ES2278395T3 - Procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteinas de baja densidad. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para cuantificar el colesterol LDL, por el cual el colesterol LDL se cuantifica por separado simplemente si necesidad de operación centrífuga complicada. El procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteína de baja densidad de acuerdo con la presente invención comprende una primera etapa para eliminar colesterol en lipoproteína de alta densidad, lipoproteína de muy baja densidad y quilomicron en una muestra de prueba, y una segunda etapa de cuantificación del colesterol restante en la muestra de prueba.
Description
Procedimiento para cuantificar el colesterol en
lipoproteínas de baja densidad.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteínas de
baja densidad (LDL). El colesterol el lipoproteínas de baja densidad
a partir de ahora también se denominará como "colesterol LDL".
En la presente memoria, el término "colesterol" incluye tanto
el colesterol del tipo éster como el colesterol libre, lo cual es
importante para el diagnóstico de la esclerosis arterial.
Las LDL desempeñan un papel principal en el
transporte del colesterol en la sangre, y la mayoría del colesterol
depositado sobre la pared de los vasos sanguíneos en la esclerosis
arterial pultácea se originan a partir de las LDL. El incremento en
la cantidad de LDL en plasma es uno de los principales factores de
riesgo en la esclerosis pultácea tal como la cardiopatía isquémica,
de forma que la cuantificación individual del colesterol LDL es
clínicamente importante.
Los procedimientos convencionales para
cuantificar el colesterol LDL incluye un procedimiento que
comprende dos pasos, a saber, una operación de fraccionamiento y una
operación para cuantificar el colesterol, y un procedimiento en el
cual se determinan los niveles en sangre de colesterol total,
colesterol HDL y triglicéridos, y la cantidad de colesterol LDL se
determina de acuerdo con la ecuación de Friedewald.
La operación de fraccionamiento incluye el
procedimiento de la ultracentrifugación, el procedimiento de la
precipitación, el procedimiento inmunoquímico, y similares. En el
procedimiento de la ultracentrifugación, las LDL se separan
explotando la diferencia en la gravedad específica mediante una
ultracentrífuga, y se mide la cantidad de colesterol en las mismas.
En el procedimiento de la precipitación, se añaden un anticuerpo
anti-HDL, un polianión y un catión divalente para
formar un precipitado insoluble, y se cuantifica el colesterol LDL
en el sobrenadante después de la centrifugación (WPI nº de acceso
85-116848/20). En el procedimiento inmunoquímico,
se unen un anticuerpo anti-HDL, un anticuerpo
anti-VLDL y un anticuerpo anti-CM a
partículas de látex, y las partículas de látex se eliminan mediante
centrifugación o pasándolas a través de un filtro después de la
aglutinación, seguido por la cuantificación del colesterol LDL (WPI
nº de acceso 84-301275/49). Sin embargo, estos
procedimientos convencionales son problemáticos en su simplicidad o
coste.
De acuerdo con la ecuación de Friedewald, la
cantidad de colesterol LDL se calcula sustrayendo la cantidad de
colesterol HDL de la cantidad de colesterol total, y restando a
continuación 1/5 de la cantidad de triglicéridos. Sin embargo,
puesto que este procedimiento no toma en consideración la influencia
por la dieta y la diferencia individual, este procedimiento es
problemático en su exactitud.
Recientemente se ha informado sobre un
procedimiento para la cuantificación del colesterol LDL, el cual no
requiere la operación de fraccionamiento (WPI nº acceso
83-766269/38). No obstante, en este procedimiento,
la especificidad para las LDL no es suficiente.
El objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para cuantificar el colesterol LDL,
mediante el cual se cuantifica individualmente el colesterol LDL de
forma simple, sin requerir una complicada operación con
centrífuga.
Los actuales inventores han descubierto que la
cantidad de colesterol en LDL puede cuantificarse suprimiendo en el
primer paso el colesterol distinto del colesterol que está en las
lipoproteínas de baja densidad, y midiendo el colesterol restante
en el segundo paso subsiguiente, completando de ese modo la presente
invención.
