CN1379235A - 高密度脂蛋白胆固醇测定方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂,它是用聚乙烯硫酸盐和表面活性剂与极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)结合掩蔽,高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)不受掩蔽,并受胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)作用,在一定的波长处测得吸光度与高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)含量成正比,而求得高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)含量。按该方法及试剂,能够直接测定、无须标本前处理、不须沉淀和离心、不堵塞管道、稳定性强,在2至8度温度下贮存,能稳定一年以上,并且,特别适合进行批量自动分析,测定结果受外界干扰小,它对满足医院快捷、准确的要求具有十分积极的现实意义。
Description
本发明涉及一种高密度脂蛋白胆固醇的测定方法及试剂。
高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是动脉粥样性质病的保护因子，是心血管疾病的预防和危险评估的一个重要指标。HDL-C的测定，国内普遍采用磷钨酸-镁沉淀法，此法需预先处理、沉淀分离非HDL脂蛋白组份，再吸取高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)组份，整个分离过程采用吸管吸取样品，操作误差大(对不同的操作人误差更大)，血清标本预处理时间长达30分钟，不适合进行批量自动分析，无法满足医院快捷、准确的要求，近年来，国外也开发了一些在自动生化分析仪上使用的HDL-C直接测定试剂，他们常用硫酸葡聚糖、肝素、磷钨酸、聚乙二醇、环湖精、低聚糖等二价金属离子来掩蔽HDL脂蛋白外的脂蛋白组份，再进行DHL-C检测。在这些方法中，常用高浓度的镁离子和上述聚阴离子、糖化合物、非HDL脂蛋白形成的书絮状混合物，当检测完毕，检测废液被排出，其过程中易与排液管道中的其他碱性废液形成氢氧化镁而发生沉淀，引起管道堵塞，容易对自动分析仪造成不良影响(如总蛋白试剂废液含高浓度的氢氧化纳)。
本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种使试剂能够直接测定、无须标本前处理、不须沉淀和离心、不堵塞管道、稳定性强，测定结果受外界干扰小的高密度脂蛋白胆固醇测定方法及试剂。
为了达到上述目的，本发明所设计的高密度脂蛋白胆固醇测定方法，是用聚乙烯硫酸盐和表面活性剂与极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)结合掩蔽，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)不受掩蔽，并受胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)作用，根据不同敏感的显色剂，在波长546nm至700nm内选择确定的波长处测得吸光度与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量成正比，而求得高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。为了提高测定的精确度，该方法所采用的测定试剂包括胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)、过氧化物酶(POD)、缓冲液和表面活性剂，在测定试剂中还可含有聚乙烯硫酸盐。为了得到最为理想的检测效果，本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，特别可以分为两个组份A、B，胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)可以全部设在A组份中，也可以全部设在B组份中或A、B组份中分别设置；A、B组份的其它成份组成是：
A组份：
缓冲液 5-500mmol/L
聚乙烯硫酸盐 0.5mg/L-5000mg/L
中性多聚物 0.1mg/L-500mg/L
显色剂 0.1mmol/L-10mmol/L
防腐剂 0.01g/L-5g/L
稳定剂 0.01mmol/L-200mmol/L
表面活性剂 0.05-50g/L
去干扰剂 0.005-20mmol/L
B组份：
缓冲液 5-500mmol/L
4-氨基安替比林 0.05-1g/L
表面活性剂 0.01-20ml/L
稳定剂 0.005-50g/L
防腐剂 0.01-5g/L
为了提高其稳定性，消除测定结果在测定过程中受外界的多种干扰，所述的表面活性剂可以是非离子表面活性剂：聚氧乙烯类表面活性剂：Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、Tween失水山梨醇聚氧乙烯系列、TritonX-100、乳化剂OP、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚等，也可以是两性离子表面活性剂EMPIGEN BB，另外，也可以用胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、SDS、聚乙二醇，在此，特别选用聚氧乙烯类表面活性剂。表面活性剂的用量因具体不同成份而定，不须特别限制。去干扰剂可以是EDTA.Fe3+、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾；稳定剂可以是BSA、聚乙二醇、多元醇、EDTA。2Na、二价金属离子、抗生素；防腐剂可以是NaN3、PC-300；显色剂可以是酚或酚的衍生物：TOOS、TOPS、TODB、MADB；缓冲液可以是GOOd‘S系列缓冲液、Tris、磷酸盐；再者，为了更好提高选择性作用，在所述的测定试剂中还可设有0.01-5g/L硫酸葡聚糖，这样，无须高浓度的金属离子，就不易堵塞管道。
