WO2007007392A1 - 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 - Google Patents

新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 Download PDF

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WO2007007392A1
WO2007007392A1 PCT/JP2005/012777 JP2005012777W WO2007007392A1 WO 2007007392 A1 WO2007007392 A1 WO 2007007392A1 JP 2005012777 W JP2005012777 W JP 2005012777W WO 2007007392 A1 WO2007007392 A1 WO 2007007392A1
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cholesterol
group
lipoprotein
polymer
reagent
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PCT/JP2005/012777
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Tomokazu Itai
Kiyoko Mori
Yo Yagura
Isao Koyama
Naoyuki Yamamoto
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Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F210/00—Copolymers of unsaturated aliphatic hydrocarbons having only one carbon-to-carbon double bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
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    • C08F293/005—Macromolecular compounds obtained by polymerisation on to a macromolecule having groups capable of inducing the formation of new polymer chains bound exclusively at one or both ends of the starting macromolecule using free radical "living" or "controlled" polymerisation, e.g. using a complexing agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention includes a polyethylene glycol segment having a group represented by the general formula [1], a monomer unit represented by the general formula [2], and a monomer unit represented by the general formula [3] as constituent components.
  • a reagent for measuring cholesterol in lipoproteins such as high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein (VLDL), and the like, using the polymer Specifically, in the direct measurement of cholesterol in a sample, HDL, LDL, and VLDL, a reagent for measuring cholesterol in a lipoprotein containing the polymer and a specific reagent using the measurement reagent.
  • the present invention relates to a method for measuring the cholesterol concentration in lipoproteins.
  • the measurement of cholesterol in serum and plasma lipoproteins is mainly used for the diagnosis of arteriosclerosis, cardiomyopathy, lipid abnormality analysis, etc., and is an important measurement item in the field of clinical examinations.
  • HDL-C HDL cholesterol
  • LD LC LDL cholesterol
  • guidelines are set even at the Arteriosclerosis Society, and it is one of the frequently measured items.
  • a method for directly measuring HDL-C that can be performed using an automated analyzer that does not perform centrifugation, etc., uses an anti-j8 lipoprotein antibody to protect lipoproteins other than HDL and only HDL-C.
  • Patent Document 1 a method of detecting only HDL-C using a sugar compound such as a cyclodextrin derivative and a modified enzyme (Patent Document 2), do not dissolve lipoproteins! ⁇ Method using surfactant (Patent Document 3), Method to detect HDL-C specifically after eliminating cholesterol in lipoproteins other than HDL (Patent Document 4), Non-HDL using caritas allenes There is a method for detecting HDL-C by forming a complex with a lipoprotein of this protein and protecting it (Patent Document 5).
  • LDL is protected with polyon and amphoteric surfactant, and in lipoproteins other than LDL.
  • Method to detect LDL-C after dissolving and erasing only lipoproteins other than LDL using surfactant Patent Document 7, Patent Document 8
  • Patent Document 9 a method for detecting LDL-C by protecting lipoproteins
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3446486
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2600065
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 2799835
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 3164829
  • Patent Document 5 International Publication WO98 / 59068
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-60600
  • Patent Document 7 Japanese Patent No. 3193634
  • Patent Document 8 Japanese Patent No. 3058602
  • Patent Document 9 International Publication WO98 / 59068
  • An object of the present invention is to provide a novel polymer, a method for measuring cholesterol in a lipoprotein, and a reagent for measurement, comprising the polymer.
  • the present invention provides:
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 3 represents a general formula [4] — COOR 4 [4]
  • R 4 represents an alkyl group, a haloalkyl group or a bornal group), and represents an alkyl group, an alkoxy group, an aralkyl group or an alkyl-powered rubermoyl group.
  • a biological sample is obtained by (1) cholesterol esterase (CHE) and cholesterol oxidase (CO), or (2) CHE, cholesterol dehydrogenase (CHD) and NAD.
  • CHE cholesterol esterase
  • CHD cholesterol dehydrogenase
  • P [Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphoric acid)] and reacted with hydrogen peroxide or NAD
  • P H [reduced nicotinamide adenine dinucleotide (phosphoric acid)]
  • a biological sample is reacted with (l) CHE and CO, or (2) CHE, CHD and NAD (P), and cholesterol is measured based on the hydrogen peroxide or NAD (P) H produced.
  • Eliminate cholesterol in lipoproteins other than specific lipoproteins from biological samples To remove cholesterol in lipoproteins other than a specific lipoprotein, and (1) CHE and CO, or (2) CHE, CHD and NAD ( A reagent for measuring cholesterol based on hydrogen peroxide or NAD (P) H produced by reaction with P), and containing the polymer according to any one of claims 1 to 7 A reagent for measuring cholesterol in a specific lipoprotein in a sample;
  • (6) (1) a polymer according to (1) above, (2) CHE, (3) CO, peroxidase (POD), and a coupler or Z and developer, and (4) a first medium comprising an aqueous medium
  • a kit for measuring cholesterol in a specific lipoprotein contained on one side
  • a kit for measuring cholesterol in lipoprotein comprising: a first reagent; and (8) a surfactant and (9) a second reagent containing an aqueous medium.
  • a polyethylene glycol segment having a group represented by the above general formula [1], a monomer unit represented by the general formula [2], and a general formula [3] By coexisting a polymer comprising a monomer unit as a constituent component (hereinafter sometimes abbreviated as “the polymer of the present invention”), a specific lipoprotein is protected and cholesterol in the specific lipoprotein is protected.
  • the reaction is inhibited, in other words, delayed or temporarily stopped, and the cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein is preceded, and the cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein is measured. can do.
  • cholesterol in a specific lipoprotein is measured by eliminating cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein that has been preceded by the reaction. Can. This makes it possible to measure cholesterol in the target lipoprotein without separating and separating lipoproteins other than the target lipoprotein to be measured. Furthermore, according to the present invention, the method for measuring cholesterol in lipoproteins, which is excellent in measurement accuracy, which is consistent with the measurement value obtained by the standard measurement method even in the measurement value of the abnormal lipid sample which has been a problem until now, and It becomes possible to provide a measurement reagent.
  • ki is usually an integer of 10 to 250, preferably ⁇ 20 to 200, more preferably ⁇ 40 to 150].
  • the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms represented by R 1 and R 2 may be linear or branched. , Ethyl group, ⁇ -propyl group, isopropyl group and the like.
  • the alkyl group represented by R 3 may be linear, branched or cyclic, and usually has 1 to 15 carbon atoms, preferably 3 to 8 carbon atoms.
  • the alkoxy group represented by R 3 may be linear, branched or cyclic, and usually includes those having 1 to LO, preferably 1 to 6 carbon atoms, specifically For example, methoxy group, ethoxy group, n_propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, n-pentyloxy group, isopentyloxy group, sec-pepoxy group Nthyloxy, tert-pentyloxy, neopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy, sec-hexyloxy, tert-hexyloxy, neohexyloxy, n-heptyloxy, isohexyl Ptyloxy, sec-heptyloxy, tert-heptyloxy, neoheptyloxy, n-octyloxy, iso
  • the Ararukiru group represented by R 3 includes generally one having 7 to 12 carbon atoms, specifically, for example, base Njiru group, Hue - Rupuropiru group, Hue - Rubuchiru group, Hue - Rupenchi Le group And a phenylhexyl group.
  • Examples of the alkyl-powered rubamoyl group represented by R 3 include those having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, which may be linear, branched or cyclic.
  • Examples include a moyl group, a cyclonolcarbamoyl group, and a cyclodecylcarbamoyl group. Examples thereof usually include those having 1 to 15 carbon atoms, preferably 3 to 12 carbon atoms.
  • haloalkyl group represented by R 4 a part or all of the hydrogen atoms in the alkyl group having 1 to 12 carbon atoms are halogen atoms (for example, fluorine atom, bromine atom, chlorine atom, iodine atom, etc.).
  • fluorine atoms are preferable.
  • those having 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms and specifically, for example, a fluoromethyl group, a chloromethyl group, Bromomethyl group, iodine methyl group, trifluoromethyl group, trifluoromethyl group, tribromomethyl group, 2-fluoroethyl group, 2-chloroethyl group, 2-bromoethyl group, 3-fluoropropyl group, 3-chloropropyl group 3-bromopropyl group, trifluoropropyl group, trichloropropyl group, tribromopropyl group, di (trifluoromethyl) methyl group, di (trichloromethyl) methyl group Tyl group, di (tribromomethyl) methyl group, heptafluoropropyl group, heptachloropropyl group, 4-fluorobutyl group, 4-chlorobutyl group, 4-ch
  • Decachlorooctylethyl group (one (CH) (CC1) CC1 group), heptadecabromooctyl
  • Ethyl group (-(CH) (CBr) CBr group), perfluorodecyl group, perchlorodecyl group,
  • Examples thereof include perbromodecyl group, perfluoroundecyl group, perchloroundecyl group, perbu mouth mound decyl group, perfluoro dodecyl group, park mouth rhododecyl group, perbu mouth mododecyl group and the like.
  • polyethylene glycol segment having a group represented by the general formula [1] examples include, for example, the general formula [5]
  • R 5 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 3 carbon atoms
  • R 6 represents a cyano group or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • E represents an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.
  • k represents an integer of 10 to 250.
  • the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms represented by R 5 and R 6 may be linear or branched, specifically, for example, a methyl group, An ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and the like.
  • the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms represented by E may be linear or branched, and specifically includes, for example, a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, a tetramethylene group, and pentamethylene.
  • Group straight-chain alkylene group such as hexamethylene group, for example, ethylidene group, propylene group, isopropylidene group, ethylethylene group, 1-methyltrimethylene group, 2-methyltrimethylene group, 1-methyltetramethylene group, 2- Examples thereof include branched alkylene groups such as a methyltetramethylene group, a 1-methylpentamethylene group, a 2-methylpentamethylene group, and a 3-methylpentamethylene group.
  • k is usually an integer of 10 to 250, preferably 20 to 200, more preferably 40 to 150.
  • a polymer comprising a polyethylene glycol segment having a group represented by the general formula [1], a monomer unit represented by the general formula [2] and a monomer unit represented by the general formula [3] as constituents present examples of the polymer of the invention include, for example, the general formula [6]
  • R 7 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 8 represents a cyano group or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • E represents an alkylene having 1 to 6 carbon atoms. Represents a group, n is 50 to 900
  • p is an integer of 50 to 900
  • m represents an integer of 1 ⁇ 10
  • ⁇ , R 5, R 6, E and k are as defined above.
  • the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms represented by R 7 and R 8 may be linear or branched.
  • the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms represented by E may be linear or branched.
  • linear alkylene groups such as methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, such as ethylidene group, propylene group, isopropylidene group, ethylethylene group, 1 -Methyltrimethylene group, 2-methyltrimethylene group, 1-methyltetramethylene group, 2-methyltetramethylene group, 1-methylpentamethylene group, 2-methylpentamethylene group, 3-methylpentamethylene group, etc.
  • branched alkylene group such as methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, such as ethylidene group, propylene group, isopropylidene group, ethylethylene group, 1 -Methyltrimethylene group, 2-methyltrimethylene group, 1-methyltetramethylene group, 2-methyltetramethylene group, 1-methyl
  • n and p are each independently an integer of usually 50 to 900, preferably 75 to 600.
  • m is an integer of usually 1 to 10, preferably 2 to 6.
  • the polymerization average molecular weight of the polymer of the present invention is usually 10,000 to 120,000, preferably 30,000 to 100,000.
  • the content of the polyethylene glycol segment having the group represented by the general formula [1] in the polymer of the present invention is usually 1 to 70% by weight, preferably 10 to 50% by weight.
  • the content of the monomer unit represented by the general formulas [2] and [3] in the polymer of the present invention is usually 20 to 80% by weight, preferably 50 to 80% by weight, respectively.
  • a polymer comprising a polyethylene glycol segment having a group represented by the general formula [1], a monomer unit represented by the general formula [2], and a monomer unit represented by the general formula [3] (the polymer of the present invention) ) Is for example the general formula [10]
  • Specific examples of the compound represented by the general formula [11] include acrylic acid and methacrylic acid.
  • Specific examples of the compound represented by the general formula [12] include, for example, tert-butyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, dodecyl methacrylate, bornal methacrylate, Methacrylic acid esters such as heptadecafluorooctyl methacrylate and 2,2,3,3,4,4,5,5-octafluoropentyl methacrylate, such as cyclohexyl acrylate ⁇ , ⁇ -unsaturated carboxylic acid esters such as acrylic acid esters, for example, ⁇ , ⁇ -unsaturated carboxylic acid amides such as cyclohexylmethacrylamide, for example, butyl ethers such as cyclohexyl vinyl ether, carboxymethyl Le to Byurushikuro, alpha of hexyl, etc., to Arirushikuro, beta -
  • the azo group-containing polyethylene glycol segment having a monomer unit represented by the general formula [10] may be a commercially available product or a suitably synthesized one by a conventional method. Specific examples in the case of using a commercially available product include polymer azo polymerization initiators (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) such as VPE-0201 and VPE-0601.
  • the azo group-containing polyethylene glycol segment having a monomer unit represented by the general formula [10] is produced according to the production method described in, for example, JP-A-6-93100 and JP-A-6-322089. You may use what you did. That is, for example, polyethylene glycol represented by the above general formula [13] and general formula [15]
  • examples of the halogen atom represented by X include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • the above production methods are preferably carried out in the presence of a basic catalyst.
  • a basic catalyst include, for example, triethylamine, diisopropylethylamine, ⁇ , ⁇ -dimethylamine, and the like.
  • Phosphorus piperidine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, 1,5-diazabicyclo [4.3.0] non-5-ene, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] unde force-7-en,
  • organic amines such as tri- ⁇ -butylamine and ⁇ -methylmorpholine
  • metal hydrides such as sodium hydride
  • basic alkali metal compounds such as ⁇ -butyllithium and tert-butyllithium.
  • the amount of the basic catalyst used is not particularly limited, but is represented by the general formula [14].
  • a diazo acid-containing dibasic acid dihalide a range force of usually 0.5 to 5 times mol, preferably 0.5 to 1.5 times mol for the azo group-containing dibasic acid or dehydrating agent shown in [15] It is.
  • dehydrating agent used in the method of reacting the polyethylene glycol with the diazo acid containing a azo group represented by the general formula [15] are those used as a dehydrating condensing agent.
  • inorganic dehydrating agents such as concentrated sulfuric acid, diphosphorus pentoxide, anhydrous zinc chloride, such as dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide )
  • Carbodiimides such as hydrochloride, polyphosphoric acid, acetic anhydride, carbodiimidazole, p-toluenesulfol chloride and the like.
  • the amount of the dehydrating agent used is not particularly limited. However, if the amount is too small, the reaction is slowed down and the molecular weight reached is too small. In addition, since it is not economical, the range force is usually appropriately selected from 1 to 5 times mol, preferably 2 to 3 times mol for the corresponding diazo acid containing azo group.
  • ethers such as jetyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane, etc., for example, carbon tetrachloride, chloroform, methylene chloride, dichloroethane, Halogenated hydrocarbons such as trichlorethylene, hydrocarbons such as n-hexane, benzene, toluene, xylene, esters such as ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, acetonitryl, ⁇ , ⁇ -Dimethylformamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacetamide and the like. These can be used alone or in appropriate combination of two or more.
  • the polyethylene glycol represented by the general formula [13] and the diazo acid-containing dibasic acid dihalide represented by the general formula [14] or the diazo compound containing the azo group represented by the general formula [15] The ratio of use with an acid is not particularly limited and is appropriately determined as necessary. However, it is preferable to use both in an equimolar amount in order to obtain a high molecular weight azo group-containing polyethylene glycol segment.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but if it is too high, the azo group decomposes, and if it is too low, the reaction rate slows down, requiring time for production, and a high molecular weight azo group-containing polyethylene glycol segment is produced.
  • the range force of 10 to 60 ° C is appropriately selected because it is difficult to obtain.
  • the reaction temperature may be increased in a stepwise manner by the low-temperature force.
  • reaction time varies depending on the production method, it is usually appropriately selected within the range of 1 to 60 hours.
  • the target product may be isolated as appropriate depending on the type and amount of raw materials used, basic catalyst, dehydrating agent, solvent, etc., and the state of the reaction solution. For example, in the case of a viscous reaction solution, After diluting the liquid with an appropriate solvent, impurities such as quaternary ammonium salts that are by-produced by operations such as filtration or washing with water are removed, and then the target azo group-containing polyethylene is removed by removing the solvent. Glycol segments can be obtained. Further, the obtained azo group-containing polyethylene glycol segment may be directly subjected to a polymerization reaction without purification and z or isolation.
  • the polymer of the present invention that is, a polyethylene glycol segment having a group represented by the general formula [1], a monomer unit represented by the general formula [2], and a monomer unit represented by the general formula [3]
  • Examples of the polymer comprising: a azo group-containing polyethylene glycol segment represented by the general formula [10], a compound represented by the general formula [11], and a compound represented by the general formula [12] in a hydrophilic organic solvent.
  • the monomer unit represented by the general formula [2] and the monomer unit represented by the general formula [3] The amount used is selected and set so that the ratio becomes the desired composition, and the polymerization reaction is performed. From the resulting solution, crystallization and isolation are performed using an insoluble organic solvent as a precipitant. It is.
  • Examples of the polymerization solvent include ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, alcohols such as methanol, ethanol, n -propanol, and isopropanol, and cyclic ethers such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane. And hydrophilic organic solvents such as N-methylpyrrolidone, ⁇ , ⁇ ′-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide and the like. These may be used alone or in appropriate combination of two or more. In addition, a water-containing solvent may be used as long as it does not affect the reaction.
  • ketones such as acetone and methyl ethyl ketone
  • alcohols such as methanol, ethanol, n -propanol, and isopropanol
  • cyclic ethers such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane.
  • hydrophilic organic solvents such as N-methylpyr
  • Examples of the polymerization reaction method include suspension polymerization, solution polymerization, Balta polymerization, and emulsion polymerization.
  • an azo group-containing polyethylene glycol segment and a normal radical polymerization initiator for example, azobisisobutyrate-tolyl, dimethyl 2,2′-azobisisobutyrate may be used in combination.
  • a chain transfer agent for example, lauryl mercaptan, octyl mercaptan, butyl mercaptan, 2-mercaptoethanol, butyl thioglycolate, etc.
  • a chain transfer agent for example, lauryl mercaptan, octyl mercaptan, butyl mercaptan, 2-mercaptoethanol, butyl thioglycolate, etc.
  • the concentration during the polymerization reaction the total of the azo group-containing polysiloxane segment and the compounds represented by the general formula [2] and the general formula [3] is usually 5 to 100% by weight (no solvent), preferably Is appropriately selected to be in the range of 5 to 80% by weight, more preferably 10 to 70% by weight, and still more preferably 20 to 50% by weight.
  • the polymerization reaction should be performed in an inert gas atmosphere.
  • the inert gas include nitrogen gas and argon gas.
  • the polymerization temperature is usually 30 to 120 ° C, preferably 60 to 100 ° C. Also, control the reaction by changing the polymerization temperature as the polymerization reaction progresses.
  • the polymerization time is usually 3 to 24 hours, preferably 5 to 15 hours.
  • the organic solvent used as the precipitating agent is not particularly limited as long as the produced polymer is precipitated as an insoluble material, and examples thereof include hexane, ethyl acetate, and jetyl ether. These may be used alone or in appropriate combination of two or more. Furthermore, if the amount of the solvent used is too small, the amount of the residual polymerization solvent and the amount of the unreacted residual monomer contained in the resulting copolymer increase, so that it is usually at least twice the volume of the polymerization solvent, preferably The volume is 3 to 20 times, more preferably 5 to 10 times.
  • the post-treatment after the reaction may be carried out in accordance with the post-treatment methods usually performed in this field.
  • the polymer of the present invention thus obtained can be used for, for example, a resin composition such as a coating resin composition or a coating resin composition, such as a hair or cosmetic base material (for example, a set agent or a treatment). It is expected to be used as a base material for cosmetics such as a base material for basic cosmetics, or as a mold release agent, coating agent, surface modifier, medical material, etc. It is useful as an additive for measuring cholesterol in specific lipoproteins.
  • the polymer of the present invention protects a specific lipoprotein and inhibits the reaction of cholesterol in the specific lipoprotein by appropriately selecting the composition ratio of monomer units constituting the polymer. can do. By utilizing this property, as described later, cholesterol in a specific lipoprotein can be specifically measured.
  • inhibitor means that the reaction of cholesterol in a specific protected lipoprotein is delayed or temporarily stopped.
  • a polymer that protects HDL and inhibits the reaction of cholesterol in HDL includes a monomer unit represented by general formula [2] (monomer A) and a monomer unit represented by general formula [3] (monomer B).
  • the composition ratio (weight ratio) to the above is usually 2 ⁇ monomer BZ monomer A, preferably 2 ⁇ monomer BZ monomer A ⁇ 3, and the monomer unit represented by general formula [2] and general formula [3]
  • the composition ratio (weight ratio) of the total monomer units (AB) and the polyethylene glycol segment (PEG) represented by the general formula [1] is usually 1 ⁇ ABZPEG ⁇ 10, preferably 2 ⁇ AB / PEG Polymers that are ⁇ 5 are preferred!
  • such a polymer is derived from, for example, a monomer unit strength methacrylic acid represented by the general formula [2], and the monomer unit represented by the general formula [3] is represented by the general formula [7].
  • R is an alkyl group having 6 to 12 carbon atoms, an alkoxy group, an alkoxy carbo group having 7 to 16 carbon atoms, a haloalkoxy carbo yl group, an alkyl group, a rubamoyl group, an aralkyl group, or a born- A polymer comprising a carboxylic group as a constituent component is preferred.
  • the alkyl group having 6 to 12 carbon atoms represented by R 9 is linear, Specific examples that may be branched or cyclic include those exemplified for those having 6 to 12 carbon atoms in the alkyl group represented by R 3 in the above general formula [3].
  • the alkoxy group represented by R 9 may be linear, branched or cyclic, and usually includes 1 to L0, preferably 1 to 6 carbon atoms, specifically Examples thereof include the same examples as those exemplified for the alkoxy group represented by R 3 in the above general formula [3].
  • the C7-C16 alkoxycarbo group represented by R 9 may be linear, branched, or cyclic. Specifically, for example, n-hexyloxy Carbonyl group, isohexyloxycarboxyl group, sec-hexyloxycarboxyl group, tert-hexyloxycarboxyl group, neohexyloxycarboxyl group, n-heptyloxycarboxyl- Group, isoheptyloxycarbonyl group, sec-heptyloxycarbol group, tert-heptyloxycarbon group, neoheptyloxycarbol group, n-octyloxycarbonyl group, Isooctyloxycarbol group, sec-octyloxycarboro group, tert-octyloxycarboro group, neooctyloxycarboro group, n-noroxycarboxyl group Group, isonoxy
  • haloalkoxycarbo group represented by R 9 some or all of the hydrogen atoms of an alkoxycarbonyl group usually having 2 to 13 carbon atoms, which may be linear, branched or cyclic, are halogen atoms ( For example, a fluorine atom, a bromine atom, a chlorine atom, an iodine atom, etc. are mentioned, and a fluorine atom is preferable. Among them, those having 2 to 13 carbon atoms, preferably 2 to L 1 are usually used.
