intervalo de 0.01 a 10%, pero se prefiere más el intervalo de 0.1 a 5%. Cuando se utiliza el agente tensioactivo en combinación con un tratamiento con un ácido o una sal del mismo, se obtendrán efectos incluso más preferidos. No se impone ninguna limitación particular sobre la proteasa siempre y cuando ésta pueda actuar sobre una variedad de multímeros, y pueda transformar diferentes formas de adiponectina hacia dicha forma que permite la medición de la adiponectina total en un inmunoensayo. La concentración a la cual se utiliza la proteasa se puede determinar apropiadamente de manera que se puede obtener un producto convertido de interés. No se impone ninguna limitación particular sobre el origen de la proteasa, y por lo tanto se pueden emplear cualesquiera especies de proteasa derivadas a partir de microorganismos, animales y plantas. Preferiblemente, las especies de proteasa derivadas a partir de microorganismos, tales como aquellos que pertenecen al género Bacillus, género Streptomyces, o género Aspergillus. Los ejemplos de proteasas derivadas de Bacillus comercialmente disponibles incluyen Proteasa tipo X (Sigma Co.); Protina AC, Protina PC (estas dos son ambas productos de Daiwa Kasei); Proteasa S "Amano" (Amano Enzyme Co.); y Sumizyme CP (Shin Nihon Chemical Co., Ltd.). Los ejemplos de proteasas derivadas de Streptomyces comercialmente disponibles incluyen Proteasa tipo XIV (Sigma), Pronasa (Rosche), y Actinasa AS (Kaken Seiyaku). Los ejemplos de proteasas derivadas de Aspergillus comercialmente disponibles incluyen Proteasa A "Amano", Proteasa P "Amano", y Umamizyme (todas estas son productos de Amano Enzyme); y Sumizyme MP (Shin Nihon Chemical Co., Ltd.). Estas proteasas pueden ser aquellas obtenidas a través de la tecnología de recombinación génica, y se pueden haber sometido a modificación química. Las condiciones de tratamiento bajo las cuales se trata una muestra biológica con proteasa difieren dependiendo de la identidad de la proteasa empleada. Preferiblemente el tratamiento se lleva a cabo en un regulador de pH con fosfato, regulador de pH Tris, regulador de pH de Good, o un regulador de pH similar de 4 a 60°C por 5 a 24 horas. La concentración de la proteasa empleada en el tratamiento se determina en consideración de la temperatura de reacción, tiempo de reacción, etc., y generalmente tiene un intervalo de 0.01 a 100 mg/ml. No se impone ninguna limitación particular sobre la manera en la cual se utilizan los artículos respectivos del agente reductor anteriormente mencionado, ácido o una sal del mismo, agente tensioactivo, y proteasa. Estos se pueden utilizar particularmente o en combinación. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo los siguientes procesos: un agente reductor o un ácido se deja reaccionar con una muestra que contiene adiponectina, y subsecuentemente, la mezcla de reacción se trata con proteasa. Además, durante el uso de estos artículos de agentes reductores, ácidos y sales de los mismos, agentes tensioactivos, y proteasa, también se pueden añadir compuestos adicionales para propósitos de la regulación del ambiente en el cual los artículos anteriormente mencionados actúan sobre la adiponectina o mejorando la estabilidad de almacenamiento de los artículos anteriormente mencionados. Los ejemplos de dichos componentes adicionales incluyen componentes del regulador de pH tales como regulador de pH con fosfato, regulador de pH con glicerina, regulador de pH con Tris, y regulador de pH de Good; agentes tensioactivos los cuales no actúan sobre diversos multímeros; albúmina de suero de bovino (BSA); sacarosa; conservadores (tal como azida de sodio); y reguladores de la concentración de sal (tal como cloruro de sodio). No se impone ninguna limitación particular sobre la elección del anticuerpo a ser empleado en el inmunoensayo de la presente invención, siempre y cuando se pueda medir la adiponectina total después de que al menos un miembro seleccionado de entre un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa se deje reaccionar con diversos multímeros de adiponectina sin ningún tratamiento de ebullición. De dichas especies de anticuerpo, un anticuerpo policlonal incluye una pluralidad de anticuerpos capaces de unirse específicamente a una pluralidad de epítopes presentes sobre la adiponectina transformada hacia una cierta forma estructural. El anticuerpo policlonal se puede obtener a través de la inmunización de una especie animal apropiada (tal como conejo, cabra, oveja, caballo, vaca, ratón, y rata) con adiponectina a través de un método conocido. Mientras tanto, un anticuerpo monoclonal puede ser uno o más anticuerpos monoclonales diferentes capaces de unirse específicamente a un adiponectina transformada hacia una cierta forma estructural. Dichos anticuerpos monoclonales se pueden preparar a través de un método apropiado, o una combinación de métodos conocidos en la tecnología de fusión celular, para establecer así líneas celulares de fusión capaces de producir anticuerpos monoclonales, y a través del uso de dichas líneas celulares. Además, los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a la adiponectina que ha sido transformada hacia una cierta forma estructural pueden estar disponibles en el mercado y utilizarse en la presente invención. Dependiendo de la forma estructural de la adiponectina, se pueden utilizar los siguientes anticuerpos, por ejemplo: anticuerpo de cabra a Acrp30 (Cosmo Bio Co., Ltd., GT Co.), de conejo hu adiponectin-MoAb (Cosmo Bio Co., Chemicon Co.), hu Acrp30-MoAb (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Co.), de ratón a hu Adiponectina MoAb (Cosmo Bio Co., Chemicon Co.), anticuerpo monoclonal anti-ACRP30 de humano (AX773, AX741 , Ne, Na, Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), etc. Como el antígeno a ser utilizado para obtener un anticuerpo empleado en la presente invención, por lo tanto se puede utilizar adiponectina que ha sido purificada y aislada a partir de una muestra a través de un método conocido. Por lo tanto alternativamente se puede utilizar adiponectina que se ha sometido a un tratamiento, pero no a