JPH08201393A - コレステロールの定量方法 - Google Patents

コレステロールの定量方法

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JPH08201393A JP7013607A JP1360795A JPH08201393A JP H08201393 A JPH08201393 A JP H08201393A JP 7013607 A JP7013607 A JP 7013607A JP 1360795 A JP1360795 A JP 1360795A JP H08201393 A JPH08201393 A JP H08201393A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 リポタンパク質を含む検体に、高比重リポタ
ンパク質以外のリポタンパク質と複合体を形成する物質
及び界面活性剤を添加した後、酵素的測定法によりコレ
ステロールを測定する高比重リポタンパク質中のコレス
テロールの定量方法。 【効果】 遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な
操作で効率良く高比重リポタンパク質中のコレステロー
ルを定量することができる。また、種々の自動分析装置
に適用することができ、臨床検査の分野においても有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遠心分離などの前処理
の必要がなく、少ない試料で簡便な操作により効率良く
高比重リポタンパク質中のコレステロールを測定する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】コレステロール等の脂質は、血清中にお
いてアポタンパクと結合し、リポタンパク質を形成して
いる。リポタンパク質は物理的な性状の違いにより、カ
イロミクロン、超低比重リポタンパク、低比重リポタン
パク（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）等に分
類される。これらのリポタンパク質のうち、ＬＤＬは動
脈硬化惹起性を有し、一方ＨＤＬは抗動脈硬化作用を示
すことが知られている。
【０００３】疫学的には、ＨＤＬ中のコレステロール値
は動脈硬化性疾患の発症頻度と逆相関を示すことが証明
されており、今日では、虚血性心疾患の予防や診断を目
的として、ＨＤＬ中のコレステロールの測定が広く行わ
れている。ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法として
は、例えば超遠心分離によってＨＤＬを他のリポタンパ
ク質と分離した後、コレステロール測定に供する方法
や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行っ
て、その発色強度を測定する方法等が知られている。し
かしながら、これらの方法は、いずれも、操作が煩雑で
あったり、多数の検体を処理できないなどの問題があ
り、日常的にはほとんど用いられていなかった。
【０００４】ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法とし
て、現在臨床検査の領域で一般に広く用いられている方
法は、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポタンパク
質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離
されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定
する沈殿法である。この方法は、超遠心法や電気泳動法
に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する
操作を含むために、比較的多量の検体量を必要とし、ま
た分析誤差を生じる可能性も高く、全分析工程を完全に
自動化することはできなかった。
【０００５】一方、酵素的にＨＤＬ中のコレステロール
を分別定量する方法も検討されている。例えば、胆汁酸
塩又は非イオン系界面活性剤の存在下に、酵素反応を行
う方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）が知られて
いる。この方法は、反応初期の酵素反応速度はＬＤＬ濃
度に比例し、その後ＨＤＬ中のコレステロール濃度に比
例することを利用したものであるが、ＨＤＬ中のコレス
テロールと他のリポタンパク質中のコレステロールの反
応を完全に分別することはできず、測定される対象がＬ
ＤＬ中のコレステロールからＨＤＬ中のコレステロール
へと、段階的にではなく、オーバーラップしながら徐々
に変化していくため、正確な方法とは言い難かった。
【０００６】また、ＨＤＬ以外のリポタンパク質を予め
凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素
的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集を
再溶解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２
４２１１０号公報）が知られている。しかしながら、こ
の方法は、少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要