  • a fluoromethoxycarbonyl group a chloromethoxycarbon group, a bromomethoxycarbon group, a iodine methoxycarbon group, a trifluoromethoxycarbon group, Trichloromethoxycarbol group, tribromomethoxycarbon group, 2-fluoroethoxycarboro group, 2-chloroethoxycarboro group, 2-bromoethoxycarboro group, 3-fluoropro Xycarbon group, 3-chloropropoxycarbol group, 3-bromopropoxycarbol group, trifluoropropoxycarbol group, tricloropropoxycarbol group, tribromopropoxycarbol group, di (Trifluoromethyl) methoxycarbon group, di (trichloromethyl) methoxycarbon group, di (tribromomethyl) methoxycarbon group, heptafluoropropoxycarbol group, heptachloropropoxycarbo- group Group, 4-fluorobutoxycarbol group, 4-
  • Borol group (—COOCH (CBr) H), perfluoropentyloxycarbol group,
  • Clodecyl carbonyl group perbromodecyloxy carboxylic group, perfluorodecyloxy carboxylic group, perchlorodecyloxy carboxylic group, norbromoundecyl chloro group
  • Examples thereof include a xylcarbol group, a perfluorododecyloxycarbol group, a park-ported rhododecyloxycarbol group, and a peru-ported mododecoxycarbonyl group.
  • Examples of the alkyl-powered rubamoyl group represented by R 9 include those having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, which may be linear, branched or cyclic. Examples thereof include those similar to the examples of the alkyl-powered rubamoyl group represented by R 3 in the above general formula [3].
  • Examples of the aralkyl group represented by R 9 usually include those having 7 to 12 carbon atoms.
  • examples of the aralkyl group represented by R 3 in the above general formula [3] include The same can be mentioned.
  • the monomer unit represented by the general formula [7] include, for example, dodecyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, bornyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, and cyclohexyl acrylate. , Heptadecafluorooctyl methacrylate, 2,2,3,3,4,4,5,5-octafluoropentyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, cyclohexyl vinyl ether, Examples include those derived from vinyl cyclohexyl, allyl cyclohexyl, allyl benzene and the like. [0074] (2) LDL protection polymer
  • the ratio (weight ratio) is usually BZA ⁇ 1, preferably 0.5 ⁇ BZA ⁇ 1, and the monomer unit represented by general formula [2] and the monomer unit represented by general formula [3]
  • the composition ratio (weight ratio) of the mer (AB) and the polyethylene glycol segment (PEG) represented by the general formula [1] is usually 1 ⁇ AB / PEG ⁇ 10, preferably 2 ⁇ AB / PEG ⁇ 5 Is preferred.
  • a monomer unit represented by the general formula [2] is derived from methacrylic acid or acrylic acid, and the monomer unit represented by the general formula [3] Formula [8]
  • R 1U represents an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, R is the same as defined above
  • a polymer comprising as a constituent is preferred.
  • the alkyl group having 1 to 8 carbon atoms represented by R 1G is usually a linear, branched or cyclic group having 1 to 8 carbon atoms.
  • the same ones as exemplified for those having 1 to 8 carbon atoms in the alkyl group represented by R 3 in the above general formula [3] can be mentioned.
  • Preferable specific examples of the monomer unit represented by the general formula [8] include those derived from tert-butyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, and the like.
  • a monomer unit (A) represented by general formula [2] and a general formula [3] are shown as a polymer that protects LDL and HDL and inhibits the reaction of cholesterol in HDL and cholesterol in LDL.
  • the composition ratio (weight ratio) to the monomer unit (B) is usually 1 ⁇ B / A ⁇
  • Preferred is a polymer whose composition ratio (weight ratio) (AB / C) is usually 1 ⁇ ABZC ⁇ 10, preferably 2 ⁇ ABZC ⁇ 5.
  • such a polymer is derived from, for example, monomer unit strength methacrylic acid or acrylic acid represented by the general formula [2], and the monomer unit represented by the general formula [3] is generally used.
  • R 11 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and R 2 is the same as defined above
  • a polymer comprising as a constituent component is preferred.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R 11 may be linear, branched, or cyclic. equation [3], and those similar to the exemplified ones having 1 to 6 carbon atoms in the alkyl group represented by in R 3 in.
  • Preferable specific examples of the monomer unit represented by the general formula [9] include those derived from tert-butyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate and the like.
  • the cholesterol in the lipoprotein of the present invention can be measured by measuring cholesterol in a specific lipoprotein in a biological sample in the presence of the polymer of the present invention as described above.
  • an enzyme reaction is used.
  • cholesterol in a biological sample The ester is decomposed into free cholesterol and fatty acids by CHE, and is oxidized by CO together with the free cholesterol that is present from the beginning into cholesterol 4-en-3-one and hydrogen peroxide, and is produced in the presence of POD.
  • Oxidation that colorimetrically quantifies the resulting oxidative dye by oxidizing and coloring an oxidizable color reagent for example, a combination of a coupler and a developer, a color former that develops color itself by acid
  • Coloration method (2) For example, cholesterol in biological samples is decomposed into free cholesterol and fatty acids by CHE, and reacted with NAD (P) in the presence of CHD together with the free cholesterol present from the beginning.
  • the polymer of the present invention should exist (coexist) in the reaction system!
  • the method of the present invention may be carried out in accordance with the above-described method except that the polymer of the present invention is used, and reagents used in the above-described method can also be used. .
  • the measurement method of the present invention is roughly classified into the following two methods.
  • a biological sample is brought into contact with the polymer of the present invention to inhibit the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein in the sample, in other words, delayed or temporarily stopped.
  • the product produced by the reaction of cholesterol in lipoproteins other than the specific lipoprotein is measured.
  • a biological sample is brought into contact with the polymer of the present invention to inhibit the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein in the sample, in other words, delayed or temporarily stopped, and as a result, the specific lipoprotein is stopped.
  • the reaction of cholesterol in lipoproteins other than protein Prior to the reaction of cholesterol in lipoproteins other than protein, these are eliminated (consumed), and then the product produced by the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein is measured.
  • CHE and CO are allowed to act on a biological sample to produce hydrogen peroxide, and POD and an acid-sensitive color reagent (for example, A combination of a coupler and a developer, a color former that develops its own color by oxidation, etc.) to produce an acid pigment, and then the absorbance is measured, and based on this, the lipoprotein in the biological sample is measured.
  • an acid-sensitive color reagent for example, A combination of a coupler and a developer, a color former that develops its own color by oxidation, etc.
  • CHE, CHD and NAD (P) are allowed to act on a biological sample to produce NAD (P) H, and then the absorbance is measured. Based on this, the biological sample is measured.
  • the amount of cholesterol in the lipoproteins that is, the amount of cholesterol in the lipoproteins other than the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention is calculated.
  • the time when the absorbance is measured is determined by the contact of the lipoprotein whose reaction is not inhibited by the polymer of the present invention (by contact between the biological sample and the polymer of the present invention).
  • the reaction of cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein whose reaction was inhibited) was substantially terminated, and the lipoprotein whose reaction was inhibited by the polymer of the present invention (between the biological sample and the polymer of the present invention) This is the time point (ODnb) before the reaction of cholesterol in the specific lipoprotein (in which the reaction is inhibited by contact) is substantially initiated.
  • the timing for measuring the absorbance varies depending on the measurement method, the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc. Review the reactivity (reaction curve, etc.) to the image and set as appropriate.
  • cholesterol in a lipoprotein other than a specific lipoprotein is specifically measured by appropriately selecting and using the polymer of the present invention. be able to.
  • the amount of cholesterol in lipoproteins other than HDL (LDL cholesterol and VLDL—the amount of cholesterol) can be determined by (2) using the polymer that protects LDL as described above, so that cholesterol in lipoproteins other than LDL can be reduced.
  • the amount of HDL-cholesterol and VLDL-cholesterol, and (3) the amount of cholesterol in lipoproteins other than HDL and LDL by using a polymer that protects HDL and LDL as described above (the amount of VLDL cholesterol). Quantity) can be determined respectively. Specific examples and preferred embodiments of the polymer of the present invention are as described above.
  • the erasing methods as described above are further divided into two types as follows.
  • Elimination method (1) A method of measuring absorbance at two different points after contacting a biological sample with the polymer of the present invention.
  • Elimination method (2) Another reaction in which cholesterol in lipoproteins other than the lipoprotein protected by the polymer of the present invention is not involved in the reaction of cholesterol in the lipoprotein protected by the polymer of the present invention Erasing and consuming (consuming).
  • Examples of the erasing method (1) as described above include the following methods.
  • CHE and CO are allowed to act on a biological sample to produce hydrogen peroxide, and POD and an acid-sensitive color reagent (for example, A combination of a coupler and a developer, a color former that develops color itself by oxidation, etc.) to produce an acid dye, and the absorbance at two different points in time is measured.
  • POD and an acid-sensitive color reagent for example, A combination of a coupler and a developer, a color former that develops color itself by oxidation, etc.
  • CHE, CHD and NAD (P) are allowed to act on a biological sample to produce NAD (P) H, and the absorbance at two different time points is measured. Based on these, the amount of cholesterol in lipoproteins in biological samples, ie, biological origin The amount of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact between the sample and the polymer of the present invention is calculated.
  • time points There are two time points, the time point at which the reaction of cholesterol in the lipoprotein (the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by the contact between the biological sample and the polymer of the present invention) was substantially completed (ODt). These two The time point differs depending on the measurement method, the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc. Curve and the like) and may be set as appropriate.
  • the polymer of the present invention is appropriately selected and used, whereby cholesterol in a specific lipoprotein is specifically detected. It can be measured. For example, (1) by using a polymer that protects HDL as described above, the amount of HDL-cholesterol, and (2) by using a polymer that protects LDL, as described above, the amount of L DL-cholesterol, (3) By using a polymer that protects HDL and LDL as described above, the amounts of HDL-cholesterol and LDL-cholesterol can be determined respectively. Specific examples and preferred embodiments of the polymer of the present invention are as described above.
  • the reaction of cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact) and the polymer of the present invention The reaction of cholesterol in the lipoprotein (the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) whose reaction was inhibited by the After the time point (ODnb), a substance capable of releasing protection of the polymer of the present invention against a specific lipoprotein, in other words, reinstates (reverts) the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein that is inhibited by the polymer of the present invention. ) Or a substance that can be promoted is preferably present in the reaction system. This restores (returns) or accelerates the cholesterol reaction in the specific lipoprotein that has been inhibited, and thus completes the measurement of cholesterol in the target specific lipoprotein in a shorter time (termination). can do.
  • the reaction of cholesterol in a lipoprotein whose reaction is not inhibited by the polymer of the present invention is substantially
  • the reaction of cholesterol in lipoproteins (specific lipoproteins whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) whose reaction was inhibited by the polymer of the present invention was substantially reduced.
  • the reagent and the polymer of the present invention are present in the presence of a reagent for eliminating cholesterol in the lipoprotein other than the lipoprotein protected by the polymer of the present invention.
  • the cholesterol in the lipoprotein other than the lipoprotein protected by the present invention is reacted with cholesterol in the lipoprotein other than the lipoprotein protected by the polymer of the present invention to react with cholesterol in the lipoprotein protected by the polymer of the present invention.
  • the reaction of cholesterol in the specific lipoprotein protected by the polymer of the present invention may be carried out.
  • a reagent for eliminating cholesterol in lipoproteins other than the lipoprotein protected by the polymer of the present invention (0 cholesterol in a biological sample is reacted with CHE to produce free cholesterol.
  • Peroxy-hydrogen scavenging reagent to eliminate peracid-hydrogen generated by reacting with CO and then reacting with CO in GO biological samples Examples include NAD (P) H elimination reagent for eliminating NAD (P) H produced by reacting cholesterol with CHE to decompose free cholesterol and fatty acids and reacting with CHD and NAD (P). .
  • Hydrogen peroxide scavenging reagents include, for example, combinations with CHE, CO, POD and couplers, combinations with CHE, CO, POD and developers, combinations of CHE, CO, POD, couplers and developers, CHE, CO And NAD (P)
  • H elimination reagent includes a combination of CHE, CHD and NAD (P).
  • the elimination method (2) of the present invention using a reagent for eliminating cholesterol in lipoproteins other than the lipoprotein protected by the polymer of the present invention is carried out as follows, for example. be able to.
  • CHE and CO are allowed to act on biological samples to generate hydrogen peroxide, and POD and coupler (or developer) or CAT are allowed to act on the resulting hydrogen peroxide.
  • POD and coupler (or developer) or CAT are allowed to act on the resulting hydrogen peroxide.
  • the cholesterol in the lipoproteins other than the specific lipoprotein whose reaction is inhibited by the contact between the biological sample and the polymer of the present invention is eliminated (consumed), and then the developer (or coupler) or CAT
  • An inhibitor and an acid-developing color reagent are allowed to act to produce an acid-dye pigment, and the absorbance is measured. Based on this, the amount of cholesterol in the lipoprotein in the biological sample, that is, the biological sample
  • the amount of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact with the polymer of the present invention is calculated.
  • CHE, CHD and NAD (P) (or CHE, CO, POD and coupler or Z and developer) are allowed to act on biological samples, and NAD (P) H (or excess After introducing into a reaction system that generates (hydrogen oxide) and eliminating (consuming) cholesterol in lipoproteins other than specific lipoproteins whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention, CO, POD, oxidizable color reagent and CHD inhibitor (or CHD, NAD (P) and CO inhibitor) to produce oxidative dye (or NAD (P) H) and measure absorbance Based on this, the amount of cholesterol in the lipoprotein in the biological sample, that is, the contact between the biological sample and the polymer of the present invention. The amount of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by is calculated.
  • ODb absorbance at the time point when the reaction of cholesterol in the specific lipoprotein (in which the reaction is inhibited by contact with one) is substantially completed. Since it varies depending on the difference in the method, the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc. Consider and set as appropriate.
  • cholesterol in a specific lipoprotein is specifically measured by appropriately selecting and using the polymer of the present invention.
  • I can do it.
  • the amounts of HDL-cholesterol and LDL-cholesterol can be determined respectively.
  • Specific examples and preferred embodiments of the polymer of the present invention are as described above.
  • cholesterol in lipoproteins other than a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact between a biological sample and the polymer of the present invention is substantially eliminated (consumed), and the polymer of the present invention is used.
  • the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention whose reaction was inhibited by the time (ODbl) before the reaction was substantially initiated.
  • the protection of the polymer of the present invention against the specific lipoprotein is released, in other words, the reaction of the specific lipoprotein inhibited by the polymer of the present invention is restored (reversion). Or it can be promoted.
  • the direct method of the present invention may be either a one-liquid method, a two-liquid method, or a method using more than one reagent.
  • the polymer of the present invention may be contained in a reagent that is directly mixed with a biological sample.
  • the one-liquid method it goes without saying that all of the polymer of the present invention and the reagents for measuring cholesterol are contained in the test solution.
  • Biological sample (1) polymer of the present invention, (2) CHE, (3) CO, POD, and oxidizability Color reagent [or (3) CHD and NAD (P)] and (4) Absorbance (ODnb) is measured after mixing with a test solution containing an aqueous medium, and identification in biological samples based on this absorbance
  • the amount of cholesterol in the lipoprotein (the cholesterol in lipoproteins other than the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) may be calculated.
  • a biological sample and (1) the polymer of the present invention and (2) a first reagent solution containing an aqueous medium are mixed, and then, if necessary, the absorbance (ODbl) is measured, and then the mixing is performed.
  • Amount of cholesterol in a specific lipoprotein in a biological sample (cholesterol in a lipoprotein other than a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) If you calculate, When CO is contained in the second reagent, POD, coupler, and developer are contained in at least one of the first reagent and the second reagent, respectively, and when CHD is contained in the second reagent, NAD (P) is contained in at least one of the first reagent and the second reagent.
  • the time point at which ODnb is measured differs depending on the measurement method, the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc.
  • the reactivity (reaction curve, etc.) for each lipoprotein fraction should be examined and set as appropriate.
  • the reaction conditions between the biological sample and the test solution depend on the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc. Since it is different, it cannot be generally stated, but the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C, and the reaction time is 1 to 20 minutes. Preferably, from the range of 2 to 15 minutes, more preferably 3 to 10 minutes, for example, the reactivity (reaction curve etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set appropriately.
  • the pH during the reaction may be appropriately set within the range of usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, and particularly preferably around 7. .
  • the reaction conditions between the biological sample and the first reagent solution may vary depending on the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc.
  • the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C, and the reaction time is 1 to From the range of 20 minutes, preferably 2 to 15 minutes, more preferably 3 to 10 minutes, for example, the reactivity (reaction curve, etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set appropriately.
  • the pH during the reaction may be appropriately set within the range of usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, still more preferably 6 to 8, and particularly preferably around 7.
  • the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably.
  • the reaction time is 1 to 20 minutes, preferably 2 to 15 minutes, more preferably 3 to 10 minutes
  • the pH during the reaction is also usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, particularly preferably a range force in the vicinity of 7, for example, the reactivity (reaction curve, etc.) to each lipoprotein fraction, etc. You only have to set it.
  • the erasing method (1) [Elimination method (l) -a and (l) -b] of the present invention may be either a one-liquid method, a two-liquid method, or a method using a higher reagent.
  • the polymer of the present invention may be contained in a reagent that is directly mixed with a biological sample, and the protection of the polymer of the present invention against a specific lipoprotein can be achieved.
  • the substance may be a lipoprotein whose reaction is not inhibited by the polymer of the present invention (a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact between a biological sample and the polymer of the present invention).
  • the other lipoprotein may be contained in a test solution that is added after the reaction of cholesterol in the reaction (for example, the second test solution in the case of the two-component method).
  • a test solution that is added after the reaction of cholesterol in the reaction (for example, the second test solution in the case of the two-component method).
  • the absorbance (ODnb) is measured at a time before the reaction of cholesterol in the protein is substantially started, and then the lipoprotein (the biological sample and the polymer of the present invention) whose reaction is inhibited by the polymer of the present invention. Reaction is inhibited by contact with When the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein) is substantially completed, the absorbance (OD t) is measured again. Based on these absorbances, the absorbance in a specific lipoprotein in a biological sample is determined. What is necessary is just to calculate the amount of cholesterol (cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention).
  • a biological sample and (1) the polymer of the present invention and (2) a first reagent solution containing an aqueous medium are mixed, and then the absorbance (ODbl) is measured if necessary, and then the mixing is performed.
  • the reaction of cholesterol in (a lipoprotein other than a specific lipoprotein whose reaction has been inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) is substantially terminated and is reacted by the polymer of the present invention used.
  • the absorbance (OD t) was measured again when the reaction of cholesterol in the lipoprotein (the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) was substantially completed. Based on these absorbances, the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in a biological sample (the cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) ) Calculate the amount.
  • CO POD CO POD
  • coupler In the second reagent, CO POD, coupler, and developer are contained in at least one of the first reagent and the second reagent, respectively.
  • NAD NAD
  • It is contained in at least one of the test solution and the second test solution.
  • the present invention can be carried out by the two-liquid method as follows.
  • a biological sample (1) the polymer of the present invention, (2) CHE, (3) CO, POD and an oxidizable color reagent [or (3) CHD and NAD (P)] and (4) Absorbance (ODnb) is measured after mixing with a first reagent containing an aqueous medium, and then (4) a substance capable of releasing the protection of the polymer of the present invention against a specific lipoprotein.
  • Absorbance is measured after mixing with a second test solution containing an aqueous medium, and the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in a sample derived from a living body (based on a biological sample) And the amount of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact with the polymer of the present invention.
  • the time point at which ODnb and ODt are measured differs depending on the measurement method, the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc.
  • the reactivity (reaction curve etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set as appropriate.
  • the reaction conditions between the biological sample and the test solution depend on the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc. Since it is different, it cannot be generally stated, but the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C, and the reaction time is 1 to 20 minutes. Preferably, from the range of 2 to 15 minutes, more preferably 3 to 10 minutes, for example, the reactivity (reaction curve etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set appropriately. Similarly, the pH during the reaction may be appropriately set within the range of usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, and particularly preferably around 7. .
  • the reaction conditions between the biological sample and the first reagent solution may vary depending on the type and concentration of the polymer of the present invention used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc.
  • the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C, and the reaction time is 1 to 20 minutes, preferably From 2 to 15 minutes, more preferably from 3 to 10 minutes, for example, the reactivity (reaction curve, etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set appropriately.
  • the pH during the reaction may be appropriately set within the range of usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, still more preferably 6 to 8, and particularly preferably around 7.
  • the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably.
  • the reaction time is 1 to 20 minutes, preferably 2 to 15 minutes, more preferably 3 to 10 minutes
  • the pH during the reaction is also usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, particularly preferably a range force in the vicinity of 7, such as reactivity to each lipoprotein fraction (reaction curve etc.) What is necessary is just to set suitably.
  • the erasing method (2) [Elimination method (2) -a and (2) -b] of the present invention is usually carried out by a two-liquid method or a method using a reagent solution higher than that.
  • the polymer of the present invention may be contained in a reagent that is directly mixed with a biological sample.
  • elimination method (2) -a, POD and coupler, POD and developer, or CAT are treated with a lipoprotein whose reaction is inhibited by the polymer of the present invention (by contact between a biological sample and the polymer of the present invention).
  • POD is sufficient if it is contained in a test solution added at a time before the reaction of cholesterol in the specific lipoprotein (the reaction is inhibited).
  • a coupler or Z and developer, or NAD (P) a lipoprotein whose reaction is inhibited by the polymer of the present invention (a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) What is necessary is just to make it contain in the test solution added before the reaction of the inside cholesterol starts substantially.
  • the substance When a substance capable of releasing the protection of the polymer of the present invention against a specific lipoprotein is used, the substance is treated with a lipoprotein (a biological sample and a polymer of the present invention whose reaction is not inhibited by the polymer of the present invention).
  • a lipoprotein a biological sample and a polymer of the present invention whose reaction is not inhibited by the polymer of the present invention.
  • the sample solution added after the cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein whose reaction has been inhibited by contact with the substance is substantially eliminated (consumed) If included in the reagent).
  • the elimination method (2) -a can be carried out as follows.
  • a biological sample (1) the polymer of the present invention, (2) CHE, (3) CO, (4) POD and coupler (or developer) [or (4) CAT], and (5) aqueous Mix with the first reagent containing the medium, then measure the absorbance (ODbl) if necessary, and then (6) Developer (or coupler) [or (6) CAT inhibition Agent), (7) aqueous medium, and if necessary, (8) absorbance (ODb) measured after mixing with second reagent containing substance capable of deprotecting polymer of the present invention against specific lipoproteins Based on these absorbances, the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in the sample derived from the living body (the cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the sample derived from the living body and the polymer of the present invention) 1) Calculate the amount.
  • CAT When CAT is contained in the first reagent, POD, coupler, and developer are contained in at least one of the first reagent and the second reagent, respectively.
  • CHE, CO, and POD may be contained in both the first reagent and the second reagent.
  • the elimination method (2) -b can be performed as follows.
  • a biological sample (1) the polymer of the present invention, (2) CHE, (3) CO, POD, and coupler or Z and developer (or (3) CHD and NAD (P)), and (5) Mix with the first sample solution containing an aqueous medium, then measure the absorbance (ODbl) if necessary, and then (6) CHD, NAD (P) and CO inhibition.
  • Agent or (6) CO, POD, oxidizable color reagent and CHD inhibitor
  • aqueous medium if necessary (8) the protection of the polymer of the present invention against specific lipoproteins.
  • Absorbance is measured after mixing with the second test solution containing the substance to be obtained, and based on these absorbances, the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in the biological sample (with the biological sample) The amount of cholesterol in lipoproteins other than the specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact with the polymer of the present invention may be calculated.