tratamiento de ebullición, con una solución de pretratamiento que contiene al menos un miembro seleccionado de entre un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa. El antígeno se puede preparar en la forma de una proteína recombinante a través del uso de una tecnología convencional de ingeniería genética con base en la información de secuencia de nucleótidos de la proteína. El ¡nmunoensayo de la presente invención se basa en un método el cual incluye el siguientes proceso: permitir que un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la adiponectina que ha sido transformada hacia una cierta forma estructural se una a un vehículo insoluble, para capturar así a la adiponectina transformada, por medio del cual se determina la presencia o ausencia de adiponectina en la muestra (cualitativamente) o el nivel de adiponectina se determina cuantitativamente. Los ejemplos específicos del inmunoensayo incluyen LTIA (inmunoensayo turbidimétrico en látex), ELISA (inmunoensayo enzimático), CLEIA (inmunoensayo enzimático quimioluminiscente), RIA (radioinmunoensayo), etc. De éstos, LTIA es un método en el cual un vehículo insoluble que porta un anticuerpo capaz de unirse a la adiponectina que ha sido transformada hacia una cierta forma estructural se mezcla con adiponectina que ha sido transformada hacia una cierta forma estructural, para inducir entrecruzamiento (agregación) del vehículo insoluble mediante la mediación de la adiponectina transformada, y por lo tanto la turbidez que resulta se determina ópticamente. De conformidad con este método, se puede determinar la presencia o ausencia de adiponectina (cualitativamente), o el nivel de adiponectina se puede determinar cuantitativamente. Este método es benéfico puesto que provee una medición simple, rápida, y precisa de la adiponectina. El vehículo insoluble a ser empleado en la presente invención puede ser un vehículo orgánico insoluble el cual se ha empleado en reactivos convencionales de inmunoensayo y el cual se puede producir industrialmente a gran escala. En LTIA, se prefieren las partículas de látex de poliestireno, puesto que exhiben una excelente absorción del anticuerpo y mantienen la actividad biológica estable por un largo período de tiempo. En ELISA, se prefiere una microplaca de 96 pozos elaborada, por ejemplo, de poliestireno. Se conocen varios métodos para la unión de un anticuerpo a dicho vehículo insoluble, y se pueden emplear cualquiera de dichos métodos conocidos en la presente invención como se desee. Por ejemplo, un anticuerpo se puede unir (sensibilizado) a través de la adsorción física a la superficie de un vehículo insoluble. Alternativamente, la superficie de un vehículo insoluble que tiene un grupo funcional se puede sensibilizar de manera eficiente con un anticuerpo a través de un método de unión física o química. No se impone ninguna limitación particular sobre las condiciones de reacción bajo las cuales ocurre la reacción de un vehículo insoluble que porta el anticuerpo y la adiponectina que ha sido transformada hacia una cierta forma estructural, siempre y cuando ocurra una reacción antígeno-anticuerpo bajo las condiciones de reacción. No se impuso ninguna limitación particular sobre la mezcla de reacción, siempre y cuando la mezcla de reacción permita que proceda la reacción antígeno-anticuerpo con la adiponectina que se ha sometido a pretratamiento para que tenga una cierta forma estructural. Por ejemplo, una mezcla de reacción puede contener un componente regulador de pH para ajusfar el pH (por ejemplo, regulador de pH con fosfato, regulador de pH con glicina, regulador de pH Tris, regulador de pH de Good); un agente tensioactivo, cloruro de sodio, o una sustancia similar para prevenir las reacciones no específicas; un estabilizante tal como albúmina de suero de bovino (BSA); y sacarosa, polímeros de polisacárído o una sustancia similar. La mezcla de reacción también puede contener, además de las sustancias anteriormente mencionadas las cuales controlan la reactividad, polisacárído soluble en agua tal como dextrán; un neutralizador para neutralizar el agente reductor o ácido contenido en el agente para tratamiento anteriormente mencionado; o un agente inactivador para proteasa, de conformidad con las necesidades. Los métodos de detección ejemplares que se llevan a cabo en LTIA o ELISA anteriormente mencionados incluyen el método descrito a continuación. No se impuso ninguna limitación particular sobre el método para la determinación del grado de agregación del vehículo insoluble en LTIA. Por ejemplo, con el objeto de evaluar cualitativamente o semi-cualitativamente la agregación, se puede determinar el grado de agregación visualmente a través de la comparación en la turbidez entre las muestras que tienen concentraciones conocidas y la muestra blanco. Con el objeto de evaluar la agregación cuantitativamente, preferiblemente, se emplea la medición óptica, a partir del punto de vista de conveniencia y precisión. La medición óptica de la agregación se puede llevar a cabo a través de un método conocido. Los ejemplos específicos de la medición óptica los cuales se pueden emplear en la presente invención incluyen la medición denominada turbidimétrica (se observa la formación de masa agregada como un incremento en la turbidez), medición de la distribución del tamaño de la partícula (se observa la formación de masa agregada como un cambio en la distribución del tamaño de la partícula o en el tamaño medio de la partícula), e integrando el ensayo turbidimótrico en esfera (se mide el cambio en la radiación diseminada hacia adelante con una esfera integradora, y la relación en la intensidad con respecto a la radiación transmitida). Cuando se lleva a cabo el ELISA, no se impuso ninguna limitación particular sobre el método para ensayar un producto de reacción entre un sustrato y una enzima, con base en la actividad enzimática del anticuerpo marcado con enzima. Específicamente, se puede leer la longitud de onda intrínseca al producto de reacción enzimática; por ejemplo, la absorbancia a 492 nm, se puede leer con un lector de microplaca de 96 pozos.

