DE2128670B2 - Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode - Google Patents

Description

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Jedes Organ bzw. Gewebe besitzt ein spezifisches Enzymmuster, das sich von den Enzymmustern anderer Organe bzw. Gewebe mehr oder weniger unterscheidet. Treten Zellschädigungen auf, dann ändern sich meistens auch die Enzymmuster der umgebenden Körperflüssigkelten in einer für das erkrankte Organ bzw. Gewebe spezifischen Weise.

Die Enzymdiagnostik leitet aus den Veränderungen des Enzymmusters in Körperflüssigkeiten Schlüsse auf die Art der geschädigten Organe bzw. Gewebe oder auf die Art einer Erkrankung her. Die aus Körperflüssigkeiten (z. B. Vollblut, Plasma, Serum, Liquor), Geweben (z. B. Blutkörperchen, Leber, Niere, Muskel, Gehirn) und Ausscheidungen (z. B. Harn, Stuhl, Sputum) gewonnenen Testflüssigkeiten werden dabei auf ihre enzymatisehen Aktivitäten qualitativ und/oder quantitativ untersucht. Diese Untersuchungen sind jedoch nicht eindeutig, da die Proportionen der Enzymaktivitäten in vielen Organen bzw. Geweben sehr ähnlich sind. Eine echte Organspezifität der Diagnose läßt sich deshalb nur selten erreichen.

Es liegt deshalb nahe, den Befund, daß einige Enzyme in multiplen Molekularformen auftreten und sogenannte »Isoenzyme« bilden, für diagnostische Zwecke heranzuziehen. Isoenzyme katalysieren die gleiche Reaktion, sind aber mehr oder weniger unterschiedlich zusammengesetzt und zeigen unterschiedliche physikalische und biochemische Eigenschaften.

Die Isoenzymkonzentrationen eines Enzyms sind in den Organ-Strukturen des menschlichen Körpers unterschiedlich hoch. Bisweilen sind die Isoenzyme sogar streng organspezifisch. Durch die Bestimmung des Isoenzym-Musters kann daher eine weitergehende Differential-Diagnose gestellt werden als durch die übliche Bestimmung des Enzymmusters.

Die katalytischen Eigenschaften der Isoenzyme sind in der Regel se ähnlich, daß eine differenzierte Aktivitätsbestimmung mit Hilfe üblicher Methoden nicht möglich ist Es wurden verschiedene Methoden angewandt, um Isoenzyme bestimmter Enzyme zu differenzieren:

1. Hitze-lnaktivierung,

2. Adsorption an Sorptionsmitteln,

3. Aktivitätsbestimmung mit verschiedenen Substraten und

4. elektrophoretische Trennung.

Die Methoden 1 bis 3 erlauben die vollständige Differenzierung der Isoenzymaktivitäten und somit die quantitative Bestimmung des Isoenzym-Musters nicht. Nach Methode 4 ist die vollständige Trennung der Isoenzyme nur dann möglich, wenn ihre isoelektrischen Punkte weit genug auseinanderliegen. In allen diesen Fällen ist die quantitative Bestimmung der Isoenzym-Aktivitäten nach der Trennung aber langwierig und fehlerhaft und somit mit empfindlichen Nachteilen verbunden.

Es sind auch bereits Methoden zur Differenzierung einzelner Isoenzyme durch kombinierte enzymologische und immunologische Methoden bekannt, vgl. z. B. J. Biol. Chem., Vol. 234,1959, S. 1433 - 1437 und Vol. 236, 1961, S. 401 -404. Sie arbeiten mit Antiseren gegen mehr oder weniger gereinigte Isoenzyme. Da diese Seren jedoch nicht alleine auf das antigene Isoenzym, sondern auch auf Verunreinigungen durch andere Isoenzyme und andere Proteine eingestellt sind, enthalten sie neben den reinen Antikörpern auch andere Antikörperaktivitäten. Man verwendete neben Antiseren menschlicher Herkunft auch Antiseren, die durch Immunisation mit tierischen Isoenzymen gewonnen wurden. Da tierische und menschliche Isoenzyme aber einen mehr oder weniger unterschiedlichen Molekülaufbau besitzen, differieren auch die entsprechenden Antiseren. Die gegen tierische Isoenzyme gerichteten Antiseren sind für die menschlichen Isoenzyme nicht absolut spezifisch. Bei diagnostischen Untersuchungen am Menschen kann damit deshalb kein quantitatives Bild eines Isoenzymmusters erhalten werden.