  • the time point at which ODb is measured differs depending on the measurement method, the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc.
  • the reactivity to the lipoprotein fraction should be examined and set as appropriate.
  • the reaction conditions between the biological sample and the first reagent vary depending on the type and concentration of the polymer of the present invention to be used, the type and concentration of other reagents such as enzymes, etc.
  • the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C
  • the reaction time is 1 to 20 minutes, preferably From 2 to 15 minutes, more preferably from 3 to 10 minutes, for example, the reactivity (reaction curve, etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set appropriately.
  • a range force of usually 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, and particularly preferably around 7 may be set as appropriate. .
  • the reaction temperature is usually 15 to 40 ° C, preferably 25 to 40 ° C.
  • the reaction time is in the range of 1 to 20 minutes, preferably in the range of 2 to 15 minutes, more preferably in the range of 3 to 10 minutes.
  • Range force in the range of 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, and particularly preferably about 7.For example, the reactivity (reaction curve, etc.) to each lipoprotein fraction is examined. And may be set as appropriate.
  • the amount of cholesterol in lipoprotein in a biological sample can be calculated based on the obtained absorbance, for example, as follows.
  • (l) ODnb for example, cholesterol in a lipoprotein other than a specific lipoprotein having a known concentration in advance (cholesterol in a lipoprotein other than a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact with the polymer of the present invention) )
  • a calibration curve showing the relationship between the cholesterol concentration in the lipoprotein and ODnb, obtained using a standard product such as a standard solution containing The amount of cholesterol in lipoproteins other than lipoproteins (cholesterol in lipoproteins other than specific lipoproteins whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention) is calculated.
  • the ODnb force is also determined by obtaining the absorbance (ODtv) obtained by subtracting ODbl [or a value derived from ODbl (for example, a value obtained by multiplying ODbl by the liquid volume correction coefficient)], and the obtained ODtv is determined in advance, for example.
  • Elimination method (1) [Direct method (l) -a and (l) -b]
  • the ODt force is also determined by calculating the absorbance (ODcb) obtained by subtracting ODnb (or a value derived from ODnb (for example, a value obtained by multiplying the liquid volume correction coefficient by ODnb)).
  • ODcb absorbance
  • a standard product such as a standard solution containing cholesterol in a specific lipoprotein (specific cholesterol in the reaction whose reaction is inhibited by contact with the polymer of the present invention) was obtained in the same manner as described above, By applying a calibration curve indicating the relationship between the cholesterol concentration in the lipoprotein and O Deb, the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in the biological sample (reacted by contact between the biological sample and the polymer of the present invention). Calculate the value of cholesterol in the specific lipoprotein in which is inhibited.
  • the ODnb force is also derived by subtracting the ODbl (or the value derived from ODbl (for example, the value obtained by multiplying the ODbl by the liquid volume correction factor)) and ODt from ODt (or from ODbl).
  • the absorbance (ODct) obtained by subtracting the value (for example, the value obtained by multiplying the liquid volume correction coefficient by ODbl) is obtained, and the absorbance (ODcb) obtained by subtracting ODcnb from ODct is obtained.
  • the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in a sample derived from a living body was determined by applying a calibration curve indicating the relationship between the cholesterol concentration in the lipoprotein and ODcb, which was obtained in the same manner as described above using the product as a sample.
  • the value of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the derived sample and the polymer of the present invention is calculated.
  • Elimination method (2) [Direct method (2) -a and (2) -b] (l) A standard product such as a standard solution containing ODb in advance, for example, cholesterol in a specific lipoprotein of known concentration (a cholesterol in a specific lipo whose reaction is inhibited by contact with the polymer of the present invention).
  • a calibration curve showing the relationship between cholesterol concentration in the lipoprotein and ODb obtained in the same manner as the above method as a sample, the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in a sample derived from a living body (biological sample) And the cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact with the polymer of the present invention.
  • the absorbance (ODcb) obtained by subtracting the ODb force from ODbl (or a value derived from ODbl (for example, a value obtained by multiplying the ODbl by the liquid volume correction coefficient)) is obtained, and the obtained ODcb is determined in advance, for example.
  • a standard product such as a standard solution containing cholesterol in a specific lipoprotein having a known concentration (cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact with the polymer of the present invention) is used as a sample.
  • the amount of cholesterol in a specific lipoprotein in a biological sample was determined in the same manner by applying a calibration curve showing the relationship between the cholesterol concentration in the lipoprotein and ODcb.
  • the value of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction was inhibited by the contact of was calculated.
  • the polymer used in the present invention may be used at a concentration that inhibits the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein and precedes the reaction of cholesterol in a lipoprotein other than the specific lipoprotein.
  • concentration in the test solution to be directly mixed with the biological sample is usually 0.001% to 10% ( ⁇ ⁇ / ⁇ ), preferably 0.05% to 2% ( ⁇ ⁇ / ⁇ ).
  • These polymers of the present invention may be used alone or in appropriate combination of two or more.
  • Examples of CO used in the present invention are those usually used in this field, for example, Examples thereof include those derived from microorganisms such as Nocardia and Pseudomonas, and those derived from animal organs such as bovine spleen.
  • the amount of CO used is, for example, 0.03 to 330 uZml, preferably 0.07 to 130 uZml, more preferably 0.13 to 65 uZml as the concentration in the first reagent in the two-liquid method, or in the final reaction solution.
  • the concentration is usually 0.02 to 250 uZml, preferably 0.05 to 100 uZml, more preferably 0.1 to 50 uZml.
  • the concentration range force in the final reaction liquid is appropriately selected. (The same applies hereinafter.)
  • Examples of CHE used in the present invention include those usually used in this field, for example, those derived from microorganisms such as Candida and Pseudomonas, and those derived from animal organs such as bovine spleen.
  • the amount of CHE used is, for example, 0.03 to 330 uZml, preferably 0.07 to 130 uZml, more preferably 0.13 to 65 uZml as the concentration in the first test solution in the two-liquid method, or the final reaction solution.
  • the concentration is usually 0.02 to 250 u / mU, preferably 0.05 to 100 uZml, more preferably 0.1 to 50 uZml.
  • POD used in the present invention those usually used in this field, for example, those derived from plants such as horseradish rust, soybeans, radishes, those derived from microorganisms such as mold, yeast, animals Examples include those derived from leukocytes, thyroid and the like.
  • the amount of POD used is, for example, usually 0.1 to 1000 uZml, preferably 0.25 to 400 uZml, more preferably 0.5 to 200 uZml as the concentration in the first test solution in the two-component method, or the final reaction solution.
  • the concentration is usually 0.1 to 250 uZml, preferably 0.25 to 100 uZml, more preferably 0 • 5 to 50 uZml.
  • the acid-oxidizing color reagent used in the present invention is not particularly limited as long as it reacts with hydrogen peroxide in the presence of POD and develops a color.
  • 4-aminoantipyrine hereinafter referred to as 4 AA.
  • a combination of a coupler and a developer that produces a dye by acid condensation for example, a combination of 4 AA and a phenol compound, a naphthol compound, or an ar phosphorus compound, 3 -Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and aryl
  • 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), triphenylmethane leuco dye, diphenylamine, benzidine derivative, triallylimidazole derivative
  • Examples thereof include color formers that themselves develop color by oxidation of leucomethylene blue derivatives, 0-phenylenediamine derivatives, and the like.
  • phenol compounds as a developer include phenol, P-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, and the like.
  • naphthol compounds include 1-naphthol, 1 -Naphthol-2-sulfonic acid, 1-naphthol-2-carboxylic acid, and the like.
  • aline compounds include, for example, ⁇ , ⁇ -jetaline, ⁇ -ethyl- ⁇ .
  • DAOS 2-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-
  • the amount of coupler used varies depending on the type of coupler used and the type of developer to be combined.
  • the concentration in the first reagent in the two-component method is usually The concentration is 0.01 to 400 mM, preferably 0.1 to 40 mM, more preferably 0.2 to 10 mM, and the concentration in the final reaction solution is usually 0.01 to 100 mM, preferably 0.1 to 10 mM.
  • the amount used when 4-AA is used as the coupler is, for example, 0.01 to 200 mM, preferably 0.1 to 40 mM, more preferably 0.2 to 10 mM as the concentration in the first reagent in the two-liquid method.
  • the concentration in the final reaction solution is usually 0.01 to 50 mM, preferably 0.1 to 5 mM.
  • the amount of developer used varies depending on the type of developer used and the type of coupler to be combined, etc., but cannot be generally stated.
  • the concentration in the first reagent in the two-component method is usually 0.01 to 200 mM, preferably 0.1 to 40 mM, more preferably 0.2 to 10 mM, and the concentration in the final reaction solution is usually 0.01 to 50 mM, preferably 0.1 to 5 mM.
  • Specific examples of triphenylmethane-based leuco dyes include leucomalachite green, bis (p-jetylaminophenol) -2-sulfophenolmethane, and bis (p-jetylaminophenol).
  • diphenylamine derivatives include bis [4-di (2-butoxychetyl) amino-2-methylphenol. ], ⁇ , ⁇ -bis (4-jetylamino-2-methylphenol) -N'-p-toluenesulfonylurea and the like
  • leucomethylene blue derivatives include, for example, 10- (carboxymethyl Aminocarbole) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt, 10- [3- (methoxycarbolaminomethyl) phenolmethylaminomino] -3,7-bis (dimethylamino) ) Funotiaji Etc.
  • benzidine derivative examples include benzidine, 0-tolidine, and the like. -Di-cydin, 3,3'-dianaminobenzidine, 3,3 ', 5,5'-tetraaminobenzidine and the like.
  • triallylimidazole derivative examples include, for example, 2- (4- Carboxyphenol) -3-N-methylcarbamoyl-4,5-bis (4-detylaminophenol) imidazole, 2- (3-methoxy-4-detylaminophenol) 3- And N-methylcarbamoyl-4,5-bis (2-methyl-4-jetylaminophenol) imidazole.
  • the amount of these color formers used is a concentration range usually used in this field.
  • the CAT used in the present invention is usually used in this field, for example, those derived from animal organs such as cattle liver, those derived from plants such as black mouth plasts, Micrococcus, Rhodosidum. Examples include those derived from microorganisms such as Eudomonas.
  • the amount of CAT used is, for example, usually 10 to 50,000 u / mU, preferably 100 to 5000 uZml, more preferably 50 to 2000 uZml, as the concentration in the first reagent in the two-liquid method.
  • the CHD used in the present invention includes those usually used in this field, such as those derived from the genus Nocardia.
  • the amount of CHD used is, for example, usually 0.1 to 150 uZml, preferably 0.3 to 100 uZml, more preferably 0.5 to 60 uZml as the concentration in the first reagent in the two-liquid method. As a rule, it is usually 0.1 to 100 u / mU, preferably 0.5 to 50 uZml.
  • NAD (P) used in the present invention examples include those usually used in this field, such as those derived from yeast.
  • the amount of NAD (P) used is, for example, 0.2 to 70 mM, preferably 0.5 to 50 mM, more preferably 1 to 20 mM as the concentration in the first reagent in the two-liquid method.
  • the concentration is usually 0.2 to 50 mM, preferably 1 to 10 mM.
  • CAT inhibitor used in the present invention examples include those usually used in this field, such as NaN, 3-amino-1,2,4-triazole and the like. These CAT inhibitors
  • the concentration in the second reagent in the two-component method is usually 0.01 to 10% (W / V), preferably It is 0.02 to 5% (W / V), more preferably 0.03 to 3% (W / V).
  • the CO inhibitor used in the present invention is usually used in this field, and examples thereof include Ag + ion, Zn2 + ion, and dartathione.
  • the amount of these CO inhibitors used varies depending on the type of CO inhibitor used and cannot be generally stated.
  • the concentration in the second reagent in the two-component method is usually 0.00002 to 40% (W / V ), Preferably 0.0002 to 4% (W / V), more preferably 0.002 to 0.4% (W / V).
  • the CHD inhibitor used in the present invention is usually used in this field !, and examples thereof include Ag + ions, Zn2 + ions and the like.
  • the amount of these CHD inhibitors to be used varies depending on the type of CHD inhibitor used and cannot be generally stated.
  • the concentration in the second reagent in the two-component method is usually 0.00001 to 70% (W / V), preferably 0.0001 to 7% (W / V), more preferably 0.001 to 0.7% (W / V).
  • aqueous medium used in the present invention examples include water and a buffer solution.
  • Any buffering agent may be used as long as it has a buffering action in the pH range of 5 to 11 and does not inhibit the cholesterol measurement reaction.
  • trishydroxymethylaminomethane Good Buffering agents (PIPES, BES, TES, HEPES, etc.), phosphates, borates, imidazoles, etc., which are usually used in this field are mentioned, and the concentration used is usually lmM to 2M, preferably 10 mM.
  • the pH is generally 5 to 11, preferably 5 to 10, more preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6 to 8, and particularly preferably around 7.
  • cholesterol in lipoproteins other than specific lipoproteins whose reaction is inhibited by contact between a biological sample and the polymer of the present invention is substantially eliminated (consumed) and used in the present invention.
  • the specific lipoprotein whose reaction was inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention whose reaction was inhibited by the time (ODbl) before the reaction was substantially initiated.
  • the pH of the reaction system by changing the pH of the reaction system, the protection of the polymer of the present invention against the specific lipoprotein is released, in other words, the reaction of the specific lipoprotein inhibited by the polymer of the present invention is restored (reverted).
  • the reaction of the pH of a test solution (for example, the first test solution) containing the polymer of the present invention to be directly mixed with the biological sample is inhibited by the polymer of the present invention.
  • a test solution for example, the first test solution
  • the reaction of cholesterol in the lipoproteins lipoproteins other than the specific lipoproteins whose reaction has been inhibited by contact between the biological sample and the polymer of the present invention
  • it may be higher or lower than the pH of the second reagent to such an extent that the protection of the polymer of the present invention against a specific lipoprotein can be released.
  • the pH difference between these test solutions is usually 0.5 to 3, preferably 1 to 3.
  • Examples of the substance that can be used in the present invention to release the protection of the polymer of the present invention against a specific lipoprotein include a lipoprotein whose reaction is inhibited by the polymer of the present invention (contact between a biological sample and the polymer of the present invention). It is only necessary to have a property capable of restoring (reverting) or accelerating the reaction of cholesterol in a specific lipoprotein whose reaction has been inhibited by.
  • Examples of substances having such properties include nonionic surfactants and anions that have the properties described above and are used in known total cholesterol measurement methods (reagents). Surfactants and amphoteric surfactants can be used. [0175] Examples of nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers [polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene higher alcohol ether, etc.
  • Polyoxyethylene alkyl aryl ether polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, etc.] polyoxyethylene fatty acid ester [polyethylene glycol monolaurate, polyethylene glycol monostearate, Polyethylene glycol distearate, polyethylene glycol monooleate, etc.), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester [polyoxyethylene sorbate Monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, etc.), sorbitan Fatty acid esters (such as sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan distearate, sorbitan tristearate, sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, etc.),
  • anionic surfactant examples include cholic acid and derivatives thereof (cholic acid, deoxycholic acid, polyoxyethylene alkylphenol ether sulfate, lauroyl sarcosine, etc.) and the like.
  • amphoteric surfactants include alkyl betaine derivatives [lauryl betaine, stearyl betaine, lauryl dimethylammo-umbetaine, coconut betaine, coconut oil fatty acid amidopropyl betaine, lauric acid amidopropyl betaine.
  • imidazolium betaine derivatives [2-lauryl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoline, 2-undecyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazole- 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazole-mubetaine such as umbetaine; 2-alkyl-N-carboxyethyl-N-hydroxyethylimidazolium-umbetaine, etc.] Sulfobetaine derivatives (N-octyl- ⁇ , ⁇ -dimethyl-3-ammo-1-propanesulfonic acid, ⁇ -decyl- ⁇ , ⁇ -dimethyl-3-ammo-1-propanesulfonic acid, ⁇ -Dodecyl- ⁇ , ⁇ -dimethyl-3-ammo-1-propanesulfonic acid, ⁇ ⁇ ⁇ -tetradecyl- ⁇ ,
  • nonionic surfactants and anionic surfactants are preferable.
  • the concentration of the surfactant used as described above may be a lipoprotein whose reaction is inhibited by the polymer of the present invention (a specific lipoprotein whose reaction is inhibited by contact between a biological sample and the polymer of the present invention). If the concentration is sufficient to restore (revert) or accelerate the cholesterol reaction in the protein), the concentration of the polymer of the present invention to be used, the concentration of the polymer used, the type of surfactant, etc. cannot be used. However, when it is used in the two-component method, the force varies depending on the volume ratio of the first reagent and the second reagent, etc.
  • the concentration in the second reagent is usually 0.01-20% (W / V), preferably 0.05-5% (W / V).
  • surfactants may be used alone or in combination of two or more.
  • reagents in addition to the reagents (constituent requirements) as described above, reagents generally used in this field can be used.
  • Examples of such reagents include avoidance of the influence of coexisting substances such as ascorbic acid, hemolysis, and pyrilvin (for example, ascorbate oxidase, metal ions such as copper ions, ferrocyan potassium, etc.), high triglyceride samples, etc.
  • coexisting substances such as ascorbic acid, hemolysis, and pyrilvin (for example, ascorbate oxidase, metal ions such as copper ions, ferrocyan potassium, etc.), high triglyceride samples, etc.
  • Effect prevention agent for example, surfactant, salt such as NaCl, KC1, enzyme such as LPL, etc.
  • reaction accelerator for example, interface
  • Activators, metal ions, etc. eg, proteins such as bovine albumin, eg, various amino acids such as glutamic acid, eg, various sugars such as glucose
  • various salts eg, sodium chloride salt, Salt, calcium, etc.
  • anti-acidic substances eg, mannitol
  • chelating agents eg, EDTA
  • preservatives eg, sodium azide
  • concentration of other reagents as described above may be appropriately selected according to a method known per se.
  • biological samples to which the present invention is applied include biological samples such as serum and plasma, and water, physiological saline, and usually used in this field, such as Tris buffer, phosphate buffer, and veronal.
  • biological samples such as serum and plasma, and water, physiological saline, and usually used in this field, such as Tris buffer, phosphate buffer, and veronal.
  • treated products obtained by reconstitution by appropriately dissolving in a buffer solution such as a buffer solution, borate buffer solution, and Good's buffer solution.
  • the reagent and kit of the present invention are used for carrying out the measurement method of the present invention as described above.
  • the reagents (components) used in the above may be prepared so as to contain in the concentration range normally used in this field, and the preferred mode of components and the concentration used are as described above. .
  • the reagent and kit of the present invention contain, for example, the following reagents (constituent requirements) as main components, and may contain other reagents in addition to these.
  • Examples of the reagent kit for the direct method of the present invention as described above include those containing the following reagents (constituent requirements) as main components.
  • the POD, coupler, and developer are contained in at least one of the first reagent and the second reagent, respectively.
  • NAD (P) is contained in at least one of the first reagent solution and the second reagent solution.
  • Examples of the reagent kit for the elimination method (1) of the present invention as described above include those containing the following reagents (constituent requirements) as main components.
  • the POD, coupler, and developer are contained in at least one of the first reagent and the second reagent, respectively.
  • NAD (P) is contained in at least one of the first reagent solution and the second reagent solution.
  • Examples of the reagent kit for the elimination method (2) of the present invention as described above include those containing the following reagents (constituent requirements) as main components.
  • Elimination method (2) -a reagent 'kit (two-component method)
  • CHE, CO, and POD may be contained in both the first reagent and the second reagent.
  • Elimination method (2)-Reagent for 'kit two-component method
  • POD, coupler, and developer may be included in at least one of the first reagent and the second reagent, respectively, and CHE and CO may be included in both the first reagent and the second reagent. good.
  • CHE may be contained in both the first reagent and the second reagent.
  • Elimination method (2) -b Reagent 'kit two-component method
  • CHE may be contained in both the first reagent and the second reagent.
  • the kit may be combined with a cholesterol standard in the lipoprotein to be measured, if necessary.
  • a cholesterol standard in the lipoprotein to be measured for example, standard serum prepared using serum from human animals or the like, or one containing a lipoprotein fraction to be measured derived therefrom can be used.
  • the lipoprotein to be measured is, for example, when the measurement method used is the direct method of the present invention, the lipoprotein other than the lipoprotein protected by the polymer of the present invention (by the polymer of the present invention). This means a lipoprotein other than a specific lipoprotein that inhibits the reaction.
  • the measurement method used is the elimination method of the present invention
  • the lipoprotein protected by the polymer of the present invention by the polymer of the present invention. It means a specific lipoprotein whose reaction is inhibited).
  • instructions for use in the measurement method of the present invention as described above may be included.
  • the “instructions” refer to the instruction manuals, package inserts, pamphlets (leaflets), etc. of the kit in which the characteristics “principle” operation procedure etc. in the method of the present invention are substantially described by text or diagrams. means.
  • Methacrylic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 23 g [hereinafter abbreviated as “monomer A”.
  • cyclohexyl methacrylate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 23 g [hereinafter abbreviated as “monomer B”.
  • PEG polymerization initiator
  • VPE-0201 trade name: VPE-0201, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Example 1-1 As the monomer A and monomer B in the polymer according to the present invention, the same procedure as in Example 1-1 was performed, except that various monomers shown in Table 2 were used at a predetermined ratio to obtain the polymer according to the present invention. It was. The results are also shown in Table 2.
  • the reaction curve between the cholesterol measurement reagent containing the polymer of the present invention and each type of lipoprotein fractionated by ultracentrifugation was measured, and the reactivity of cholesterol in each lipoprotein of the polymer of the present invention was determined. The effect was confirmed.
  • HDL fraction (cholesterol: 200 mg / dL), LDL fraction (cholesterol: 300 mg / dL) and VLDL fraction (cholesterol: 1 OOmg / dL) ) Were used as samples.
  • the polymer synthesized in Examples 11-1 to 1-47 was used as the polymer of the present invention.
  • a reagent not containing the polymer of the present invention was used.
  • FIG. 1 shows the reaction time course of each lipoprotein obtained using a reagent that does not contain the polymer of the present invention
  • FIG. 2 shows the use of the reagent containing the polymer obtained in Example 1-1.
  • FIG. 3 shows the reaction time course of each lipoprotein obtained
  • FIG. 4 shows the reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer obtained in Example 1-3.
  • the reaction time course of each lipoprotein obtained using the polymer-containing reagent obtained in 1-8 is shown in FIG. 5 using the polymer-containing reagent obtained in Example 1-11.
  • the reaction time course of each lipoprotein is shown in FIG. 6, the reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer obtained in Example 1-16, and FIG.
  • the reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer obtained in Examples 1-22 is shown.
  • ⁇ 1 is the result obtained for the HDL fraction sample (cholesterol: 200 mg / dL)
  • ⁇ is the result obtained for the LDL fraction sample (cholesterol: 300 mg / dL)
  • Ichikokuichi shows the results obtained for the VLDL fraction sample (cholesterol: 100 mg / dL) !
  • - ⁇ - shows the results obtained using physiological saline as a sample.
  • Example 1 When using the reagent containing the polymer of the present invention obtained in Examples 9 to 112, LDL and it forces the reaction of cholesterol in HDL is inhibited in example 1- 13 ⁇ i- 15, 1- 17 ⁇ 21, 1
  • the polymer represented by the general formula [2] is selected from the polymers of the present invention.
  • these yarns and A polymer (Examples 1-9 to 1-12) with a composition ratio (weight ratio) of 1 ⁇ BZA 2 protects LDL and HDL, and reacts cholesterol in HDL and cholesterol in LDL.