EJEMPLOS A continuación se describirá la presente invención con detalle a manera de ejemplos, los cuales no deben considerarse como limitantes de la invención. Los reactivos materiales empleados en los ejemplos y los ejemplos prueba son como sigue.

Reactivos y materiales a. Solución para lavado de resina para unión al anticuerpo (en adelante referida como solución de lavado): NaHC03 0.1M-NaOH (pH 8.3) que contiene NaCI 0.5 ; b. Solución para elución de la resina para unión al anticuerpo (en adelante referida como solución para elución): Glicina 0.1 M-HCI (pH 2.5); c. Solución para neutralización de la resina para unión al anticuerpo (en adelante referida como solución para neutralización): Tris 2 .HCI (pH 8.0); d. Látex: látex de partículas de poliestireno (tamaño medio de la partícula: 0.2 µ?t?, contenido sólido: 10% (p/v), producto de SEKISUI CHEMICAL CO., LTD.); e. Regulador de pH para la preparación del látex que porta el anticuerpo: Tris 20 mM-HCI (pH 8.0); f. Regulador de pH para bloqueo: Tris 20 mM-HCI (pH 8.0) que contiene 2% de BSA; g. Regulador de pH LTIA (R1): Tris 20 mM-HCI (pH 8.0) que contiene 0.15% de BSA y NaCI 0. 5 M; h. Placa para ELISA: microplaca de 96 pozos (producto de NUNC); i. Solución para sensibilización del anticuerpo para ELISA: PBS (pH 7.4); j. Regulador de pH para ELISA: PBS (pH 7.4) que contiene 1% de BSA y 0.1% de Tween 20; k. Anticuerpo de cabra a Acrp30 de humano: producto de Cosmo Bio Co., Ltd., GT, No. de catálogo 421065 (producto comercial del anticuerpo policlonal anti-adiponectina de humano); I. Anticuerpo monoclonal Acrp30 de humano: producto de Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories, código del producto: A12820 (producto comercial del anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano); m. Anticuerpo marcado con HRP IgG de cabra a de conejo: Cosmo Bio Co., Ltd., producto de Capple; n. Solución de lavado para ELISA: PBS (pH 7.4) que contiene 0.05% de Tween 20; y o. Regulador de pH 2 para ELISA: PBS (pH 7.4) que contiene 1 % de BSA y 0.05% de Tween 20.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Preparación de adiponectina globular de ratón en E. coli recombinante (rMgAd) Una secuencia del dominio globular (que corresponde a los residuos 104-247) de la secuencia génica de adiponectina de ratón (# de acceso NCBI U37222) se insertó entre BamHI y HindIII del vector pQE30 que contiene la marca 6xHis, y luego introducirla dentro de E. coli. La adiponectina globular recombinante de ratón (rMgAd) expresada en E. coli se purificó a través del siguiente proceso. Específicamente, una fracción soluble de E. coli se aplicó a agarosa Ni-NTA (producto de QIAGEN), y se permitió que rMgAd se uniera a ésta por 16 horas a 4°C, seguida por elución serial con imidazol. La fracción que contenía adiponectina se recolectó y luego se dializó con PBS por tres días. El contenido de proteína de la rMgAd resultante se determinó por medio de un equipo para ensayo de proteína Bio-Rad DC.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2 Preparación de anticuerpo anti-rMgAd La rMgAd (50 µg) obtenida en el ejemplo de referencia 1 anteriormente mencionado y la misma cantidad de adyuvante completo de Freund se mezclaron juntos, y dos conejos se inmunizaron con la mezcla seis veces, a intervalos de dos semanas, para producir antisuero. El anticuerpo específico (IgG) presente en el antisuero se purificó a través de un método convencional mediante el uso de la resina Proteína A (anticuerpo anti-rMgAd).

EJEMPLO DE REFERENCIA 3 Purificación de adiponectina (mAd) derivada a partir de sangre de humano El anticuerpo anti-rMgAd (500 mg) preparado en el ejemplo de referencia 2 anteriormente mencionado se unió a Sepharose 4B activada por CNBr (Amersham Bioscience) (50 mL), para prepararas! resina Sepharose 4B unida a anticuerpo anti-rMgAd. Se añadió suero de humano (2.5 L) al anticuerpo anti-rMgAd unido a la resina Sepharose 4B, y la resina se lavó extensivamente con la solución de lavado. La solución de elución se utilizó para eluir una fracción de adiponectina en suero de humano (mAd), y se añadió la solución para neutralización a la fracción eluida en un volumen que corresponde a 1/10 de la fracción, para llevar a cabo la neutralización.

Posteriormente, la fracción neutralizada se añadió a la resina Proteína A, y la fracción que contenía los componentes los cuales no se adsorben a la resina Proteína A se recolectó como mAd purificada. El contenido de adiponectina se determinó por medio de un "equipo de ELISA para adiponectina de humano" (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).

