ES2323271T3 - Metodo de pretratamiento de una muestra y metodo de dosificacion inmunologica utilizado. - Google Patents

Abstract

Un método de determinación de la cantidad total de adiponectina presente en una muestra biológica como indicador de enfermedades relacionadas con el estilo de vida, cuyo método consiste en: (a) procesar la muestra que contiene multímeros de adiponectina con un ácido o una sal del mismo y un surfactante sin hervir para convertir los multímeros de adiponectina en un producto convertido derivado de adiponectina, donde la concentración del ácido o de su sal varía de 1 a 1.000 mM, y, cuando se usa el ácido o su sal como un tampón, el pH del tampón es de 4 o inferior; y (b) determinar la cantidad total de la adiponectina midiendo el producto convertido derivado de adiponectina en la muestra usando un método de inmunoensayo.

Description

Método de pretratamiento de una muestra y método de dosificación inmunológica utilizado.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con un método de determinación de la cantidad total de adiponectina presente en una muestra biológica como indicador de enfermedades relacionadas con el estilo de vida y con un reactivo de inmunoensayo específico.

La presente invención utiliza un método de pretratamiento de una muestra para determinar convenientemente, con rapidez y con precisión la cantidad total de adiponectina presente en la muestra.

Técnica anterior

La adiponectina (véanse los Documentos No Patente 1 a 4) es una proteína de tipo secretor expresada específica y abundantemente en el tejido adiposo blanco. La adiponectina es una proteína plasmática (aproximadamente 30 kDa) perteneciente a la familia C1q y está compuesta por 244 aminoácidos.

La adiponectina posee una estructura trimérica de triple hélice, en la que cada monómero está formado por un dominio N-terminal de tipo colágeno con múltiples repeticiones Gly-X-Y y un dominio globular C-terminal. Además, se ha descrito que, en la sangre, una pluralidad de trímeros se unen entre sí para formar productos de orden superior (a los que en adelante se puede hacer referencia como "diversos multímeros").

En los últimos años, se ha descrito que la adiponectina existe en la sangre humana en un elevado nivel de 5 a
10 \mug/mL y ejerce una variedad de actividades fisiológicas. En particular, la adiponectina suprime el crecimiento de las células musculares lisas y evita la adhesión de los monocitos sobre las células endoteliales. A partir de estos hallazgos, se considera que la adiponectina tiene un efecto antiarteriosclerosis (Documento No Patente 5). Más aún, gracias a los hallazgos de que, cuando se administra adiponectina a un ratón que padece diabetes de tipo 2 o diabetes lipoatrófica, se invierte la resistencia a la insulina y se alivian los niveles elevados de AGL (ácidos grasos libres) en sangre y los niveles elevados de TG (triglicéridos) en sangre, se dice que la adiponectina funciona como una hormona sensible a la insulina y que exhibe un efecto mejorador sobre la diabetes (Documento No Patente 6). También se dice que los pacientes con fallo renal que muestran bajos niveles de adiponectina en sangre tienen un alto riesgo de complicaciones de enfermedades cardiovasculares y muestran bajas tasas de supervivencia, y que, en un estudio realizado en nativos Americanos de la tribu Pima, que se sabe desarrollan resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 con alta incidencia, se suprime la aparición de la diabetes de tipo 2 entre sujetos que muestran un elevado nivel en sangre de adiponectina (Documento No Patente 7).

Los anteriores descubrimientos sugieren la posibilidad de que la adiponectina podría ser un factor endocrino responsable de la relación directa entre la acumulación excesiva de grasa visceral y la aparición de resistencia a la insulina. Por lo tanto, se considera que el nivel de adiponectina en sangre es un factor predictivo para la aparición de diabetes o arteriosclerosis y se espera que las mediciones de dichos niveles sirvan como indicador útil de enfermedades relacionadas con el estilo de vida.

Según un método de determinación de la cantidad total de diversos multímeros de la adiponectina contenida en una muestra de sangre, se hierve una muestra en presencia de dodecilsulfato de sodio ("SDS") para exponer los sitios de reconocimiento de anticuerpos de varios multímeros que se han ocultado estereoestructuralmente y se realiza luego un inmunoensayo (Documento de Patente 1). Sin embargo, este método presenta algunos problemas, en el sentido de que requiere un aparato para el tratamiento de ebullición (100ºC) y de que es también realmente difícil que resulte disponible para una automatización de dos etapas, es decir, tratamiento de ebullición y posterior inmunoensayo.

Se dispone de un kit comercial llamado "HUMAN ADIPONECTIN RIA KIT" (Cat. #HADP-61HK) (LINCO RESEARCH, INC.). Sin embargo, dado que el kit utiliza el método de dos anticuerpos/PEG, donde compiten la adiponectina de ratón marcada con ^{125}I y la adiponectina humana y se usa anticuerpo policlonal anti-adiponectina para la captura, habría que hacer notar que la manipulación de este kit es engorrosa, y además sigue habiendo cuestiones preocupantes en cuanto a seguridad, especificidad y calidad de los reactivos. Con objeto de posibilitar que la especificidad en el método anterior establecida en base a la reacción competitiva continúe siendo constante, se necesitan condiciones en las cuales la reactividad del anticuerpo policlonal anti-adiponectina contra la adiponectina de ratón marcada con ^{125}I y diversos multímeros de la adiponectina humana continúe siendo constante. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, una muestra biológica contiene diversos multímeros en un estado de mezcla y varían las proporciones de los respectivos multímeros. Por lo tanto, este kit conlleva esencialmente el problema de que no se puede medir con precisión la adiponectina total.

Además, existe un documento de la técnica anterior que describe un anticuerpo monoclonal que reconoce adiponectina no desnaturalizada que tiene una estereoestructura específica que no ha sido modificada por ningún tratamiento de desnaturalización con, por ejemplo, SDS o calor (véase el Documento de Patente 2; se hace referencia a la adiponectina de este tipo como adiponectina nativa en esta referencia) y un método de ensayo que utiliza el anticuerpo monoclonal (Documento de Patente 2). Sin embargo, este método presenta el problema de que la adiponectina total de una muestra biológica no puede ser medida con precisión, ya que contiene varios multímeros en proporciones variables, porque la forma de la adiponectina presente en una muestra (por ejemplo, el número de trímeros y la condición de agregación de los trímeros) afecta a la reactividad de la adiponectina con el anticuerpo monoclonal antes mencionado.

La forma estructural de la adiponectina ha sido investigada con respecto a un recombinante, aunque no en una muestra biológica. Según dicha investigación, cuando se trata la adiponectina con ditiotreitol (DTT) a bajo pH (Documento No Patente 8) o con tripsina (Documento No Patente 9), su forma estructural cambia. Sin embargo, no existe información acerca de los resultados de un inmunoensayo de la adiponectina sometida a dicho tratamiento.