であるため、限定された自動分析装置にしか適用でき
ず、汎用性の点で問題があった。また、沈殿の再溶解に
際しては、高濃度の塩を使う等、分析機器に対するダメ
ージや試薬廃棄の点でも満足できるものではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で
効率良く測定することができ、種々の自動分析装置に適
用することができるＨＤＬ中のコレステロールの定量方
法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を行った結果、検体に、ＨＤＬ以外
のリポタンパク質と複合体を形成する物質と界面活性剤
を添加した後、酵素的にコレステロールを測定すれば、
ＨＤＬ中のコレステロールを効率良く定量することがで
き、しかも自動分析装置にも適用できることを見出し、
本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、リポタンパク質を含
む検体に、高比重リポタンパク質以外のリポタンパク質
と複合体を形成する物質及び界面活性剤を添加した後、
酵素的測定法によりコレステロールを測定することを特
徴とする高比重リポタンパク質中のコレステロールの定
量方法を提供するものである。
【００１０】本発明で用いられるＨＤＬ以外のリポタン
パク質と複合体を形成する物質としては、ＨＤＬとＨＤ
Ｌ以外のリポタンパク質とで親和性に差がある物質であ
れば良く、例えばデキストラン硫酸、リンタングステン
酸、ヘパリン等のポリアニオン；マグネシウムイオン、
カルシウムイオン等の２価金属イオン；ポリエチレング
リコール等の水溶性高分子；ＨＤＬ以外のリポタンパク
質に対する抗体などが挙げられる。これらの物質は１種
又は２種以上を組み合わせて用いることができる。ま
た、これらのうち、特にポリアニオンと２価金属イオン
を組み合わせて用いるのが好ましい。
【００１１】これらの物質の使用量は特に制限されず、
また物質の種類により異なるが、これらの物質とＨＤＬ
以外のリポタンパク質とが測定時に複合体を形成してい
ればよく、凝集物を形成していても、又は形成していな
くてもよい。例えば、ポリアニオンと２価金属イオンを
組み合わせて用いる場合、試料と混合したときの濃度
が、ポリアニオン０．０２〜２重量％、２価金属イオン
１０〜５００mMとなるのが好ましく、特にポリアニオン
０．０５〜１重量％、２価金属イオン２０〜２００mMと
なる範囲で用いるのが好ましい。
【００１２】また、本発明で用いられる界面活性剤とし
ては、コレステロールの酵素的測定系に対して阻害効果
を有するもの、すなわちリポタンパク質を溶解しないも
のが好ましく、例えばポリオキシエチレンアルキルエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベ
ンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。これらのうち、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテルとしてはポリオキシ
エチレンセチルエーテル（ＨＬＢ１４）（市販品として
はエマルゲン２２０（花王社製）等）が；ポリオキシエ
チレンアルキルフェニルエーテルとしてはポリオキシエ
チレンノニルフェニルエーテル（ＨＬＢ１５）（市販品
としてはエマルゲン９１３（花王社製）等）が；ポリオ
キシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物としては、
市販品としてプルロニックＦ８８（旭電化社製）等が；
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩としてはポ
リオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（市
販品としてはエマール２０Ｃ（花王社製）等）が；アル
キルベンゼンスルホン酸塩としてはドデシルベンゼンス
ルホン酸ナトリウムが好ましい。
【００１３】これらの界面活性剤は、１種又は２種以上
を組み合わせて用いることができ、その使用量は特に制
限されないが、試料と混合した時の濃度が０．０１〜５
重量％、特に０．０５〜１重量％になるような範囲で用
いるのが好ましい。
【００１４】本発明においては、まずＨＤＬ以外のリポ
タンパク質と複合体を形成する物質及び界面活性剤を検
体に添加するが、その際には、これらの物質を混合して
同一の試薬として添加しても、またそれぞれ別個の試薬
として添加してもよい。次に、このようにＨＤＬ以外の
リポタンパク質と複合体を形成する物質及び界面活性剤
を添加した検体を、直接コレステロールの測定に付す。
すなわち、遠心分離などの前処理を行う必要はない。
【００１５】コレステロールの測定方法としては、公知
の酵素的測定法のいずれをも用いることができ、例えば
酵素試薬としてコレステロールエステラーゼ及びコレス
テロールオキシダーゼを組み合わせて用いる方法、コレ
ステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲ
ナーゼを組み合わせて用いる方法等が挙げられる。これ
らのうち、コレステロールエステラーゼ及びコレステロ
ールオキシダーゼを組み合わせて用いる方法が好まし
い。酵素試薬を添加した後、一定時間のシグナル量を測
定することにより、測定対象であるコレステロール濃度