EJEMPLO PE REFERENCIA 4 Producción de anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano La mAd purificada (20 µg) obtenida en el ejemplo de referencia 3 anteriormente mencionado se mezcló con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund, y dos ratones se inmunizaron con la mezcla tres o cuatro veces, a intervalos de dos semanas. Posteriormente la mezcla se administró de nuevo a los ratones tres días antes de la fusión celular. Las células de bazo se recolectaron a partir de los ratones inmunizados, y se llevó a cabo la fusión celular con células de mieloma P3U1 a través de un método convencional utilizando polietilenglicol. Las células fusionadas las cuales producen anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano se seleccionaron a través de un método conocido. Específicamente, los pozos que fueron altamente reactivos con mAd se seleccionaron a través de ELISA, y se llevó a cabo la dilución limitante. Las células fusionadas seleccionadas se administraron intraperitonealmente a los ratones los cuales habían sido tratados con pristano, y los ascitos se recolectaron como anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano. La purificación del anticuerpo específico (IgG) a partir de los ascitos se llevó a cabo a través de un método convencional mediante el uso de la resina Proteína A. Por lo tanto, se obtuvieron las células fusionadas que producen once anticuerpos monoclonales anti-adiponectina de humano así como dichos anticuerpos monoclonales (números de identificación 64401 a 64411).

EJEMPLO DE REFERENCIA 5 Preparación de látex para sensibilización del anticuerpo Una solución de látex (1 volumen) y un regulador de pH para preparación del látex que porta el anticuerpo (4 volúmenes) se mezclaron, para preparar así una solución diluida del látex. Cada uno de los anticuerpos anti-rMgAd y un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401) se diluyeron a 1 mg/mL con el regulador de pH para preparación, para preparar así una solución diluida del anticuerpo. Cada una de las dos soluciones resultantes de anticuerpo diluido (1 volumen) se añadió a y se mezcló con la solución diluida de látex anteriormente preparada (1 volumen) bajo agitación. Después de una agitación adicional de la mezcla resultante, se añadió regulador de pH para bloqueo (2 volúmenes), seguido por agitación. Por lo tanto, se obtuvieron una solución para almacenamiento de látex que portaba anti-rMgAd y una solución para almacenamiento de látex que portaba el anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401).

EJEMPLO DE PRUEBA 1 Análisis del multímero de adiponectina en suero de humano a través de Western blot i Cada una de las muestras de suero (0.2 µ?) obtenidas a partir de ocho sujetos sanos se sometieron a PAGE (2 a 15%). El material aislado se transfirió sobre una membrana de PVDF a través de un blot semi-seco. La membrana se sometió a inmunotinción. El procedimiento de inmunotinción es como sigue. La membrana con el material transferido se sometió a bloqueo con solución de PBS (pH 7.4) que contenía 5% de leche descremada y 0.1% de NaN3. La membrana resultante se lavó con solución de PBS (pH 7.4) que contenía 0.1% de Tween 20, y la membrana así lavada se dejó reaccionar con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano comercialmente disponible (hu Acrp30-MoAb; producto de Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories) (1 µg/mL) a temperatura ambiente por 1 hora. Subsecuentemente, la membrana así reaccionada se lavó extensivamente con solución de PBS (pH 7.4) que contenía 0.1 % de Tween 20. A través del uso del equipo Vector ABC (para ratón) y un equipo con sustrato DAB (FUNAKOSI), se desarrolló el color. Como un resultado, se detectaron tres bandas principales teñidas, indicando que varios multímeros de la adiponectina presente en la sangre se clasificarán principalmente dentro de tres tipos (figura 1 ). Como se identifica en los perfiles de electroforesis de la figura 1 , los tipos de adiponectina que corresponden a estas tres bandas teñidas fueron denominados fracciones "HMW-Ad", "MMW-Ad", y "LMW-Ad" de la parte superior (alto peso molecular) hacia la parte inferior.

EJEMPLO 1 Procesamiento de mAd purificada a través de un agente reductor, ácido o sal del mismo, o proteasa La mAd purificada obtenida en el ejemplo de referencia 3 se trató a través del uso de un agente reductor, un ácido o sales del mismo, o una proteasa, particularmente o en combinación. En cada caso, la mAd purificada tratada se observó para cualquier cambio en la forma. 1 ) Procesamiento a través de un agente reductor o un ácido Se prepararon diversos reguladores de pH (50 mM cada uno) tales como regulador de pH con Tris-HCI (pH 8.5) y reguladores de pH con acetato de sodio (pH 3.0 y pH 4.0) de manera que contenían mAd purificada. Bajo la presencia o ausencia de un agente reductor (DTT 10 mM), las muestras se calentaron a 37°C por 60 minutos. Las mezclas así tratadas se sometieron a PAGE (2 a 15%), seguido por tinción de proteína mediante el uso de CBB. Una imagen teñida de una muestra que contenía Tris-HCI (pH 8.5) sin DTT (condición de procesamiento 1) se empleó como un control, y se observó el incremento o disminución en la intensidad de las bandas que correspondían a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, y LMW-Ad bajo las condiciones de procesamiento respectivas. Además, se observa la producción de las bandas atribuida a los productos recientemente convertidos (cuadro 1). Como resultado, bajo las condiciones en donde el agente reductor no se añadió y los valores de pH de regulador de pH con acetato de sodio fueron de 3.0 y 4.0 (condiciones de procesamiento 3 y 5), la banda teñida que correspondía a la fracción HMW-Ad desapareció y la intensidad de la banda teñida que correspondía a la fracción MMW-Ad se incrementó. Mientras tanto, bajo las condiciones en donde se añadió el agente reductor y los valores de pH del regulador de pH con acetato de sodio fueron 3.0 y 4.0 (condiciones de procesamiento 4 y 6), las bandas teñidas que correspondían a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, y LMW-Ad desaparecieron y se observó una nueva banda atribuida a un producto convertido derivado de la fracción. Bajo la condición de procesamiento 2 (Tris-HCI, pH 8.5), se observó una nueva banda atribuida a un producto convertido derivado de cada fracción, pero una banda atribuida a una fracción HMW-Ad no desapareció completamente. A partir de los resultados anteriormente descritos, cuando la adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad, y LMW-Ad) se trató con un agente reductor, un ácido, o una sal del mismo, se confirmó que se produjo un nuevo producto convertido a partir de la adiponectina multimérica. Se asumió que el producto así producido convertido era un trímero de adiponectina.