Como se ha descrito anteriormente, con objeto de determinar inmunológicamente el nivel total de adiponectina en una muestra, se ha de someter la muestra a un procedimiento de pretratamiento para así alcanzar una reactividad uniforme entre cada una de las especies de multímeros (un trímero y varios multímeros compuestos de trímeros) y el anticuerpo empleado. Sin embargo, no ha habido ningún método conveniente cuyas dos etapas, es decir, la etapa de pretratamiento y la etapa de inmunoensayo, pueden ser automatizadas.

Se conoce un ensayo ELISA para determinar la cantidad de adiponectina en una muestra biológica por Arita y col. Bioch Bioph Res Comm 257, 79-83, 1999.

[Documento de Patente 1] Solicitud de Patente Japonesa Abierta al Público (kokai) Nº 2000-304748.

[Documento de Patente 2] Publicación Internacional PCT WO03/016906.

[Documento No Patente 1] Scherer P. E., y col., J. Biol. Chem. 270, 26746-26749, 1995.

[Documento No Patente 2] Hu E., y col., J. Biol. Chem. 271, 10697-10703, 1996.

[Documento No Patente 3] Maeda K., y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-289, 1996.

[Documento No Patente 4] Nakano Y., y col., J. Biochem. 120, 803-812, 1996.

[Documento No Patente 5] Ouchi N, y col., Circulation, 102, 1296-1301, 2000.

[Documento No Patente 6] Yamauchi T, y col., Nature Med. 7, 941-946, 2001.

[Documento No Patente 7] Lindsay R. S., y col., Lancet, 360, 57-58, 2002.

[Documento No Patente 8] Utpal B. Pajvani, y col., J. Biol. Chem. 278, 9073-9085, 2003.

[Documento No Patente 9] Fruebis, J., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 2005-2531, 2001.

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Descripción de la invención Problemas que la invención ha de resolver

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para determinar de un modo conveniente, rápido y preciso la cantidad total de adiponectina en una muestra biológica que contiene trímeros y diversas especies de multímeros compuestas por trímeros.

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Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores realizaron una amplia investigación con el fin de resolver los problemas antes mencionados y vieron que, cuando se tratan trímeros y diversos multímeros compuestos por trímeros con al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un surfactante y una proteasa y se analizan luego por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida (poliacrilamida: 2-15%; a continuación aquí indicada como PAGE (2-15%)), las bandas teñidas atribuibles a varios multímeros que habían existido antes del tratamiento desaparecían o se reducía su intensidad, y que se detecta un producto convertido derivado de adiponectina (al que en adelante se hará aquí referencia como producto convertido) en una posición correspondiente a un peso molecular inferior en comparación con las posiciones correspondientes a cualquier otra banda que existiera antes del tratamiento. Los inventores confirmaron también que el producto convertido tiene reactividad con un anticuerpo anti-adiponectina y que el producto convertido puede ser medido mediante el uso del anticuerpo anti-adiponectina.

En base a los descubrimientos anteriores, los presentes inventores siguieron investigando y vieron que, cuando se trata una muestra con un agente de pretratamiento que contiene al menos uno de un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un surfactante y una proteasa y luego se realiza el inmunoensayo de la muestra, se puede determinar el nivel total de adiponectina de una muestra biológica que contiene varios multímeros sin hervir la muestra junto con el agente de pretratamiento, completándose así la invención.

La presente invención proporciona un método según la reivindicación 1 y un reactivo de inmunoensayo según la reivindicación 4.

Por consiguiente, la presente invención emplea un método de pretratamiento de una muestra de medición de la adiponectina para la determinación inmunológica de la cantidad total de adiponectina en la muestra, caracterizado por añadir a una muestra que contiene adiponectina al menos un ácido o una sal del mismo y un surfactante y dejar que éstos reaccionen con la muestra sin hervirlos junto con la misma.

La presente invención proporciona un método para determinar la cantidad total de adiponectina en una muestra biológica según se define en la reivindicación 1.

La presente invención proporciona además un reactivo de inmunoensayo para determinar la cantidad total de adiponectina en una muestra biológica, caracterizado por incluir el reactivo un primer reactivo y un segundo reactivo, como se define en la reivindicación 4.

Efecto de la invención

Según la presente invención, la cantidad total de adiponectina en una muestra biológica en la que están presentes varias especies de multímeros en estado de mezcla puede ser determinada de forma conveniente, rápida y precisa.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] Resultados de western blots de adiponectina sérica humana.

[Fig. 2] Gráficos que muestran la reactividad entre un reactivo LTIA y la adiponectina tratada con proteasas.

[Fig. 3] Gráficos que muestran la reactividad entre un reactivo ELISA y la adiponectina tratada con proteasas.

[Fig. 4] Perfiles electroforéticos obtenidos por tinción CBB de adiponectina purificada derivada de suero humano separada por PAGE (2-15%) en el Ejemplo de Referencia 3.

Mejor modo de desarrollar la invención

Como se ha descrito anteriormente, en una muestra biológica la adiponectina existe en forma de varios multímeros y las proporciones de los multímeros respectivos no son siempre las mismas. Por lo tanto, cuando de realiza un inmunoensayo, se postula que la reactividad entre el anticuerpo que se ha de emplear en la medición y cada especie de los diversos multímeros difiere de una especie a otra. Específicamente, puede ser difícil determinar multímeros particulares. Más aún, si se considera una situación hipotética en la que se realiza un sistema de ensayo en emparedado sobre una muestra que contiene una molécula de un hexámero y una molécula de un trímero -lo que significa que existen 9 monómeros en la muestra- para la interpretación de los resultados de ensayo, no se puede distinguir este caso de, por ejemplo, el caso en el que hay dos moléculas de un trímero o el caso en el que hay dos moléculas de un hexámero. En cualquiera de los casos, los resultados de ensayo no reflejan correctamente la adiponectina total. A propósito, un método que emplee un pretratamiento de degradación de multímeros hirviendo la muestra en presencia de SDS proporcionará resultados de ensayo que reflejen correctamente la adiponectina total; sin embargo, el pretratamiento en este método es engorroso y además se encuentran dificultades a la hora de automatizar las dos etapas de pretratamiento y el inmunoensayo posterior.

En base a los descubrimientos antes mencionados, los presentes inventores pensaron que se podía resolver el problema cuando se realiza el ensayo inmunológico después de haberse convertido varios multímeros, sin sufrir ebullición, en una determinada forma específica que alcanza una reactividad uniforme entre el anticuerpo utilizado en el ensayo y los diversos multímeros contenidos en la muestra y proporciona, por lo tanto, resultados de ensayo que reflejan correctamente la adiponectina total.