を求めることができ、更に分析の正確度を高める目的
で、酵素試薬を添加した後、定まった２点の時間におけ
るシグナル量を比較することによっても（２point
法）、コレステロールの濃度を求めることができる。ま
た、これらの酵素試薬等を添加した後、最終的にコレス
テロールを検出する方法は特に制限されず、例えばパー
オキシダーゼと色原体を更に組み合わせて行う吸光度分
析、補酵素や過酸化水素を直接検出する方法等が挙げら
れる。
【００１６】
【発明の効果】本発明によれば、遠心分離などの前処理
の必要がなく、簡便な操作で効率良くＨＤＬ中のコレス
テロールを定量することができる。また、少ない試料
で、簡便な操作により、特異的な測定が可能であるた
め、種々の自動分析装置に適用することができ、臨床検
査の領域においても極めて有用である。
【００１７】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】実施例１ リポタンパク質を含む血清検体Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０に
ついて、本発明方法及び従来の沈殿法により、ＨＤＬ中
のコレステロールを定量し、これらの測定値を比較し
た。結果を表１に示す。すなわち、検体４μl に、リン
タングステン酸ナトリウム０．２％、塩化マグネシウム
１００mM及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
ン縮合物（プルロニックＦ−６８、旭電化社製）０．５
％を含む試薬３００μl を加え、次にコレステロールエ
ステラーゼ０．２Ｕ／ml、コレステロールオキシダーゼ
０．２Ｕ／ml、パーオキシダーゼ０．３Ｕ／ml、Ｎ，Ｎ
−ジメチルメタトルイジン０．０４％、４−アミノアン
チピリン０．００５％及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００を含むコレステロール測定試薬１００μl を加え
た。その後、５４５nmにおける吸光度の差を測定するこ
とにより、ＨＤＬ中のコレステロール濃度を求めた。な
お、以上の操作は、日立７１５０型自動分析装置を用い
て行った。
【００１９】一方、沈殿法によりＨＤＬ中のコレステロ
ールを測定するには、デキストラン硫酸０．３％及び塩
化マグネシウム２％を含む水溶液０．２mlを、検体０．
２mlと混和し、３０００rpm で１０分間遠心分離を行っ
た。この上清５０μl を採取し、前記と同様のコレステ
ロール測定試薬３mlと混合し、３７℃で１０分間インキ
ュベートした後、５４５nmにおける吸光度を測定し、Ｈ
ＤＬ中のコレステロール濃度を求めた。
【００２０】
【表１】
【００２１】表１の結果より、本発明方法は簡便な操作
であるにもかかわらず、従来の沈殿法と同程度の測定値
が得られた。
【００２２】実施例２ リポタンパク質を含む検体Ｎｏ．１１〜Ｎｏ．２０につ
いて、本発明方法及び従来の沈殿法により、ＨＤＬ中の
コレステロールを定量し、これらの測定値を比較した。
結果を表２に示す。すなわち、検体４μl に、リンタン
グステン酸ナトリウム０．２％、デキストラン硫酸１．
８ｇ／ｌ、塩化マグネシウム１００mM及びポリオキシエ
チレン−ポリオキシプロピレン縮合物（プルロニックＦ
−６８、旭電化社製）０．２％を含む試薬３００μl を
加え、次に実施例１と同様のコレステロール測定試薬１
００μl を加えた。以下、実施例１と同様にして、ＨＤ
Ｌ中のコレステロール濃度を求めた。また、沈殿法につ
いても実施例１と同様にして測定した。
【００２３】
【表２】
【００２４】表２の結果より、本発明方法は少ない試料
を用い、簡便な操作で行うことができるにもかかわら
ず、従来の沈殿法と同程度の測定値が得られた。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リポタンパク質を含む検体に、高比重リ
    ポタンパク質以外のリポタンパク質と複合体を形成する
    物質及び界面活性剤を添加した後、酵素的測定法により
    コレステロールを測定することを特徴とする高比重リポ
    タンパク質中のコレステロールの定量方法。
  2. 【請求項２】 高比重リポタンパク質以外のリポタンパ
    ク質と複合体を形成する物質及び界面活性剤を添加した
    検体を、直接コレステロールの測定に付す請求項１記載
    の高比重リポタンパク質中のコレステロールの定量方
    法。
  3. 【請求項３】 高比重リポタンパク質以外のリポタンパ
    ク質と複合体を形成する物質が、ポリアニオン、２価金
    属イオン、水溶性高分子化合物又は高比重リポタンパク
    質以外のリポタンパク質に対する抗体である請求項１又
    は２記載の高比重リポタンパク質中のコレステロールの
    定量方法。
  4. 【請求項４】 界面活性剤が、リポタンパク質を溶解し
    ないものである請求項１〜３のいずれか１項記載の高比
    重リポタンパク質中のコレステロールの定量方法。
  5. 【請求項５】 コレステロールの測定を、コレステロー
    ルエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを組み
    合わせて行う請求項１〜４のいずれか１項記載の高比重
    リポタンパク質中のコレステロールの定量方法。
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