CUADRO 1 (+): disminución, (++): sin cambio, (+++): incremento, o producción del producto convertido (-): desaparición, o sin producción del producto convertido 2) Procesamiento con proteasa La mAd purificada y una proteasa comercialmente disponible se añadieron al regulador de pH con fosfato 50 mM (pH 8.0), seguido por calentamiento a 37°C por 60 minutos. La mezcla así tratada se sometió a PAGE (2 a 15%), seguido por tinción de la proteína con CBB. Una imagen teñida de Tris-HCI (pH 8.5) que no contenía DTT (condición de procesamiento ) se empleó como un control, y se observó el incremento o la disminución en la intensidad de las bandas que correspondían a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, y LMW-Ad bajo cada una de las condiciones para procesamiento.

Además, se observó la producción de nuevas bandas atribuida a los productos convertidos (cuadro 2). A través del procesamiento bajo cualesquiera de las condiciones de procesamiento 7 a 9, todas las bandas teñidas que correspondían a las fracciones H W-Ad, MMW-Ad, y LMW-Ad desaparecieron y se observó una nueva banda teñida atribuida a los productos convertidos derivados de estas fracciones en una región de bajo peso molecular. A través del procesamiento bajo cualesquiera de las condiciones 10 a 12, las bandas teñidas que correspondían a las fracciones LMW-Ad y MMW-Ad desaparecieron y se observaron nuevas bandas atribuidas a los productos convertidos derivados de estas fracciones en las regiones de bajo peso molecular. En este caso, no se observó ningún cambio para las bandas teñidas atribuidas a una fracción HMW-Ad. A partir de los resultados anteriormente descritos, cuando la adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad, y LMW-Ad) se trató con proteasa, se confirmó un nuevo producto convertido producido a partir de la adiponectina multimérica. Las posiciones en las cuales se detectaron las bandas de estos productos convertidos mediante PAGE (2 a 15%) tienen un intervalo de 30 a 42 kDa, aunque de alguna manera las posiciones cambiaron dependiendo del tipo de proteasa empleada. Además, se encontró que las proteasas empleadas en las condiciones de procesamiento 10 a 12 eran capaces de convertir todas las fracciones hacia productos novedosos a través de un procedimiento incluyendo él pretratamiento de la adiponectina mulíimérica con un ácido o una sal del mismo para convertir la fracción HMW-Ad a la fracción MMW-Ad, seguido por el tratamiento con las proteasas respectivas.

CUADRO 2 disminución, (++): sin cambio, (+++): incremento, producción del producto convertido {-): desaparición, o sin producción del producto convertido EJEMPLO 2 Reactividad del reactivo de látex con las especies de adiponectina La mAd purificada tratada con proteasa se diluyó con regulador de pH para ELISA para obtener muestras 5 veces y 25 veces diluidas. Cada una de las soluciones para almacenamiento de látex preparadas en el ejemplo de referencia 5 se diluyeron 10 veces con regulador de pH para preparación de látex que portaba el anticuerpo, y la solución diluida resultante se empleó como el reactivo 2. Las muestras (10 µ?) se analizaron utilizando el reactivo 1 (regulador de pH LTIA (R1)) (100 µ?) y el reactivo 2 (100 µ?) con analizador bioquímico automático Hitachi 7170 (Hitachi, Ltd.) bajo las siguientes condiciones: longitud de onda: 570 nm; puntos de medición: 18 a 34. Los resultados se muestran en la figura 2. Para ambos casos del reactivo de látex con el anticuerpo anti-rMgAd y el reactivo de látex con el anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401), la absorbancia varía de conformidad con la concentración de la adiponectina de suero de humano tratada con Protina AC o con Proteasa tipo X. Por consiguiente, se encontró que la Protina AC y la Proteasa tipo X eran capaces de convertir los multímeros de adiponectina hacia nuevos productos que retienen los sitios de reconocimiento del anticuerpo, los cuales se pueden reconocer por el anticuerpo anti-rMgAd y el anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401). Por lo tanto, se ha confirmado que estas proteasas se pueden utilizar en el pretratamiento para la medición de la adiponectina total en una muestra biológica.

