CN103124906B - 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法 - Google Patents

高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法 Download PDF

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Abstract

公开了不需要复杂的操作即可定量被检测试样中的高密度脂蛋白3(HDL3)中的胆固醇的方法。HDL3中的胆固醇的定量方法包含使与高密度脂蛋白3进行特异性反应的表面活性剂与被检测试样反应，定量胆固醇。可以不需要超离心、前处理等复杂的操作，而通过自动分析装置特异性地定量被检测试样中的HDL3胆固醇。此外，也可以根据通过作为现有技术的被测物中HDL总胆固醇定量法而得到的总HDL胆固醇量，计算出HDL3胆固醇量的差，从而定量HDL2胆固醇量。

Description

高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法
技术领域
本发明涉及高密度脂蛋白3（以下有时称为“HDL3”）中的胆固醇（HDL3中的胆固醇以下有时称为“HDL3胆固醇”）的定量方法。
背景技术
高密度脂蛋白（HDL）胆固醇与由于从包括动脉硬化壁在内的各组织接收胆固醇而蓄积在细胞内的胆固醇的去除作用有关，因此也被称为胆固醇逆向转运体系。已知其与冠状动脉硬化等动脉硬化疾病成负相关，已知HDL为低值时作为血脂异常病的一种而设定有低值界限，作为动脉硬化的指标有用。
HDL由载脂蛋白和磷脂、胆固醇、中性脂肪构成。HDL分类为比重为d＝1.063～1.210g/mL、进一步d＝1.063～1.125g/mL的HDL2和d＝1.125～1.210g/mL的HDL3的2种组分。根据脂蛋白的分布曲线，在d＝1.125部分确认到凹口，从这里开始比重重的部分为HDL3。此外，还存在根据HDL中的载脂蛋白中的载脂蛋白E含量差，将载脂蛋白E的含量多的HDL作为载脂蛋白E-rich HDL的亚组分的分类法。
已知不仅现有的所有HDL蛋白，而且HDL2和HDL3各亚组分也显示出不同的作用。已知在临床中，由于CETP缺损，HDL无法代谢成LDL、IDL，HDL胆固醇量增加。由于CETP缺损而增加的HDL为HDL2。HDL2被认为具有抗动脉硬化作用。此外，也被认为由于CETP缺损，载脂蛋白E-rich HDL上升，对于Apo-E―richi HDL，其胆固醇去除能强，具有抗血小板作用，被认为是HDL中的有益蛋白。此外，由于肝脂酶活性的降低，HDL3不变化为HDL2，HDL3增加。启示了HDL3的增加导致冠动脉疾病的发病率增加。推测根据这些倾向，分别测定HDL亚组分有助于判断动脉硬化疾病的有无、原因。此外，现在各制造商都在进行基于这些HDL亚组分的作用，阻碍CETP的作用，使LDL胆固醇量减少，使HDL胆固醇量增加的治疗药的研发。
确立HDL亚组分的简便的测定方法可能关系着详细的作用的解明、它们的治疗效果。
作为到目前为止已知的HDL亚组分的测定方法，已知有超离心法、高效液相色谱法（HPLC）法、HDL3沉淀法（专利文献1）、NMR法等。
超离心是利用脂蛋白的比重差通过离心进行分级的方法，具有操作需要熟练、花费数日、以及费用也高的缺点。对于冈崎等人的使用HPLC分离HDL2和HDL3的方法，操作需要时间，需要特别的设备。HDL3沉淀法是通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂使HDL3以外的物质凝集，通过离心回收上清部分的HDL3，通过自动分析装置进行测定的方法。其也具有操作需要熟练、此外是手动方法需要被测物的前处理操作、到测定为止需要花费一定的时间等缺点，不通用。此外，NMR法是通过核磁共振测量脂蛋白的粒子数的方法，需要特殊的设备，不常用。
需要说明的是，存在HDL亚组分的分析方法(专利文献2)。可以通过通用自动分析装置测定，使用通过使用表面活性剂阻碍HDL3以外的脂蛋白不受酶的作用的方法，HDL3反应中，存在目标以外的脂蛋白，在对测定产生影响、或者在未阻碍完全的情况下，有测量到HDL3以外的脂蛋白的可能。
需要发明代替这样的方法可以简便且更选择性地定量胆固醇量的试剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 : 日本特开2009-207463号公报