Como método de pretratamiento que cumple con el fin anterior para un ensayo de las diversas especies de adiponectina contenidas en una muestra, se añaden al menos un ácido o una sal del mismo y un surfactante a una muestra que contiene adiponectina y se les deja reaccionar con adiponectina sin hervir la muestra. Los productos convertidos obtenidos de cualquiera de estos métodos de pretratamiento pueden tener la misma propiedad o propiedades diferentes de un método a otro. Aquí, los diversos multímeros pueden estar compuestos por monómeros solos, trímeros solos o multímeros específicos. Además, los productos convertidos obtenidos del pretratamiento pueden tener pesos moleculares dentro de un cierto rango de pesos moleculares. En otras palabras, cualquier método de pretratamiento resultará útil en la medida en que los productos convertidos tengan una propiedad y configuración tales que aseguren la unión de un anticuerpo seleccionado para establecer un sistema de inmunoensayo a los mismos con una cierta reactividad.

No se impone ninguna limitación en particular sobre la muestra biológica que se ha de emplear en la presente invención, siempre que la muestra biológica contenga diversos multímeros de adiponectina, tal como fluidos corporales (v.g., sangre y orina), extractos de tejidos y sobrenadantes de cultivo de células derivadas de tejidos obtenidas de un mamífero, tal como humanos, monos, cabras, ovejas, conejos, ratones, ratas, cobayas, etc. De éstos, se prefiere la sangre (suero, plasma), ya que proporciona información relacionada con la diabetes o la arteriosclerosis y por lo tanto ha adquirido interés últimamente. No se impone ninguna limitación en particular sobre el método de obtención de una muestra, en la medida en que el método no afecte a la adiponectina presente en la muestra en términos del objetivo de la realización del ensayo de adiponectina total.

No se impone ninguna limitación en particular sobre el ácido o una sal del mismo y se puede emplear cualquier ácido orgánico o ácido inorgánico, siempre que pueda romper la unión entre diversos multímeros de la adiponectina. Por ejemplo, se pueden emplear ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido tartárico y ácido oxálico. La concentración a la cual se usa el ácido o una sal del mismo es apropiadamente seleccionada de tal forma que se pueda obtener un producto convertido de interés. Específicamente, la concentración varía de 1 a 1.000 mM, preferiblemente de 10 a 200 mM. También se pueden usar el ácido o una sal del mismo como un tampón, y en tal caso el pH del tampón es preferiblemente de 4 o inferior. El tratamiento con el ácido o una sal del mismo es preferiblemente realizado a una temperatura de 4 a 60ºC durante 5 minutos a 24 horas.

No se impone ninguna limitación en particular sobre la elección del surfactante y se pueden emplear surfactantes iónicos, no iónicos y de otros tipos en la medida en que el surfactante pueda actuar sobre una variedad de multímeros, pueda transformar diferentes formas de adiponectina en una forma tal que permita la medición de la cantidad total de adiponectina por inmunoensayo y pueda mantener la reactividad entre la adiponectina y un anticuerpo específico para la adiponectina. En particular, se prefieren los surfactantes aniónicos y concretamente son más preferidos los sulfatos de alquilo, tales como el dodecilsulfato (SDS) y los sulfonatos de alquilbenceno, tales como los sulfonatos de dodecilbenceno. Estos surfactantes pueden ser usados aisladamente o en combinación. La concentración a la que se usa dicho surfactante varía generalmente del 0,01 al 10%, pero es más preferido el rango del 0,1 al 5%. Cuando se use el surfactante en combinación con un tratamiento mediante un ácido o una sal del mismo, se obtendrán efectos incluso más preferidos.

No se impone ninguna limitación en particular sobre el modo en que el ácido o la sal del mismo y el surfactante respectivos antes mencionados son usados en combinación. Más aún, durante el uso de estos ácidos y sales de los mismos y surfactantes, se pueden añadir también componentes adicionales con el fin de regular el ambiente en el que los anteriores agentes actúan sobre la adiponectina o de mejorar la estabilidad de almacenamiento de los agentes mencionados. Como ejemplos de dichos componentes adicionales, se incluyen componentes tampón tales como tampón fosfato, tampón glicina, tampón Tris y tampón de Good; surfactantes que no actúan sobre varios multímeros; seroalbúmina bovina ("BSA"); sacarosa; conservantes (tales como la azida sódica); y reguladores de la concentración salina (tales como el cloruro de sodio).

No se impone ninguna limitación en particular sobre la elección del anticuerpo que se ha de emplear en el inmunoensayo de la presente invención, en la medida en que se pueda medir la adiponectina total después de dejar que reaccionen al menos un ácido o una sal del mismo y un surfactante con varios multímeros de adiponectina sin tratamiento de ebullición. De dichas especies de anticuerpos, un anticuerpo policlonal incluye una pluralidad de anticuerpos capaces de unirse específicamente a una pluralidad de epitopos presentes sobre la adiponectina transformada en una determinada forma estructural. Se puede obtener el anticuerpo policlonal inmunizando una especie animal apropiada (tal como un conejo, una cabra, una oveja, un caballo, una vaca, un ratón y una rata) con adiponectina por un método conocido. Mientras tanto, un anticuerpo monoclonal puede ser uno o más anticuerpos monoclonales diferentes capaces de unirse específicamente a una adiponectina transformada en una determinada forma estructural. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser preparados por un método apropiado, o una combinación de métodos conocidos en la tecnología de la fusión celular, para establecer así líneas celulares de fusión capaces de producir anticuerpos monoclonales, y mediante el uso de dichas líneas celulares. Más aún, se puede disponer comercialmente de anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a adiponectina que se ha transformado en una determinada forma estructural y usarlos en la presente invención. Dependiendo de la forma estructural de la adiponectina, se pueden emplear los siguientes anticuerpos, por ejemplo: anticuerpo anti-Acrp30 humano \alpha de cabra (Cosmo Bio Co., Ltd., GT Co.), anticuerpo policlonal anti-adiponectina humana \alpha de conejo (Cosmo Bio Co., Chemicon Co.), anticuerpo monoclonal anti-Acrp30 humano (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Co.), anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana \alpha de ratón (Cosmo Bio Co., Chemicon Co.), anticuerpo monoclonal anti-ACRP30 humano (AX773, AX741, Ne, Na, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), etc.

Como antígeno para uso en la obtención de un anticuerpo empleado en la presente invención, se puede usar adiponectina purificada y aislada de una muestra por un método conocido. Se puede usar alternativamente adiponectina que haya sufrido un tratamiento, pero no un tratamiento de ebullición, con una solución de pretratamiento que contiene al menos un miembro seleccionado un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un surfactante y una proteasa. Se puede preparar el antígeno en forma de proteína recombinante mediante el uso de tecnología de ingeniería genética convencional en base a la información de la secuencia nucleotídica de la proteína.