EJEMPLO 3 Reactividad del reactivo para ELISA con especies de adiponectina Un anticuerpo de cabra Acrp30 de humanoy un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401) se diluyó cada uno a 1 µg mL con una solución para sensibilización de anticuerpo para ELISA. Subsecuentemente, una placa para ELISA se sensibilizó con la mezcla resultante, seguido por el bloqueo con un regulador de pH para ELISA. La mAd tratada con proteasa se diluyó con el regulador de pH para ELISA para obtener muestras 2 veces, 20 veces, y 200 veces diluidas. Las muestras así obtenidas se hicieron reaccionar en la placa para ELISA a temperatura ambiente por 1 hora. La placa se lavó con el regulador de pH para ELISA, y posteriormente se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 1 hora con una solución de anticuerpo anti-rMgAd la cual había sido diluida 10,000 veces con el regulador de pH para ELISA. Subsecuentemente, la placa se lavó con el regulador de pH para ELISA, y luego se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 1 hora con una solución de anticuerpo marcado con HRP de cabra a IgG de conejo la cual había sido diluida 1 ,000 veces con el regulador de pH para ELISA. La placa se lavó con el regulador de pH para ELISA, y se dejó desarrollar el color a través de reacción enzimática con HRP sin tetrametilbencidina y se añadió a la mezcla de reacción peróxido de hidrógeno-ácido sulfúrico 2N. Se midió la absorbancia a 450 nm. Los resultados de las mediciones se muestran en la figura 3. Cuando se utilizó una combinación del anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401) y el anticuerpo anti-rMgAd, o una combinación del anticuerpo de cabra a Acrp30 de humano y el anticuerpo anti-rMgAd para ELISA, la absorbancia varió de conformidad con la concentración de la adiponectina de suero de humano tratada con Protina AC o con Proteasa tipo X. Por consiguiente, se encontró que la Protina AC y la Proteasa tipo X eran capaces de convertir los multímero de adiponectina hacia nuevos productos que retienen los sitios de reconocimiento del anticuerpo los cuales se pueden reconocer por el anticuerpo de cabra ce Acrp30 de humano, anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64401), y el anticuerpo anti-rMgAd. Por lo tanto, se ha confirmado que estas proteasas se pueden utilizar en el pretratamiento para la medición de la adiponectina total en una muestra biológica.

EJEMPLO DE PRUEBA 2 Análisis de los multímeros de adiponectina derivados a partir de sangre de humano La mAd purificada se preparó recientemente de conformidad con el ejemplo de referencia 3, y se sometió a PAGE (2 a 15%), seguido por tinción de proteína con Coomassie azul brillante (CBB) (figura 4). Subsecuentemente, el producto se sometió a inmunotinción con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano comercialmente disponible (hu Acrp30-MoAb) de manera similar a aquella empleada en el ejemplo prueba 1 , y se analizó la imagen teñida. Los resultados indicaron que el multímero de adiponectina purificada partir de suero de humano tenía al menos cuatro tipos de adiponectina, que consistía de tres tipos observados en el ejemplo prueba 1 y un tipo detectado en una pequeña cantidad en este ejemplo prueba. Como se identificó en los perfiles de electroforesis de la figura 1, los tipos de adiponectina que corresponden a estas cuatro bandas teñidas con CBB fueron denominados las fracciones "HMW-Ad", " MW-Ad", "LMW-Ad" y "ULMW-Ad" de la parte superior (alto peso molecular) hacia la parte inferior.

EJEMPLO 4 Procesamientos de la mAd purificada mediante un agente reductor, ácido o una sal del mismo, un agente tensíoactivo, o proteasa La mAd purificada analizada en el ejemplo prueba 2 se trató mediante el uso de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensíoactivo, o una proteasa, particularmente o en combinación. La mAd así tratada, purificada, se observó para cualquier cambio en la forma estructural. 1 ) Combinación de un agente reductor y un ácido Se prepararon varios regulador de pH (100 mM cada uno) tales como regulador de pH Tris-HCI (pH 8.5) y reguladores de pH con citrato de sodio (pH 3.0 a pH 6.0) de manera que contenían mAd purificada. Bajo la presencia o ausencia de un agente reductor (2-mercaptoetanol 10 mM), dichos reguladores de pH se calentaron a 37°C por 30 minutos. Las mezclas así obtenidas se sometieron a PAGE (2 a 15%), seguido por tinción de proteína a través del uso del CBB. Una imagen teñida de una muestra que contenía Tris-HCI (pH 8.5) sin 2-mercaptoetanol (condición de procesamiento 13) se empleó como un control, y se observaron los incrementos o disminuciones en la intensidad de las bandas que correspondían a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad, y ULMW-Ad bajo las condiciones de procesamiento respectivas. Además, se observó la producción de bandas atribuidas a nuevos productos convertidos (cuadro 3). Como resultado, cuando no se añadió ningún agente reductor y el pH del regulador de pH con citrato de sodio fue de 4.0 o mayor (condiciones de procesamiento 15, 17, y 19), ya que el regulador de pH con citrato de sodio es acidificante, las bandas teñidas que correspondían a una fracción HMW-Ad tendieron a desaparecer, y en lugar de esto, se incrementó la intensidad de las bandas de una fracción MMW-Ad. Bajo las condiciones de procesamiento 21 (pH 3.0), se observó una nueva banda atribuida a un producto convertido el cual migró a una distancia mayor que la banda de ULMW-Ad. Mientras tanto, bajo las condiciones 14 y 16, en donde se añadió un agente reductor y el pH fue de 6.0 o mayor, las bandas teñidas atribuidas a HMW-Ad permanecieron presentes, mientras que bajo las condiciones de procesamiento 18 a 20 (pH 5.0 y 4.0), las bandas teñidas correspondieron a todas las fracciones desaparecidas, y además, se observó una nueva banda ancha en una posición que es casi la misma que la banda de ULMW-Ad. Bajo las condiciones de procesamiento 22 (pH 3.0), se observó una nueva banda ancha atribuida a los productos convertidos en una posición que es casi la misma que aquella observada bajo las condiciones de procesamiento 21. A partir de los resultados anteriormente mencionados, cuando la adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-AD, y ULMW-Ad) se trató con un agente reductor y un ácido o una sal del mismo, se confirmó la producción de un nuevo producto convertido. Además, se supuso que los productos convertidos producidos mediante las condiciones de procesamiento 21 fueron dímeros de la adiponectina, los productos convertidos producidos mediante las condiciones de procesamiento que incluían la adición de un agente reductor (condiciones de procesamiento 14, 16, 18, y 20) fueron trímeros de la adiponectina, y los productos convertidos producidos mediante las condiciones de procesamiento 22 fueron monómeros de la adiponectina. Las bandas teñidas se extrajeron, y se analizaron para confirmar que la ULMW-Ad fue un trímero de adiponectina y la LMW-Ad fue un trímero de adiponectina unido mediante albúmina.