专利文献2 : 日本特开2001-346598号公报。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种不需要复杂的操作即可定量被检测试样中的HDL3的方法。
解决问题的技术手段
本申请发明人经过深入研究，结果发现了与高密度脂蛋白3进行特异性反应的表面活性剂。于是想到，通过使被检测试样与这样的表面活性剂反应定量胆固醇，从而可以定量被检测试样中的HDL3胆固醇，并实验性地确认了上述想法可以实现，从而完成了本发明。
即本发明提供一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包含使与高密度脂蛋白3进行特异性反应的表面活性剂与被检测试样反应，定量胆固醇，所述表面活性剂的浓度为1%～5.0%（w/v）。
发明效果
根据本发明，可以不需要超离心、前处理等复杂的操作，而通过自动分析装置特异性地定量被检测试样中的HDL3胆固醇。此外，也可以根据通过作为现有技术的被测物中HDL总胆固醇定量法而得到的总HDL胆固醇量，计算出HDL3胆固醇量的差，从而定量HDL2胆固醇量。
附图说明
[图1] 是表示本发明的实施例中进行的、添加试剂K后的各组分的吸光度变化的结果的图。
具体实施方式
作为供于本发明的方法的被检测试样，只要是要定量其试样中的HDL3胆固醇的被检测试样就没有特别限定，优选为血清或血浆或它们的稀释物，特别优选血清或其稀释物。
本发明的方法中，使与HDL3进行特异性反应的（与HDL3以外的脂蛋白几乎不反应）表面活性剂与被检测试样反应。作为与HDL3进行特异性反应的表面活性剂，可以列举出聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、聚氧乙烯月桂基醚和对异辛基聚氧乙烯苯酚甲醛聚合物这样的非离子表面活性剂；月桂基二甲基-氨基醋酸内铵盐这样的两性表面活性剂；以及脂肪酸族磷酸酯这样的阴离子表面活性剂。这些表面活性剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。其中，特别优选聚氧乙烯月桂基醚。
更具体而言，作为与HDL3进行特异性反应的表面活性剂的例子，作为非离子表面活性剂，可以列举出作为聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的エマルゲンA90（商品名、花王公司制，以下，公司名为制造公司，与公司名一起记载的全部为商品名）、作为聚氧乙烯月桂基醚的エマルゲン120（花王）、作为对异辛基聚氧乙烯苯酚甲醛聚合物的Triton-WR-1339（ナカライ）、作为聚氧乙烯月桂基醚的パーソフトNK-100（日本油脂）；作为两性表面活性剂，可以列举出作为月桂基二甲基-氨基醋酸内铵盐的ニッサンアノンBL-SF（日本油脂）；作为阴离子表面活性剂，可以列举出作为脂肪酸族磷酸酯的アデカコールPS-440E（旭电化）。
本发明中对表面活性剂使用“反应”这一词时，表示表面活性剂使酶容易对脂蛋白进行作用以导出至反应体系外，或者进行保护使酶无法作用于脂蛋白。
表面活性剂的浓度优选为0.01～5.0%（w/v），进一步优选为0.05～2.0%（w/v）。
本发明的方法中，通过上述表面活性剂的反应定量胆固醇。胆固醇的定量方法本身是公知的，可以采用公知的任一种方法，下述实施例中也有具体的记载。例如，对脂蛋白中的酯型胆固醇，使用胆固醇酯酶水解，生成游离型胆固醇和脂肪酸，使用胆固醇氧化酶使生成的游离型胆固醇和原本存在于脂蛋白中的游离胆固醇产生胆甾烯酮和过氧化氢，使其在过氧化酶的存在下形成醌色素进行定量。作为产生醌色素的化合物，可以列举出，例如HDAOS(N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、DAOS(N-乙基-N(-2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠)或TOOS(N-乙基-N(-2-羟基- 3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠二水合物）和4-氨基安替比林，只要是可以产生醌色素的组合即可，但不限定于这些。在后述的前工序中使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下，本发明的工序（使其与HDL3特异的表面活性剂反应工序）中，可以直接使用前工序中使用的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，不需要重新添加。