  • polymers whose composition ratio (weight ratio) is 2 ⁇ BZA Examples 1-13 to 1-35, 139 and 1441 to 44
  • it has the property of protecting and inhibiting the reaction of cholesterol in HDL.
  • the UCHM method which is a standard measurement method, measures HDL cholesterol in a sample by the elimination method using the polymer of the present invention (polymer of Examples 1-22), which has the property of inhibiting the reaction of cholesterol in HDL. Compared with the measured value at.
  • TG tridalycelide
  • HDL cholesterol in each sample was measured by the elimination method of the present invention.
  • Olympus AU 640 automatic analyzer manufactured by Olympus Corporation
  • the measurement parameters were set as follows, and the measurement was performed.
  • a multi-calibrator lipid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the calibrator.
  • Reagent 1 180, u L
  • Measurement wavelength Main wavelength 600nm, Sub wavelength 700nm
  • the HDL cholesterol measurement method (reagent) by the elimination method of the present invention shows a good correlation with the standard measurement method UCHM method.
  • the values obtained by the HDL cholesterol measurement method (reagent) by the elimination method of the present invention agree with each other without dissociating the value of the UCHM method. I understand that.
  • polymer of the present invention (polymer of Example 18) having the property of inhibiting the reaction of cholesterol in LDL
  • LDL cholesterol in the sample was measured by the elimination method, and BQ method, which is a standard measurement method, was used. The measured value was compared.
  • TG tridalycelide
  • LDL cholesterol in each sample was measured by the elimination method of the present invention.
  • Olympus AU 640 automatic analyzer manufactured by Olympus Corporation
  • the measurement parameters were set as follows, and the measurement was performed.
  • a multi-calibrator lipid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the calibrator.
  • Reagent 1 180, u L
  • Measurement wavelength Main wavelength 600nm, Sub wavelength 700nm
  • the LDL-cholesterol measurement method (reagent) by the elimination method of the present invention shows a good correlation with the BQ method which is a standard measurement method.
  • the value obtained by the HDL-cholesterol measurement method (reagent) by the elimination method of the present invention is consistent with the measured value without dissociation of the BQ method. I understand.
  • the VLDL-cholesterol in the sample was directly obtained. was measured and compared with the measured value by the ultracentrifugation method which is a standard measuring method.
  • TG tridalycelide
  • the sample obtained by adding physiological saline to the VLDL fraction obtained by the operation in (1) above to make the original serum volume 4 mL was used, and the cholesterol concentration contained therein was determined as the total cholesterol measurement reagent (L Measurement was performed under the following measurement conditions using a Hitachi Autoanalyzer 7170S type autoanalyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.) using Type KOKO CHO 'H: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • a multi-calibrator lipid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the calibrator.
  • Reagent 1 180, u L
  • Measurement wavelength Main wavelength 600nm, Sub wavelength 700nm
  • VLDL-cholesterol in each sample was measured by the direct method of the present invention.
  • Olympus AU-640 automatic analyzer manufactured by Olympus Corporation
  • the measurement parameters were set as follows and measurements were performed.
  • a multi-calibrator lipid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the calibrator.
  • Reagent 1 180, u L
  • Measurement wavelength Main wavelength 600nm, Sub wavelength 700nm
  • the VLDL-cholesterol measurement method (reagent) by the elimination method of the present invention shows a good correlation with the ultracentrifugation method, which is the standard measurement method. I understand. Even in a high triglyceride sample, the value obtained by the VLDL-cholesterol measurement method (reagent) according to the direct method of the present invention is consistent with the measurement value without dissociation from the value of the ultracentrifugation method. I understand.
  • the coexistence of the polymer of the present invention protects specific lipoproteins and inhibits the reaction of cholesterol in the specific lipoproteins, in other words.
  • it is possible to measure cholesterol in lipoproteins other than the specific lipoprotein by delaying or temporarily stopping it and allowing the reaction of cholesterol in the lipoprotein other than the specific lipoprotein in advance.
  • a specific lipoprotein is obtained. Cholesterol in white can be measured. This makes it possible to measure cholesterol in the target lipoprotein without separating and separating lipoproteins other than the target lipoprotein to be measured.
  • FIG. 1 This is a reaction time course of each lipoprotein obtained by using the reagent not containing the polymer of the present invention obtained in Example 2-1.
  • FIG. 2 is a reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer of Example 1-1 obtained in Example 2-1.
  • FIG. 3 is a reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer of Example 1-3 obtained in Example 2-1.
  • FIG. 4 is a reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer of Example 1-8 obtained in Example 2-1.
  • FIG. 5 is a reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer of Example 1-11 obtained in Example 2-1.
  • FIG. 6 is a reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer of Example 1-16 obtained in Example 2-1.
  • FIG. 7 is a reaction time course of each lipoprotein obtained using the reagent containing the polymer of Example 1-22 obtained in Example 2-1.
  • FIG. 8 is a correlation diagram between the measured HDL-cholesterol value obtained by Example 3-1 by the method of the present invention and the measured HDL-cholesterol value by the UCHM method.
  • FIG. 9 is a correlation diagram between the LDL-cholesterol measurement value obtained by the method of the present invention and the LDL-cholesterol measurement value obtained by the BQ method, obtained in Example 3-2.
  • FIG. 10 is a correlation diagram between the measured VLDL-cholesterol value obtained by Example 3-3 according to the method of the present invention and the measured VLDL-cholesterol value obtained by the ultracentrifugation method.

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Description

新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法
技術分野
[0001] 本発明は、一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一 般式 [2]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成 分として含んで成るポリマー、当該ポリマーを用いた、例えば高比重リポ蛋白（HDL) 、低比重リポ蛋白（LDL)、超低比重リポ蛋白（VLDL)等のリポ蛋白中コレステロ一 ルの測定用試薬及び測定方法、詳しくは、試料中の HDL、 LDL、 VLDL中のコレス テロールの直接的な測定に於いて、当該ポリマーを含有させたリポ蛋白中のコレステ ロールの測定用試薬並びに該測定試薬を用いて特定のリポ蛋白中のコレステロール 濃度を測定する方法に関する。
背景技術
[0002] 血清及び血漿中リポ蛋白中コレステロールの測定は、主に動脈硬化、心筋症、脂 質異常解析等の診断に利用されており、臨床検査の分野に於いては重要な測定項 目の 1つである。特に HDLコレステロール（HDL— C)及び LDLコレステロール（LD L-C)に於いては、動脈硬化学会に於いてもガイドラインが設定され、測定頻度が 高い項目の 1つでもある。遠心分離操作等を行うことなぐ自動分析装置等を用いて 実施できる HDL— Cの直接的測定方法としては、例えば、抗 j8リポ蛋白抗体を用い て HDL以外のリポ蛋白を保護し HDL— Cのみを検出する方法 (特許文献 1)、シクロ デキストリン誘導体等の糖ィ匕合物及び修飾した酵素を用いて同様に HDL— Cのみ を検出する方法 (特許文献 2)、リポ蛋白を溶解しな!ヽ界面活性剤を使用する方法（ 特許文献 3)、 HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後に HDL— Cを 特異的に検出する方法 (特許文献 4)、カリタスアレン類を用いて HDL以外のリポ蛋 白と複合体を形成させて保護し、 HDL— Cを検出する方法 (特許文献 5)などがある 。一方、遠心分離操作等を行うことなぐ自動分析装置等を用いて実施できる LDL— Cの直接的測定法としては、ポリア-オンと両性界面活性剤で LDLを保護し、 LDL 以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後、 LDL— Cを測定する方法 (特許文 献 6)界面活性剤を用いて LDL以外のリポ蛋白のみ可溶ィ匕して消去した後、 LDL— Cを検出する方法 (特許文献 7、特許文献 8)、カリタスアレン類を用いて LDL以外の リポ蛋白を保護し、 LDL— Cを検出する方法 (特許文献 9)などが挙げられる。
[0003] しかしながら、これらの試薬の測定精度は、脂質濃度が正常範囲である検体 (正脂検 体）に於いては満足できるものの、例えば高トリグリセライド (TG)検体等の脂質異常 検体に於いては、標準的測定法で、超遠心による分画と組み合わせた UCHM法 (U ltracentrifugation— heparin— Mnし 1—method)
2 、 BQ法 (Beta-Quantification method)で の測定値を比べると必ずしも精度の面で十分とは 、えな 、のが現状である。
[0004] 特許文献 1：特許第 3446486号公報
特許文献 2：特許第 2600065号公報
特許文献 3：特許第 2799835号公報
特許文献 4：特許第 3164829号公報
特許文献 5：国際公開 WO98/59068号公報
特許文献 6：特開 2000-60600号公報
特許文献 7：特許第 3193634号公報
特許文献 8：特許第 3058602号公報
特許文献 9：国際公開 WO98/59068号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、新規なポリマー、当該ポリマーを含んで成る、リポ蛋白中のコレステロ一 ルの測定方法及び測定用試薬を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、
(1)一般式 [1]
—— (CH2CH20)k― [ 1]
[0007] (式中、 kは 10〜250の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコール セグメント、一般式 [2]
Figure imgf000005_0001
[0008] (式中、 Rは水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）で示されるモノマー 単位及び一般式 [3]
Figure imgf000005_0002
[0009] 〔式中、 R2は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R3は一般式 [4] — COOR4 [4]
[0010] (式中、 R4はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナ-ル基を表す。）で示される基 、アルキル基、アルコキシ基、ァラルキル基又はアルキル力ルバモイル基を表す。〕で 示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー、
(2)上記（1)に記載のポリマーの共存下で測定を行うことを特徴とする、リポ蛋白中の コレステロールの測定方法、
(3)上記（1)に記載のポリマーの共存下、生体由来試料を (1)コレステロールエステラ ーゼ（CHE)及びコレステロールォキシダーゼ（CO)、又は (2)CHE、コレステロール デヒドロゲナーゼ（CHD)及び NAD (P)〔ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン 酸)〕と反応させ、生成する過酸化水素量又は NAD (P) H〔還元型ニコチンアミドア デニンジヌクレオチド (リン酸)）量に基づ 、てコレステロールを測定することを特徴と する、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定方法、
(4)生体由来試料を (l)CHE及び CO、又は (2)CHE、 CHD及び NAD (P)と反応さ せ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づ 、てコレステロールを測定するため の試薬に、上記（1)に記載のポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ 蛋白中のコレステロールの測定用試薬、
(5)生体由来試料を特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する ための試薬と接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去 し、特定のリポ蛋白中のコレステロールと、（l)CHE及び CO、又は (2)CHE、 CHD及 び NAD (P)と反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づ ヽてコレステロ ールを測定するための試薬に、請求項 1〜7の何れかのポリマーを含有させた、生体 由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬、
(6) (1)上記（1)に記載のポリマー、（2)CHE、（3)CO、ペルォキシダーゼ（POD)、及 びカップラー又は Z及びデベロッパー、及び (4)水性媒体を含んでなる第一試液と、 ( 5)CHE、（6)CO及び (7)水性媒体を含んでなる第二試液と力 なるものであって、 PO D、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含 まれている特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、
(7) (1)上記（1)に記載のポリマー、（2)CHE、（3)CO、（4)POD、（5)カップラー、（6)デ ベロッパー及び (7)水性媒体を含んでなる第一試液と、（8)界面活性剤及び (9)水性媒 体を含んでなる第二試液とからなるリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、及び
(8) (1)上記（1)に記載のポリマー、（2)CHE、（3)CO、（4)カタラーゼ (CAT)及び (5) 水性媒体を含んでなる第一試液と、（6)CAT阻害剤、（7)水性媒体及び要すれば (8) 界面活性剤とを含んでなる第二試液とからなるものであって、 POD、カップラー、デ ベロツバ一がそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている特定のリ ポ蛋白中のコレステロールの測定用キット、の発明である。
発明の効果
リポ蛋白中のコレステロールの直接的測定法に於いて、上記一般式 [1]で示される 基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及 び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んでなるポリマー（以下、「 本発明のポリマー」と略記する場合がある。）を共存させることにより、特定のリポ蛋白 を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅 延ないしは一時的に停止させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール の反応を先行させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測 定することができる。また、反応を先行させた当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中 のコレステロールを消去することにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定す ることができる。これにより、測定対象となる目的のリポ蛋白以外のリポ蛋白を分離分 別することなぐ 目的のリポ蛋白中のコレステロールを測定することが可能となる。更 に、本発明によれば、これまで問題となっていた脂質異常検体の測定値に於いても 標準的測定法での測定値と一致する測定精度に優れたリポ蛋白中コレステロール測 定方法及び測定試薬を提供することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 1.本発明のポリマー
1 - 1.ポリマー
一般式 [1]【こ於 ヽて、 kiま通常 10〜250、好ましく ίま 20〜200、より好ましく ίま 40〜 150の整数である。
一般式 [2]及び [3]に於いて、 R1及び R2で示される炭素数 1〜3のアルキル基として は、直鎖状或いは分枝状でもよぐ具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 η-プロ ピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
[0013] 一般式 [3]に於いて、 R3で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環 状の何れでもよぐ通常炭素数 1〜15、好ましくは 3〜8のものが挙げられ、具体的に は、例えばメチル基、ェチル基、 η-プロピル基、イソプロピル基、 η-ブチル基、イソブ チノレ基、 sec-ブチノレ基、 tert-ブチノレ基、 n-ペンチノレ基、イソペンチノレ基、 sec-ペンチ ル基、 tert-ペンチル基、ネオペンチル基、 n-へキシル基、イソへキシル基、 sec-へキ シル基、 tert-へキシル基、ネオへキシル基、 n-ヘプチル基、イソへプチル基、 sec-へ プチル基、 tert-ヘプチル基、ネオへプチル基、 n-ォクチル基、イソォクチル基、 sec- ォクチル基、 tert-ォクチル基、ネオォクチル基、 n-ノ-ル基、イソノ-ル基、 sec-ノ- ル基、 tert-ノニル基、ネオノニル基、 n-デシル基、イソデシル基、 sec-デシル基、 tert -デシル基、ネオデシル基、 n-ゥンデシル基、イソゥンデシル基、 sec-ゥンデシル基、 t ert-ゥンデシル基、ネオゥンデシル基、 n-ドデシル基、イソドデシル基、 sec-ドデシル 基、 tert-ドデシル基、ネオドデシル基、 n-トリデシル基、イソトリデシル基、 sec-トリデ シル基、 tert-トリデシル基、ネオトリデシル基、 n-テトラデシル基、イソテトラデシル基 、 sec-テトラデシル基、 tert-テトラデシル基、ネオテトラデシル基、 n-ペンタデシル基 、イソペンタデシル基、 sec-ペンタデシル基、 tert-ペンタデシル基、ネオペンタデシ ル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シク 口へキシルメチル基、シクロへプチル基、シクロォクチル基、シクロノ-ル基、シクロデ シル基、シクロウンデシル基、シクロドデシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシ ル基、シクロペンタデシル基等が挙げられる。
[0014] R3で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ 通常炭素数 1〜： LO、好ましくは 1〜6のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシ 基、エトキシ基、 n_プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n-ブトキシ基、イソブトキシ基、 se c-ブトキシ基、 tert-ブトキシ基、 n-ペンチルォキシ基、イソペンチルォキシ基、 sec-ぺ ンチルォキシ基、 tert-ペンチルォキシ基、ネオペンチルォキシ基、 n-へキシルォキ シ基、イソへキシルォキシ基、 sec-へキシルォキシ基、 tert-へキシルォキシ基、ネオ へキシルォキシ基、 n-ヘプチルォキシ基、イソへプチルォキシ基、 sec-へプチルォキ シ基、 tert-ヘプチルォキシ基、ネオへプチルォキシ基、 n-ォクチルォキシ基、イソォ クチルォキシ基、 sec-ォクチルォキシ基、 tert-ォクチルォキシ基、ネオォクチルォキ シ基、 n-ノ-ルォキシ基、イソノ-ルォキシ基、 sec-ノ-ルォキシ基、 tert-ノ-ルォキ シ基、ネオノ-ルォキシ基、 n_デシルォキシ基、イソデシルォキシ基、 sec-デシルォ キシ基、 tert-デシルォキシ基、ネオデシルォキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブト キシ基、シクロペンチルォキシ基、シクロへキシルォキシ基、シクロへプチルォキシ基 、シクロォクチルォキシ基、シクロノ-ルォキシ基、シクロデシルォキシ基等が挙げら れる。
[0015] R3で示されるァラルキル基としては、通常炭素数 7〜12のものが挙げられ、具体的 には、例えばべンジル基、フエ-ルプロピル基、フエ-ルブチル基、フエ-ルペンチ ル基、フエ-ルへキシル基等が挙げられる。
[0016] R3で示されるアルキル力ルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何 れでもよぐ通常炭素数 1〜10、好ましくは 1〜6のものが挙げられ、具体的には、例 えばメチルカルバモイル基、ェチルカルバモイル基、 n-プロピル力ルバモイル基、ィ ソプロピル力ルバモイル基、 n-ブチルカルバモイル基、イソブチルカルバモイル基、 s ec-ブチルカルバモイル基、 tert-ブチルカルバモイル基、 n-ペンチルカルバモイル 基、イソペンチルカルバモイル基、 sec-ペンチルカルバモイル基、 tert-ペンチルカル バモイル基、ネオペンチルカルバモイル基、 n-へキシルカルバモイル基、イソへキシ ルカルバモイル基、 sec-へキシルカルバモイル基、 tert-へキシルカルバモイル基、ネ ォへキシルカルバモイル基、 n-へプチルカルバモイル基、イソへプチルカルバモイル 基、 sec-へプチルカルバモイル基、 tert-へプチルカルバモイル基、ネオへプチルカ ルバモイル基、 n-ォクチルカルバモイル基、イソォクチルカルバモイル基、 sec-オタ チルカルバモイル基、 tert-ォクチルカルバモイル基、ネオォクチルカルバモイル基、 n-ノ-ルカルバモイル基、イソノ-ルカルバモイル基、 sec-ノ-ルカルバモイル基、 ter t-ノ-ルカルバモイル基、ネオノ-ルカルバモイル基、 n-デシルカルバモイル基、イソ デシルカルバモイル基、 sec-デシルカルバモイル基、 tert-デシルカルバモイル基、 ネオデシルカルバモイル基、シクロプロピル力ルバモイル基、シクロプチルカルバモ ィル基、シクロペンチルカルバモイル基、シクロへキシルカルバモイル基、シクロへキ シルメチルカルバモイル基、シクロへプチルカルバモイル基、シクロォクチルカルバ モイル基、シクロノ-ルカルバモイル基、シクロデシルカルバモイル基等が挙げられる 一般式 [4]に於いて、 R4で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環 状の何れでもよぐ通常炭素数 1〜15、好ましくは 3〜12のものが挙げられ、具体的 には、例えばメチル基、ェチル基、 n_プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、イソ ブチノレ基、 sec-ブチノレ基、 tert-ブチノレ基、 n-ペンチノレ基、イソペンチノレ基、 sec-ペン チル基、 tert-ペンチル基、ネオペンチル基、 n-へキシル基、イソへキシル基、 sec-へ キシル基、 tert-へキシル基、ネオへキシル基、 3-メチルペンチル基、 2-メチルペンチ ル基、 1,2-ジメチルブチル基、 n-ヘプチル基、イソへプチル基、 sec-ヘプチル基、 ter t-ヘプチル基、ネオへプチル基、 n-ォクチル基、イソォクチル基、 sec-ォクチル基、 te rt-ォクチル基、ネオォクチル基、 2-ェチル -へキシル基、ノニル基、デシル基、ゥンデ シル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、シクロプロピル 基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへプチル 基、シクロォクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロドデシル基、シクロウン デシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基等が挙げ られる。 [0018] R4で示されるハロアルキル基としては、炭素数 1〜12のアルキル基中の水素原子 の一部又は全部がハロゲン原子 (例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原 子等が挙げられ、中でもフッ素原子が好ましい。）で置換されたものが挙げられ、通常 炭素数 1〜12、好ましくは 1〜10のものが挙げられ、具体的には、例えばフルォロメ チル基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ョードメチル基、トリフルォロメチル基、トリク ロロメチル基、トリブロモメチル基、 2-フルォロェチル基、 2-クロ口ェチル基、 2-ブロモ ェチル基、 3-フルォロプロピル基、 3-クロ口プロピル基、 3-ブロモプロピル基、トリフル ォロプロピル基、トリクロ口プロピル基、トリブロモプロピル基、ジ（トリフルォロメチル)メ チル基、ジ（トリクロロメチル)メチル基、ジ（トリブロモメチル)メチル基、ヘプタフルォロ プロピル基、ヘプタクロロプロピル基、 4-フルォロブチル基、 4-クロロブチル基、 4-ブ ロモブチル基、ノナフルォロブチル基、ノナクロロブチル基、ノナブロモブチル基、 5- フルォロペンチル基、 5-クロ口ペンチル基、 5-ブロモペンチル基、 2, 2,3,3,4,4,5,5-ォ クタフルォロペンチル基（一CH (CF ) H)、 2,2, 3,3,4,4,5,5-オタタクロロペンチル基（
2 2 4
-CH (CC1 ) H)、 2,2, 3,3,4,4,5, 5 -オタタブロモペンチル基（一 CH (CBr ) H)、パ
2 2 4 2 2 4 一フルォロペンチル基、パークロロペンチル基、パーブロモペンチル基、 6-フルォロ へキシル基、 6-クロ口へキシル基、 6-ブロモへキシル基、パーフルォ口へキシル基、 クロ キシノレ基、 ーブロモへキシノレ基、 フノレオ プチノレ基、 クロ 口へプチル基、パーブロモヘプチル基、パーフルォロォクチル基、パークロロォクチ ル基、パーブロモォクチル基、パーフルォロノ-ル基、パーク口ロノ-ル基、パーブ口 モノ-ル基、ヘプタデカフルォロォクチルェチル基（一 (CH ) (CF ) CF基）、ヘプタ
2 2 2 7 3
デカクロロォクチルェチル基（一 (CH ) (CC1 ) CC1基）、ヘプタデカブロモォクチル
2 2 2 7 3
ェチル基（― (CH ) (CBr ) CBr基）、パーフルォロデシル基、パークロロデシル基、
2 2 2 7 3
パーブロモデシル基、パーフルォロウンデシル基、パークロロゥンデシル基、パーブ 口モウンデシル基、パーフルォロドデシル基、パーク口ロドデシル基、パーブ口モドデ シル基等が挙げられる。
[0019] 一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメントとしては、例えば 一般式 [5]
Figure imgf000011_0001
[0020] (式中、 R5は水素原子又は炭素数 '3のアルキル基を表し、 R6はシァノ基又は炭素 数 1〜3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250 の整数を表す。）で示されるもの等が挙げられる。
[0021] 一般式 [5]に於いて、 R5及び R6で示される炭素数 1〜3のアルキル基としては、直 鎖状或いは分枝状でもよぐ具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n-プロピル基 、イソプロピル基等が挙げられる。
[0022] Eで示される炭素数 1〜6のアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよぐ具 体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメ チレン基、へキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばェチリデン基、プロピレ ン基、イソプロピリデン基、ェチルエチレン基、 1-メチルトリメチレン基、 2-メチルトリメ チレン基、 1-メチルテトラメチレン基、 2-メチルテトラメチレン基、 1-メチルペンタメチレ ン基、 2-メチルペンタメチレン基、 3-メチルペンタメチレン基等の分枝状アルキレン基 等が挙げられる。
[0023] kは通常 10〜250、好ましくは 20〜200、より好ましくは 40〜150の整数である。
[0024] 一般式 [ 1 ]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示 されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んで 成るポリマー (本発明のポリマー）としては、例えば一般式 [6]
(CH2CH20)k- [6]
Figure imgf000011_0002
[0025] (式中、 R7は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R8はシァノ基又は炭素 数 1〜3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 nは 50〜900
2