El inmunoensayo de la presente invención se basa en un método que incluye el siguiente proceso: dejar que un anticuerpo capaz de unirse específicamente a adiponectina que se ha transformado en una determinada forma estructural se una a un soporte insoluble, para capturar así la adiponectina transformada, mediante lo cual se determina la presencia o ausencia de adiponectina en la muestra (cualitativamente) y se determina el nivel de adiponectina cuantitativamente. Como ejemplos específicos del inmunoensayo, se incluyen LTIA (inmunoensayo turbidimétrico en látex), ELISA (enzimoinmunoensayo), CLEIA (enzimoinmunoensayo quimioluminiscente), RIA (radioinmunoensayo), etc. De éstos, el LTIA es un método en el cual se mezcla un soporte insoluble portador de un anticuerpo capaz de unirse a adiponectina que ha sido transformada en una determinada forma estructural con adiponectina que ha sido transformada en una determinada forma estructural, para inducir entrecruzamiento (agregación) del soporte insoluble por mediación de la adiponectina transformada, y se determina ópticamente la turbidez que resulta. Según este método, se puede determinar la presencia o ausencia de adiponectina (cualitativamente) y se puede determinar el nivel de adiponectina cuantitativamente. Este método es beneficioso, en el sentido de que proporciona una medición simple, rápida y precisa de la adiponectina.

El soporte insoluble para empleo en la presente invención puede ser un soporte insoluble orgánico que haya sido utilizado en reactivos de inmunoensayo convencionales y que pueda ser producido industrialmente a gran escala. En el LTIA, se prefieren las partículas de látex de poliestireno, ya que exhiben una excelente adsorción de anticuerpos y mantienen una actividad biológica de manera estable durante un largo período de tiempo. En el ELISA, se prefiere una microplaca de 96 pocillos hecha, por ejemplo, de poliestireno.

Se conocen diversos métodos para unir un anticuerpo a dicho soporte insoluble y se puede emplear cualquiera de dichos métodos conocidos en la presente invención según se desee. Por ejemplo, se puede unir (sensibilizar) un anticuerpo por adsorción física a la superficie de un soporte insoluble. Alternativamente, la superficie de un soporte insoluble que tiene un grupo funcional puede ser eficientemente sensibilizada con un anticuerpo por un método conocido de unión física o química.

No se impone ninguna limitación en particular sobre las condiciones de reacción en las que se produce la reacción de un soporte insoluble portador de un anticuerpo y adiponectina transformada en una determinada forma estructural, en la medida en que la reacción antígeno-anticuerpo se produzca en las condiciones de reacción. No se impone ninguna limitación en particular sobre la mezcla de reacción, en la medida en que la mezcla de reacción permita que proceda la reacción antígeno-anticuerpo con la adiponectina que ha sufrido pretratamiento para tener una determinada forma estructural. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede contener un componente tampón para ajustar el pH (v.g., tampón fosfato, tampón glicina, tampón Tris, tampón de Good); un surfactante, cloruro de sodio o una substancia similar para evitar reacciones inespecíficas; un estabilizador, tal como seroalbúmina bovina (BSA); y sacarosa, polímeros polisacáridos o una substancia similar. La mezcla de reacción puede contener también, además de las anteriores substancias que controlan la reactividad, un polisacárido hidrosoluble, tal como el dextrano; un neutralizador para neutralizar el agente reductor o el ácido contenido en el agente de tratamiento antes mencionado; o un agente inactivador para proteasa, según las necesidades.

Como ejemplos de métodos de detección llevados a cabo en el LTIA o el ELISA antes mencionados, se incluye el método descrito a continuación. No se impone ninguna limitación en particular sobre el método para determinar el grado de agregación del soporte insoluble en el LTIA. Por ejemplo, con objeto de evaluar cualitativa o semicuantitativamente la agregación, se puede determinar el grado de agregación visualmente por comparación de la turbidez entre muestras que tienen concentraciones conocidas y la muestra diana. Con objeto de evaluar cuantitativamente la agregación, se emplea preferiblemente una medición óptica, desde el punto de vista de la conveniencia y de la precisión. Se puede realizar la medición óptica de la agregación por un método conocido. Como ejemplos específicos de la medición óptica que pueden emplearse en la presente invención, se incluyen la así llamada medición turbidimétrica (se observa la formación de una masa agregada como un aumento de turbidez), la medición de la distribución del tamaño de partícula (se observa la formación de una masa agregada como un cambio en la distribución del tamaño de partícula o en el tamaño medio de partícula) y el ensayo turbidimétrico con esfera integrante (se mide el cambio en la radiación dispersa frontalmente causada por la formación de una masa agregada con una esfera integrante y se compara la razón de la intensidad con respecto a la radiación transmitida). Cuando se realiza un ELISA, no se impone ninguna limitación en particular sobre el método para valorar un producto de reacción entre un substrato y una enzima, en base a la actividad enzimática del anticuerpo marcado con enzima. Específicamente, se puede leer la longitud de onda intrínseca al producto de la reacción enzimática, por ejemplo la absorbancia a 492 nm, con un lector de microplacas de 96 pocillos.

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Ejemplos

La presente invención será descrita a continuación con detalle por medio de ejemplos, los cuales no han de ser considerados como limitantes de la invención a los mismos.

Los reactivos y materiales empleados en los Ejemplos y Ejemplos de Ensayo son los siguientes.

Reactivos y materiales

a.

Solución para lavar la resina de unión a anticuerpos (a la que en adelante se hará aquí referencia como solución de lavado): NaHCO_{3}-NaOH 0,1M (pH 8,3) que contiene NaCl 0,5M.

b.

Solución para eluir la resina de unión a anticuerpos (a la que en adelante se hará aquí referencia como solución de elución): Glicina-HCl 0,1M (pH 2,5).

c.

Solución para neutralizar la resina de unión a anticuerpos (a la que en adelante se hará aquí referencia como solución neutralizante): Tris-HCl 2M (pH 8,0).

d.

Látex: látex de partículas de poliestireno (tamaño medio de partícula: 0,2 \mum, contenido sólido: 10% (p/v), producto de SEKISUI CHEMICAL CO., LTD.).

e.

Tampón de preparación del látex portador de anticuerpos: Tris-HCl 20 mM (pH 8,0).

f.

Tampón de bloqueo: Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contiene BSA al 2%.

g.

Tampón LTIA (R1): Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contiene BSA al 0,15% y NaCl 0,15M.

h.

Placa ELISA: microplaca de 96 pocillos (producto de NUNC).

i.

Solución de sensibilización de anticuerpos para ELISA: PBS (pH 7,4).

j.

Tampón ELISA: PBS (pH 7,4) que contiene BSA al 1% y Tween 20 al 0,1%.

k.

Anticuerpo anti-Acrp30 humano \alpha de cabra: producto de Cosmo Bio Co., Ltd., GT, Nº Cat. 421065 (producto comercial de anticuerpo policlonal anti-adiponectina humana).

l.

Anticuerpo monoclonal anti-Acrp30 humano: producto de Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories, código de producto: A12820 (producto comercial de anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana);

m.

Anticuerpo marcado con HRP anti-IgG de conejo \alpha de cabra: Cosmo Bio Co., Ltd., producto de Capple.

n.

Solución de lavado ELISA: PBS (pH 7,4) que contiene Tween 20 al 0,05%.

o.