Es decir, la presente invención proporciona un
procedimiento para cuantificar el colesterol en las lipoproteínas
de baja densidad en una muestra de ensayo, la cual puede contener
lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de elevada densidad,
o proteínas de muy baja densidad y/o quilomicrones, procedimiento
que comprende un primer paso para eliminar el colesterol en las
lipoproteínas de elevada densidad, en las lipoproteínas de muy baja
densidad y los quilomicrones en una muestra de ensayo, y un segundo
paso de cuantificación del colesterol restante en dicha muestra de
ensayo.
Mediante la presente invención se proporciona un
procedimiento para cuantificar el colesterol LDL, mediante el cual
se cuantifica individualmente el colesterol LDL de forma simple, sin
requerir una complicada operación con centrífuga.
\newpage
La Figura 1 muestra la correlación entre los
resultados de la medición del colesterol LDL en el Ejemplo 1 y la
cantidad calculada mediante la ecuación de Friedewald.
La Figura 2 muestra la correlación entre los
resultados de la medición del colesterol LDL en el Ejemplo 2 y la
cantidad calculada mediante la ecuación de Friedewald.
La Figura 3 muestra la correlación entre la
concentración de colesterol LDL, en ausencia o presencia de HDL,
VLDL y CM, y la absorbancia medida mediante la presente invención en
el Ejemplo 4.
El colesterol contenido en las lipoproteínas
incluye el colesterol del tipo éster (ésteres de colesterol) y el
colesterol libre. En esta memoria, el término "colesterol"
incluye ambos de éstos, a menos que se especifique lo
contrario.
La muestra de ensayo sometida al procedimiento
de la presente invención puede ser cualquier muestra que puede
contener lipoproteínas tales como las HDL, LDL, VLDL y los CM. Los
ejemplos de las muestras de ensayo incluyen los fluidos corporales
tales como la sangre, el suero y el plasma, así como las diluciones
de los mismos, aunque las muestras de ensayo no están restringidas
a ellos.
El procedimiento de la presente invención
comprende un primer paso y un segundo paso. En el primer paso se
suprime el colesterol en las HDL, VLDL y en los CM en la muestra de
ensayo, y en segundo paso se cuantifica el colesterol restante en
la muestra de ensayo. Puesto que el colesterol en las HDL, VLDL y en
los CM se elimina en el primer paso, el colesterol cuantificado en
el segundo paso es mayoritariamente el colesterol en las LDL en la
muestra de ensayo.
El término "suprimir" en el primer paso en
la presente invención significa descomponer el colesterol y hacer
que el producto descompuesto sea indetectable en el segundo paso
subsiguiente. Los procedimientos para eliminar selectivamente el
colesterol en las lipoproteínas distintas de las LDL, es decir, en
las HDL, VLDL y en los CM, y similares, incluye los siguientes
procedimientos.
Esto es, se preparan la colesterol esterasa y la
colesterol oxidasa para actuar sobre la muestra de ensayo en
presencia de un tensioactivo que actúa sobre las lipoproteínas
distintas de las lipoproteínas de baja densidad, y el peróxido de
hidrógeno generado se elimina.
Los procedimiento para suprimir el peróxido de
hidrógeno incluyen un procedimiento en el cual el peróxido de
hidrógeno se descompone en agua y oxígeno mediante la catalasa; y un
procedimiento en el cual se hace reaccionar un compuesto donante de
hidrógeno, basado en fenol o basado en anilina, con el peróxido de
hidrógeno para convertir el peróxido de hidrógeno en un quinona
incolora, aunque los procedimientos para eliminar el peróxido de
hidrógeno no se restringen a estos procedimientos.
La concentración de la colesterol esterasa en la
mezcla de reacción en el primer paso preferiblemente puede ser
aproximadamente de 0,2 a 1,0 U/ml, y la colesterol esterasa puede
originarse preferiblemente de una bacteria perteneciente al género
Pseudomonas. La concentración de la colesterol oxidasa
preferiblemente puede ser aproximadamente de 0,1 a 0,7 U/ml, y la
colesterol oxidasa puede originarse preferiblemente de una bacteria
o levadura. La concentración de la catalasa preferiblemente puede
ser aproximadamente de 40 a 100 U/ml, y la concentración de la
peroxidasa mediante la cual el peróxido de hidrógeno se convierte en
una quinona incolora, preferiblemente puede ser aproximadamente de
0,4 a 1,0 U/ml. La concentración del compuesto donante de hidrógeno
basado en fenol o basado en anilina puede preferiblemente ser
aproximadamente de 0,4 a 0,8 mmol/l.