の整数を表し、 pは 50〜900の整数を表し、 mは 1〜10の整数を表し、 〜 、 R5、 R6、 E及び kは前記に同じ。）で示されるもの等が挙げられる。 [0026] 一般式 [6]に於いて、 R7及び R8で示される炭素数 1〜3のアルキル基としては、直 鎖状或いは分枝状でもよぐ具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n-プロピル基 、イソプロピル基等が挙げられる。
[0027] Eで示される炭素数 1〜6のアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよぐ具
2
体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメ チレン基、へキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばェチリデン基、プロピレ ン基、イソプロピリデン基、ェチルエチレン基、 1-メチルトリメチレン基、 2-メチルトリメ チレン基、 1-メチルテトラメチレン基、 2-メチルテトラメチレン基、 1-メチルペンタメチレ ン基、 2-メチルペンタメチレン基、 3-メチルペンタメチレン基等の分枝状アルキレン基 等が挙げられる。
[0028] n及び pは、夫々独立して通常 50〜900、好ましくは 75〜600の整数である。
[0029] mは、通常 1〜10、好ましくは 2〜6の整数である。
[0030] 本発明のポリマーの重合平均分子量は、通常 10,000〜120,000、好ましくは 30,000 〜100,000である。
[0031] また、本発明のポリマーに於ける一般式 [1]で示される基を有するポリエチレンダリ コールセグメントの含有量は、通常 1〜70重量％、好ましくは 10〜50重量％である。
[0032] 更に、本発明のポリマーに於ける一般式 [2]及び [3]で示されるモノマー単位の含 有量は、夫々通常 20〜80重量％、好ましくは 50〜80重量％である。
[0033] 1 2.製造法
一般式 [ 1 ]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示 されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んで 成るポリマー (本発明のポリマー）は、例えば一般式 [10]
R7 R°
CO-E2-C- N = N-C- E1-COO— (CH2CH20)k [10]
R8 R6
[0034] (式中、 R5〜R8、 E、 E及び kは前記に同じ。 )で示されるモノマー単位を有するァゾ
1 2
基含有ポリエチレングリコールセグメントの共存下に、一般式 [11] CC HH HHIIII CCC R RRIIII
3 2〇 1
ο
[0035] 式中、 R1は前 Η記に同じ。）で示される化合物及び- 式 [12」
Figure imgf000013_0001
[0036] 式中、 R2及び R3は前記に同じ。）で示される化合 を共: 合することにより得られる
[0037] 一般式 [11]で示される化合物の具体例としては、例えばアクリル酸、メタクリル酸等 が挙げられる。
[0038] 一般式 [12]で示される化合物の具体例としては、例えばメタクリル酸 tert-ブチル、 メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸 2-ェチルへキシル、メタクリル酸ドデシル、メ タクリル酸ボルナ-ル、メタクリル酸ヘプタデカフルォロォクチルェチル、メタクリル酸 2, 2,3,3,4,4,5,5-ォクタフルォロペンチル等のメタクリル酸エステル類、例えばアクリル 酸シクロへキシル等のアクリル酸エステル類等の α , β -不飽和カルボン酸エステル 類、例えばシクロへキシルメタクリルアミド等の α , β -不飽和カルボン酸アミド類、例え ばシクロへキシルビ-ルエーテル等のビュルエーテル類、例えばビュルシクロへキシ ル、ァリルシクロへキシル等の α , β -不飽和脂肪族炭化水素類、例えばァリルべンゼ ン等の (X , β -不飽和芳香族炭化水素類等が挙げられる。
[0039] 一般式 [10]で示されるモノマー単位を有するァゾ基含有ポリエチレングリコールセ グメントは、市販品を用いても常法により適宜合成したものを用いてもよい。市販品を 使用する場合の具体例としては、例えば VPE— 0201、 VPE— 0601等の高分子ァ ゾ重合開始剤 (和光純薬工業 (株)製)等が挙げられる。
[0040] また、常法により適宜合成したものを使用する場合の具体例としては、例えば特開 平 4-372675号公報等に記載の製造法に従って容易に製造することができる。即ち、 例えば一般式 [13] HO— (CH2CH20)k-OH [ 13]
[0041] (式中、 kは前記に同じ。）で示されるポリエチレングリコールと、例えば一般式 [14]
R7 R5
XOC-E2-C- N = N-C-Ei-COX [14]
I I
R8 R6
[0042] (式中、 Xはハロゲン原子を表し、 R5〜R8、 E及び Eは前記に同じ。 )で示されるァゾ
1 2
基含有二塩基酸ジハライドとを適当な溶媒中、要すれば塩基性触媒の存在下で反 応させること〖こより得ることができる。
[0043] また、一般式 [10]で示されるモノマー単位を有するァゾ基含有ポリエチレングリコ ールセグメントは、例えば特開平 6-93100号公報、特開平 6-322089号公報等に記載 の製造法に従って製造したものを用いてもよい。即ち、例えば上記一般式 [13]で示 されるポリエチレングリコールと、一般式 [15]
R7 R5
HOOC- E2-C- N = N-C-E1-COOH [15]
R8 R6
[0044] (式中、 R5〜R8、 E及び Eは前記に同じ。 )で示されるァゾ基含有二塩基酸とを適当
1 2
な溶媒中、要すれば塩基性触媒の存在下、脱水剤を用いて反応させることによって ち得ることがでさる。
[0045] 一般式 [14]に於いて、 Xで示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩 素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
[0046] 上記製造法は、何れも塩基性触媒の存在下で行うのが好ましぐ使用する塩基性 触媒の具体例としては、例えばトリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、 Ν,Ν-ジ メチルァ-リン、ピぺリジン、ピリジン、 4-ジメチルァミノピリジン、 1,5-ジァザビシクロ [4. 3.0]ノナ- 5-ェン、 1,8-ジァザビシクロ [5.4.0]ゥンデ力- 7-ェン、トリ- η-ブチルァミン、 Ν -メチルモルホリン等の有機アミン類、例えば水素化ナトリウム等の金属水素化物類、 例えば η-ブチルリチウム、 tert-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類等 が挙げられる。
[0047] 塩基性触媒の使用量としては特に限定されるものではないが、一般式 [14]で示さ れるァゾ基含有二塩基酸ジハライド、 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸或いは脱 水剤に対して通常 0.5〜5倍モル、好ましくは 0.5〜1.5倍モルの範囲力 適宜選択さ れる。
また、当該ポリエチレングリコールと一般式 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸とを 反応させる方法に於いて使用される脱水剤の具体例としては、脱水縮合剤として用 いられるものであれば特に限定されないが、例えば濃硫酸、五酸化二リン、無水塩化 亜鉛等の無機脱水剤類、例えばジシクロへキシルカルポジイミド、ジイソプロピルカル ボジイミド、 1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノプロピルカルボジイミド)塩酸塩等のカルボ ジイミド類、ポリリン酸、無水酢酸、カルボ-ルジイミダゾール、 p-トルエンスルホ-ル クロラ ド等が挙げられる。
[0048] 脱水剤の使用量としては特に限定されるものではないが、少ないと反応が遅くなり、 且つ到達分子量も小さくなり、多すぎると短時間で高分子量になるが分子量の制御 が困難となり、且つ、経済的でないため、相当するァゾ基含有二塩基酸に対して通 常 1〜5倍モル、好ましくは 2〜3倍モルの範囲力 適宜選択される。
[0049] 反応溶媒としては、どちらの方法に於いても例えばジェチルエーテル、ジイソプロピ ルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、ジメトキシェタン等のエーテル類、例え ば四塩化炭素、クロ口ホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエチレン等のハ ロゲン化炭化水素類、例えば n-へキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の炭化水 素類、例えば酢酸ェチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のエステル類、ァセト 二トリル、 Ν,Ν-ジメチルホルムアミド、 Ν,Ν-ジメチルァセトアミド等が挙げられる。これら は夫々単独で用いても、二種以上適宜組み合わせて用いてもょ 、。
[0050] 一般式 [13]で示されるポリエチレングリコールと、一般式 [14]で示されるァゾ基含 有二塩基酸ジハライド或!ヽは一般式 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸との使用 割合は特に限定されず必要に応じて適宜決定されるが、高分子量のァゾ基含有ポリ エチレングリコールセグメントを得るには両者をほぼ等モル量用いることが好ましい。
[0051] 反応温度は、特に限定されないが、あまり高いとァゾ基が分解し、低すぎると反応 速度が遅くなり製造に時間を要し、且つ高分子量のァゾ基含有ポリエチレングリコー ルセグメントが得られ難くなるため、通常— 10〜60°Cの範囲力 適宜選択される。ま た、反応温度は低温力も段階的に温度を上昇させる方法をとつてもよい。
[0052] 反応時間は製造方法により異なるが、通常 1〜60時間の範囲力 適宜選択される。
目的物の単離は、使用した原料、塩基性触媒、脱水剤、溶媒等の種類や量並びに 反応液の状態等に応じて適宜行えばよぐ例えば粘稠な反応液の場合には、反応液 を適当な溶媒で希釈した後、濾過或いは水洗等の操作により副生する第四級アンモ -ゥム塩等の不純物を除いた後、溶媒を除去することにより目的のァゾ基含有ポリェ チレングリコールセグメントを得ることができる。また、得られた該ァゾ基含有ポリェチ レンダリコールセグメントは精製及び z又は単離することなぐそのまま重合反応に付 してちよい。
[0053] 尚、原料として用いられる、上記一般式 [13]で示されるポリエチレングリコール、一 般式 [14]で示されるァゾ基含有二塩基酸ジハライド又は一般式 [15]で示されるァ ゾ基含有二塩基酸は、市販品を用いても或いは常法により適宜製造したものを用い てもよい。
[0054] 本発明のポリマー、即ち、一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコール セグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単 位を構成成分として含んで成るポリマーは、例えば親水性有機溶媒中、一般式 [10] で示されるァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメント、一般式 [11]で示される化合 物及び一般式 [12]で示される化合物を、得られるポリマーの主たる構成単位である 一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示 されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位の組成比が目的とする 組成となるように夫々の使用量を選択設定して重合反応させ、得られる溶液から、不 溶性有機溶剤を沈殿剤として用いて晶析、単離することにより得られる。
[0055] 重合溶媒としては、例えばアセトン、メチルェチルケトン等のケトン類、例えばメタノ ール、エタノール、 n-プロパノール、イソプロパノール等のアルコール類、例えばテト ラヒドロフラン、 1,4-ジォキサン等の環状エーテル類、例えば N-メチルピロリドン、 Ν,Ν' -ジメチルァセトアミド、ジメチルスルホキシド等の親水性有機溶媒が挙げられる。これ らは単独で用いても 2種類以上適宜組み合わせて用いてもよい。また、反応に影響 が出な 、範囲であれば、含水溶媒であってもよ 、。 [0056] 上記重合反応の方法としては、例えば懸濁重合、溶液重合、バルタ重合、乳化重 合等が挙げられる。この際ァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントと通常のラジ カル重合開始剤（例えばァゾビスイソブチ口-トリル、 2,2'-ァゾビスイソ酪酸ジメチル 等)を併用してもよい。
[0057] この共重合反応を行う際、必要に応じて連鎖移動剤（例えばラウリルメルカブタン、 ォクチルメルカプタン、ブチルメルカプタン、 2-メルカプトエタノール、チォグリコール 酸ブチル等）を添加し、分子量の調節を行ってもよい。
[0058] 重合反応時の濃度としては、当該ァゾ基含有ポリシロキサンセグメント、一般式 [2] 及び一般式 [3]で示される化合物の合計が通常 5〜100重量％ (無溶媒)、好ましく は 5〜80重量％、より好ましくは 10〜70重量％、更に好ましくは 20〜50重量％の範囲 となるよう適宜選択される。
[0059] 重合反応は、不活性ガス雰囲気下で行うことが望ま ヽ。不活性ガスとしては、例え ば窒素ガス、アルゴンガス等が挙げられる。
[0060] 重合温度は、高すぎると反応の制御が困難になり、低すぎると反応速度が遅くなり 反応に時間を要するため、通常 30〜120°C、好ましくは 60〜100°Cである。また、重 合反応の進行に合わせて重合温度を変化させ、反応の制御を行ってもょ 、。
[0061] 重合時間は、通常 3〜24時間、好ましくは 5〜15時間である。
沈殿剤として用いる有機溶媒としては、生成したポリマーが不溶物として析出するも のであれば特に限定されないが、例えばへキサン、酢酸ェチル、ジェチルエーテル 等が挙げられる。これらは単独で用いても 2種類以上適宜組み合わせて用いてもよ い。更に、溶媒の使用量は、少なすぎると、得られる共重合体に含まれる残存重合溶 媒の量や未反応の残存モノマーの量が多くなるため、通常重合溶媒の 2倍容量以上 、好ましくは 3〜20倍容量、より好ましくは 5〜 10倍容量である。
尚、反応後の後処理等はこの分野に於 、て通常行われる後処理法に準じてこれを 行えばよい。
[0062] 1 - 3.ポリマーの性質
このようにして得られた本発明のポリマーは、例えば塗料用榭脂組成物、被覆用榭 脂組成物等の榭脂組成物、例えば頭髪ィ匕粧料用基材 (例えばセット剤、トリートメント 剤等)、基礎化粧料用基材等の化粧料用基材等として、或いは、離型剤、コーティン グ剤、表面改質剤、医療材料等としての用途が期待されているが、中でも、特定のリ ポ蛋白中のコレステロール測定用添加剤として有用である。
[0063] 例えば本発明のポリマーは、当該ポリマーを構成するモノマー単位の組成比を適 宜選択することにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロ ールの反応を阻害することができる。この性質を利用することにより、後述するように、 特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することが可能となる。
尚、本発明に於いて「阻害」とは、保護された特定のリポ蛋白中のコレステロールの反 応を、遅延ないしは一時的に停止させることを意味する。
[0064] (l) HDL保護ポリマー
例えば、 HDLを保護し、 HDL中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとして は、一般式 [2]で示されるモノマー単位 (モノマー A)と一般式 [3]で示されるモノマ 一単位（モノマー B)との組成比（重量比）が、通常 2≤モノマー BZモノマー A、好ま しくは 2≤モノマー BZモノマー A≤ 3であって、一般式 [2]で示されるモノマー単位と 一般式 [3]で示されるモノマー単位の合計 (AB)と一般式 [1]で示されるポリエチレン グリコールセグメント (PEG)との組成比（重量比）は、通常 1≤ ABZPEG≤ 10、好まし くは 2≤ AB/PEG≤ 5であるポリマーが好まし!/、。
[0065] また、このようなポリマーとしては、例えば一般式 [2]で示されるモノマー単位力メタ クリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位が、一般式 [7]
Figure imgf000018_0001
[0066] (式中、 R ま炭素数 6〜 12のアルキル基、アルコキシ基、炭素数 7〜16のアルコキシ カルボ-ル基、ハロアルコキシカルボ-ル基、アルキル力ルバモイル基、ァラルキル 基又はボルナ-ルォキシカルボ-ル基を表す。 )で示されるものを構成成分として含 んで成るポリマーが好まし 、。
[0067] 一般式 [7]に於いて、 R9で示される炭素数 6〜 12のアルキル基としては、直鎖状、 分枝状或いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R3 で示されるアルキル基中の炭素数 6〜12のものの例示と同様のものが挙げられる。
[0068] R9で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ 通常炭素数 1〜： L0、好ましくは 1〜6のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一 般式 [3]に於ける R3で示されるアルコキシ基の例示と同様のものが挙げられる。
[0069] R9で示される炭素数 7〜16のアルコキシカルボ-ル基としては、直鎖状、分枝状或 いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば n-へキシルォキシカルボニル基、イソ へキシルォキシカルボ-ル基、 sec-へキシルォキシカルボ-ル基、 tert-へキシルォ キシカルボ-ル基、ネオへキシルォキシカルボ-ル基、 n-ヘプチルォキシカルボ- ル基、イソへプチルォキシカルボ-ル基、 sec-ヘプチルォキシカルボ-ル基、 tert- ヘプチルォキシカルボ-ル基、ネオへプチルォキシカルボ-ル基、 n-ォクチルォキ シカルボニル基、イソォクチルォキシカルボ-ル基、 sec-ォクチルォキシカルボ-ル 基、 tert-ォクチルォキシカルボ-ル基、ネオォクチルォキシカルボ-ル基、 n-ノ-ル ォキシカルボ-ル基、イソノ-ルォキシカルボ-ル基、 sec-ノ-ルォキシカルボ-ル 基、 tert-ノ-ルォキシカルボ-ル基、ネオノ-ルォキシカルボ-ル基、 n-デシルォキ シカルボニル基、イソデシルォキシカルボ-ル基、 sec-デシルォキシカルボ-ル基、 t ert-デシルォキシカルボ-ル基、ネオデシルォキシカルボ-ル基、 n-ゥンデシルォキ シカルボニル基、イソゥンデシルォキシカルボ-ル基、 sec-ゥンデシルォキシカルボ ニル基、 tert-ゥンデシルォキシカルボ-ル基、ネオゥンデシルォキシカルボ-ル基、 n-ドデシルォキシカルボ-ル基、イソドデシルォキシカルボ-ル基、 sec-ドデシルォ キシカルボ-ル基、 tert-ドデシルォキシカルボ-ル基、ネオドデシルォキシカルボ- ル基、 n-トリデシルォキシカルボ-ル基、イソトリデシルォキシカルボ-ル基、 sec-トリ デシルォキシカルボ-ル基、 tert-トリデシルォキシカルボ-ル基、ネオトリデシルォキ シカルボニル基、 n_テトラデシルォキシカルボ-ル基、イソテトラデシルォキシカルボ ニル基、 sec-テトラデシルォキシカルボ-ル基、 tert-テトラデシルォキシカルボ-ル 基、ネオテトラデシルォキシカルボ-ル基、 n_ペンタデシルォキシカルボ-ル基、イソ ペンタデシルォキシカルボ-ル基、 sec-ペンタデシルォキシカルボ-ル基、 tert-ペン タデシルォキシカルボ-ル基、ネオペンタデシルォキシカルボ-ル基、シクロへキシ ルォキシカルボ-ル基、シクロへキシルメトキシカルボニル基、シクロへプチルォキシ カルボ-ル基、シクロォクチルォキシカルボ-ル基、シクロノ-ルォキシカルボ-ル基 、シクロデシルォキシカルボ-ル基、シクロウンデシルォキシカルボ-ル基、シクロド デシルォキシカルボ-ル基、シクロトリデシルォキシカルボ-ル基、シクロテトラデシ ルォキシカルボ-ル基、シクロペンタデシルォキシカルボ-ル基等が挙げられる。
R9で示されるハロアルコキシカルボ-ル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の 何れでもよぐ通常炭素数 2〜 13のアルコキシカルボニル基の水素原子の一部又は 全部がハロゲン原子 (例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子等が挙げ られ、中でもフッ素原子が好ましい。）で置換されたものが挙げられ、通常炭素数 2〜 13、好ましくは 2〜： L 1のものが挙げられ、具体的には、例えばフルォロメトキシカルボ ニル基、クロロメトキシカルボ-ル基、ブロモメトキシカルボ-ル基、ョードメトキシカル ボ-ル基、トリフルォロメトキシカルボ-ル基、トリクロロメトキシカルボ-ル基、トリブロ モメトキシカルボ-ル基、 2-フルォロエトキシカルボ-ル基、 2-クロ口エトキシカルボ- ル基、 2-ブロモエトキシカルボ-ル基、 3-フルォロプロポキシカルボ-ル基、 3-クロ口 プロポキシカルボ-ル基、 3-ブロモプロポキシカルボ-ル基、トリフルォロプロポキシ カルボ-ル基、トリクロ口プロポキシカルボ-ル基、トリブロモプロポキシカルボ-ル基 、ジ（トリフルォロメチル)メトキシカルボ-ル基、ジ（トリクロロメチル)メトキシカルボ- ル基、ジ（トリブロモメチル）メトキシカルボ-ル基、ヘプタフルォロプロポキシカルボ- ル基、ヘプタクロロプロポキシカルボ-ル基、 4_フルォロブトキシカルボ-ル基、 4-ク ロロブトキシカルボ-ル基、 4-ブロモブトキシカルボ-ル基、ノナフルォロブトキシカル ボ-ル基、ノナクロロブトキシカルボ-ル基、ノナブロモブトキシカルボ-ル基、 5-フル ォロペンチルォキシカルボ-ル基、 5-クロ口ペンチルォキシカルボ-ル基、 5-ブロモ ペンチルォキシカルボニル基、 2,2, 3,3,4,4,5,5-ォクタフルォロペンチルォキシカルボ -ル基（一COOCH (CF ) H)、 2, 2,3,3,4,4,5,5 -オタタクロロペンチルォキシカルボ
2 2 4
-ル基（— COOCH (CC1 ) H)、 2,2,3, 3,4,4,5, 5 -オタタブロモペンチルォキシカル
2 2 4
ボ-ル基（— COOCH (CBr ) H)、パーフルォロペンチルォキシカルボ-ル基、ノ
2 2 4
一クロ口ペンチルォキシカルボ-ル基、パーブロモペンチルォキシカルボ-ル基、 6- フルォ口へキシルォキシカルボ-ル基、 6-クロ口へキシルォキシカルボ-ル基、 6-ブ ロモへキシルォキシカルボ-ル基、パーフルォ口へキシルォキシカルボ-ル基、パー クロ口へキシルォキシカルボ-ル基、パーブロモへキシルォキシカルボ-ル基、パー フルォ口へプチルォキシカルボ-ル基、パークロロへプチルォキシカルボ-ル基、 , 一ブロモヘプチルォキシカルボ-ル基、パーフルォロォクチルォキシカルボ-ル基、 パークロロォクチルォキシカルボ-ル基、パーブロモォクチルォキシカルボ-ル基、 パーフルォロノ-ルォキシカルボ-ル基、パーク口ロノ-ルォキシカルボ-ル基、パ ーブロモノ-ルォキシカルボ-ル基、ヘプタデカフルォロォクチルェトキシカルボ- ル基（— COO(CH ) (CF ) CF基）、ヘプタデカクロロォクチルエトキシカルボ-ル
2 2 2 7 3
基（— COO(CH ) (CC1 ) CC1基）、ヘプタデカブロモォクチルェトキシカルボ-ル
2 2 2 7 3
基（— COO(CH ) (CBr ) CBr基）、パーフルォロデシルォキシカルボ-ル基、パー
2 2 2 7 3
クロ口デシルォキシカルボ-ル基、パーブロモデシルォキシカルボ-ル基、パーフル ォロウンデシルォキシカルボ-ル基、パークロロゥンデシルォキシカルボ-ル基、ノ ーブロモウンデシルォキシカルボ-ル基、パーフルォロドデシルォキシカルボ-ル基 、パーク口ロドデシルォキシカルボ-ル基、パーブ口モドデシルォキシカルボ-ル基 等が挙げられる。
[0071] R9で示されるアルキル力ルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何 れでもよぐ通常炭素数 1〜10、好ましくは 1〜6のものが挙げられ、具体的には、例 えば上記一般式 [3]に於ける R3で示されるアルキル力ルバモイル基の例示と同様の ものが挙げられる。
[0072] R9で示されるァラルキル基としては、通常炭素数 7〜12のものが挙げられ、具体的 には、例えば上記一般式 [3]に於ける R3で示されるァラルキル基の例示と同様なも のが挙げられる。
[0073] 一般式 [7]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸 ドデシル、メタクリル酸 2-ェチルへキシル、メタクリル酸ボルナ-ル、メタクリル酸シクロ へキシル、アクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸ヘプタデカフルォロォクチルェチ ル、メタクリル酸 2,2,3,3,4,4,5,5-ォクタフルォロペンチル、シクロへキシルメタクリルァ ミド、シクロへキシルビニルエーテル、ビニルシクロへキシル、ァリルシクロへキシル、 ァリルベンゼン等由来のものが挙げられる。 [0074] (2) LDL保護ポリマー
例えば、 LDLを保護し、 LDL中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとして は、一般式 [2]で示されるモノマー単位 (A)と一般式 [3]で示されるモノマー単位 (B )との組成比（重量比）が、通常 BZA≤1、好ましくは 0. 5≤BZA≤1であって、一 般式 [2]で示されるモノマー単位と一般式 [3]で示されるモノマー単位力も成るコポリ マー (AB)と一般式 [1]で示されるポリエチレングリコールセグメント（PEG)との組成比 (重量比）は、通常 1≤AB/PEG≤10、好ましくは 2≤AB/PEG≤5であるポリマー が好ましい。
[0075] また、このようなポリマーとしては、例えば一般式 [2]で示されるモノマー単位力メタ クリル酸又はアクリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位が、一 般式 [8]
Figure imgf000022_0001
[0076] (式中、 R1Uが炭素数 1〜8のアルキル基を表し、 R ま前記に同じ。）で示されるものを 構成成分として含んで成るポリマーが好まし 、。
[0077] 一般式 [8]に於いて、 R1Gで示される炭素数 1〜8のアルキル基としては、直鎖状、 分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数 1〜8のものが挙げられ、具体的には 、例えば上記一般式 [3]に於ける R3で示されるアルキル基中の炭素数 1〜8のものの 例示と同様なものが挙げられる。
[0078] 一般式 [8]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸 t ert-ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、アクリル酸シクロへキシル等由来のものが挙 げられる。
[0079] (3) HDL'LDL保護ポリマー
例えば、 LDLと HDLとを保護し、 HDL中のコレステロール及び LDL中のコレステ ロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式 [2]で示されるモノマー単位 (A) と一般式 [3]で示されるモノマー単位 (B)との組成比（重量比）が、通常 1 < B/A< 2であって、一般式 [2]で示されるモノマー単位と一般式 [3]で示されるモノマー単位 力も成るコポリマー (AB)と一般式 [1]で示されるポリエチレングリコールセグメント（PE G)との組成比（重量比） (AB/C)は、通常 1≤ABZC≤10、好ましくは 2≤ABZC ≤ 5であるポリマーが好まし 、。
[0080] また、このようなポリマーとしては、例えば一般式 [2]で示されるモノマー単位力メタ クリル酸又はアクリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位が、一 般式 [9]
Figure imgf000023_0001
[0081] (式中、 R11は炭素数 1〜6のアルキル基を表し、 R2は前記に同じ。）で示されるものを 構成成分として含んで成るポリマーが好まし 、。
[0082] 一般式 [9]に於いて、 R11で示される炭素数 1〜6のアルキル基としては、直鎖状、 分枝状或いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R3 で示されるアルキル基中の炭素数 1〜6のものの例示と同様なものが挙げられる。
[0083] 一般式 [9]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸 t ert-ブチル、メタクリル酸シクロへキシル等由来のものが挙げられる。
[0084] 2.本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定法
本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定法は、上記した如き本発明のポリマー の存在下で、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定すればよ い。
[0085] このような生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法と しては、原理的には、生体由来試料中のコレステロールを CHEと反応させて遊離コ レステロールと脂肪酸に分解し、次 、で (a)COを反応させて生成する過酸ィ匕水素を 測定するか、或 、は (b)CHD及び NAD (P)を反応させて生成する NAD (P) Hを測 定する方法が挙げられる。
[0086] より具体的には、酵素反応を利用する、（1)例えば生体由来試料中のコレステロ一 ルエステルを CHEによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在す る遊離コレステロールと共に、 COによって酸化して、コレステ一 4—ェン一 3—オンと 過酸化水素とにし、 PODの存在下、生成した過酸化水素で被酸化性呈色試薬 (例 えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸ィ匕によってそれ自体が発色する発色剤 等)を酸化発色させて、生じた酸化色素を比色定量する酸化呈色法、（2)例えば生体 由来試料中のコレステロールを CHEによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、 初めから存在する遊離コレステロールと共に CHDの存在下、 NAD (P)と反応させて 、生成する NAD (P) Hを 340應で測定する紫外部測定法等が挙げられる。
[0087] 即ち、本発明の測定法は、これらの方法を行うに際して、反応系に、本発明のポリ マーを存在（共存)させればよ!、。
[0088] 尚、本発明の方法は、本発明のポリマーを使用する以外は上記した如き方法に準 じて実施すれば良ぐまた、上記した如き方法において使用される試薬類も使用可能 である。
[0089] 本発明の測定法は、より具体的には以下の 2つの方法に大別される。
[0090] (1)本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール を測定する方法 (直接法）
生体由来試料と本発明のポリマーとを接触させて、当該試料中の特定のリポ蛋白 中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ
、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応によって生成される 前記生成物を測定する。
[0091] (2)本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法 ( 消去法）
先ず、生体由来試料と本発明のポリマーとを接触させて、当該試料中の特定のリポ 蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止 させ、その結果として当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応 を先行させてこれらを消去（消費）し、し力る後、特定のリポ蛋白中のコレステロール の反応によって生成される前記生成物を測定する。
[0092] 2— 1.直接法 上記した如き直接法としては、例えば以下の如き方法が挙げられる。
[0093] 直接法 (1)
本発明のポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHEと COを作用させて過 酸化水素を生じさせ、生じた過酸ィ匕水素に PODと被酸ィ匕性呈色試薬 (例えばカップ ラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用 させて酸ィ匕色素を生じさせ、次いで吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料 中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明のポリマーとの接 触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量を 算出する。
[0094] 直接法 (2)
本発明のポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHE、 CHD及び NAD (P )を作用させて NAD (P) Hを生じさせ、次いで吸光度を測定し、これに基づいて生体 由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明のポリマ 一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロ 一ル量を算出する。
[0095] 上記直接法 (1)及び直接法 (2)において、吸光度を測定する時期は、本発明のポリ マーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接 触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの 反応が実質的に終了し、且つ本発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（ 生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋 白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODnb)である。尚、 当該吸光度を測定する時期は、測定方法の違いや、使用する本発明のポリマーの 種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるた め、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)を検討し、適宜設定すれ ばよい。
[0096] また、上記直接法 (1)及び直接法 (2)において、本発明のポリマーを適宜選択して用 いることにより、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定 することができる。例えば (1)前述した如き HDLを保護するポリマーを用いることにより 、 HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（LDL コレステロール及び VLDL —コレステロールの量)を、（2)前述した如き LDLを保護するポリマーを用いることによ り、 LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（HDL—コレステロール及び VLDL —コレステロールの量）を、また、（3)前述した如き HDL及び LDLを保護するポリマー を用いることにより、 HDL及び LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（VLDL コレステロールの量）を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明のポリマー の具体例、好ましい態様は前述した通りである。
[0097] 2- 2.消去法
上記した如き消去法としては、以下のように更に 2つに大別される。
[0098] 消去法 (1) :生体由来試料と本発明のポリマーとを接触させた後、相異なる二つの時 点での吸光度を測定する方法。
[0099] 消去法 (2) :本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレス テロールを、本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールの反応 に関与しない別の反応に導いて消去（消費)する方法。
[0100] (1)消去法 (1)
上記した如き消去法 (1)としては、例えば以下の如き方法が挙げられる。
[0101] 消去法 (l)-a
本発明のポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHEと COを作用させて過 酸化水素を生じさせ、生じた過酸ィ匕水素に PODと被酸ィ匕性呈色試薬 (例えばカップ ラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用 させて酸ィ匕色素を生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基 づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本 発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロ一 ル量を算出する。
[0102] 消去法 (l)-b