CUADRO 3 (+): disminución, (++): sin cambio, (+++): incremento, o producción del producto convertido (-): desaparición, o sin producción del producto convertido 2) Procesamiento con proteasa La mAd purificada y una proteasa comercialmente disponible se añadieron a regulador de pH con fosfato 50 mM (pH 8. 0) (a la concentración final de 1 mg/ml para cada uno), y la mezcla resultante se calentó a 37°C por 60 minutos. La mezcla así tratada se sometió a PAGE (2 a 5%), seguido por tinción de proteína a través del uso del CBB. Subsecuentemente, una imagen teñida de Tris-HCI (pH 8.5) que no contenía DTT (condición de procesamiento 1 ) se empleó como un control, y se observó el incremento o disminución en la intensidad de las bandas que correspondían a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad, y ULMW-Ad bajo condiciones de procesamiento respectivas. Además, se observó la producción de nuevas bandas atribuidas a los productos convertidos (cuadro 4). Bajo cualquiera de las condiciones de procesamiento 23 a 25, todas las bandas teñidas que correspondían a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad, y ULMW-Ad desaparecieron y se observó una nueva banda teñida atribuida a los productos convertidos derivados a partir de estas fracciones en una región de bajo peso molecular. A través del procesamiento bajo cualesquiera de las condiciones de procesamiento 26 a 28, las bandas teñidas que correspondían a las fracciones ULMW-Ad, LMW-Ad, y MMW-Ad desaparecieron y se observaron nuevas bandas atribuidas a los productos de conversión derivados a partir de estas fracciones en las regiones de bajo peso molecular. En este caso, no se observó ningún cambio para las bandas teñidas atribuidas a una fracción HMW-Ad.

A partir de los resultados anteriormente descritos, cuando la adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad, y ULMW-Ad) se trató con proteasa, se confirmó un nuevo producto convertido producido a partir de la adiponectina multimérica. Las posiciones en las cuales se detectaron las bandas de estos productos convertidos mediante PAGE (2 a 15%) tienen un intervalo de 30 a 42 kDa, a partir de las posiciones en donde de alguna manera cambiaron dependiendo del tipo de proteasa empleada. Las bandas teñidas se extrajeron, y se sometieron a análisis de aminoácidos, el cual reveló que estos productos convertidos eran adiponectina globular. Además, las proteasas empleadas bajo las condiciones de procesamiento 26 a 28 se encontraron capaces de convertir todas las fracciones hacia productos nuevos a través del procedimiento que incluía el pretratamiento de la adiponectina multimérica con un ácido o una sal del mismo para convertir la fracción HMW-Ad, seguido por el tratamiento con las proteasas respectivas.