Manchmal wurde auch die einwandfreie Präzipitation zwischen Isoenzym und homologem Antiserum nicht erreicht, so daß die Hemmung der Enzymaktivität durch spezifische Antikörper zur Bestimmung herangezogen werden mußte. Bei diesen Methoden verbleibt der Präzipitinkomplex im Testserum. Da aber auch dieser Komplex eine gewisse Enzymaktivität haben kann, kann die Immunhemmung in der Regel nicht quantitativ gestaltet werden. Es ergeben sich dadurch systematische, schwer ausschaltbare und schwer abschätzbare Fehler.

Man hat auch versucht, nicht präzipitierbare Isoenzym-Antikörperkomplexe zu fällen, indem man das Antiserum im Überschuß mit dem isoenzym vereinte und den gebildeten Komplex samt allen anderen y-Globulinen mit Anti-y-Globulinseren präzipitierte. Dazu war aber eine weitere quantitative Vorbestimmung des Titers an y-Globulinen erforderlich. Die Reaktion mit dem Anti-y-Globulin benötigt außerdem längere Zeiten, z. B. 12 Stunden und eignet sich deshalb für die Routinediagnostik weniger.

Die bisherigen Methoden hatten vielfach den Nachteil, daß sie nur einige Isoenzyme des Isoenzymmusters erfaßten. Man stellte z. B. fest, daß die Gesamtakti-

rität et:;es Enzyms bei bestimmten Krankheiten durch :in Antiserum mehr oder weniger ausgeschaltet wurde, )hne daß man die Veränderungen bei den übrigen soenzvmen berücksichtigte. Diese Diagnose mußte iber empirisch bleiben.

Die bisher bekanntgewordenen Ergebnisse auf iiesem zwischen Enzymologie und Immunologie sterienden Forschungsgebiet waren für die Diagnostik nur schwer auswertbar. Dies lag an der Kompliziertheit der Methoden, die eine Anwendung in der Routine nicht nahelegten. Die Methoden waren aber auch mit einer für die Differential-Diagnostik zu großen Fehlerbreite behaftet

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und Mittel zu entwickeln, mit denen das Isoenzymmuster eines in multiplen Molekularformen auftretenden Enzyms einfach und trotzdem präzis bestimmt werden kann. Das zu entwickelnde Verfahren soll durch eine Analyse aller Isoenzyme eines interessierenden Enzymmusters eine einwandfreie Bestimmung in Richtung Organspezifität erlauben.

Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren zur organ- bzw. krankheitsspezifischen Bestimmung des Isoenzymmusters eines in multiplen Molekularformen auftretenden Enzyms in einer Probe einer menschlichen Körperflüssigkeit, eines Gewebeextraktes bzw. einer Ausscheidung durch quantitative Messung der Enzym-Gesamtaktivität, anschließende Präzipitation der einzelnen Isoenzyme mit homologen, vermittels von menschlichen Isoenzym-Antigenen gewonnenen Antiseren, vollständige Entfernung der jeweils gebildeten Präzipitate, Messung der verbleibenden Enzymaktivität mit einem an sich bekannten Mittel zur Enzymaktivitätsbestimmung und Vergleich der Enzym-Gesamtaktivität mit den sich nach Entfernen der Präzipitate ergebenden restlichen Enzyvnaktivitäten, dadurch gelöst, daß man alle diagnostisch relevanten Isoenzyme des Isoenzymmusters mit jeweils einem bis zu lOfachen Überschuß von zu 95 bis 100% präzipitierenden, homologen, vermittels von reinen Isoenzym-Antigenen gewonnenen Aniiseren prazipitiert.

Die Erfindung betrifft ferner ein diagnostisches Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an einem 95-100%ig präzipitierenden, homologen, vermittels von reinen menschlichen lüoenzym-Antigenen gewonnenen Antiserum gegen ein diagostisch relevantes Isoenzym eines Isoenzymmiusteirs.

Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Reduktion komplizierter wissenschaftlicher Verfahren auf ein praxisnahes Diagnoseverfahren erreicht. Zugleich wird die Bestimmungsgenauigkeit erhöht. Dies wurde aufgrund folgender Gedanken realisiert:

1. Verwendung reiner menschlicher Isoenzyme zur Antise rumherstellung;

2. Verwendung praktisch vollständig präzipitierender Antiseren und

3. Berücksichtigung des gesamten Isoenzymmusters zur Diagnose, soweit die Isoenzyme für eine Organoder Krankheitsspezifität relevant sind.

Für die Erfindung kommen alle in multiplen Molekularformen auftretende Enzyme in Frage, deren Isoenzyme:

a) in menschlichen Organen und Geweben oder innerhalb eines Organs oder Gewebes oder innerhalb einer Zelle eine unterschiedliche Verteilung im Isoenzymmuster aufweisen,

b) sich auf immunologischem Wege quantitativ

präzipitieren lassen und
c) verschiedener genetischer Kontrolle
unterliegen. Unter diesen Enzymen sind Aldolase, Hexokinase, Creatinkinase und die Lactat-Dehydrogenase bevorzugt.

Aldolase kommt als Aldolase »A«, »B« und »C« im menschlichen Körper vor, wobei Typ »A« bevorzugt im Herz- und Skelettmuskel, Typ »B« in der Leber und Typ »C« bevorzugt im Gehirn vorhanden ist. Hexokinase

ίο tritt in mindestens 5 verschiedenen Isoenzymen auf, darunter zwei diagnostisch relevanten. In Leber, Muskel, Gehirn, Erythrocyten usw. kommen die Hexokinase-lsoenzyme in verschiedenen, jeweils charakteristischen Isoenzymmustern vor. Creatinkinase besteht aus mindestens drei verschiedenen Isoenzymen, von denen sich das Muskel- und Hirn-Enzym immunologisch unterscheiden, während eine dritte »Intermediärform« aus Untereinheiten der ersten beiden Isoenzyme besteht. Von der Lactat-Dehydrog^nase sind mindestens 5 verschiedene Isoenzyms (1 —5) bekannt, die elektrophoretisch unterscheidbar sind. Die LDH-Isoenzymmuster sind gewebscharakleristisch; die elektrophoretisch schneller wandernden Isoenzyme 1 und 2 sind in Hemextrakten, die langsamer wandernden Isoenzyme 4 und 5 dagegen im Leber- und Skelettmuskel konzentriert.

Für das Verfahren der Erfindung eignen sich auch andere in multiplen Molekularformen auftretende Enzyme, so verschiedene Kinasen, Transaminasen (z. B.

.10 A.lanin-aminotransferase, Aspartat-aminotransferase), Dehydrogenasen (z. B. Glutamat-dehydrogenase, GIucose-6-phosphat-dehydrogenase), Phosphatasen (z. B. saure und alkalische Phosphatasen), Peptidasen (z. B. Leucin-aminopeptidase) und Proteasen (z. B. Trypsin).

Unter einem Isoenzymmuster wird hier allgemein die Summe der in den einzelnen Organen, Geweben, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen des Menschen auftretenden Isoenzyme verstanden. Speziell bedeutet dieser Begriff auch die Summe der diagno-

••o stisch relevanten Isoenzyme eines in multiplen Molekularformen auftretenden Enzyms. Isoenzyme, die einen geringeren Anteil an der Gesamtaktivität des Enzyms als etwa 10°/o haben, sind diagnostisch im allgemeinen nicht relevant Ebenfalls sollen immunologisch nicht erfaßbare Isoenzyme nicht unter diesen Begriff fallen. Diagnostisch relevante Isoenzyme haben dementsprechend einen über 10%igen Anteil an der Gesamtaktivität und sind immunologisch erfaßbar.
Humane Isoenzyme können dem lebenden oder toten Körper entstammen. Sie lassen sich z. B. durch Operation bzw. Punktion erhalten. Als Herkunftsorgan bzw. -gewebe kommen unter anderem in Frage: Herz, Leber, Niere, Milz, Lunge, Gehirn, Schilddrüse, Mandel, Rückenmark, Blutkörperchen, Muskel. Die Verteilung der Isoenzyme auf die einzelnen Organe bzw. Gewebe läßt sich der Literatur entnehmen, z. B. E. L. C ο ο d 1 e y, »Diagnostic Enzymology« Kapitel 8, Seiten 223 - 255, Philadelphia, Pennsylvania 1970; J. King, »Practical Clinical Enzymology«, Kapitel 8, Seiten 309 — 341, London 1965.