Los tensioactivos preferidos que actúan sobre
las lipoproteínas distintas de las LDL, los cuales se usan en el
primer paso, incluyen los derivados del óxido de polialquileno que
tienen valores de HLB que no son inferiores a 13 y no son
superiores a 15, preferiblemente que no son inferiores a 13 y no son
superiores a 14. Los ejemplos de derivados en la presente invención
incluyen los productos de condensación con alcoholes superiores,
los productos de condensación con ácidos grasos superiores, los
productos de condensación con amidas de ácidos grasos superiores,
los productos de condensación con alquilaminas superiores, los
productos de condensación con alquilmercaptanos superiores y los
productos de condensación con alquilfenoles. El procedimiento para
calcular el HLB de los tensioactivos es bien conocido, y se
describe, por ejemplo, en Hiroshi HORIUCHI, "New Surfactants",
1986, Sankyo
Shuppan.
Shuppan.
Los ejemplos específicos preferidos de los
derivados del óxido de polialquileno que tienen valores de HLB que
no son inferiores a 13 y no son superiores a 15, incluyen el éter
laurílico de polioxietileno, el éter cetílico de polioxietileno, el
éter oleico de polioxietileno, el éter de alcohol superior de
polioxietileno, el éter octílico fenílico de polioxietileno, el
éter nonilfenílico de polioxietileno, y similares, cuyo valor de
HLB no es inferior a 13 y no es superior a 15, aunque el
tensioactivo no está restringido a éstos.
\newpage
También puede usarse un tensioactivo catiónico
como el tensioactivo usado en el primer paso. En este caso, se
prefieren como tensioactivo catiónico aquéllos que tienen la sal de
amonio cuaternaria como un grupo hidrofílico, representados por la
fórmula (I) siguiente,
en donde R representa de forma
independiente un grupo alquilo lineal C1-C8, y R\1
representa un grupo alquenilo
C3-C20.
La concentración de los tensioactivos
mencionados más arriba y usados en el primer paso preferiblemente
puede ser aproximadamente de 0,1 a 10 g/l, más preferiblemente
aproximadamente de 0,5 a 5,0 g/l.
La reacción en el primer paso preferiblemente
puede llevarse a cabo en un tampón con un pH de 5 a 8, y el tampón
preferiblemente puede ser uno que contenga una amina, tal como un
tampón Tris, trietanolamina o el tampón de Good. Son especialmente
preferidos el Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES y
POPSO, los cuales son tampones de Good. La concentración del tampón
preferiblemente puede ser aproximadamente de 10 a 500 mM.
Para inhibir la reacción con las LDL y para
incrementar el grado de supresión de las otras lipoproteínas, la
mezcla de reacción puede contener un metal divalente. Los ejemplos
preferidos del ion metálico divalente incluyen el ion de cobre, el
ion de hierro y el ion de magnesio. Entre éstos, el ion de magnesio
es especialmente preferido. La concentración del ion metálico
divalente preferiblemente puede ser aproximadamente de 5 a 200
mM.
Opcionalmente, puede añadirse una lipoproteinasa
a la mezcla de reacción en el primer paso. Se prefiere la adición
de este enzima porque especialmente el colesterol en las VLDL
reacciona fácilmente. La concentración de este enzima en la mezcla
de reacción preferiblemente puede ser aproximadamente de 5,0 a 10,0
U/ml.
La temperatura de reacción en el primer paso
preferiblemente puede ser aproximadamente de 25\degC a 40\degC, y
37\degC es la más preferida. El tiempo de reacción puede ser
aproximadamente de 2 a 10 minutos.
En el segundo paso subsiguiente, se cuantifica
el colesterol restante en la muestra de ensayo. Esto puede llevarse
a cabo, por ejemplo, añadiendo un tensioactivo que actúa al menos
sobre las LDL, y cuantificar el peróxido de hidrógeno mediante la
acción de la colesterol esterasa y de la colesterol oxidasa añadidas
en el primer paso. Aquí, el tensioactivo que actúa al menos sobre
las LDL puede ser un tensioactivo que selectivamente actúa sobre
las LDL solas, o puede ser un tensioactivo que actúa sobre todas las
lipoproteínas.