CUADRO 4 disminución, (++): sin cambio, (+++): incremento, producción del producto convertido (-): desaparición, o sin producción del producto convertido EJEMPLO 5 Medición de la adiponectina total en sangre a través del procesamiento con ácido y agente tensioactivo en combinación (1 ) Preparación de la solución para pretratamiento Un agente tensioactivo comercialmente disponible se añadió a un regulador de pH con citrato de sodio 100 mM (pH 3.0, utilizado para el establecimiento de un tratamiento ácido). Los agentes tensioactivos empleados son SDS y Neoperex F65 (producto de KAO CORPORATION), los cuales son agentes tensioactivos aniónicos; Cortamina 24P y Cortamina 86P (producto de KAO CORPORATION), los cuales son agentes tensioactivos catiónicos; y Tritón X-100 y Tween 20, los cuales son agentes tensioactivos no iónicos. SDS se añadió en una concentración de 2%, y los otros se añadieron cada uno en una concentración de 0.5%. (2) Procesamiento de las muestras Cada una de las diversas soluciones para pretratamiento (490 µ?_) anteriormente mencionadas se añadió a cada una de las muestras de suero (10 µ?_) obtenidas a partir de ocho voluntarios. La mezcla resultante se diluyó 5250 veces con regulador de pH 2 para ELISA sin ebullición. Para comparación con respecto al efecto, se preparó una muestra control como sigue: Tris-HCI 50 mM (pH 6.8, SDS al 2%) (490 µ1_), que sirvió como una solución para pretratamiento, se añadió a cada uno de los sueros (10 µ?) anteriormente mencionados, se agitó extensivamente, se hirvió, y se diluyó 5250 veces con regulador de pH 2 para ELISA. Se preparó una serie de muestras estándares para el cálculo de la concentración como sigue: La mAd purificada la cual había sido analizada en el ejemplo de prueba 2 se añadió a Tris-HCI 50 mM (pH 6.8, SDS al 2%), se hirvió, y se diluyó serialmente con regulador de pH 2 para ELISA. (3) Medición de la adiponectina total Una placa para ELISA se sensibilizó con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina de humano (64405) el cual había sido diluido con PBS a 5 µ p?., seguido por bloqueo con regulador de pH 2 para ELISA. Se añadieron una solución estándar y una solución tratada con suero (véase anteriormente) a la placa, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente por 1 hora. La placa se lavó con solución para lavado de ELISA. Se añadió un anticuerpo monoclonal antí-adiponectina de humano marcado con biotina (64404) el cual había sido diluido 2,000 veces con regulador de pH 2 para ELISA para reacción a temperatura ambiente por 1 hora. La HRP-avidina la cual había sido diluida 2,000 veces con regulador de pH 2 para ELISA se añadió a la placa para reacción a temperatura ambiente por 30 minutos. La placa se lavó con solución de lavado para ELISA. Para el desarrollo del color, se empleó una solución desarrolladora del color OPD (regulador de pH con citrato 250 m que contenía 2 mg/ml de clorhidrato de ortofenilendiamina y 0.02% del peróxido de hidrógeno, pH 5.0). La reacción se detuvo mediante la adición de una solución de paro (ácido sulfúrico 1.5 N, EDTA-2Na 1 mM), y se midió la absorbancia a 492 nm. Los niveles totales de adiponectina (concentración) de las muestras de suero las cuales habían sido tratadas con la solución respectiva para pretratamiento se calcularon con referencia a los valores de color del color desarrollado de las muestras estándares. Se llevó a cabo un análisis de correlación, en el cual la ebullición con Tris-HCI 50 mM (pH 6.8, SDS al 2%) representa la condición comparativa (cuadro 5). El análisis revela que cuando las muestras fueron tratadas con un ácido sin adición de un agente tensioactivo, se obtuvo un excelente coeficiente de correlación, pero la pendiente de la ecuación de regresión fue de 0.45, lo cual es bajo en comparación con un valor correspondiente obtenido a partir del control. Bajo la coexistencia de un agente tensioactivo, se obtuvo un coeficiente de correlación mejorado, y las mediciones de las muestras tendieron a aproximarse a aquellas del control. En particular, el efecto considerable se obtuvo a partir de la adición de un agente tensioactivo aniónico. Por lo tanto, se encontró que el método de pretratamiento de la presente invención logra la medición de la cantidad total de adiponectina en una muestra sin ebullición de la muestra.

CUADRO 5 (control): Tris-HCI 50 mM pH 6.8 (SDS al 2%), hervido

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para el pretratamiento de una muestra para el ensayo inmunológico de la cantidad total de adiponectina presente en la muestra, el cual comprende la adición, a una muestra que contiene adiponectina, de al menos uno de un agente reductor, un ácido o sal del mismo, un agente tensioactivo y una proteasa, y permitiendo que el mismo reaccione con la muestra sin ebullición junto con la muestra.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ensayo inmunológico se lleva a cabo al hacer uso de un vehículo insoluble en el cual se coloca un anticuerpo anti-adiponectina.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la proteasa es una proteasa derivada de un microorganismo o una proteasa obtenida a través de la tecnología de recombinación génica.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en los microorganismos los cuales pertenecen al género Bacillus, género Streptomyces, o género Aspergillus.

5. - Un agente para el pretratamiento de una muestra para el ensayo inmunológico de la cantidad total de adiponectina presente en la muestra, en donde el agente contiene al menos uno de un agente reductor, un ácido o sal del mismo, un agente tensioactivo y una proteasa; y, en uso, el agente para pretratamiento se deja reaccionar con la muestra sin llevar a cabo ebullición junto con la muestra.

6. - El agente de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el ensayo inmunológico se lleva a cabo al hacer uso de un vehículo insoluble sobre cual se coloca un anticuerpo anti-adiponectina.

7. - El agente de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado además porque la proteasa es una proteasa derivada de un microorganismo o una proteasa obtenida a través de la tecnología de recombinación génica.

8.- El agente de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en los microorganismos los cuales pertenecen al género Bacillus, género Streptomyces, o género Aspergillus.

9.- Un método para la medición de la cantidad total de adiponectina presente en una muestra, que comprende la adición, a una muestra que contiene adiponectina, de al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo, y una proteasa, permitiendo que el mismo reaccione con la muestra sin ebullición junto con la muestra, y llevando a cabo un ensayo inmunologico de adiponectina.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el ensayo inmunologico se lleva a cabo al hacer uso de un vehículo insoluble sobre el cual se coloca un anticuerpo anti-adiponectina.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada además porque la proteasa es una proteasa derivada de un microorganismo o una proteasa obtenida a través de la tecnología de recombinación génica.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en los microorganismos los cuales pertenecen al género Bacillus, género Streptomyces, o género Aspergillus.

13. - Un reactivo de inmunoensayo para la evaluación inmunológica de la cantidad total de adiponectina presente en una muestra, en donde el reactivo incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, el primer reactivo contiene al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un agente tensioactivo y una proteasa, el segundo reactivo contiene un vehículo insoluble con un anticuerpo para la determinación de un nivel de adiponectina, y la reacción entre la muestra y el primer reactivo se lleva a cabo sin ebullición del sistema de reacción.