对于产生醌色素的化合物的浓度，例如，为HDAOS时，浓度优选为0.5～2.0mmol/L左右，为4-氨基安替比林时优选为0.1～2.0mmol/L，此外，过氧化酶的浓度优选为0.4～5.0U/mL。此外，在用过氧化氢酶分解前工序中产生的过氧化氢的工序中，使用作为过氧化氢酶的抑制剂的叠氮化钠，添加到第二工序的反应液中。此时的叠氮化钠的浓度通常为0.1g/L～1.0g/L左右。
反应液中可以使用能够在通常的生物化学反应中使用的各种缓冲液，优选pH在5～8之间的缓冲液。作为溶液，优选Good、Tris、磷酸、甘氨酸的缓冲溶液，优选作为Good缓冲液的双（2-羟基乙基）亚氨基三（羟基乙基）甲烷（Bis-Tris）、哌嗪-1,4-二（2-乙磺酸）（PIPES）、哌嗪-1,4-二（2-乙磺酸）、1.5钠盐、一水合物（PIPES1.5Na）、3-吗啉代丙磺酸（MOPSO）、N,N-双（2-羟基乙基）-2-氨基乙磺酸（BES）、2-［4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪基］乙磺酸（HEPES）和哌嗪-1,4-双（2-羟基-3-丙磺酸）（POPSO）
反应温度优选为25～40℃左右，进一步优选为35～38℃，最优选为37℃。反应时间没有特别限定，通常为2～10分钟左右。
对于本发明的方法，可以直接使上述表面活性剂与被检测试样反应来进行，而若先进行将HDL或HDL3中的胆固醇以外的胆固醇移动至反应体系外的前工序，对进行该前工序后的试样进行上述本发明的方法，则可以更准确地定量HDL3胆固醇，因而优选。
前述前工序优选在与HDL以外的脂蛋白反应的表面活性剂或者与HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂的存在下进行。作为与HDL以外的脂蛋白反应的表面活性剂，优选聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯壬基苯基醚和酰胺非离子这样的非离子表面活性剂；聚氧乙烯烷基醚硫酸钠酰胺非离子这样的阴离子表面活性剂；和/或HLB值为14～17的聚氧乙烯多环苯基醚这样的非离子系表面活性剂。这些表面活性剂可以单独使用，也可以组合2种以上使用。更具体而言，可以列举出プルロニックP123（旭电化）プルロニックF88（旭电化）、レベノールWX（花王)、ノニオンHS220(日本油脂) 、ナイミッドMT-215（日本油脂）、Newcol-723（日本乳化剂）、Newcol-2614（日本乳化剂）、Newcol-714（日本乳化剂）。
作为与HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂，可以列举出聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯-硬脂胺等非离子表面活性剂；酰胺醚硫酸盐等阴离子表面活性剂；椰子油脂肪酸-酰胺丙基二甲基-氨基醋酸内铵盐、烷基二甲基-氨基醋酸内铵盐和月桂基甜菜碱等两性表面活性剂；以及月桂基三甲基氯化铵这样的阳离子表面活性剂，但不限定于这些。更具体而言，作为非离子表面活性剂，可以列举出作为聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的エマルゲンA500（商品名、花王公司制，以下，公司名为制造公司，与公司名一起记载的全部为商品名）、作为聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物的プルロニックF127（旭电化）、プルロニックF68（旭电化）プルロニックP103（旭电化）、作为聚氧乙烯-硬脂胺的ナイミーンS210（日本油脂）；作为阴离子可以列举出作为酰胺醚硫酸盐的サンアミドCF-10（日本油脂）；作为两性表面活性剂可以列举出作为椰子油脂肪酸-酰胺丙基二甲基-氨基醋酸内铵盐的ニッサンアノンBDF-SF（日本油脂）、作为烷基二甲基-氨基醋酸内铵盐的ニッサンアノンBF（日本油脂）、作为月桂基甜菜碱的アンヒトール24B（花王）；作为阳离子表面活性剂可以列举出作为月桂基三甲基氯化铵的コータミン24P（花王）。这些可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