Tampón ELISA 2: PBS (pH 7,4) que contiene BSA al 1% y Tween 20 al 0,05%.

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Ejemplo de Referencia 1

Preparación de adiponectina globular de ratón recombinante en E. coli (rMgAd)

Se insertó una secuencia de dominio globular (correspondiente a los residuos 104-247) de la secuencia del gen de la adiponectina del ratón (Nº de acceso NCBI U37222) entre BamHI y HindIII de un vector pQE30 que contenía un marcaje 6xHis y se introdujo después en E. coli. Se purificó la adiponectina globular de ratón recombinante (rMgAd) expresada en E. coli por el siguiente procedimiento. Específicamente, se aplicó una fracción soluble de E. coli a Ni-NTA agarosa (producto de QIAGEN) y se dejó que la rMgAd se uniera a la misma durante 16 horas a 4ºC, seguido de elución seriada con imidazol. Se recogió la fracción que contenía la adiponectina y se dializó después con PBS durante tres días. Se determinó el contenido en proteína de la rMgAd resultante por medio de un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad DC.

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Ejemplo de Referencia 2

Preparación de anticuerpo anti-rMgAd

Se mezclaron entre sí rMgAd (50 \mug) obtenida en el Ejemplo de Referencia 1 anterior y la misma cantidad de adyuvante completo de Freund y se inmunizaron dos conejos con la mezcla seis veces, a intervalos de dos semanas, para producir antisuero. Se purificó el anticuerpo (IgG) específico presente en el antisuero por un método convencional usando resina de Proteína A (anticuerpo anti-rMgAd).

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Ejemplo de Referencia 3

Purificación de adiponectina (mAd) derivada de sangre humana

Se unió el anticuerpo anti-rMgAd (500 mg) preparado en el Ejemplo de Referencia 2 anterior a sefarosa 4B activada con CNBr (Amersham Bioscience) (50 mL), para así preparar resina de sefarosa 4B de unión a anticuerpo anti-rMgAd. Se añadió suero humano (2,5 L) a la resina de sefarosa 4B de unión a anticuerpo anti-rMgAd y se lavó la resina a conciencia con la solución de lavado. Se usó la solución de elución para eluir una fracción de adiponectina sérica humana (mAd) y se añadió la solución neutralizante a la fracción eluida en un volumen igual a 1/10 del de la fracción para efectuar la neutralización. A continuación, se añadió la fracción neutralizada resina de Proteína A y se recogió la fracción que contenía componentes que no se adsorben en la resina de Proteína A como mAd purificada. Se determinó el contenido en adiponectina por medio de un "kit ELISA para adiponectina humana" (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).

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Ejemplo de Referencia 4

Producción de anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana

Se mezcló la mAd purificada (20 \mug) obtenida en el Ejemplo de Referencia 3 anterior con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund y se inmunizaron dos ratones con la mezcla tres o cuatro veces, a intervalos de dos semanas. Se administró de nuevo la mezcla a los ratones tres días antes de la fusión celular. Se recogieron las células del bazo de los ratones inmunizados y se realizó la fusión celular con células de mieloma P3U1 por un método convencional usando polietilenglicol. Se seleccionaron las células fusionadas que producen anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana por un método conocido. Específicamente, se seleccionaron los pocillos que eran altamente reactivos con la mAd por ELISA y se realizó una dilución limitante. Se administraron intraperitonealmente las células fusionadas seleccionadas a ratones que habían sido tratados con pristano y se recogió el líquido ascítico como anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana. La purificación del anticuerpo (IgG) específico a partir del líquido ascítico fue realizada mediante un método convencional usando resina de Proteína A. De este modo, se obtuvieron células fusionadas que producen once anticuerpos monoclonales anti-adiponectina humana, así como dichos anticuerpos monoclonales (números de identificación 64401 a 64411).

Ejemplo de Referencia 5

Preparación de látex de sensibilización de anticuerpos

Se mezclaron una solución de látex (1 volumen) y un tampón de preparación de látex portador de anticuerpo (4 volúmenes), para así preparar una solución de látex diluida. Un anticuerpo anti-rMgAd y un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401) fueron cada uno diluidos a 1 mg/mL con el tampón de preparación, para así preparar una solución diluida de anticuerpo. Se añadió cada una (1 volumen) de las dos soluciones de anticuerpo diluidas resultantes a, y se mezcló con, la solución de látex diluida antes preparada (1 volumen) con agitación. Después de una mayor agitación de la mezcla resultante, se añadió a la misma tampón de bloqueo (2 volúmenes), seguido de agitación. Así, se obtuvieron una solución madre de látex portador de anti-rMgAd y una solución madre de látex portador de anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401).

Ejemplo de Ensayo 1

Análisis de multímeros de adiponectina en suero humano por western blotting

Se sometieron cada una (0,2 \muL) de las muestras de suero obtenidas de ocho sujetos sanos a PAGE (de un 2 a un 15%). Se transfirió el material aislado a una membrana PVDF por blotting semiseco. Se sometió la membrana a inmunotinción. El procedimiento de inmunotinción es como sigue. Se sometió la membrana con el material transferido a bloqueo con solución PBS (pH 7,4) que contenía un 5% de leche desnatada y un 0,1% de NaN_{3}. Se lavó la membrana resultante con solución PBS (pH 7,4) que contenía un 0,1% de Tween 20 y se dejó que la membrana así lavada reaccionara con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana comercial (hu Acrp30-MoAb; producto de Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., BD Transduction Laboratories) (1 \mug/mL) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se lavó la membrana así reaccionada a conciencia con solución PBS (pH 7,4) que contenía un 0,1% de Tween 20. Usando el kit Vector ABC (Ratón) y un kit de substrato DAB (FUNAKOSI), se reveló un color. Como resultado, se detectaron tres bandas principales como teñidas, lo que indica que los diversos multímeros de adiponectina presentes en la sangre se clasifican principalmente en tres tipos (Fig. 1). Según se identifica en los perfiles electroforéticos de la Fig. 1, los tipos de adiponectina correspondientes a estas tres bandas teñidas fueron denominados fracciones "HMW-Ad", "MMW-Ad" y "LMW-Ad" de arriba (peso molecular alto) abajo.

Ejemplo de Referencia 6

Procesamiento de mAd purificada mediante un agente reductor, un ácido o sal del mismo o una proteasa

Se trató la mAd purificada obtenida en el Ejemplo de Referencia 3 usando un agente reductor, un ácido o sales del mismo o una proteasa, solos o en combinación. En cada caso, se observó la mAd purificada tratada en cuanto a cualquier cambio de forma.