另外，为了对HDL选择作用更好，在测定试剂中还可设有0.05-5g/L的硫酸葡聚糖。
本发明所得到的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，使试剂能够直接测定、无须标本前处理、不须沉淀和离心、不堵塞管道、稳定性强，在2至8度温度下贮存，能稳定一年以上，并且，特别适合进行批量自动分析，测定结果受外界干扰小，这种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂对满足医院快捷、准确的要求具有十分积极的现实意义。
下面通过实施例对本发明作进一步的描述，但本发明绝不限于以下的实施例或被这些实施例所限。
实施例1：
本实施例描述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，分为A、B两个组份：
A组份：PH6.5缓冲液MES 100mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
防腐剂NaN3 0.9g/L
4-氨基安替比林 0.3g/L
稳定剂EDTA-2Na 0.1mmol/L
BSA 1g/L
表面活性剂PEG6000 20g/L
Brij35 0.3g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
抗坏血酸氧化酶 5000U/L
B组份：PH7.0缓冲液MES 50mM
显色剂TOOS 1.5mmol/L
CEH 2000U/L
COD 5000U/L
POD 20KU/L
表面活性剂胆酸钠 3mmol/L
Triton X-100 0.3ml/L
稳定剂MgCl2 5mmol/L
EDTA.2Na 0.5mmol/L
BSA 2g/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
本实施例描述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如日立7060自动分析仪，操作如下：
计算：HDL-C(mmol/L)＝C标准*(ΔA测定/ΔA标准)
| 加入物 | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
| 试剂A | 300μl | 300μl | 300μl |
| 蒸馏水 | 3μl | ||
| 标准液 | 3μl | ||
| 标本 | 3μl | ||
| 混合，置37℃预孵育3至5分钟，在主波长546nm/辅助波长660nm读取各管吸光度A1 | |||
| 试剂B | 100μl | 100μl | 100μl |
| 混匀，置37℃孵育5分钟，在主波长546nm/辅助波长660nm下读取各管吸光度A2；计算ΔA＝A2-A1 | |||
实施例2：
本实施例描述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，是在测定试剂中去掉常用的抗坏血酸氧化酶，并将稳定剂EDTA.2Na改换成EDTA-Fe3+，以降低总体成本。
A组份：PH7.0缓冲液PIPES 50mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
显色剂TOOS 1.5mmol/L
防腐剂NaN3 0.9g/L
稳定剂EDTA-Fe3+ 0.5mmol/L
BSA 1g/L
表面活性剂PEG6000 20g/L
Brij35 0.3g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
B组份：PH7.0缓冲液PIPES 200mM
4-氨基安替比林 0.3g/L
CEH 2000U/L
COD 5000U/L
POD 20KU/L
表面活性剂胆酸钠 3mmol/L
Triton X-100 0.3ml/L
稳定剂MgCl2 5mmol/L
EDTA.2Na 0.5mmol/L
BSA 2g/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
实施例3：
本实施例描述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，是将胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)全部设在A组份中：
A组份：PH7.0缓冲液MOPS 10mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
显色剂TOOS 1.5mmol/L
防腐剂PC300 0.5g/L
稳定剂EDTA-Fe3+ 0.5mmol/L
BSA 1g/L
表面活性剂PEG6000 20g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
EMPIGEN BB 0.3g/L
CEH 850U/L
COD 2000U/L
POD 1KU/L
稳定剂MgCl2 10mmol/L
B组份：PH7.0缓冲液PIPES 100mM
4-氨基安替比林 0.3g/L
表面活性剂胆酸钠 3mmol/L