Los ejemplos preferidos de los tensioactivos que
actúan sobre todas las lipoproteínas incluyen los derivados del
óxido de polialquileno que tienen valores de HLB que no son
inferiores a 11 y que no son superiores a 13, preferiblemente que
no son inferiores a 12 y que no son superiores a 13. Los ejemplos de
derivados en la presente invención incluyen los productos de
condensación con alcoholes superiores, los productos de condensación
con ácidos grasos superiores, los productos de condensación con
amidas de ácidos grasos superiores, los productos de condensación
con alquilaminas superiores, los productos de condensación con
alquilmercaptanos superiores y los productos de condensación con
alquilfenoles.
Los ejemplos específicos preferidos de los
derivados del óxido de polialquileno que tienen valores de HLB que
no son inferiores a 11 y no son superiores a 13, incluyen el éter
laurílico de polioxietileno, el éter cetílico de polioxietileno, el
éter oléico de polioxietileno, el éter de alcohol superior de
polioxietileno, el éter octílico fenílico de polioxietileno, el
éter nonilfenílico de polioxietileno, y similares, cuyo valor de
HLB no es inferior a 11 y no es superior a 13, aunque el
tensioactivo no está restringido a éstos.
Los ejemplos de los tensioactivos que actúan
selectivamente sobre las LDL solas incluyen los tensioactivos
aniónicos. Aunque los tensioactivos aniónicos usados en la presente
invención no están restringidos, se prefieren aquéllos que tienen
uno o más anillos aromáticos a los cuales están unidos uno o más
grupos alquilos C4-C18 lineales o ramificados. En
la presente invención, el anillo aromático puede ser preferiblemente
aquéllos consistentes en átomos de carbono y átomos de hidrógeno,
tales como el benceno, el naftaleno y el difenilo. Son preferidos
también aquellos en los cuales están unidos uno o más grupos
hidrofílicos, tales como el grupo sulfonato, a los anillos
aromáticos mencionados más arriba. Los ejemplos preferidos de tales
tensioactivos aniónicos incluyen aquéllos representados por las
Fórmulas (II) a (VI) siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En las Fórmulas (II) a (VI), R representa de
forma independiente el grupo alquilo C4-C18 lineal o
ramificado. Los ejemplos preferidos de los tensioactivos aniónicos
que pueden usarse en el segundo paso incluyen también el sulfato
sódico de alcoholes superiores y similares.
La concentración de los tensioactivos usados en
el segundo paso preferiblemente puede ser aproximadamente de 0,1 a
100 g/l, más preferiblemente aproximadamente de 1 a 50 g/l.
Otras condiciones de reacción preferidas en el
segundo paso son las mismas que las condiciones de reacción
preferidas en el primer paso.
La presente invención se describirá ahora más
concretamente por medio de ejemplos de la misma. No obstante, debe
mencionarse que la presente invención no está restringida por los
ejemplos siguientes.
Ejemplo
1
| Tampón BES, pH 6,0 | 100 mmol/l | |
| HDAOS: N-(2-hidroxisulfopropil)-3,5-dimetiloxianilina | 0,7 mmol/l | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Colesterol esterasa, obtenida a partir de un bacteria perteneciente al género Pseudomonas (marca comercial "CEN", disponible comercialmente en Asahi Chemical Industry Co. Ltd.) \end{minipage} | 0,8 U/ml | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Colesterol oxidasa, obtenida a partir de un bacteria perteneciente al género Streptomyces (marca comercial "COO", disponible comercialmente en Toyobo Co. Ltd.)\end{minipage} | 0,5 U/ml | |
| Catalasa | 80 U/ml | |
| Cloruro magnésico | 10 mmol/l | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Emulgen B66, disponible comercialmente en KAO CORPORATION (derivado de polioxietileno (HLB = 13,2)) \end{minipage} | 0,2% |
| Tampón BES, pH 7,0 | 50 mmol/l | |
| 4-aminoantipirina | 4,0 mmol/l | |
| Peroxidasa | 2,4 U/ml | |
| Azida sódica | 0,1% | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Emulgen A60, disponible comercialmente de KAO CORPORATION (derivado de polioxietileno (HLB = 12,8))\end{minipage} | 5,0% |
A cada una de las 4 muestras con un volumen de 4
\mul que contenían HDL, LDL, VLDL y CM purificados, a una
concentración respectivamente de 100 mg/dl en términos de
colesterol, se les añadieron 300 \mul de los primeros reactivos
descritos más arriba, los cuales se habían calentado previamente a
37\degC, y cada una de las mezclas resultantes se dejó reaccionar a
37\degC durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 100 \mul de
los segundos reactivos a cada mezcla, y cada una de las mezclas
resultantes se dejó reaccionar durante 5 minutos, seguidos por la
medición de la absorbancia de cada mezcla de reacción a 600 nm. En
base a las absorbancias medidas, se calcularon las cantidades de
colesterol, y se calculó la proporción de la cantidad así calculada
respecto la cantidad de colesterol en la muestra, la cual se define
como proporción de captura. Los resultados se muestran en la Tabla
1 siguiente.