前工序中使用的表面活性剂的浓度优选为0.01～5.0重量%，更优选为0.03～3.0重量%左右。
前工序中，受到表面活性剂的反应使胆固醇移动至反应体系外。这里“移动至反应体系外”是指，通过消除或保护胆固醇及其酯，使在之后的工序中胆固醇及其酯不参与。
这里“消除”是指，将被检测试样中的脂蛋白的胆固醇分解，在之后的工序中，使其不作用于胆固醇测定的反应。作为用于消除脂蛋白胆固醇的方法，可以列举出使用过氧化氢酶将使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用而产生的过氧化氢分解成水和氧的方法。此外，也可以使用过氧化酶使供氢体与产生的过氧化氢反应转化为无色醌，但不限定于这些。消除胆固醇的方法本身是该领域中公知的，下述实施例中也有具体的记载。
“保护”是指，为了使被检测试样中的脂蛋白在之后的工序中不在胆固醇测定中反应而进行保护。保护脂蛋白可以列举出使用特异性地保护各脂蛋白的表面活性剂以使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶不作用于其的方法，但不限定于这些。
本申请发明人进一步发现，磷脂酶和鞘磷脂酶作用于脂蛋白，但几乎不作用于HDL3。因此，通过除了上述表面活性剂以外，还使磷脂酶和/或鞘磷脂酶（以下，有时将两者统称为“磷脂酶等”）共存，可以更加准确地定量HDL3胆固醇，因而优选。
作为磷脂酶，至少是作用于磷脂酰胆碱的物质即可，优选磷脂酶A、磷脂酶C和磷脂酶D，特别优选磷脂酶C和磷脂酶D。磷脂酶等市场上有售，因而可以优选使用市售品。磷脂酶等可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
磷脂酶等的最终浓度（使用2种以上时为其总浓度，以下相同）优选为0.1～100U/mL左右，更优选为0.2～50U/mL左右。
需要说明的是，即使在前工序中使表面活性剂共存的情况下，反应条件（反应温度、时间、缓冲液等）也如上面所述。
前工序也可以通过预先同时添加用于使胆固醇移动至反应体系外的酶系、表面活性剂，将两工序以单一工序的形式同时进行。需要说明的是，第1工序和第2工序中使用不同的表面活性剂。
前工序中，在使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下，胆固醇酯酶的浓度（本说明书中，浓度在无特别说明时表示最终浓度）优选为0.1～10.0U/mL左右，更优选为0.2～2.0U/mL左右。胆固醇氧化酶的浓度优选为0.05～10.0U/mL左右，更优选为0.1～1.0U/mL左右。需要说明的是，对于胆固醇酯酶，只要是作用于酯型胆固醇的就没有特别限制，例如可以使用旭化成公司制的胆固醇酯酶(CEBP、CEN)、东洋纺公司制的胆固醇酯酶(COE-311、COE-312)等市售品。此外，对于胆固醇氧化酶，只要是作用于游离型胆固醇的就没有特别限制，例如可以使用旭化成公司制的胆固醇氧化酶(CONII)、东洋纺公司制的胆固醇氧化酶（COO-311、COO-321、COO-331）等市售品。
前工序中，在使用过氧化酶的情况下，过氧化酶的浓度优选为2.0～5.0单位/mL左右，进一步优选为3.0～4.0单位/mL左右。此外，在使用转化为无色醌的化合物的情况下，其浓度优选为0.4～0.8mm0l/L左右。
前工序的其它条件（反应温度、反应时间、缓冲液等）可以与上述本发明的方法相同。
以下基于实施例更具体地说明本发明。但是本发明不受下述实施例的限定。
实施例
参考例1
制备以下试剂组成的试剂A和试剂B，分别制备在试剂A中添加0.1%（w/v）或1.0%（W/V）浓度的各种表面活性剂而成的试剂。即将要测定之前以1：3的比例混合加入有各种表面活性剂的下述试剂A与试剂B，使HDL2组分和HDL3组分的胆固醇反应，测定主波长700nm、副波长600nm下的最终吸光度，并进行比较。
HDL2组分和HDL3组分如以下那样操作进行分级。使用含有HDL的被检测试样即血清中使用氯化钠和溴化钠而成的溶液，通过超离心进行分级使得HDL2和HDL3以界限比重(1.125)分离，回收各组分。