1) Procesamiento mediante un agente reductor o un ácido

Se prepararon varios tampones (50 mM cada uno), tales como tampón Tris-HCl buffer (pH 8,5) y tampón acetato de sodio (pH 3,0 y pH 4,0), de forma que contuvieran mAd purificada. En presencia o ausencia de un agente reductor (DTT 10 mM), se calentaron las muestras a 37ºC durante 60 minutos. Se sometieron las muestras así tratadas a PAGE (del 2 al 15%), seguido de tinción de proteínas usando CBB. Se empleó una imagen teñida de una muestra que contenía Tris-HCl (pH 8,5) sin DTT (condición de procesado 1) como control y se observó el aumento o la disminución de la intensidad de las bandas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad y LMW-Ad bajo las respectivas condiciones de procesado. Además, se observó la producción de bandas atribuidas a nuevos productos convertidos (Tabla 1).

\newpage

Como resultado, en condiciones en las que no se añadió el agente reductor y los valores del pH del tampón acetato de sodio eran 3,0 y 4,0 (condiciones de procesado 3 y 5), la banda teñida correspondiente a la fracción HMW-Ad desapareció y la intensidad de la banda teñida correspondiente a la fracción MMW-Ad aumentó. Mientras tanto, en condiciones en las que se añadió el agente reductor y los valores del pH del tampón acetato de sodio eran 3,0 y 4,0 (condiciones de procesado 4 y 6), las bandas teñidas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad y LMW-Ad desaparecieron y se observó una nueva banda teñida atribuida a un producto convertido derivado de cada fracción. En la condición de procesado 2 (Tris-HCl, pH 8,5), se observó una nueva banda atribuida a un producto convertido derivado de cada fracción, pero no desapareció por completo una banda atribuida a una fracción HMW-Ad.

Por los resultados antes descritos, cuando se trató adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad y LMW-Ad) con un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, se confirmó que se producía un nuevo producto convertido a partir de la adiponectina multimérica. Se supuso que el producto convertido así producido era un trímero de adiponectina.

TABLA 1

1

\hskip0,3cm (+): Disminución, (++): Sin cambios, (+++): Aumento o producción de producto convertido

\hskip0,3cm (-): Desaparición o sin producción de producto convertido

\vskip1.000000\baselineskip

2) Procesamiento con proteasa

Se añadieron mAd purificada y una proteasa comercial a tampón fosfato 50 mM (pH 8,0), seguido de calentamiento a 37ºC durante 60 minutos. Se sometió la mezcla así tratada a PAGE (del 2 al 15%), seguido de tinción de proteína con CBB. Se empleó una imagen teñida de Tris-HCl (pH 8,5) que no contenía DTT (condición de procesado 1) como control y se observó el aumento o la disminución de intensidad de las bandas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad y LMW-Ad en cada una de las condiciones de procesado. Además, se observó la producción de nuevas bandas atribuidas a productos convertidos (Tabla 2).

Por procesamiento en cualquiera de las condiciones de procesado 7 a 9, todas las bandas teñidas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad y LMW-Ad desaparecieron y se observó una nueva banda teñida atribuida a productos convertidos derivados de estas fracciones en una región de bajo peso molecular. Por procesamiento en cualquiera de las condiciones 10 a 12, las bandas teñidas correspondientes a las fracciones LMW-Ad y MMW-Ad desaparecieron y se observaron nuevas bandas atribuidas a productos convertidos derivados de estas fracciones en regiones de bajo peso molecular. En este caso, no se observó ningún cambio para las bandas teñidas atribuidas a una fracción HMW-Ad.

Por los resultados antes descritos, cuando se trató adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad y LMW-Ad) con proteasa, se confirmó que se producía un nuevo producto convertido a partir de la adiponectina multimérica. Las posiciones en las que fueron detectadas las bandas de estos productos convertidos por PAGE (del 2 al 15%) varían de 30 a 42 kDa, aunque las posiciones se desplazaban algo dependiendo del tipo de la proteasa empleada.

Además, se vio que las proteasas empleadas en las condiciones de procesado 10 a 12 eran capaces de convertir todas las fracciones en nuevos productos por un procedimiento que incluía pretratamiento de la adiponectina multimérica con un ácido o una sal del mismo para convertir la fracción HMW-Ad en la fracción MMW-Ad, seguido de tratamiento con proteasas respectivas.

TABLA 2

2

\hskip0,3cm (+): Disminución, (++): Sin cambios, (+++): Aumento o producción de producto convertido

\hskip0,3cm (-): Desaparición o sin producción de producto convertido

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo de Referencia 7

Reactividad de reactivo de látex con especies de adiponectina

Se diluyó la mAd purificada tratada con proteasa con tampón ELISA para obtener muestras diluidas en un factor de 5 y en un factor de 25. Se diluyó cada una de las soluciones madre de látex preparadas en el Ejemplo de Referencia 5 diez veces con tampón de preparación de látex portador de anticuerpo y se empleó la solución diluida resultante como Reactivo 2. Se analizaron muestras (10 \muL) usando Reactivo 1 (tampón LTIA (R1)) (100 \muL) y Reactivo 2
(100 \muL) con un analizador bioquímico automático Hitachi 7170 (Hitachi, Ltd.) en las siguientes condiciones: longitud de onda: 570 nm; puntos de medición: 18 a 34. En la Fig. 2 se muestran los resultados.

Para ambos casos del reactivo de látex para el anticuerpo anti-rMgAd y el reactivo de látex para el anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401), la absorbancia varía según la concentración de la adiponectina e suero humano tratada con Protina AC o con Proteasa de Tipo X.

Por consiguiente, se vio que la Protina AC y la Proteasa de Tipo X eran capaces de convertir los multímeros de adiponectina en nuevos productos que conservaban sitios de reconocimiento de anticuerpo que pueden ser reconocidos por el anticuerpo anti-rMgAd y el anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401). Por lo tanto, se ha confirmado que estas proteasas pueden ser usadas en un pretratamiento para la medición de la adiponectina total en una muestra biológica.

Ejemplo de Referencia 8

Reactividad del reactivo ELISA con especies de adiponectina

Se diluyeron un anticuerpo para el Acrp30 humano \alpha de cabra y un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401) cada uno a 1 \mug/mL con una solución de sensibilización de anticuerpos ELISA. A continuación, se sensibilizó una placa ELISA con la mezcla resultante, seguido de bloqueo con un tampón ELISA. Se diluyó la mAd tratada con proteasa con el tampón ELISA para obtener muestras diluidas en un factor de 2, en un factor de 20 y en un factor de 200. Las muestras así obtenidas reaccionaron en la placa ELISA a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó la placa con el tampón ELISA y se la hizo reaccionar entonces a temperatura ambiente durante 1 hora con una solución de anticuerpo anti-rMgAd que había sido diluida 10.000 veces con el tampón ELISA. A continuación, se lavó la placa con el tampón ELISA y se la hizo reaccionar entonces a temperatura ambiente durante 1 hora con una solución de anticuerpo marcado con HRP para IgG de conejo \alpha de cabra que había sido diluida 1.000 veces con el tampón ELISA. Se lavó la placa con el tampón ELISA y se dejó que se revelara el color por reacción enzimática de HRP con tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. Se añadió ácido sulfúrico 2N a la mezcla de reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm. En la Fig. 3 se muestran los resultados de la medición

Cuando se usa una combinación de anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401) y el anticuerpo anti-rMgAd, o una combinación de anticuerpo para el Acrp30 humano \alpha de cabra y el anticuerpo anti-rMgAd para ELISA, la absorbancia varía según la concentración de la adiponectina sérica humana tratada con Protina AC o con Proteasa de Tipo X.