Tal como se muestra en la Tabla 2, mediante el
procedimiento descrito más arriba, se capturó la mayoría del
colesterol en las LDL, mientras que el colesterol en las otras
lipoproteínas no se capturó sustancialmente, de forma que puede
cuantificarse selectivamente el colesterol en las LDL.
Ejemplo
2
| Tampón PIPES, pH 7,0 | 50 mmol/l | |
| HDAOS | 0,7 mmol/l | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Colesterol esterasa, procedente de un bacteria perteneciente al género Pseudomonas (marca comercial "CEN", disponible comercialmente en Asahi Chemical Industry Co. Ltd.) \end{minipage} | 0,8 U/ml | |
| \begin{minipage}[t]{120mm} Colesterol oxidasa, procedente de un bacteria perteneciente al género Streptomyces (marca comercial "COO", disponible comercialmente en Toyobo Co. Ltd.) \end{minipage} | 0,5 U/ml | |
| Catalasa | 80 U/ml | |
| Cloruro magnésico | 10 mmol/l | |
| Emulgen B66, disponible comercialmente en KAO CORPORATION | 0,2% |
| Tampón PIPES, pH 7,0 | 50 mmol/l | |
| 4-aminoantipirina | 4,0 mmol/l | |
| Peroxidasa | 2,4 U/ml | |
| Azida sódica | 0,1% | |
| Triton X100 | 3,0% |
Se repitieron los mismos procedimientos que en
el Ejemplo 1, y se midió la reactividad de cada lipoproteína. Los
resultados se muestran en la Tabla 2 siguiente.
Ejemplo
3
Se repitieron los procedimientos en Ejemplos 1 y
2 usando sueros de personas normales como muestras de ensayo para
medir las concentraciones de colesterol LDL. Como controles, se
midieron las concentraciones de colesterol LDL en los sueros
empleando la ecuación de Friedewald (CLIN. CHEM., 41:1414,
1995). Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2, mostrando
la correlación entre los mismos.
Tal como se muestra en las Figuras 1 y 2, los
resultados de las mediciones mediante ambos procedimientos
coinciden, de forma que se demostró que el colesterol en las LDL
puede cuantificarse con exactitud mediante el procedimiento de la
presente invención.
Ejemplo
4
| Tampón de Good, pH 7,0 | 50 mmol/l | |
| HDAOS | 0,7 mmol/l | |
| Colesterol esterasa | 0,8 U/ml | |
| Colesterol oxidasa | 0,5 U/ml | |
| Catalasa | 80 U/ml | |
| Tensioactivo catiónico (cloruro de lauril trimetilamonio) | 0,1% |
| 4-aminoantipirina | 4,0 mmol/l | |
| Peroxidasa | 2,4 U/ml | |
| Azida sódica | 0,1% | |
| Tensioactivo no iónico (éter laurílico de polioxietileno) | 0,1% | |
| (El tensioactivo no iónico se usó en la segunda reacción.) |
Se mezclaron veinte microlitros de una muestra
con 180 \mul de los primeros reactivos, previamente calentado a
37\degC, y la mezcla resultante se dejó reaccionar a 37\degC durante
5 minutos. A continuación, se añadieron 60 \mul de los segundos
reactivos, y la mezcla resultante se dejó reaccionar durante 5
minutos, seguidos por la medición de la absorbancia a 600 nm.