下述表1中示出了HDL2/HDL3的比率为0.75以下、CM～IDL/HDL3、LDL/HDL3为0.75以下的表面活性剂，将它们作为与HDL3反应的表面活性剂。表2中示出了HDL2/HDL3的比率为1.25以上、CM～IDL/HDL2、LDL/HDL2的比率为1.25以上的表面活性剂，将它们作为与HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂。表3中示出了HDL2/HDL3的比率在0.75～1.25之间、CM～IDL/HDL2、LDL/HDL2、CM～IDL/HDL3、LDL/HDL3的比率为0.75以下的表面活性剂，将它们作为与HDL反应的表面活性剂。表4中示出了HDL2/HDL3的比率在0.75～1.25之间、CM～IDL/HDL2、LDL/HDL2、CM～IDL/HDL3、LDL/HDL3的比率为0.75以上的表面活性剂，将它们作为与所有的脂蛋白进行反应的表面活性剂。表5中示出了不符合上述条件的表面活性剂，将它们作为与HDL以外的脂蛋白反应的表面活性剂。
试剂A
BES缓冲液 (pH7.0） 　100mmol/L
HDAOS　 　0.7mmol/L
过氧化氢酶　 　600U/L
胆固醇氧化酶　　 1.4U/mL
胆固醇酯酶　 　0.8U/mL。
试剂B
BES缓冲液 （pH6.6）　 100mmol/L
叠氮化钠　 0.1%
4-氨基安替比林 　4.0mmol/L
过氧化酶　 2.4U/mL。
[表1]
（单位：Abs×10000）
エマルゲンA90、エマルゲン120、ニッサンアノンBL-SF、Triton-WR-1339、パーソフトNK-100、アデカトールPS440E是与HDL3进行特异性反应的表面活性剂。
[表2]
（单位：Abs×10000）
エマルゲンA500、ニッサンアノンBDF-SF、ニッサンアノンBF、ナイミーンS210、プルロニックP103、コータミン24P、サンアミドCF-10、アンヒトール24B、プルロニックF68、プルロニックF127是与HDL3以外的脂蛋白进行反应的表面活性剂。
[表3]
（单位：Abs×10000）
エマルゲンB66、エマルゲンA60、エマルゲンLS110、Nowol610、Newcol2609、Newcol-CMP-11、ニッサンアノンGLM-RLV、Newcol-710是与HDL进行特异性反应的表面活性剂。
[表4]
（单位：Abs×10000）
エマルゲン108、エマルゲン707、Newcol707、アデカトールLB83、アデカトールLB103、エマルゲン909是与所有的脂蛋白进行特异性反应的表面活性剂。
[表5]
（单位：Abs×10000）
Newcol-714、Newcol-723、Newcol2614、ナイミーンS215、プルロニックP123、レベノールWX、ナイミッドMT215、ノニオンHS220、プルロニックF88是与HDL以外的脂蛋白进行特异性反应的表面活性剂。
实施例1
使用超离心将CM～LDL组分、HDL2组分、HDL3组分分级，使其与下述试剂J反应，进一步地添加下述试剂K，进行测定。关于测定，在血清2μL中添加150μL的试剂E，加热反应5分钟后，添加试剂K进一步加热反应5分钟，测定主波长700nm、副波长600nm下的吸光度。
试剂J
BES缓冲液 （pH7.0）　 100mmol/L
HDAOS　 0.7mmol/L
プルロニックP103 0.03w/v%
过氧化氢酶　　 600U/L
胆固醇氧化酶　　 1.4U/mL
胆固醇酯酶　　 0.8U/mL
磷脂酶D　　 5.0U/mL。
试剂K
BES缓冲液 （pH6.6）　 100mmol/L
叠氮化钠 　0.1%
エマルゲン120 　1.0%
4-氨基安替比林 　4.0mmol/L
过氧化酶　　 2.4U/mL。
添加试剂K后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图1。可以观察得知对HDL3进行特异性反应。

Claims (1)

1.高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包含使与高密度脂蛋白3进行特异性反应的表面活性剂与被检测试样反应，定量胆固醇，所述表面活性剂的浓度为1％～2.0％(w/v)，表面活性剂为选自エマルゲンA90、エマルゲン120、ニッサンアノンBL-SF、Triton-WR-1339、パーソフトNK-100和アデカトールPS440E中的至少1种。
CN201180036065.6A 2010-07-23 2011-07-22 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法 Active CN103124906B (zh)

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