本発明のポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHE、 CHD及び NAD (P )を作用させて NAD (P) Hを生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、こ れらに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来 試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレ ステロール量を算出する。
[0103] 上記消去法 (l)-a及び (l)-bにおいて、相異なる二つの時点とは、（0本発明のポリマ 一によつて反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触 によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反 応が実質的に終了し、且つ本発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生 体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白） 中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODnb)と、 GO本発明の ポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの 接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質 的に終了した時点（ODt)、の二つの時点である。尚、これら二つの時点は、測定方 法の違いや、使用する本発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試 薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応 性 (反応曲線等)を検討し、適宜設定すればよい。
[0104] また、上記消去法 (l)-a及び消去法 (l)-bにお 、て、本発明のポリマーを適宜選択し て用いることにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することがで きる。例えば (1)前述した如き HDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL—コ レステロールの量を、（2)前述した如き LDLを保護するポリマーを用いることにより、 L DL—コレステロールの量を、また、（3)前述した如き HDL及び LDLを保護するポリマ 一を用いることにより、 HDL—コレステロール及び LDL—コレステロールの量を、そ れぞれ求めることができる。尚、これら本発明のポリマーの具体例、好ましい態様は 前述した通りである。
[0105] 上記消去法 (l)-a及び消去法 (l)-bにおいては、（0本発明のポリマーによって反応 が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が 阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に 終了した後、好ましくは本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生 体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白 以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明のポリマ 一によつて反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触に よって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開 始される前の時点（ODnb)の後に、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保 護を解除し得る物質、言い換えれば、本発明のポリマーによって阻害されている特定 のリポ蛋白中のコレステロールの反応を復活 (復帰)或いは促進し得る物質を反応系 に共存させるのが好ましい。これにより阻害されていた特定のリポ蛋白中のコレステロ ールの反応が復活 (復帰)或いは促進されるので、より短時間に目的とする特定のリ ポ蛋白中のコレステロールの測定を完了（終了）することができる。
[0106] また、本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本 発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白） 中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明のポリマーによって反応 が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻 害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時 点（ODnb)の後に、反応系の pHを変化させることによつても、特定のリポ蛋白に対す る本発明のポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明のポリマーによって阻害さ れて 、る特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰)或いは促進し得る。
[0107] (2)消去法 (2)
本発明の消去法 (2)を実施するには、本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以 外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬の存在下、当該試薬と本発 明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールとを反応さ せて、本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロ一 ルを、本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールの反応に関与 しない別の反応に導いて消去 (消費)した後、本発明のポリマーにより保護された特 定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を実施すればよい。
[0108] 例えば、このような本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中の コレステロールを消去するための試薬としては、（0生体由来試料中のコレステロール を CHEと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、次 、で COを反応させて 生成する過酸ィ匕水素を消去するための過酸ィ匕水素消去試薬、 GO生体由来試料中の コレステロールを CHEと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、 CHD及 び NAD (P)を反応させて生成する NAD (P) Hを消去するための NAD (P) H消去試 薬等が挙げられる。
[0109] 過酸化水素消去試薬としては、例えば CHE、 CO、 POD及びカップラーとの組合 せ、 CHE、 CO、 POD及びデベロッパーとの組合せ、 CHE、 CO、 POD、カップラー 及びデベロッパーの組合せ、 CHE、 CO及び CAT等が挙げられ、 NAD (P) H消去 試薬としては、 CHE、 CHD及び NAD (P)の組合せが挙げられる。
[0110] このような本発明のポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステ ロールを消去するための試薬を用いる、本発明の消去法 (2)は、例えば以下のように 実施することができる。
[0111] 消去法 (2)-a
本発明のポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHEと COを作用させて過 酸化水素を生じさせ、生じた過酸ィ匕水素に PODとカップラー（又はデベロッパー）、 又は CATを作用させて、生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が 阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去（消費）し、次!、 でデベロッパー（又はカップラー）、又は CAT阻害剤及び被酸ィ匕性呈色試薬を作用 させて酸ィ匕色素を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリ ポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によ つて反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。
[0112] 消去法 (2)-b
本発明のポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHE、 CHD及び NAD (P ) (或いは CHE、 CO、 POD及びカップラー又は Z及びデベロッパー）を作用させて NAD (P) H (或いは過酸化水素）を生じさせる反応系に導 ヽて、生体由来試料と本 発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白 中のコレステロールを消去（消費）した後、次いで、 CO、 POD、被酸化性呈色試薬 及び CHD阻害剤（或いは CHD、 NAD (P)及び CO阻害剤）を作用させて酸化色素 (或いは NAD (P) H)を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中 のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明のポリマーとの接触 によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。
[0113] 上記消去法 (2)-a及び (2)-bにおいては、一つの時点、即ち、本発明のポリマーによ つて反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって 反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した 時点（ODb)のみの吸光度の測定によっても生体由来試料中の特定リポ蛋白中のコ レステロール量を測定し得るが、より測定精度を上げるために、上記消去法 (1)- a及び (l)-bと同様の相異なる二つの時点、即ち、（0生体由来試料と本発明のポリマーとの 接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール が実質的に消去（消費）され、且つ本発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ 蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリ ポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODbl)と、 GO本 発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマ 一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が 実質的に終了した時点（ODb)での吸光度を測定するのが好ましい。尚、これら二つ の時点は、測定方法の違いや、使用する本発明のポリマーの種類及び使用濃度、そ の他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分 画に対する反応性 (反応曲線等)を検討し、適宜設定すればょ ヽ。
[0114] また、上記消去法 (2)-a及び消去法 (2)-bにおいて、本発明のポリマーを適宜選択し て用いることにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することがで きる。例えば (1)前述した如き HDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL—コ レステロールの量を、（2)前述した如き LDLを保護するポリマーを用いることにより、 L DL—コレステロールの量を、また、（3)前述した如き HDL及び LDLを保護するポリマ 一を用いることにより、 HDL—コレステロール及び LDL—コレステロールの量を、そ れぞれ求めることができる。尚、これら本発明のポリマーの具体例、好ましい態様は 前述した通りである。
[0115] 上記消去法 (2)-a及び消去法 (2)-bにおいては、生体由来試料と本発明のポリマー との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロ一 ルが実質的に消去 (消費)された後、好ましくは生体由来試料と本発明のポリマーと の接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロ一 ルが実質的に消去 (消費)され、且つ使用する本発明のポリマーによって反応が阻害 されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害され た特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前 (ODbl)に、 特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質、言い換えれば 、本発明のポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰)或 いは促進し得る物質を反応系に共存させるのが好ま 、。これにより阻害されて！ヽた 特定のリポ蛋白の反応が復活 (復帰)或いは促進されるので、より短時間にそくて 、 を完了（終了）することができる。
[0116] また、生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定の リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用 する本発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明 のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロール の反応が実質的に開始される前の時点（ODbl)の後に、反応系の pHを変化させるこ とによっても、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除、言い換えれ ば、本発明のポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰） 或いは促進し得る。
[0117] 2- 3.具体的な測定法
(1)直接法〔直接法 (1)及び (2)〕
本発明の直接法〔直接法 (1)及び (2)〕は、 1液法でも 2液法でも或いはそれ以上の試 液を用いる方法の何れでもよぐ 2液以上の試液を用いる方法においては、本発明の ポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよい。尚、 1液法 の場合には、本発明ポリマー及びコレステロール測定用の試薬類の全てが当該試液 に含まれることは言うまでもな 、。
[0118] 以下に本発明の直接法〔直接法 (1)及び (2)〕の具体例を示すが、本発明の方法はこ れらに限定されるものではない。
[0119] 1液法で行う場合は、例えば以下の如くである。
[0120] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー、（2)CHE、（3)CO、 POD及び被酸化性呈 色試薬〔又は (3)CHD及び NAD (P)〕及び (4)水性媒体を含んでなる試液とを混合し た後に吸光度 (ODnb)を測定し、この吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリ ポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反 応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すれば よい。
[0121] 2液法で行う場合は、例えば以下の如くである。
[0122] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー及び (2)水性媒体を含んでなる第一試液とを 混合し、その後、要すれば吸光度 (ODbl)を測定し、次いで、当該混合液と、 (3)CH E、 (4)CO〔又は (4)CHD〕及び (5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に 吸光度 (ODnb)を測定し、この吸光度に基づ!/、て生体由来試料中の特定のリポ蛋白 中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻 害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すればょ 、。 尚、第二試液に COを含有させる場合には、 POD及びカップラー、デベロッパーを、 それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、第二試液に CHD を含有させる場合には、 NAD (P)を第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有さ せる。
[0123] 上記において、 ODnbを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明の ポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等によ り異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜 設定すればよい。
[0124] また、上記の 1液法において、生体由来試料と試液との反応条件としては、使用す る本発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用 濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C、 好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1〜20分、好ま しくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する 反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについ ても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6 〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。 [0125] 上記の 2液法において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する 本発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃 度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C、好 ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1〜20分、好ましく は 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反 応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても 同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8 、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一 試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、 通常 15〜40°C、好ましくは 25 〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間 は 1〜20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に 好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲力 例えば各リポ蛋白分画に対する反 応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。
[0126] (2)消去法 (1)〔消去法 (l)-a及び (l)-b〕
本発明の消去法 (1)〔消去法 (l)-a及び (l)-b〕は、 1液法でも 2液法でも或いはそれ 以上の試液を用いる方法の何れでもよ 、。 2液以上の試液を用いる方法にぉ 、ては 、本発明のポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよぐ また、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質を使用す る場合には、当該物質を、本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（ 生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋 白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後の時点で添カロ する試液中（例えば 2液法の場合には第二試液）に含有させればよい。尚、 1液法の 場合には、本発明ポリマー及びコレステロール測定用の試薬類の全てが当該試液に 含まれることは言うまでもな!/、。
[0127] 以下に本発明の消去法 (1)〔消去法 (1)- a及び (l)-b〕の具体例を示すが、本発明の 方法はこれらに限定されるものではない。
[0128] 1液法で行う場合は、例えば以下の如くである。 [0129] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー、（2)CHE、（3)CO、 POD及び被酸化性呈 色試薬〔又は (3)CHD及び NAD (P)〕及び (4)水性媒体を含んでなる試液とを混合し 、本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明の ポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコ レステロールの反応が実質的に終了し、且つ使用する本発明のポリマーによって反 応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が 阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の 時点で吸光度 (ODnb)を測定し、次いで、本発明のポリマーによって反応が阻害さ れたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された 特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度 (OD t)を再度測定し、これらの吸光度に基づ!/、て生体由来試料中の特定のリポ蛋白中の コレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害さ れた特定のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。
[0130] 2液法で行う場合は、例えば以下の如くである。
[0131] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー及び (2)水性媒体を含んでなる第一試液とを 混合し、その後、要すれば吸光度 (ODbl)を測定し、次いで、当該混合液と、 (3)CH E、 (4)CO〔又は (4)CHD〕及び (5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後、 本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明の ポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコ レステロールの反応が実質的に終了し、且つ使用する本発明のポリマーによって反 応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が 阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の 時点で吸光度 (ODnb)を測定し、次いで、本発明のポリマーによって反応が阻害さ れたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された 特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度 (OD t)を再度測定し、これらの吸光度に基づ!/、て生体由来試料中の特定のリポ蛋白中の コレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害さ れた特定のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すればよい。尚、第二試液に CO を含有させる場合には、 POD及びカップラー、デベロッパーを、それぞれ第一試液と 第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、第二試液に CHDを含有させる場合に は、 NAD (P)を第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。
[0132] また、例えば以下のようにしても 2液法で本発明を実施することができる。
[0133] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー、（2)CHE、（3)CO、 POD及び被酸化性呈 色試薬〔又は (3)CHD及び NAD (P)〕及び (4)水性媒体を含んでなる第一試液とを混 合した後に吸光度 (ODnb)を測定し、次いで、当該混合液と、（4)特定のリポ蛋白に 対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質及び (5)水性媒体を含んでなる第 二試液とを混合した後に吸光度 (ODt)を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由 来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマ 一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量)を算出 すればよい。
[0134] 上記において、 ODnbと ODtを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本 発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度 等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し 、適宜設定すればよい。
[0135] また、上記の 1液法において、生体由来試料と試液との反応条件としては、使用す る本発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用 濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C、 好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1〜20分、好ま しくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する 反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについ ても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6 〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。
[0136] 上記の 2液法において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する 本発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃 度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C、好 ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1〜20分、好ましく は 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反 応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても 同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8 、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一 試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、 通常 15〜40°C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1〜20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、また、反応時の pH についても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ま しくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲力 例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。
[0137] (3)消去法 (2)〔消去法 (2)-a及び (2)-b〕
本発明の消去法 (2)〔消去法 (2)-a及び (2)-b〕は、通常 2液法又はそれ以上の試液を 用いる方法で行われる。 2液以上の試液を用いる方法においては、本発明のポリマ 一を、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよい。また、上記消去 法 (2)-aにおいては、 PODとカップラー、 PODとデベロッパー、又は CATを、本発明 のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーと の接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実 質的に開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよぐ上記消去法 (2) -bにおいては、 PODとカップラー又は Z及びデベロッパー、又は NAD (P)を、本発 明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマー との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実 質的に開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよい。特定のリポ蛋 白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質を使用する場合には、当該物 質を、本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発 明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中 のコレステロールが実質的に消去（消費）された後の時点で添加する試液中（例えば 2液法の場合には第二試液）に含有させればょ 、。
[0138] 以下に本発明の消去法 (2)〔消去法 (2)-a及び (2)-b〕の具体例を示すが、本発明の 方法はこれらに限定されるものではない。
[0139] 例えば以下のようにして、消去法 (2)-aを実施することができる。
[0140] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー、（2)CHE、（3)CO、（4)PODとカップラー（又 はデベロッパー）〔或いは (4)CAT〕、及び (5)水性媒体を含んでなる第一試液とを混 合し、その後、要すれば吸光度 (ODbl)を測定し、次いで、当該混合液と、（6)デベロ ッパー (又はカップラー）〔或いは (6)CAT阻害剤〕、（7)水性媒体及び要すれば (8)特 定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質を含んでなる第二 試液とを混合した後に吸光度 (ODb)を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来 試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーと の接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロ一 ル)量を算出すればよい。尚、第一試液に CATを含有させる場合には、 POD、カツ ブラー、デベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ る。また、 CHE、 CO、 PODは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。
[0141] 例えば以下のようにして、消去法 (2)-bを実施することができる。
[0142] 生体由来試料と、（1)本発明のポリマー、（2)CHE、（3)CO、 POD、及びカップラー 又は Z及びデベロッパー〔或 、は (3)CHD及び NAD (P)〕、及び (5)水性媒体を含ん でなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度 (ODbl)を測定し、次いで、当 該混合液と、（6)CHD、 NAD (P)及び CO阻害剤〔或いは (6)CO、 POD、被酸化性 呈色試薬及び CHD阻害剤〕及び (7)水性媒体、要すれば (8)特定のリポ蛋白に対す る本発明のポリマーの保護を解除し得る物質を含んでなる第二試液とを混合した後 に吸光度 (ODb)を測定し、これらの吸光度に基づ 、て生体由来試料中の特定のリ ポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反 応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量)を算出すれば よい。
[0143] 上記において、 ODbを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明のポ リマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により 異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)を検討し、適宜設 定すればよい。 [0144] また、上記において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本 発明のポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度 等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C、好ま しくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1〜20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応 性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても同 様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、 特に好ましくは 7付近の範囲力も適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試 液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通 常 15〜40°C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は 1 〜20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、また、反応時の pH についても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ま しくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲力 例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればよい。
[0145] (4)リポ蛋白中のコレステロール量の算出
上記した如き本発明の方法において、得られた吸光度に基づいて生体由来試料 中のリポ蛋白中のコレステロール量を算出するには、例えば以下の如くして行えばよ い。
[0146] 直接法〔直接法 (1)及び (2)〕
(l)ODnbを、例えば予め、濃度既知の、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステ ロール (本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外の リポ蛋白中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と 同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODnbとの関係を示す検 量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中の コレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害さ れた特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)の値を算出する。
[0147] (2)ODnb力も ODbl〔又は ODblに由来する値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて 求めた値)〕を差し引いた吸光度 (ODtv)を求め、得られた ODtvを、例えば予め、濃 度既知の、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール (本発明のポリマーと の接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール )を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ 蛋白中のコレステロール濃度と ODtvとの関係を示す検量線に当てはめることにより、 生体由来試料中の特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来 試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリ ポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。
[0148] 消去法 (1)〔直接法 (l)-a及び (l)-b〕
(l)ODt力も ODnb〔又は ODnbに由来する値 (例えば ODnbに液量補正係数を掛け て求めた値)〕を差し引いた吸光度（ODcb)を求め、得られた ODcbを、例えば予め、 濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明のポリマーとの接触によって 反応が阻害される特定のリポ中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品を 試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と O Debとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋 白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が 阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール)の値を算出する。
[0149] (2)ODnb力も ODbl〔又は ODblに由来する値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて 求めた値)〕を差し引いた吸光度（ODcnb)と、 ODtから ODbl〔又は ODblに由来する 値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて求めた値)〕を差し引いた吸光度 (ODct) を求め、更に ODctから ODcnbを差し引いた吸光度（ODcb)を求める。得られた ODc bを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明のポリマー との接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白中のコレステロール)を含有する 標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコ レステロール濃度と ODcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来 試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーと の接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール)の値を算出す る。
[0150] 消去法 (2)〔直接法 (2)-a及び (2)-b〕 (l)ODbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明の ポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ中のコレステロール)を含有 する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中 のコレステロール濃度と ODbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由 来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマ 一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算 出する。
[0151] (2)ODb力も ODbl〔又は ODblに由来する値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて 求めた値)〕を差し引いた吸光度 (ODcb)を求め、得られた ODcbを、例えば予め、濃 度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明のポリマーとの接触によって反 応が阻害される特定のリポ蛋白中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品 を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ 蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応 が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール)の値を算出する。
[0152] 2-4.各構成要件の態様及び使用濃度
以下に本発明における各構成要件の好ましい態様、具体例及びその使用濃度等 について説明する。
[0153] (1)本発明のポリマー
本発明のポリマーの好ま 、態様、具体例は前述した通りである。
[0154] また、本発明のポリマーの使用濃度としては、特定のリポ蛋白中のコレステロールの 反応を阻害させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応 を先行させ得る濃度であればよぐ生体由来試料と直接混合させる試液中の濃度と して、通常 0.001%〜10% (\^/¥)、好ましくは0.05%〜2% (\^/¥)でぁる。尚、これら 本発明のポリマーは単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてもよい
[0155] (2) CO
本発明において用いられる COとしては、通常この分野で使用されているもの、例え ば、ノカルディア属、シユードモナス属等の微生物に由来するもの、牛脾臓等動物臓 器に由来するもの等が挙げられる。 COの使用量としては、例えば 2液法に於ける第 一試液中の濃度として、通常 0.03〜330uZml、好ましくは 0.07〜130uZml、より好ま しくは 0.13〜65uZmlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常 0.02〜250u Zml、好ましくは 0.05〜100uZml、より好ましくは 0.1〜50uZmlである。
[0156] 尚、一液法の場合は、上記最終の反応液中の濃度範囲力 適宜選択される。（以 下、同様。 )
[0157] (3) CHE
本発明において用いられる CHEとしては、通常この分野で使用されているもの、例 えば、キャンディダ属、シユードモナス属等の微生物に由来するもの、牛脾臓等動物 臓器に由来するもの等が挙げられる。 CHEの使用量としては、例えば 2液法に於け る第一試液中の濃度として、通常 0.03〜330uZml、好ましくは 0.07〜130uZml、より 好ましくは 0.13〜65uZmlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常 0.02〜2 50u/mU好ましくは 0.05〜100uZml、より好ましくは 0.1〜50uZmlである。
[0158] (4) POD
本発明において用いられる PODとしては、通常この分野で使用されているもの、例 えば、西洋ヮサビ、大豆、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由 来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。 PODの使用 量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.1〜1000uZml、 好ましくは 0.25〜400uZml、より好ましくは 0.5〜200uZmlであり、又は、最終の反応 液中の濃度として、通常 0.1〜250uZml、好ましくは 0.25〜100uZml、より好ましくは 0 •5〜50uZmlである。
[0159] (5)被酸化性呈色試薬
本発明において用いられる被酸ィ匕性呈色試薬としては、 PODの存在下、過酸化水 素と反応して呈色するものであればよぐ例えば 4-ァミノアンチピリン (以下、 4 AA と略記する。）等のカップラー及び、該カップラーと酸ィヒ縮合して色素を生ずるデベロ ッパーとの組合せ、即ち、例えば 4 AAとフエノール系化合物、ナフトール系化合物 若しくはァ-リン系化合物の組合せ、 3-メチル -2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとァ-リ ン系化合物の組合せ等や、例えば 2,2'-アジノビス (3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-ス ルホン酸)、トリフエ-ルメタン系ロイコ色素、ジフエ-ルァミン誘導体、ベンジジン誘導 体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、 0-フエ-レンジァミン 誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。
[0160] デベロッパーとしてのフエノール系化合物の具体例としては、例えばフエノール、 P- クロ口フエノール、 2,4-ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体 例としては、例えば 1-ナフトール、 1-ナフトール- 2-スルホン酸、 1-ナフトール- 2-カル ボン酸等が挙げられ、また、ァ-リン系化合物の具体例としては、例えば Ν,Ν-ジェチ ルァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- ( j8 -ヒドロキシェチル) - m-トルイジン、 N-ェチル -N- (2-ヒド 口キシ- 3-スルホプロピル)- 3,5-ジメトキシァ-リン（DAOS)、 N-ェチル -N- (2-ヒドロ キシ -3-スルホプロピル)- 3,5-ジメトキシ- 4-フルォロア-リン（FDAOS)、 N-(2-ヒドロ キシ- 3-スルホプロピル)- 3,5-ジメトキシァ-リン（HDAOS)、 N-ェチル -N- (2-ヒドロ キシ- 3-スルホプロピル)- m-トルイジン（TOOS)、 N-ェチル -N- (3-メチルフエ-ル) - Ν'-サクシ-ル-エチレンジァミン（EMSE)、 Ν- (3-スルホプルピル) -3-メトキシ -5-メ チルァ-リン（HMMPS)等が挙げられる。
[0161] カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、 用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なる力 例え ば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.01〜400mM、好ましくは 0.1〜40 mM、より好ましくは 0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.01〜10 0mM、好ましくは 0.1〜10mMの範囲である。また、カップラーとして 4— AAを使用する 場合の使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.01〜 200mM、好ましくは 0.1〜40mM、より好ましくは 0.2〜10mMであり、最終の反応液中の 濃度として、通常 0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜5mMである。
[0162] また、デベロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類や組み合わせる カップラーの種類等により異なるため一概には言えないが、例えば 2液法に於ける第 一試液中の濃度として、通常 0.01〜200mM、好ましくは 0.1〜40mM、より好ましくは 0. 2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜 5mMである。 [0163] トリフエ-ルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、 ビス (p-ジェチルァミノフエ-ル) -2-スルホフエ-ルメタン、ビス (p-ジェチルァミノフエ -ル) -3,4-ジスルホプロポキシフエ-ルメタン'ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフエ二 ルァミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔4-ジ (2-ブトキシェチル)ァミノ- 2-メチ ルフエ-ル〕ァミン、 Ν,Ν-ビス (4-ジェチルァミノ- 2-メチルフエ-ル)- N'-p-トルエンス ルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、 例えば 10- (カルボキシメチルァミノカルボ-ル)- 3 , 7-ビス (ジメチルァミノ)フエノチアジ ン ·ナトリウム塩、 10-〔3- (メトキシカルボ-ルアミノメチル)フエ-ルメチルァミノカルボ -ル〕 -3,7-ビス (ジメチルァミノ)フヱノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導 体の具体例としては、例えばべンジジン、 0-トリジン、。-ジァ-シジン、 3,3'-ジァミノべ ンジジン、 3,3', 5,5'-テトラァミノべンジジン等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導 体の具体例としては、例えば 2-(4-カルボキシフエ-ル)- 3-N-メチルカルバモイル- 4, 5-ビス (4-ジェチルァミノフエ-ル)イミダゾール、 2-(3-メトキシ- 4-ジェチルァミノフエ -ル) 3-N-メチルカルバモイル- 4,5-ビス (2-メチル -4-ジェチルァミノフエ-ル)イミダゾ ール等が挙げられる。
[0164] これら発色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲である。
[0165] (6) CAT
本発明において用いられる CATとしては、通常この分野で使用されているもの、例 えば、牛肝臓等の動物臓器に由来するもの、クロ口プラスト等の植物に由来するもの 、ミクロコッカス属、ロドシユードモナス属等の微生物に由来するもの等が挙げられる。 CATの使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 10〜5 0000u/mU好ましくは 100〜5000uZml、より好ましくは 50〜2000uZmlである。
[0166] (7) CHD
本発明において用いられる CHDは、通常この分野で使用されているもの、例えば 、ノカルディア属に由来するもの等が挙げられる。 CHDの使用量としては、例えば 2 液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.1〜150uZml、好ましくは 0.3〜100u Zml、より好ましくは 0.5〜60uZmlであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.1〜1 00u/mU好ましくは 0.5〜50uZmlである。 [0167] (8) NAD (P)
本発明において用いられる NAD (P)は、通常この分野で使用されているもの、例 えば、酵母に由来するもの等が挙げられる。 NAD (P)の使用量としては、例えば 2液 法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.2〜70mM、好ましくは 0.5〜50mM、より 好ましくは l〜20mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.2〜50mM、好まし くは l〜10mMである。
[0168] (9) CAT阻害剤
本発明にお 、て用いられる CAT阻害剤としては、通常この分野で使用されて!ヽる もの、例えば NaN、 3-ァミノ- 1,2,4-トリァゾール等が挙げられる。これら CAT阻害剤
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の使用量としては、用いる CAT阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが 、例えば 2液法に於ける第二試液中の濃度として、通常 0.01〜10% (W/V)、好ましく は 0.02〜5% (W/V)、より好ましくは 0.03〜3% (W/V)である。
[0169] (10) CO阻害剤
本発明にお!ヽて用いられる CO阻害剤としては、通常この分野で使用されて!、るも の、例えば Ag+イオン、 Zn2+イオン、ダルタチオン等が挙げられる。これら CO阻害 剤の使用量としては、用いる CO阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが 、例えば 2液法に於ける第二試液中の濃度として、通常 0.00002〜40% (W/V)、好ま しくは 0.0002〜4% (W/V)、より好ましくは 0.002〜0.4% (W/V)である。
[0170] (l l) CHD阻害剤
本発明にお 、て用いられる CHD阻害剤としては、通常この分野で使用されて!、る もの、例えば Ag+イオン、 Zn2+イオン等が挙げられる。これら CHD阻害剤の使用 量としては、用いる CHD阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例え ば 2液法に於ける第二試液中の濃度として、通常 0.00001〜70% (W/V)、好ましくは 0.0001〜7% (W/V)、より好ましくは 0.001〜0.7% (W/V)である。
[0171] (12)水性媒体
本発明において用いられる水性媒体としては、水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液 を構成する緩衝剤としては、 pH5〜 11の範囲で緩衝作用を有し、コレステロール測定 反応を阻害しないものであればよぐ例えばトリスヒドロキシメチルァミノメタン、グッド の緩衝剤（PIPES、 BES、 TES、 HEPES等）、リン酸塩、ホウ酸塩、イミダゾール等、 通常この分野で用いられるものが挙げられ、その使用濃度としては、通常 lmM〜2M 、好ましくは 10mM〜lMの範囲であり、また、 pHは、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、よ り好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近である。
[0172] また、生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定の リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用 する本発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明 のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロール の反応が実質的に開始される前の時点（ODbl)の後に、反応系の pHを変化させるこ とによって、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除、言い換えれば 、本発明のポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰)或 いは促進させる場合には、生体由来試料と直接混合させる本発明のポリマーを含む 試液 (例えば第一試液)の pHを、本発明のポリマーによって反応が阻害されないリポ 蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリ ポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後の時点で 添加する試液 (例えば第二試液)の pHよりも、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリ マーの保護を解除し得る程度高ぐまたは低くすればよい。具体的には、使用する本 発明のポリマーの種類や濃度等によって異なるため一概には言えないが、これら試 液間での pHの差は、通常 0.5〜3、好ましくは 1〜3である。
[0173] (13)特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質
本発明において用いられる、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を 解除し得る物質としては、本発明のポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生 体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白） 中のコレステロールの反応を復活 (復帰)或 、は促進し得る性質を有するものであれ ばよい。
[0174] このような性質を有する物質としては、例えば、上記した如き性質を有するものであ つて、自体公知の総コレステロール測定方法 (試薬)で使用される非イオン性界面活 性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤が使用できる。 [0175] 非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル〔ポリ ォキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシェ チレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシェチレ ン高級アルコールエーテル等〕、ポリオキシエチレンアルキルァリールエーテル〔ポリ ォキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテ ル等〕、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル〔ポリエチレングリコールモノラウレート、ポ リエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールジステアレート、ポリエ チレングリコールモノォレエート等〕、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミ テート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタン トリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソ ルビタントリオレエート等〕、ソルビタン脂肪酸エステル〔ソルビタンモノラウレート、ソル ビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビ タントリステアレート、ソルビタンモノォレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセ スキォレエート等〕、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル〔テトラオレイン 酸ポリオキシエチレンソルビット等〕、ポリオキシエチレンアルキルアミン〔ポリオキシェ チレンラウリルァミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等〕、グリセリン脂肪酸エス テル〔ステアリン酸モノダリセライド、ォレイン酸モノグリセライド等〕等が挙げられる。
[0176] 陰イオン性界面活性剤としては、例えばコール酸およびその誘導体〔コール酸、デ ォキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフエノールエーテル硫酸塩、ラウロイル サルコシン等〕等が挙げられる。
[0177] 両性界面活性剤としては、例えばアルキルべタイン誘導体〔ラウリルべタイン、ステ ァリルべタイン、ラウリルジメチルアンモ -ゥムベタイン、ココナットべタイン、ヤシ油脂 肪酸アミドプロピルべタイン、ラウリン酸アミドプロピルべタイン等〕、イミダゾリ-ゥムべ タイン誘導体〔2-ラウリル- N-カルボキシメチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ-ゥムべ タイン、 2-ゥンデシル- N-カルボキシメチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ-ゥムべタイ ン等の 2-アルキル- N-カルボキシメチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ-ゥムベタイン ； 2-アルキル- N-カルボキシェチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ-ゥムベタイン等〕、 スルホベタイン誘導体〔N -ォクチル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホ ン酸、 Ν-デシル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホン酸、 Ν-ドデシル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホン酸、 Ν-テトラデシル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホン酸、 Ν-へキサデシル- Ν,Ν-ジメチル- 3-アンモ-ォ -1-プロパンスルホン酸等〕等のベタイン誘導体；例えばアルキルグリシン、アルキル ビス (アミノエチル)グリシン、ジォクチルポリアミノェチルグリシン、 Ν-アルキルポリアミ ノエチルダリシン、 β -ァラニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体;例えばビス (2-ゥ ンデシル- Ν-ヒドロキシェチルイミダゾリン)クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導 体等のイミダゾリン誘導体；例えばラウリルジメチルァミンオキサイド等のアミンォキサ イド誘導体等が挙げられる。
[0178] 上記した如き界面活性剤の中でも、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤が 好ましい。
[0179] 上記した如き界面活性剤の使用濃度としては、本発明のポリマーによって反応が阻 害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明のポリマーとの接触によって反応が阻害さ れた特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応を復活 (復帰)或いは促進し得る濃 度であればよぐ使用する本発明のポリマーの種類やその使用濃度、界面活性剤の 種類等により異なる為一概には言えないが、 2液法で用いる場合、第一試液と第二 試液の液量比等により異なる力 第二試液中の濃度としては、通常 0.01〜20% (W/V )、好ましくは 0.05〜5% (W/V)である。
[0180] 尚、これら界面活性剤は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いて ちょい。
[0181] (14)その他の試薬類
本発明においては、上記した如き試薬類 (構成要件)以外にも、通常この分野で用 Vヽられて ヽる試薬類が使用可能である。
[0182] このような試薬類としては、例えばァスコルビン酸、溶血、ピリルビン等の共存物質 の影響回避（例えばァスコルビン酸ォキシダーゼ、銅イオン等の金属イオン、フエロシ アンィ匕カリウム等）、高トリグリセライド検体等による乳びの影響回避剤 (例えば界面活 性剤、 NaCl、 KC1等の塩類、例えば LPL等の酵素等)及び反応促進剤（例えば界面 活性剤、金属イオン等）、酵素等の安定化剤 (例えば牛アルブミン等の蛋白質、例え ばグルタミン酸等の各種アミノ酸類、例えばブドウ糖等の各種糖類等）、各種塩類 (例 えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カルシウム等）、抗酸ィ匕性物質 (例えばマン-トール等）、キ レート剤 (例えば EDTA等）、防腐剤 (例えばアジィ匕ナトリウム等)等が挙げられる。
[0183] 尚、上記した如きその他の試薬類の使用濃度は、自体公知の方法に従い適宜選 択すればよい。
[0184] (15)生体由来試料
本発明が適用される生体由来試料としては、例えば血清、血漿等の生体由来試料 、及びこれらを水、生理食塩水や通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液 、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液等に適 宜溶解させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。
[0185] 3.本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬及びキット
本発明の試薬及びキットは、上記した如き本発明の測定法を実施するために使用 されるものであり、本発明のポリマーを用いる以外は、上記した如き生体由来試料中 のコレステロールを測定する方法に使用される試薬類 (構成要件)を、通常この分野 で使用される濃度範囲で含有するように調製されたものでよく、構成要件の好ま ヽ 態様や使用濃度等は、前述した通りである。
[0186] より具体的には、本発明の試薬及びキットは、例えば以下の如き試薬類 (構成要件 )を主成分として含むものであり、これら以外にその他の試薬類を含有していてもよい
[0187] (1)直接法用試薬'キット
上記した如き本発明の直接法用の試薬'キットとしては、例えば以下の如き試薬類 ( 構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。
[0188] 直接法 (1)用試薬'キット (一液法）
'本発明のポリマー
•CHE
•CO
•POD •被酸化性呈色試薬 (カップラー及びデベロッパー）
•水性媒体
[0189] 直接法 (1)用試薬'キット (2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•水性媒体
(第二試液）
•CHE
•CO
•水性媒体
尚、上記の場合には、 POD、カップラー及びデベロッパーは、それぞれ第一試液と 第二試液の少なくとも一方に含有させる。
[0190] 直接法 (2)用試薬'キット (一液法）
'本発明のポリマー
•CHE
•CHD
•NAD (P)
•水性媒体
[0191] 直接法 (2)用試薬'キット (2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•水性媒体
(第二試液）
•CHE
•CHD
•水性媒体
尚、上記の場合には、 NAD (P)は、第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有さ せる。 [0192] (2)消去法 (1)用試薬'キット
上記した如き本発明の消去法 (1)用の試薬 'キットとしては、例えば以下の如き試薬 類 (構成要件)を主成分として含むものが挙げられる。
[0193] 消去法 (l)-a用試薬'キット (一液法）
'本発明のポリマー
•CHE
•CO
•POD
'被酸ィ匕性呈色試薬 (カップラー及びデベロッパー）
•水性媒体
[0194] 消去法 (l)-b用試薬'キット (一液法）
'本発明のポリマー
•CHE
•CHD
•NAD (P)
•水性媒体
[0195] 消去法 (l)-a用試薬'キット (2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•水性媒体
(第二試液）
•CHE
•CO
•水性媒体
尚、上記の場合には、 POD、カップラー及びデベロッパーは、それぞれ第一試液と 第二試液の少なくとも一方に含有させる。
[0196] 消去法 (l)-a用試薬'キット（2液法）
(第一試液） '本発明のポリマー
•CHE
•CO
•POD
•カップラー
•ァベロ、、/ノヽ1 ~~
•水性媒体
(第二試液）
•特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質 (例えば界面活 性剤）
•水性媒体
[0197] 消去法 (l)-b用試薬'キット (2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•水性媒体
(第二試液）
•CHE
•CHD
•水性媒体
尚、上記の場合には、 NAD (P)は、第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有さ せる。
[0198] 消去法 (l)-b用試薬'キット（2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•CHE
•CHD
•NAD (P)
•水性媒体 (第二試液）
•特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質 (例えば界面活 性剤）
•水性媒体
[0199] (3)消去法 (2)用試薬'キット
上記した如き本発明の消去法 (2)用の試薬'キットとしては、例えば以下の如き試薬 類 (構成要件)を主成分として含むものが挙げられる。
[0200] 消去法 (2)-a用試薬'キット（2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•CHE
•CO
•POD
'カップラー又はデベロッパー
•水性媒体
(第二試液）
•デベロッパー又はカップラー
•水性媒体
•要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質 (例 えば界面活性剤）
上記の場合には、 CHE、 CO、 PODは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても 良い。
[0201] 消去法 (2)- a用試薬'キット (2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•CHE
•CO
•CAT •水性媒体
(第二試液）
•CAT阻害剤
•水性媒体
'要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質 (例 えば界面活性剤）
上記の場合には、 POD、カップラー、デベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試 液の少なくとも一方に含有させ、また、 CHE、 COは第一試薬と第二試薬の両方に含 有させても良い。
[0202] 消去法 (2)-b用試薬 ·キット（2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー
•CHE
•CO
•POD
'カップラー又は Z及びデベロッパー
•水性媒体
(第二試液）
•CHD
•NAD (P)
•CO阻害剤
•水性媒体
•要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質 (例 えば界面活性剤）
上記の場合には、 CHEは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。
[0203] 消去法 (2)-b用試薬'キット（2液法）
(第一試液）
'本発明のポリマー •CHE
•CHD
•NAD (P)
•水性媒体
(第二試液）
•CO
•POD
•CHD阻害剤
•被酸化性呈色試薬 (カップラー及びデベロッパー）
•水性媒体
•要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明のポリマーの保護を解除し得る物質 (例 えば界面活性剤）
上記の場合には、 CHEは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良 、。
[0204] また、当該キットには、必要に応じて、測定対象となるリポ蛋白中のコレステロール 標準品等が組み合わされていてもよい。当該標準品は、例えばヒトゃ動物等の血清 等を用いて調製された標準血清やこれらに由来する測定対象となるリポ蛋白分画を 含有するもの等を使用することができる。尚、ここで、測定対象となるリポ蛋白質とは、 例えば利用する測定法が本発明の直接法の場合には、本発明のポリマーによって 保護されるリポ蛋白以外のリポ蛋白（本発明のポリマーによって反応が阻害される特 定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）を意味し、利用する測定法が本発明の消去法の場合 には、本発明のポリマーによって保護されるリポ蛋白（本発明のポリマーによって反応 が阻害される特定のリポ蛋白）を意味する。
[0205] 更に、前述した如き本発明の測定法での使用のための説明書等を含ませておいて も良い。当該「説明書」とは、本発明の方法における特徴 '原理'操作手順等が文章 又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、 或いはパンフレット（リーフレット)等を意味する。
[0206] 以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより 何ら限定されるものではな 、。 実施例
[0207] 以下に表記される「ィ匕合物 (1)〜(16)」とは、下記表 1に示される化合物のことを意味 する。
[0208] [表 1]
Figure imgf000056_0001
[0209] 実施例 1.本発明に係るポリマーの製造方法
実施例 1— 1.
メタクリル酸 (和光純薬工業 (株)社製) 23g〔以下、「モノマー A」と略記する。〕とメタ クリル酸シクロへキシル (和光純薬工業 (株)社製） 23g〔以下、「モノマー B」と略記す る。〕とをイソプロパノール 180g中に溶解し、重合開始剤（ァゾ基含有ポリエチレング リコール）（以下、「PEG」と略記する。 ) (商品名： VPE- 0201,和光純薬工業 (株)社製 ) 15gを添加した後、アルゴンガス置換下、 78°Cで 6時間攪拌した。反応終了後、得ら れた反応液をへキサン 500mLに投入し、上澄みを除去した。残渣を減圧乾燥するこ とにより、本発明に係るポリマーを得た。
得られたポリマーは、 NMR ^ベクトル分析により、ポリメタクリル酸セグメント (0.88 ppm〜1.96ppm)及びポリエチレングリコールセグメント (3.58ppm)を有していること、 IR スペクトル分析により、カルボ-ル基 (-C=0) (1725cm— の存在を確認した。その結果 を表 2に示す。
[0210] 実施例 1 2〜1 24.
本発明に係るポリマーに於けるモノマー A及びモノマー Bとして、表 2に示す各種モ ノマーを所定の割合で用いる以外は、実施例 1—1と同様の操作を行い、本発明に 係るポリマーを得た。その結果を表 2に併せて示す。
[0211] [表 2]
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000058_0002
LLLZlO/SOOZdT/lDd 99 Z6C.00/.00Z OAV [0212] 実施例1 25〜1 47
本発明に於けるモノマー A及びモノマー Bとして、表 3に示す各種モノマーを所定 の割合で用いる以外は、実施例 1—1と同様の操作を行い、本発明に係るポリマーを 得た。その結果を表 3に示す。
[0213] [表 3]
Figure imgf000060_0001
実施例 2— 1
本発明のポリマーを含有するコレステロール測定用試薬と、超遠心法で分画した各 種リポ蛋白との反応曲線を測定し、本発明のポリマーの各リポ蛋白中のコレステロ一 ルの反応性への影響にっ 、て確認した。
t試料 3
自体公知の超遠心法によりヒト血清より分画して得た、 HDL分画 (コレステロール: 2 00mg/dL)、 LDL分画（コレステロール： 300mg/dL)及び VLDL分画（コレステロール： 1 OOmg/dL)をそれぞれ試料とした。
t試薬 3
下記の組成の試薬を使用した。
• M0PS緩衝液 (pH7. 0) 25mM
-塩化ナトリウム 0. 40%
' コレステロ一ノレ才キシダ ゼ lu/mL
* コレステロ一ノレエステラー ゼ lu/mL
* HMMPS 0. 5mM
• 4 アミノアンチピリン ImM
-ぺノレォキシダーゼ 1. 5u/mL
-本発明のポリマー 0. 10%
尚、本発明のポリマーとしては、実施例 1 1〜 1—47で合成したポリマーを使用し た。また、対照として、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いた。
〔測定条件〕
日立 7170形自動分析装置（(株）日立製作所製)を用い、測定パラメータを以下のよ うに設定して測定を行った。
•測定方法： 1ポイントエンド [15]- [0]
'試料量 : 2.0 μ L
•試液量 ：180 ;z L
'測定波長： 700/600nm
•測定温度: 37°C
〔結果〕
図 1に、本発明のポリマーを含有しな 、試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タ ィムコースを、図 2に、実施例 1—1で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得ら れた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図 3に、実施例 1—3で得られたポリマーを含 有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図 4に、実施例 1—8 で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコース を、図 5に、実施例 1— 11で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リ ポ蛋白の反応タイムコースを、図 6に、実施例 1—16で得られたポリマーを含有する 試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、また、図 7に、実施例 1— 22 で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコース をそれぞれ示す。
尚、各図中、ー參一は HDL分画試料（コレステロール： 200mg/dL)について得られ た結果を、 ♦一は LDL分画試料（コレステロール： 300mg/dL)について得られた結 果を、一國一は VLDL分画試料（コレステロール： 100mg/dL)につ!/、て得られた結果 を、また、—△—は生理食塩水を試料として得られた結果をそれぞれ示す。
[0216] 図 1〜図 4の結果から、実施例 1— 1、 1—3及び 1—8で得られた本発明のポリマー を含有する試薬を用いた場合、 LDL中のコレステロールの反応が阻害されているこ とが、図 1及び図 5の結果から、実施例 1— 11で得られた本発明のポリマーを含有す る試薬を用 、た場合、 LDL及び HDL中のコレステロールの反応が阻害されて!、るこ と力 また、図 1及び図 6〜7の結果から、実施例 1— 16及び 1— 22で得られた本発 明のポリマーを含有する試薬を用いた場合、 HDL中のコレステロールの反応が阻害 されていること力 それぞれ判る。
[0217] 尚、図示はしていないが、実施例 1— 2、 1 4〜1 7、 1 36〜1 38、 1 40及 び 1—45〜1—47で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、 LDL中のコレステロールの反応が阻害されること力 実施例 1 9〜1 12で得られ た本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、 LDL及び HDL中のコレス テロールの反応が阻害されること力 また、実施例 1— 13〜i— 15、 1— 17〜21、 1
— 23〜1— 26、 1— 27〜1— 35、 1— 39及び 1— 41〜1— 44で得られた本発明の ポリマーを含有する試薬を用いた場合には、 HDL中のコレステロールの反応が阻害 されることが、それぞれ確認された。
[0218] 以上の結果と表 2及び 3から、本発明のポリマーのうち、一般式 [2]で示されるモノ マー単位 (A)と一般式 [3]で示されるモノマー単位 (B)との組成比（重量比）が、 / A≤lであるポリマー（実施例 1— 1〜1— 8、 1— 36〜1— 38、 1— 40及び 1— 45〜1 -47)は、 LDLを保護し、 LDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する ことが、本発明のポリマーのうち、これらの糸且成比（重量比）が、 1 < BZAく 2である ポリマー（実施例 1— 9〜1— 12)は、 LDLと HDLとを保護し、 HDL中のコレステロ一 ル及び LDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を、また、これらの組成比（重 量比）が、 2≤BZAであるポリマー（実施例 1— 13〜1— 35、 1 39及び 1 41〜1 -44)は、 HDLを保護し、 HDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する ことが示唆される。
[0219] 更に、本発明のポリマーが有するこれらの性質を適宜選択することによって、例え ば本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステ ロールを直接測定することや、本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白 以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去法によって消去した後に、本発明のポリマ 一によつて保護された特定のリポ蛋白質中のコレステロールを測定することが可能と なることが示唆される。
[0220] 実施例 3—1 消去法による HDL コレステロールの測定
HDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施 例 1— 22のポリマー）を用いて、消去法により試料中の HDL コレステロールを測定 し、基準的測定法である UCHM法での測定値と比較した。
m
人血清 20検体
尚、各人血清中のトリダリセライド (TG)値は、 Lタイプヮコー TG-M (和光純薬工業（ 株)製)によって測定した。
〔UCHM法〕
Recommendations on Lipoprotein Measurement From the Working uroup on Lipop rotein Measurement (NIH Publication No.95- 3044 September 1995 page63- 124)に 記載の方法に従 、測定した。
〔本発明による HDL コレステロールの測定〕 (試薬）
以下の試薬を用 ヽ、本発明の消去法により各試料中の HDL コレステロールを測 £した。
'第一試液
Figure imgf000064_0001
(測定条件）
ォリンパス AU 640自動分析装置 (ォリンパス (株)製)を用い、測定パラメータを 以下のように設定して測定を行った。
尚、キヤリブレーターとしてマルチキヤリブレーターリピッド (和光純薬工業 (株)製） を用いた。
'条件 ：2ポイントエンド法 （測光ポイント 10— 27)
，試料 ：2 し
•試薬 1 : 180 ,u L
•試薬 2 : 60 /ζし
，測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm
[0221] 〔結果〕
測定結果及び各試料中の TG値を表 4に、また、本発明の方法と UCHM法との相 関図を図 8にそれぞれ示す。
尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。
相関式: y= 1.03x— 1.3444;相関係数： R2=0.9742
[0222] [表 4]
Figure imgf000065_0001
[0223] 表 4と図 8の結果から明らかなように、本発明の消去法による HDL コレステロール 測定法 (試薬)は、基準的測定法である UCHM法と良好な相関を示すことが判る。 特に、高トリグリセライド検体においても、本発明の消去法による HDL コレステロ一 ル測定法 (試薬)で得られた値は、 UCHM法の値力も解離することなぐその測定値 は両者で一致して ヽることが判る。
[0224] 実施例 3— 2 消去法による LDL コレステロールの測定
LDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施 例 1 8のポリマー）を用いて、消去法により試料中の LDL コレステロールを測定し 、基準的測定法である BQ法での測定値と比較した。
t試料 3
人血清 20検体
尚、各人血清中のトリダリセライド (TG)値は、 Lタイプヮコー TG-M (和光純薬工業（ 株)製)によって測定した。 〔BQ法〕
Recommendations on Lipoprotein Measurement From the Working Group on Lipop rotein Measurement (NIH Publication No.95- 3044 September 1995 page 1-62)に記 載の方法に従い測定した。
〔本発明による LDL コレステロールの測定〕
(試薬）
以下の試薬を用い、本発明の消去法により各試料中の LDL コレステロールを測 疋した。
'第一試液
Figure imgf000066_0001
(測定条件）
ォリンパス AU 640自動分析装置 (ォリンパス (株)製)を用い、測定パラメータを 以下のように設定して測定を行った。
尚、キヤリブレーターとしてマルチキヤリブレーターリピッド (和光純薬工業 (株)製） を用いた。
'条件 ：2ポイントエンド法 （測光ポイント 10— 27)
，試料 ：2 し
•試薬 1 : 180 ,u L
•試薬 2 : 60 /ζし
，測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm
〔結果〕 測定結果及び各試料中の TG値を表 5に、また、本発明の方法と BQ法との相関図 を図 9にそれぞれ示す。
尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。
相関式: y=0.987x— 1.1931；相関係数： R2=0.9862
[表 5]
Figure imgf000067_0001
[0227] 表 5と図 9の結果から明らかなように、本発明の消去法による LDL—コレステロール 測定法 (試薬)は、基準的測定法である BQ法と良好な相関を示すことが判る。特に、 高トリグリセライド検体においても、本発明の消去法による HDL—コレステロール測 定法 (試薬)で得られた値は、 BQ法の値力 解離することなぐその測定値は両者で 一致していることが判る。
[0228] 実施例 3— 3 直接法による VLDL—コレステロールの測定
LDL及び HDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリ マー（実施例 1— 11のポリマー）を用いて、直接法により試料中の VLDL—コレステロ ールを測定し、基準的測定法である超遠心法での測定値と比較した。
t試料 3
人血清 20検体
尚、各人血清中のトリダリセライド (TG)値は、 Lタイプヮコー TG-M (和光純薬工業（ 株)製)によって測定した。
〔超遠心法〕
(1)超遠心分離法による VLDL分画の採取
「新生化学実験講座、第 4卷 脂質 I 197ページ (東京化学同人編)」に記載された 方法により、 VLDL分画を採取した。即ち、血清試料 (4mL)に比重 d=l.006の塩ィ匕 ナトリウム溶液を 2mL重層し、 16°C、 20,000rpmで 30分間遠心して上層にあるキロミク ロンを分離除去して残った下層に、さらに比重 d=1.006の塩ィ匕ナトリウム溶液を 2mL 重層し、 16°C、 40,000rpmで 18時間遠心した後の上層部を採取して VLDL分画とし た。
(2) VLDL コレステロールの測定
上記（1)の操作により得た VLDL分画に生理食塩水をカ卩えて元の血清量 4mLにし たものを試料として、その中に含まれて 、るコレステロール濃度を総コレステロール測 定試薬 (Lタイプヮコー CHO 'H :和光純薬工業 (株)製)を用いて、 日立自動分析装 置 7170S形自動分析装置（(株）日立製作所製)を用い、下記の測定条件で測定し た。
尚、キヤリブレーターとしてマルチキヤリブレーターリピッド (和光純薬工業 (株)製） を用いた。
'条件 ：2ポイントエンド法 （測光ポイント 16— 34)
，試料 ：2 し
•試薬 1 : 180 ,u L
•試薬 2 : 60 /ζし
，測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm
〔本発明による VLDL コレステロールの測定〕
(試薬） 以下の試薬を用 ヽ、本発明の直接法により各試料中の VLDL -コレステロールを 測定した。
'第一試液
■ MOPS緩衝液、 pH7. 0 0. 025M
•塩化ナトリウム 0. 10%
'ポリマー （実施例 1 - 1 1のボリマー） 0. 15%
■歷 MPS l mM
'第二試液
■ MOPS緩衝液、 pH7. 0 0. 025M
■ コレステロールエステラ. t 2U/mL
• コレステロ一/レ才キシダーゼ lU/mL
-ぺ /レ才キシダ■ tf 10U/mL
■ 4ーァミノアンチピリ ン mM
(測定条件）
ォリンパス AU— 640自動分析装置 (ォリンパス (株)製)を用い、測定パラメータを 以下のように設定して測定を行った。
尚、キヤリブレーターとしてマルチキヤリブレーターリピッド (和光純薬工業 (株)製） を用いた。
'条件 ：2ポイントエンド法 （測光ポイント 10— 27)
• 料 ： ύ μ L·
•試薬 1 : 180 ,u L
•試薬 2 : 60 /ζし
，測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm
[0229] 〔結果〕
測定結果及び各試料中の TG値を表 6に、また、本発明の方法と UCHM法との相 関図を図 10にそれぞれ示す。
尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。
相関式: y= 1.0065x— 1.1194;相関係数： R2=0.9909
[0230] [表 6]
Figure imgf000070_0001
[0231] 表 6と図 10の結果から明らかなように、本発明の消去法による VLDL—コレステロ ール測定法 (試薬)は、基準的測定法である超遠心法と良好な相関を示すことが判る 。高トリグリセライド検体においても、本発明の直接法による VLDL—コレステロール 測定法 (試薬)で得られた値は、超遠心法の値から解離することなぐその測定値は 両者で一致して ヽることが判る。
産業上の利用可能性
[0232] リポ蛋白中のコレステロールの直接的測定法に於いて、本発明のポリマーを共存さ せることにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの 反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させて、特定のリポ蛋白以 外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させて、当該特定のリポ蛋白以外のリ ポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。また、反応を先行させた当該特 定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することにより、特定のリポ蛋 白中のコレステロールを測定することができる。これにより、測定対象となる目的のリポ 蛋白以外のリポ蛋白を分離分別することなぐ目的のリポ蛋白中のコレステロールを 測定することが可能となる。更に、本発明によれば、これまで問題となっていた脂質 異常検体の測定値に於いても標準的測定法での測定値と一致する測定精度に優れ たリポ蛋白中コレステロール測定方法及び測定試薬を提供することが可能となる。 図面の簡単な説明
[0233] [図 1]実施例 2—1で得られた、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いて得られた 各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 2]実施例 2—1で得られた、実施例 1—1のポリマーを含有する試薬を用いて得ら れた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 3]実施例 2—1で得られた、実施例 1—3のポリマーを含有する試薬を用いて得ら れた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 4]実施例 2—1で得られた、実施例 1—8のポリマーを含有する試薬を用いて得ら れた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 5]実施例 2— 1で得られた、実施例 1— 11のポリマーを含有する試薬を用いて得 られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 6]実施例 2—1で得られた、実施例 1— 16のポリマーを含有する試薬を用いて得 られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 7]実施例 2—1で得られた、実施例 1— 22のポリマーを含有する試薬を用いて得 られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
[図 8]実施例 3— 1で得られた、本発明の方法による HDL—コレステロール測定値と UCHM法による HDL—コレステロール測定値との相関図である。
[図 9]実施例 3— 2で得られた、本発明の方法による LDL—コレステロール測定値と B Q法による LDL—コレステロール測定値との相関図である。
[図 10]実施例 3— 3で得られた、本発明の方法による VLDL—コレステロール測定値 と超遠心法による VLDL—コレステロール測定値との相関図である。
符号の説明
[0234] 図 1〜7中、ー參一は HDL分画試料（コレステロール： 200mg/dL)について得られ た結果を、 ♦一は LDL分画試料（コレステロール： 300mg/dL)について得られた結 果を、一國一は VLDL分画試料（コレステロール： 100mg/dL)につ!/、て得られた結果 を、また、—△—は生理食塩水を試料として得られた結果をそれぞれ示す。

Claims

請求の範囲
一般式 [1]
—— (CH2CH20)k― [1]
(式中、 kは 10〜250の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコ セグメント、一般式
[2]
Figure imgf000073_0001
(式中、 Rは水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）で示されるモノマー 単位及び一般式 [3]
Figure imgf000073_0002
〔式中、 R2は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R3は一般式 [4] — COOR4 [4]
(式中、 R4はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナ-ル基を表す。）で示される基 、アルキル基、アルコキシ基、ァラルキル基又はアルキル力ルバモイル基を表す。〕で 示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー。
ポリエチレングリコールセグメントが、一般式 [5]
[5]
Figure imgf000073_0003
(式中、 R5は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R6はシァノ基又は炭素 数 1〜3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250 の整数を表す。）で示されるものである、請求項 1に記載のポリマー。
[3] 下記一般式 [6]
C一 E厂 COO— (CH2CH20)k- [6] R6
Figure imgf000074_0001
(式中、 R5及び R7は夫々独立して水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R 6及び R8は夫々独立してシァノ基又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 E及び Eは
1 2 夫々独立して炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250の整数を表し、 nは 5 0〜900の整数を表し、 pは 50〜900の整数を表し、 mは 1〜10の整数を表し、 1^〜 R3は前記に同じ。）で示される、請求項 1に記載のポリマー。
[4] 重合平均分子量が 10, 000-120, 000である、請求項 1〜3の何れかに記載のポリ マー。
[5] 一般式 [5]で示されるポリエチレングリコールセグメントを 1〜70重量％含有する、請 求項 2に記載のポリマー。
[6] 一般式 [2]で示されるモノマー単位を 20〜80重量％含有する、請求項 1に記載のポ リマー。
[7] 一般式 [3]で示されるモノマー単位を 20〜80重量％含有する、請求項 1に記載のポ リマー。
[8] 請求項 1〜7の何れかのポリマーの共存下で測定を行うことを特徴とする、リポ蛋白中 のコレステロールの測定方法。
[9] 請求項 1〜7の何れかのポリマーの共存下、生体由来試料を (1)コレステロールエステ ラーゼ及びコレステロールォキシダーゼ、又は (2)コレステロールエステラーゼ、コレス テロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)と反応させ、生成する過酸化水素量又は N AD (P) H量に基づ 、てコレステロールを測定することを特徴とする、生体由来試料 中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[10] リポ蛋白が高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDL)又は超低比重リポ蛋白（ VLDL)である、請求項 8又は 9に記載の測定方法。
[11] 生体由来試料とポリマーとを接触させた後、相異なる二つの時点での吸光度を測定 し、これらに基づ!/、て生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算 出する、請求項 9に記載の方法。
[12] 生体由来試料とポリマーとを接触させ、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステ ロールの反応が実質的に終了し、且つ特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が 開始される前に反応系の吸光度を測定し、更に特定のリポ蛋白中のコレステロール の反応が実質的に終了した後に再度反応系の吸光度を測定し、これらの結果に基 づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを算出する、請求項 11 に記載の方法。
[13] 請求項 1〜7の何れかのポリマー共存下、生体由来試料と特定のリポ蛋白以外のリポ 蛋白中のコレステロールを消去するための試薬とを接触させて、特定のリポ蛋白以外 のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、次いで、（1)特定のリポ蛋白中のコレステロ ールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼとの反応によつ て生成する過酸ィ匕水素量又は (2)特定のリポ蛋白中のコレステロールと、コレステロ一 ルエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)との反応によって精 製する NAD (P) H量に基づいて特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する、請 求項 9に記載の方法。
[14] 特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬力 コレス テロ一ノレエステラーゼ、コレステローノレオキシダーゼ、ぺノレオキシダーゼとカップラー 又はデベロッパー、或いはカタラーゼである、請求項 13に記載の方法。
[15] 特定のリポ蛋白が高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDL)又は超低比重リ ポ蛋白（VLDL)である、請求項 12又は 13に記載の測定方法。
[16] 生体由来試料を (1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼ、又 は (2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)と 反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づ 、てコレステロールを測定す るための試薬に、請求項 1〜7の何れかのポリマーを含有させた、生体由来試料中の 特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬。
[17] 生体由来試料を特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するため の試薬と接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、 特定のリポ蛋白中のコレステロールと、（1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロ ーノレオキシダーゼ、又は (2)コレステロ一ノレエステラーゼ、コレステロ一ノレデヒドロゲナ ーゼ及び NAD (P)と反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づ ヽてコ レステロールを測定するための試薬に、請求項 1〜7の何れかのポリマーを含有させ た、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬。
[18] 特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬力 コレス テロ一ノレエステラーゼ、コレステローノレオキシダーゼ、ぺノレオキシダーゼとカップラー 又はデベロッパー、或いはカタラーゼである、請求項 15に記載の試薬。
[19] (1)請求項 1〜7の何れかのポリマー、（2)コレステロールエステラーゼ、（3)コレステロ一 ルォキシダーゼ、ペルォキシダーゼ、及びカップラー又は Z及びデベロッパー、及び (4)水性媒体を含んでなる第一試液と、（5)コレステロールエステラーゼ、（6)コレステロ ールォキシダーゼ及び (7)水性媒体を含んでなる第二試液とからなるものであって、 ペルォキシダーゼ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少 なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[20] (1)請求項 1〜7の何れかのポリマー、（2)コレステロールエステラーゼ、（3)コレステロ一 ルォキシダーゼ、（4)ペルォキシダーゼ、（5)カップラー、（6)デベロッパー及び (7)水性 媒体を含んでなる第一試液と、（8)界面活性剤及び (9)水性媒体を含んでなる第二試 液と力もなる、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[21] (1)請求項 1〜7の何れかのポリマー、（2)コレステロールエステラーゼ、（3)コレステロ一 ルォキシダーゼ、（4)カタラーゼ及び (5)水性媒体を含んでなる第一試液と、（6)力タラ ーゼ阻害剤、（?)水性媒体及び要すれば (8)界面活性剤とを含んでなる第二試液とか らなるものであって、ペルォキシダーゼ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試 液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール の測定用キット。
[22] リポ蛋白が高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDL)又は超低比重リポ蛋白（ VLDL)である、請求項 17〜 19の何れかに記載のキット。
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