Por consiguiente, se vio que la Protina AC y la Proteasa de Tipo X eran capaces de convertir los multímeros de adiponectina en nuevos productos que conservaban sitios de reconocimiento de anticuerpos que pueden ser reconocidos por el anticuerpo para el Acrp30 humano \alpha de cabra, el anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64401) y el anticuerpo anti-rMgAd. Así, se ha confirmado que estas proteasas pueden ser usadas en un pretratamiento para la medición de la adiponectina total en una muestra biológica.

Ejemplo de Ensayo 2

Análisis de multímeros de adiponectina derivados de sangre humana

Se hizo una preparación reciente de mAd purificada según el Ejemplo de Referencia 3 y se sometió a PAGE (de un 2 a un 15%), seguido de tinción de proteínas con Azul Brillante Coomassie (CBB) (Fig. 4). A continuación, se sometió el producto a inmunotinción con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana comercial (hu Acrp30-MoAb) de un modo similar al empleado en el Ejemplo de Ensayo 1 y se analizó la imagen teñida. Los resultados indicaron que el multímero de adiponectina purificado a partir de suero humano tenía al menos cuatro tipos de adiponectina, consistentes en los tres tipos observados en el Ejemplo de Ensayo 1 y un tipo detectado en una pequeña cantidad en este Ejemplo de Ensayo. Según se identificaron en los perfiles electroforéticos de la Fig. 1, los tipos de adiponectina correspondientes a estas cuatro bandas teñidas con CBB fueron denominados como fracciones "HMW-Ad", "MMW-Ad", "LMW-Ad" y "ULMW-Ad" de arriba (alto peso molecular) abajo.

Ejemplo de Referencia 9

Procesamiento de mAd purificada mediante un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un surfactante o una proteasa

Se trató la mAd purificada analizada en el Ejemplo de Ensayo 2 usando un agente reductor, un ácido o una sal del mismo, un surfactante o una proteasa, solos o en combinación. Se observó la mAd purificada así tratada en cuanto a cualquier cambio en la forma estructural.

1) Combinación de un agente reductor y un ácido

Se prepararon varios tampones (cada uno 100 mM), tales como tampón Tris-HCl (pH 8,5) y tampones citrato de sodio (de pH 3,0 a pH 6,0) de tal manera que contuvieran mAd purificada mAd. En presencia o ausencia de un agente reductor (2-mercaptoetanol 10 mM), se calentaron esos tampones a 37ºC durante 30 minutos. Se sometieron las mezclas así tratadas a PAGE (de un 2 a un 15%), seguido de tinción de proteínas usando CBB. Se empleó una imagen teñida de una muestra que contenía Tris-HCl (pH 8,5) sin 2-mercaptoetanol (condición de procesado 13) como control y se observó el aumento o la disminución de intensidad de las bandas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad y ULMW-Ad en las condiciones de procesado respectivas. Además, se observó la producción de bandas atribuidas a nuevos productos convertidos (Tabla 3).

Como resultado, cuando no se añadió ningún agente reductor y el pH del tampón citrato de sodio era de 4,0 o superior (condiciones de procesado 15, 17 y 19), como el tampón citrato de sodio acidifica, las bandas teñidas correspondientes a una fracción HMWAd tendían a desaparecer y, sin embargo, aumentaba la intensidad de las bandas de una fracción MMW-Ad. En la condición de procesado 21 (pH 3,0), se observó una nueva banda teñida atribuida a un producto convertido que migraba en una distancia mayor que ULMW-Ad. Mientras tanto, en las condiciones de proceso 14 y 16, donde se añadió un agente reductor y el pH era de 6,0 o superior, las bandas teñidas atribuidas a HMW-Ad seguían presentes, mientras que, en las condiciones de procesado 18 y 20 (pH 5,0 y 4,0), desaparecían las bandas teñidas correspondientes a todas las fracciones y además se observaba una nueva banda ancha teñida en una posición casi igual a la de ULMW-Ad. En la condición de proceso 22 (pH 3,0), se observó una nueva banda ancha atribuida a productos convertidos en una posición casi igual a la observada en la condición de procesado 21.

Por los resultados antes descritos, cuando se trató adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad y ULMW-Ad) con un agente reductor y un ácido o una sal del mismo, se confirmó que se producía un nuevo producto convertido. Además, se supuso que los productos convertidos producidos en la condición de procesado 21 eran dímeros de adiponectina, que los productos convertidos producidos en condiciones de procesado que incluían la adición de un agente reductor (condiciones de procesado 14, 16, 18 y 20) eran trímeros de adiponectina y que los productos convertidos producidos en la condición de procesado 22 eran monómeros de adiponectina. Se extrajeron las bandas teñidas y se analizaron para confirmar que ULMW-Ad era un trímero de adiponectina y que LMW-Ad era un trímero de adiponectina unido por la albúmina.

TABLA 3

3

\hskip0,4cm (+): Disminución, (++): Sin cambios, (+++): Aumento o producción de producto convertido.

\hskip0,4cm (-): Desaparición o ausencia de producción de producto convertido.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Procesamiento con proteasa

Se añadieron mAd purificada y una proteasa comercial a tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) (a una concentración final de 1 mg/ml para cada uno) y se calentó la mezcla resultante a 37ºC durante 60 minutos. Se sometió la mezcla así tratada a PAGE (de un 2 a un 15%), seguido de tinción de proteínas usando CBB. A continuación, se empleó una imagen teñida de Tris-HCl (pH 8,5) que no contenía DTT (condición de procesado 1) como control y se observó el aumento o la disminución de intensidad de las bandas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad y ULMW-Ad en las condiciones de procesado respectivas. Además, se observó la producción de nuevas bandas atribuidas a productos convertidos (Tabla 4).

En cualquiera de las condiciones de procesado 23 a 25, todas las bandas teñidas correspondientes a las fracciones HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad y ULMW-Ad desaparecieron y se observó una nueva banda teñida atribuida a productos convertidos derivados de estas fracciones en una región de bajo peso molecular. Por procesado en cualquiera de las condiciones de procesado 26 a 28, desaparecieron las bandas teñidas correspondientes a las fracciones ULMW-Ad, LMW-Ad y MMW-Ad y se observaron nuevas bandas atribuidas a productos convertidos derivados de estas fracciones en regiones de bajo peso molecular. En este caso, no se observó ningún cambio para las bandas teñidas atribuidas a una fracción HMW-Ad.