Triton X-100 0.3ml/L
Brij35 0.3g/L
稳定剂EDTA.2Na 0.5mmol/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
实施例4：
本实施例描述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，是将胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)分别设在A组份和B组份中：
A组份：PH6.5磷酸盐缓冲液 50mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
显色剂HDAOS 2.5mmol/L
防腐剂NaN3 0.9g/L
稳定剂EDTA-Fe3+ 0.5mmol/L
乙二醇 20％
表面活性剂PEG6000 20g/L
Brij35 0.3g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
COD 2000U/L
POD 1KU/L
稳定剂MgCl2 10mmol/L
B组份：PH7.0缓冲液Tris 50mM
4-氨基安替比林 0.3g/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
CEH 2000U/L
稳定剂MgCl2 5mmol/L
EDTA.2Na 0.5mmol/L
表面活性剂胆酸钠 3mmol/L
Triton X-100 0.3ml/L
实施例5：
本实施例描述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，是在测定试剂中增设硫酸葡聚糖，由此对HDL选择作用更好。
A组份：PH6.8缓冲液Pipes 100mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
显色剂TODB 3mmol/L
防腐剂NaN3 0.9g/L
稳定剂EDTA-Fe3+ 0.5mmol/L
BSA 1g/L
表面活性剂PEG6000 20g/L
表面活性剂Tween-80 0.6g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
硫酸葡聚糖 0.5g/L
CEH 850U/L
COD 2000U/L
POD 1KU/L
稳定剂MgCl2 10mmol/LB组份：PH7.0缓冲液BES 100mM
4-氨基安替比林 0.3g/L
防腐剂PC300 0.3ml/L
表面活性剂胆酸钠 3mmol/L
聚氧乙烯苯基醚 3ml/L
稳定剂EDTA.2Na 0.5mmol/L
Claims (6)
1、一种高密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征是用聚乙烯硫酸盐和表面活性剂与极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)结合掩蔽，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)不受掩蔽，并受胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)作用，根据不同敏感的显色剂，在波长546nm至700nm内选择确定的波长处测得吸光度与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量成正比，而求得高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。
2、根据权利要求1所述的高密度脂蛋白胆固醇测定方法，它包括胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)、过氧化物酶(POD)、缓冲液和表面活性剂，其特征是在测定试剂中含有聚乙烯硫酸盐。
3、一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是它分为两个组份A、B，胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)可以全部设在A组份中，也可以全部设在B组份中或A、B组份中分别设置；
A、B组份的其它成份组成是：
A组份：缓冲液 5-500mmol/L
聚乙烯硫酸盐 0.5mg/L-5000mg/L
中性多聚物 0.1mg/L-500mg/L
显色剂 0.1mmol/L-10mmol/L
防腐剂 0.01g/L-5g/L
稳定剂 0.01mmol/L-200mmol/L
表面活性剂 0.05-50g/L
去干扰剂 0.005-20mmol/L
B组份：缓冲液 5-500mmol/L
4-氨基安替比林 0.05-1g/L
表面活性剂 0.01-20ml/L
稳定剂 0.005-50g/L
防腐剂 0.01-5g/L
4、根据权利要求2或3所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是所述的表面活性剂特别选用聚氧乙烯类表面活性剂。
5、根据权利要求2或3所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是在所述的测定试剂中还设有0.05-5g/L的硫酸葡聚糖。
6、根据权利要求4所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是在所述的测定试剂中还设有0.05-5g/L的硫酸葡聚糖。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |