JP3058602B2 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 - Google Patents
低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法Info
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- JP3058602B2 JP3058602B2 JP9111944A JP11194497A JP3058602B2 JP 3058602 B2 JP3058602 B2 JP 3058602B2 JP 9111944 A JP9111944 A JP 9111944A JP 11194497 A JP11194497 A JP 11194497A JP 3058602 B2 JP3058602 B2 JP 3058602B2
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- lipoproteins
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動脈硬化症の臨床
診断に重要な低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）中のコレステロ
ール（以下、「ＬＤＬコレステロール」ということがあ
る。本明細書において単に「コレステロール」という場
合にはエステル型コレステロール及び遊離型コレステロ
ールの両者を包含する）の分別定量法に関する。
診断に重要な低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）中のコレステロ
ール（以下、「ＬＤＬコレステロール」ということがあ
る。本明細書において単に「コレステロール」という場
合にはエステル型コレステロール及び遊離型コレステロ
ールの両者を包含する）の分別定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＬＤＬは血液中におけるコレステロール
運搬の主役であり粥状動脈硬化において血管壁に沈着し
たコレステロールは主にＬＤＬに由来している。血漿に
おけるＬＤＬの増加は虚血性心疾患等の粥状硬化性疾患
の主要な危険因子の１つであり、ＬＤＬコレステロール
を分別定量することは臨床的に有用である。
運搬の主役であり粥状動脈硬化において血管壁に沈着し
たコレステロールは主にＬＤＬに由来している。血漿に
おけるＬＤＬの増加は虚血性心疾患等の粥状硬化性疾患
の主要な危険因子の１つであり、ＬＤＬコレステロール
を分別定量することは臨床的に有用である。
【０００３】従来のＬＤＬコレステロールの定量法は、
分画操作とコレステロール定量操作の２段階から求める
方法と血中の総コレステロール、ＨＤＬ中のコレステロ
ール、トリグリセリドをそれぞれに求めるＦｒｉｅｄｅ
ｗａｌｄの式により算出する方法がある。
分画操作とコレステロール定量操作の２段階から求める
方法と血中の総コレステロール、ＨＤＬ中のコレステロ
ール、トリグリセリドをそれぞれに求めるＦｒｉｅｄｅ
ｗａｌｄの式により算出する方法がある。
【０００４】分画操作には、超遠心法、沈殿法、免疫化
学的方法等がある。超遠心法を用いる場合には、比重の
差を利用して超遠心分離機によりＬＤＬを分離し、その
コレステロール量を測定するものである。沈殿法はＨＤ
Ｌ抗体、ポリアニオン及び２価の陽イオンを添加し、不
溶性沈殿物を生成させて遠心分離により上清中のＬＤＬ
コレステロールを定量する方法（WPI Acc No.85-116848
/20)である。免疫化学的方法はＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ
に対する抗体をラテックスに結合させ、凝集反応後に遠
心又はフィルタにより取り除き、ＬＤＬコレステロール
を定量する方法（WPI Acc No.84-301275/49)が報告され
ているが、いずれも簡便性や経済性に問題がある。
学的方法等がある。超遠心法を用いる場合には、比重の
差を利用して超遠心分離機によりＬＤＬを分離し、その
コレステロール量を測定するものである。沈殿法はＨＤ
Ｌ抗体、ポリアニオン及び２価の陽イオンを添加し、不
溶性沈殿物を生成させて遠心分離により上清中のＬＤＬ
コレステロールを定量する方法（WPI Acc No.85-116848
/20)である。免疫化学的方法はＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ
に対する抗体をラテックスに結合させ、凝集反応後に遠
心又はフィルタにより取り除き、ＬＤＬコレステロール
を定量する方法（WPI Acc No.84-301275/49)が報告され
ているが、いずれも簡便性や経済性に問題がある。
【０００５】Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの式では総コレステ
ロールからＨＤＬコレステロールを引き、さらにトリグ
リセリドの１／５量を引きＬＤＬコレステロールを求め
る。しかし、食事の影響や個体差を加味していないため
正確性に問題がある。
ロールからＨＤＬコレステロールを引き、さらにトリグ
リセリドの１／５量を引きＬＤＬコレステロールを求め
る。しかし、食事の影響や個体差を加味していないため
正確性に問題がある。
【０００６】また近年、分画操作を要しないＬＤＬコレ
ステロールの定量法（WPI Acc No.83-766269/38)が報告
されているが、ＬＤＬに対する特異性が不十分である。
ステロールの定量法（WPI Acc No.83-766269/38)が報告
されているが、ＬＤＬに対する特異性が不十分である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、煩雑
な遠心分離操作を要せず、ＬＤＬコレステロールを簡便
に分別定量する方法を提供することである。
な遠心分離操作を要せず、ＬＤＬコレステロールを簡便
に分別定量する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは第１工程
でアミンを含む緩衝液の存在下で、低密度リポ蛋白以外
のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することによ
り、低密度リポ蛋白中のコレステロール以外のコレステ
ロールを消去し、続く第２工程において残存するコレス
テロールを測定することにより、低密度リポ蛋白中のコ
レステロールを定量することができることを見出し本発
明を完成した。
でアミンを含む緩衝液の存在下で、低密度リポ蛋白以外
のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することによ
り、低密度リポ蛋白中のコレステロール以外のコレステ
ロールを消去し、続く第２工程において残存するコレス
テロールを測定することにより、低密度リポ蛋白中のコ
レステロールを定量することができることを見出し本発
明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、アミンを含む緩衝液
の存在下で、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する
界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じ
た過酸化水素を消去することにより、被検試料中の高密
度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中の
コレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試
料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成
る、低密度リポ蛋白、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋
白及び／又はカイロミクロンを含むかもしれない被検試
料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を
提供する。
の存在下で、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する
界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じ
た過酸化水素を消去することにより、被検試料中の高密
度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中の
コレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試
料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成
る、低密度リポ蛋白、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋
白及び／又はカイロミクロンを含むかもしれない被検試
料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を
提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】リポ蛋白中に含まれるコレステロ
ールとしては、エステル型コレステロール（コレステロ
ールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明
細書において、単に「コレステロール」という場合に
は、これらの両者を包含する。
ールとしては、エステル型コレステロール（コレステロ
ールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明
細書において、単に「コレステロール」という場合に
は、これらの両者を包含する。
【００１１】本発明の方法に供される被検試料として
は、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を
含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、
例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げ
ることができるがこれらに限定されるものではない。
は、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を
含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、
例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げ
ることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１２】本発明の方法は、第１工程及び第２工程か
ら成り、第１工程ではアミンを含む緩衝液の存在下で、
低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の
存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素
を消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存コレス
テロールを定量する。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及び
ＣＭ中のコレステロールが消去されているので、第２工
程で定量されるコレステロールは、主として被検試料中
のＬＤＬ中のコレステロールである。
ら成り、第１工程ではアミンを含む緩衝液の存在下で、
低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の
存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素
を消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存コレス
テロールを定量する。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及び
ＣＭ中のコレステロールが消去されているので、第２工
程で定量されるコレステロールは、主として被検試料中
のＬＤＬ中のコレステロールである。
【００１３】第１工程におけるコレステロールの「消
去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産
物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味
する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬ
ＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールの選択的な消去
は以下のようにして行われる。
去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産
物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味
する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬ
ＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールの選択的な消去
は以下のようにして行われる。
【００１４】すなわち、アミンを含む緩衝液の存在下
で、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性
剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化
水素を消去する。
で、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性
剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化
水素を消去する。
【００１５】過酸化水素を消去する方法としては、カタ
ラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペル
オキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素
供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転
化する方法を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。
ラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペル
オキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素
供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転
化する方法を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。
【００１６】第１工程の反応液中のコレステロールエス
テラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好まし
く、由来としてはシュードモナス属細菌から生成される
ものが効果的である。また、コレステロールオキシダー
ゼの濃度は０．１〜 ０．７Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、
細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さら
に、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好
ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合
のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌが
好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合
物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好まし
い。
テラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好まし
く、由来としてはシュードモナス属細菌から生成される
ものが効果的である。また、コレステロールオキシダー
ゼの濃度は０．１〜 ０．７Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、
細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さら
に、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好
ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合
のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌが
好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合
物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好まし
い。
【００１７】第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ
蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ
値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下で
あるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることがで
きる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級
脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキル
アミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アル
キルフェノール縮合物を挙げることができる。なお、界
面活性剤のＨＬＢ算出方法は周知であり、例えば「新界
面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載さ
れている。
蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ
値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下で
あるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることがで
きる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級
脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキル
アミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アル
キルフェノール縮合物を挙げることができる。なお、界
面活性剤のＨＬＢ算出方法は周知であり、例えば「新界
面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載さ
れている。
【００１８】ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキ
レンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリ
オキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン
セチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリ
オキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシ
エチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以
上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限
定されるものではない。
レンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリ
オキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン
セチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリ
オキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシ
エチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以
上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限
定されるものではない。
【００１９】
【００２０】
【００２１】
【００２２】第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃
度は、０．１〜１０ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ま
しくは０．５〜５．０ｇ／ｌ程度である。
度は、０．１〜１０ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ま
しくは０．５〜５．０ｇ／ｌ程度である。
【００２３】第１工程は、ｐＨ５〜８の緩衝液中で行う
ことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノー
ルアミン、グッドの緩衝液等のアミンを含む緩衝液を用
いる。特にグッド緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩ
ＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳ
Ｏが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が
好ましい。
ことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノー
ルアミン、グッドの緩衝液等のアミンを含む緩衝液を用
いる。特にグッド緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩ
ＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳ
Ｏが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が
好ましい。
【００２４】第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他の
リポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価
の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとし
ては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用
することができるが、特にマグネシウムイオンが好まし
い。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好
ましい。
リポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価
の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとし
ては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用
することができるが、特にマグネシウムイオンが好まし
い。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好
ましい。
【００２５】なお、第１工程の反応液中には、任意的
に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素
を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロール
が反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中
濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。
に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素
を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロール
が反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中
濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。
【００２６】第１工程の反応温度は２５〜４０℃程度が
適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は
２〜１０分間程度でよい。
適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は
２〜１０分間程度でよい。
【００２７】続く第２工程では、被検試料中の残存コレ
ステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬ
ＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することによ
り行なうことができる。ここで、少なくともＬＤＬに作
用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界
面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活
性剤であってもよい。
ステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬ
ＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することによ
り行なうことができる。ここで、少なくともＬＤＬに作
用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界
面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活
性剤であってもよい。
【００２８】全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好
ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好まし
くは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド
誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級
アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミ
ド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメ
ルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げる
ことができる。
ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好まし
くは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド
誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級
アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミ
ド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメ
ルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げる
ことができる。
【００２９】ＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキ
レンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオ
キシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセ
チルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、
ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキ
シエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１
３未満の化合物を挙げることができるがこれらに限定さ
れるものではない。
レンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオ
キシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセ
チルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、
ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキ
シエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１
３未満の化合物を挙げることができるがこれらに限定さ
れるものではない。
【００３０】また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面
活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができ
る。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特
に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又
は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ま
しい。ここで、芳香環は、ベンゼン、ナフタレン、ジフ
ェニール等のように炭素と水素のみから成るものが好ま
しい。さらに、上記芳香環にスルホン酸塩のような親水
基が結合したものが好ましい。このような好ましい陰イ
オン界面活性剤の例を下記式（II）ないし（VI）に示
す。
活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができ
る。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特
に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又
は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ま
しい。ここで、芳香環は、ベンゼン、ナフタレン、ジフ
ェニール等のように炭素と水素のみから成るものが好ま
しい。さらに、上記芳香環にスルホン酸塩のような親水
基が結合したものが好ましい。このような好ましい陰イ
オン界面活性剤の例を下記式（II）ないし（VI）に示
す。
【００３１】
【化２】
【００３２】
【化３】
【００３３】
【化４】
【００３４】
【化５】
【００３５】
【化６】
【００３６】但し、式（II）〜（VI）において、Ｒは炭
素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基を示す。ま
た、第２工程で用いられる好ましい陰イオン界面活性剤
として、高級アルコール硫酸ナトリウム等を挙げること
ができる。
素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基を示す。ま
た、第２工程で用いられる好ましい陰イオン界面活性剤
として、高級アルコール硫酸ナトリウム等を挙げること
ができる。
【００３７】第２工程で用いられる界面活性剤の濃度
は、０．１〜１００ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ま
しくは１〜５０ｇ／ｌ程度である。
は、０．１〜１００ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ま
しくは１〜５０ｇ／ｌ程度である。
【００３８】第２工程のその他の好ましい反応条件は、
第１工程における好ましい反応条件と同様である。
第１工程における好ましい反応条件と同様である。
【００３９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００４０】実施例１ 第１試薬 ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ6.0 100 mmol/L HDAOS:N-(2−ヒドロキシスルホプロピル)-3,5- ジメチオキシアニリン 0.7 mmol/L シュードモナス属細菌由来コレステロールエステラーゼ （旭化成工業社製商品名「ＣＥＮ」） 0.8 U/ml ストレプトミセス属細菌由来コレステロールオキシダーゼ （東洋紡績社製商品名「ＣＯＯ」） 0.5 U/ml カタラーゼ 80 U/ml 塩化マグネシウム 10 mmol/L 花王社製エマルゲンＢ６６ （ポリオキシエチレン誘導体（HLB=13.2）） 0.2 ％
【００４１】第２試薬 ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ7.0 50 mmol/L ４- アミノアンチピリン 4.0 mmol/L ペルオキシダーゼ 2.4単位/ml アジ化ナトリウム 0.1％ 花王社製エマルゲンＡ６０ （ポリオキシエチレン誘導体（HLB=12.8）） 5.0％
【００４２】コレステロール濃度として100mg/dlに精製
したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭをそれぞれ含む4
種類の試料各4 μl に、あらかじめ37℃で加温した第１
試薬300 μl を混和し、37℃で5 分間反応させた後に、
第２試薬100 μl を加え5 分間反応させ、600nm におけ
る吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロ
ール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計
算して捕捉率を求めた。結果を下記表１に示す。
したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭをそれぞれ含む4
種類の試料各4 μl に、あらかじめ37℃で加温した第１
試薬300 μl を混和し、37℃で5 分間反応させた後に、
第２試薬100 μl を加え5 分間反応させ、600nm におけ
る吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロ
ール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計
算して捕捉率を求めた。結果を下記表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】表２に示されるように、上記方法によれ
ば、ＬＤＬ中のコレステロールはかなりの部分について
捕らえているが、それ以外のリポ蛋白中コレステロール
はほとんど捕らえておらず、ＬＤＬ中コレステロールを
選択的に定量できることがわかる。
ば、ＬＤＬ中のコレステロールはかなりの部分について
捕らえているが、それ以外のリポ蛋白中コレステロール
はほとんど捕らえておらず、ＬＤＬ中コレステロールを
選択的に定量できることがわかる。
【００４５】実施例２ 第１試薬 ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ7.0 50 mmol/L ＨＤＡＯＳ 0.7 mmol/L シュードモナス属細菌由来コレステロールエステラーゼ （旭化成工業社製商品名「ＣＥＮ」） 0.8 U/ml ストレプトミセス属細菌由来コレステロールオキシダーゼ （東洋紡績社製商品名「ＣＯＯ」） 0.5 U/ml カタラーゼ 80 U/ml 塩化マグネシウム 10 mmol/L 花王社製エマルゲンＢ６６ 0.2 ％
【００４６】第２試薬 ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ7.0 50 mmol/L ４- アミノアンチピリン 4.0 mmol/L ペルオキシダーゼ 2.4単位/ml アジ化ナトリウム 0.1％ TritonＸ100 3.0％
【００４７】実施例１と同様な操作を行い各リポ蛋白と
の反応性を求めた。結果を下記表２に示す。
の反応性を求めた。結果を下記表２に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】実施例３ 試料として健常人血清を用い、実施例１、２の操作を行
い、ＬＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法として
Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの計算式（CLIN.CHEM.、41、141
4、1995）を用いて血清中のＬＤＬコレステロール濃度
を求めた。その結果を図１及び図２の相関図として示し
た。
い、ＬＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法として
Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの計算式（CLIN.CHEM.、41、141
4、1995）を用いて血清中のＬＤＬコレステロール濃度
を求めた。その結果を図１及び図２の相関図として示し
た。
【００５０】図１及び図２に示されるように、両方法に
よる定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法
により正確にＬＤＬ中のコレステロールが定量できるこ
とが明らかになった。
よる定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法
により正確にＬＤＬ中のコレステロールが定量できるこ
とが明らかになった。
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【発明の効果】本発明により、煩雑な遠心分離操作を要
せず簡便にＬＤＬコレステロールを分別定量する方法が
提供された。
せず簡便にＬＤＬコレステロールを分別定量する方法が
提供された。
【図１】実施例１におけるＬＤＬコレステロールの測定
結果と、Friedewald算出値との相関関係を示す図であ
る。
結果と、Friedewald算出値との相関関係を示す図であ
る。
【図２】実施例２におけるＬＤＬコレステロールの測定
結果と、Friedewald算出値との相関関係を示す図であ
る。
結果と、Friedewald算出値との相関関係を示す図であ
る。
フロントページの続き (72)発明者 小原 秀一 新潟県五泉市大字木越字鏡田1359ー１ デンカ生研株式会社 鏡田工場内 (72)発明者 藤原 明 新潟県五泉市大字木越字鏡田1359ー１ デンカ生研株式会社 鏡田工場内 (72)発明者 高杉 憲一 新潟県五泉市大字木越字鏡田1359ー１ デンカ生研株式会社 鏡田工場内 (72)発明者 岡田 正彦 新潟県新潟市白山浦１ー315 (56)参考文献 特開 平４−173099（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−108998（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−48857（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−301636（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−299（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−313200（ＪＰ，Ａ) 国際公開96／28734（ＷＯ，Ａ１) 国際公開96／29599（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/92 C12Q 1/60 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 アミンを含む緩衝液の存在下で、低密度
リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下
において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロ
ールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去
することにより、被検試料中の高密度リポ蛋白、超低密
度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを消
去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステ
ロールを定量する第２工程とから成る、低密度リポ蛋
白、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及び／又はカイ
ロミクロンを含むかもしれない被検試料中の低密度リポ
蛋白中のコレステロールの定量方法。 - 【請求項２】 前記アミンを含む緩衝液は、グッドの緩
衝液である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記第２工程は、前記第１工程の産物
に、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤を
加え、前記コレステロールエステラーゼ及びコレステロ
ールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量
することから成る、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用す
る界面活性剤は、全てのリポ蛋白に作用するものである
請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記第１工程で用いられる、低密度リポ
蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値
が１３以上１５以下であるポリアルキレンオキサイド誘
導体である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項６】 前記第２工程で用いられる、全てのリポ
蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１１以上１３
未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求
項４記載の方法。 - 【請求項７】 前記第２工程で用いられる、少なくとも
低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤は陰イオン界面活
性剤である請求項３記載の方法。 - 【請求項８】 前記第１工程は、前記界面活性剤濃度を
０．１〜１０ｇ／ｌとして行われる請求項１ないし７の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記第２工程は、ＨＬＢ値が１１以上１
３未満である前記ポリオキシアルキレン誘導体又は前記
陰イオン界面活性剤の濃度を１〜１００ ｇ／ｌとして行
われる請求項６又は７記載の方法。 - 【請求項１０】 前記第１及び第２の工程は、ｐＨ５〜
８の緩衝液中で行なわれる請求項１ないし９のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 上記第１及び第２工程は、温度２５〜
４０℃で行なう請求項１ないし１０のいずれか１項に記
載の方法。
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|---|---|---|---|
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| EP97943184A EP0990904B1 (en) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | Method for quantitating cholesterol present in low density lipoproteins |
| DE69737108T DE69737108T2 (de) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | Methode zur quantifizierung von cholesterol in lipoproteinen geringer dichte |
| AT97943184T ATE348339T1 (de) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | Methode zur quantifizierung von cholesterol in lipoproteinen geringer dichte |
| ES97943184T ES2278395T3 (es) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | Procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteinas de baja densidad. |
| PCT/JP1997/003663 WO1998047005A1 (fr) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | Procede pour determiner le taux de cholesterol present dans des lipoproteines de basse densite |
| AU83114/98A AU735659B2 (en) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | Method for quantifying cholesterol present in low density lipoprotein |
| KR1019997009211A KR100540086B1 (ko) | 1997-04-14 | 1997-10-13 | 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법 |
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| JP11694496 | 1996-04-15 | ||
| JP8-116944 | 1996-04-15 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
1997
- 1997-04-14 JP JP9111944A patent/JP3058602B2/ja not_active Expired - Lifetime
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