La Figura 3 muestra la relación entre la
concentración del colesterol LDL y la absorbancia. Tal y como puede
verse en la Figura 3, el colesterol LDL puede medirse
específicamente y de forma dependiente de la concentración incluso
en presencia de HDL, VLDL y CM.
Ejemplo
5
Usando sueros como muestras de ensayo, se
repitieron los mismos procedimientos que en el Ejemplo 4 para
determinar la concentración de colesterol LDL. Como controles, se
midieron las concentraciones de colesterol LDL en los sueros
empleando la ecuación de Friedewald (CLIN. CHEM., 41:1414,
1995). Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tal y como se
muestra en la Tabla 3, los resultados obtenidos mediante el
procedimiento de la presente invención coinciden con los resultados
calculados de acuerdo con la ecuación de Friedewald.
Claims (13)
1. Procedimiento para cuantificar el colesterol
en las lipoproteínas de baja densidad en una muestra de ensayo, la
cual puede contener lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de
elevada densidad, lipoproteínas de muy baja densidad y/o
quilomicrones, procedimiento que comprende un primer paso para
eliminar el colesterol en las lipoproteínas de elevada densidad, en
las lipoproteínas de muy baja densidad y en los quilomicrones en
una muestra de ensayo, y un segundo paso de cuantificación del
colesterol restante en dicha muestra de ensayo, en donde dicho
primer paso se lleva a cabo mediante las acciones de la colesterol
esterasa y la colesterol oxidasa en presencia de un tensioactivo,
el cual actúa sobre las lipoproteínas distintas de las lipoproteínas
de baja densidad, y mediante la supresión del peróxido de hidrógeno
generado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el cual dicho segundo paso comprende añadir un tensioactivo que
actúa sobre al menos las lipoproteínas de baja densidad, y
cuantificar el peróxido de hidrógeno generado mediante las acciones
de dicha colesterol esterasa y colesterol oxidasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el cual dicho tensioactivo, el cual actúa sobre al menos las
lipoproteínas de baja densidad, es un tensioactivo que actúa sobre
todas las lipoproteínas.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho tensioactivo, el cual
actúa sobre las lipoproteínas distintas de las lipoproteínas de baja
densidad, y el cual se usa en dicho primer paso, es un derivado del
óxido de polialquileno que tiene un valor de HLB que no es inferior
a 13 y no es superior a 15.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el cual dicho tensioactivo, el cual actúa sobre todas las
lipoproteínas usadas en dicho segundo paso, es un derivado del óxido
de polialquileno que tiene un valor de HLB que no es inferior a 11
y es inferior a 13.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el cual dicho tensioactivo, el cual actúa sobre las lipoproteínas
distintas de las lipoproteínas de baja densidad, y el cual se usa en
dicho primer paso, es un tensioactivo catiónico.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el cual dicho tensioactivo catiónico tiene una sal de amonio
cuaternaria.
8. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el cual dicho tensioactivo, el cual actúa al menos sobre las
lipoproteínas de baja densidad, y el cual se usa en el segundo paso,
es un tensioactivo aniónico.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el cual dicho primer paso se lleva a
cabo a una concentración de dicho tensioactivo de 0,1 a 10 g/l.
10. Procedimiento según la reivindicación 5 u 8,
en el cual dicho derivado de polioxilaquileno, el cual tiene un
valor de HLB que no es inferior a 11 y es inferior a 13, o dicho
tensioactivo aniónico, usado en dicho segundo paso, tienen una
concentración de 1 a 100 g/l.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el cual dichos primer y segundo paso se
llevan a cabo en un tampón con un pH de 5 a 8.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el cual dicho tampón contiene una amina.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el cual dichos primer y segundo paso se
llevan a cabo a una temperatura de 25 a 40\degC.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP9-111944 | 1997-04-14 | ||
| JP9111944A JP3058602B2 (ja) | 1996-04-15 | 1997-04-14 | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2278395T3 true ES2278395T3 (es) | 2007-08-01 |
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