Por los resultados antes descritos, cuando se trató adiponectina multimérica (HMW-Ad, MMW-Ad, LMW-Ad y ULMW-Ad) con proteasa, se confirmó la producción de un nuevo producto convertido a partir de la adiponectina multimérica. Las posiciones en las que se detectaron las bandas de estos productos convertidos por PAGE (de un 2 a un 15%) varían de 30 a 42 kDa, aunque las posiciones se desplazaban algo dependiendo del tipo de proteasa empleado. Se extrajeron las bandas teñidas y se sometieron a análisis de aminoácidos, el cual reveló que estos productos convertidos eran adiponectina globular.

Además, las proteasas empleadas en las condiciones de procesado 26 a 28 resultaron capaces de convertir todas las fracciones en nuevos productos mediante un procedimiento que incluía el pretratamiento de la adiponectina multimérica con un ácido o una sal del mismo para convertir la fracción HMW-Ad en la fracción MMW-Ad, seguido de tratamiento con proteasas respectivas.

TABLA 4

4

\hskip0,2cm (+): Disminución, (++): Sin cambios, (+++): Aumento o producción de producto convertido

\hskip0,2cm (-): Desaparición o sin producción de producto convertido

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo

Medición de la adiponectina en sangre total por procesamiento con ácido y surfactante en combinación (1) Preparación de la solución de pretratamiento

Se añadió un surfactante comercial a un tampón citrato de sodio 100 mM (pH 3,0, usado para establecer un tratamiento ácido). Los surfactantes empleados son SDS y Neoperex F65 (producto de KAO CORPORATION), los cuales son surfactantes aniónicos; Cortamine 24P y Cortamine 86P (productos de KAO CORPORATION), los cuales son surfactantes catiónicos; y Tritón X-100 y Tween 20, que son surfactantes no iónicos. Se añadió SDS en una concentración del 2% y se añadió cada uno de los demás en una concentración del 0,5%.

(2) Procesamiento de las muestras

Se añadió cada una (490 \muL) de las diversas soluciones de pretratamiento antes mencionadas a cada una (10 \muL) de las muestras de suero obtenidas de ocho voluntarios. Se diluyó la mezcla resultante 5.250 veces con tampón ELISA 2 sin hervir. Para hacer comparaciones en cuanto al efecto, se preparó una muestra control como sigue: se añadió Tris-HCl 50 mM (pH 6,8, 2% de SDS) (490 \muL), que servía como solución de pretratamiento, a cada uno (10 \muL) de los sueros anteriores, se agitó bien, se hirvió y se diluyó 5.250 veces con tampón ELISA 2. Se prepararon una serie de muestras estándar para calcular la concentración como sigue: Se añadió la mAd purificada que había sido analizada en el Ejemplo de Ensayo 2 a Tris-HCl 50 mM (pH 6,8, 2% de SDS), se hirvió y se hizo una dilución seriada con tampón ELISA 2.

(3) Medición de la adiponectina total

Se sensibilizó una placa de ELISA con un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana (64405) que había sido diluido con PBS a 5 \mug/mL, seguido de bloqueo con tampón ELISA 2. Se añadieron una muestra estándar y una solución tratada con suero (véase lo que antecede) a la placa y se hizo que reaccionaran a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó la placa con solución de lavado ELISA. Se añadió un anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana marcado con biotina (64404) que había sido diluido 2.000 veces con tampón ELISA 2 para reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió HRP-avidina, que había sido diluida 2.000 veces con tampón ELISA 2, a la placa para reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se lavó la placa con solución de lavado ELISA. Para el revelado de color, se empleó una solución de revelado de color de OPD (tampón citrato 250 mM que contenía 2 mg/ml de clorhidrato de ortofenilendiamina y un 0,02% de peróxido de hidrógeno, pH 5,0). Se detuvo la reacción por adición de una solución de interrupción (ácido sulfúrico 1,5N, EDTA-2Na 1 mM) y se midió la absorbancia a 492 nm. Se calcularon los niveles (concentración) de adiponectina total de las muestras de suero que habían sido tratadas con las respectivas soluciones de pretratamiento en relación a los valores de color del color revelado de las muestras estándar. Se realizó un análisis de correlación, en el que la ebullición con Tris-HCl 50 mM (pH 6,8, 2% de SDS) representa la condición comparativa (Tabla 5).

El análisis revela que, cuando se trataron las muestras con un ácido sin adición de un surfactante, se obtuvo un excelente coeficiente de correlación, pero la pendiente de la ecuación de regresión era de 0,45, la cual es baja en comparación con un valor correspondiente obtenido del control. Bajo la coexistencia de un surfactante, se obtuvo un mejor coeficiente de correlación y las mediciones de las muestras tendían a aproximarse a las del control. En particular, se obtuvo un efecto notable por adición de un surfactante aniónico. Por lo tanto, el método de pretratamiento de la presente invención resultó conseguir la medición de la cantidad total de adiponectina en una muestra sin hervir la muestra.

TABLA 5

5

\hskip0,2cm (Control) = Tris-HCl 50 mM, pH 6,8 (2% de SDS), hervido.

Claims (5)

1. Un método de determinación de la cantidad total de adiponectina presente en una muestra biológica como indicador de enfermedades relacionadas con el estilo de vida, cuyo método consiste en:

(a) procesar la muestra que contiene multímeros de adiponectina con un ácido o una sal del mismo y un surfactante sin hervir para convertir los multímeros de adiponectina en un producto convertido derivado de adiponectina, donde la concentración del ácido o de su sal varía de 1 a 1.000 mM, y, cuando se usa el ácido o su sal como un tampón, el pH del tampón es de 4 o inferior; y

(b) determinar la cantidad total de la adiponectina midiendo el producto convertido derivado de adiponectina en la muestra usando un método de inmunoensayo.

2. El método según la reivindicación 1, donde el método de inmunoensayo es seleccionado entre LTIA (inmunoensayo turbidimétrico con látex), ELISA (enzimoinmunoensayo), CLEIA (enzimoinmunoensayo quimioluminiscente) y RIA (radioinmunoensayo).

3. El método según la reivindicación 1, donde el ensayo inmunológico es realizado mediante el uso de un soporte insoluble al que se une un anticuerpo anti-adiponectina.

4. Un reactivo de inmunoensayo para determinar inmunológicamente la cantidad total de adiponectina presente en una muestra biológica, donde el reactivo incluye un primer y un segundo reactivo, donde el primer reactivo contiene:

- un ácido o una sal del mismo usados como tampón con un pH de 4 o inferior y

- un surfactante

y es capaz de convertir los multímeros de adiponectina en un producto convertido derivado de adiponectina sin hervir cuando la concentración del ácido o de su sal varía entre 1 y 1.000, mM, y el segundo reactivo contiene un soporte insoluble portador de un anticuerpo para determinar la cantidad total de adiponectina.

5. El reactivo según la reivindicación 4, donde el anticuerpo para determinar la cantidad total de adiponectina es un anticuerpo anti-adiponectina puesto en una placa de ELISA.