Die Reinheit der Isoenzym-Antigene ist für die Genauigkeit der erfindungsgemäßen Reaktion entscheidend. Das folgt daraus, daß bei der Immunisierung schon geringste Antigenmengen die immunkompetenten ZeI-

('S len zur Antikörperproduktion anregen können, wobei die Antikörpermenge in keinem Verhältnis zu den geringen Mengen Antigen zu stehen braucht. Die Isoenzyme müssen vor allem frei sein von den übrigen

Isoenzymaktivitäten des untersuchten Enzyms. Ein empfindliches Kriterium dafür ist die immunologische Analyse, die vorteilhafterweise mittels Diffusions- oder Elektrophoresetechnik durchgeführt wird. Daneben sind z. B. die Methoden der analytischen Disk-Elektro- s phorese und der Polyacrylamid-Gel-Elektrofokussierung nützlich. Bei Anwendung dieser Methoden steht der Nachweis der Reinheit gegenüber den heterologen Antigenen im Vordergrund; die absolute Reinheit gegenüber anderen Proteinen, die z. B. durch die beiden zuletzt genannten Methoden ermittelt werden kann, ist dagegen weniger wichtig. Die Mikroheterogenität einiger Isoenzyme, die sich z. B. in geringen Unterschieden der Aminosäurezusammensetzung äußern kann, spielt als Reinheitskriterium in der Regel keine Rolle. Verunreinigungen können durch eine (oder mehrere) geeignet erscheinende präparative Methoden) abgetrennt werden. Bei der Reinigung von Aldolase kann man z. B. die präparative Elektrofokussierung an Polyacrylar.iid-Gel im pH-Bereich zwischen 7 und 10, aber auch die trägerfreie präparative Elektrophorese anwenden.

Eine Voraussetzung für die Erfindung ist die immunologisch erfaßbare Verschiedenheit der Isoenzyme. Sie ist dann gegeben, wenn die Antiseren nicht ;<; kreuzreagieren.

Für das Verfahren der Erfindung müssen praktisch vollständig präzipitierende Antiseren verwendet werden, damit das komplex gebundene und präzipitiertc Isoenzym vor Bestimmung der Restaktivität völlig aus der Analysenlösung entfernt werden kann. Unter einer praktisch vollständigen quantitativen Präzipitation wird hier eine Ausfällung verstanden, die 95—100% der vorhandenen Isoenzymaktivität erfaßt

Die Antiseren werden vorzugsweise durch Immunisierung solcher Tiere gewonnen, die präzipitierende Antikörper ergeben. Hierfür kommen in erster Linie Wirbeltiere in Frage, z.B. Pferd, Kuh, Schaf, Hund, Schwein (auch Minipig), Kaninchen, Affenarten, Hühnervögel (darunter Huhn, Perlhuhn, Truthuhn, Trappe, Strauß), Gänse- und Entenvögel, Ratten, Meerschweinchen, Mäuse usw.; für die Gewinnung größerer Serummengen eignen sich insbesondere die größeren Tiere. Präzipitierende Antikörper gegen Aldolase können z. B. aus Truthühnern gewonnen werden.

Die Antiseren werden nach in der Immunologie bekannten Verfahren gewonnen. Diese sind 2. B. in »Methods in immunology and immunochemistry«, Band 1, herausgegeben von C. A. Williams und M. W. Chase, Academic Press 1967, beschrieben. Zur Erhöhung des Antikörperspiegels des immunisierten Tieres werden unter anderem auch Zweitimmunisierungen bzw. sogenannte »booster-Reaktionen« angewandt. Letztere werden z. B. mit dem sogenannten Freundschen Adjuvans durchgeführt, das eine Wasser-in-Öl-Suspension darstellt und gegebenenfalls zusätzlich gewisse abgetötete Mycobacterien enthalten kann.

Ist der Isoenzym-Antikörperkomplex nicht vollständig präzipitierbar, so ist es unter Umständen auch möglich, die Präzipitation durch geeignete, in der Immunologie bekannte Verfahren quantitativer zu gestalten. So kann z. B. das zuvor gereinigte Antiserum an Latex-Partikeln absorbieren, die sich z. B. aus Polystyrol in beliebiger und genau eingestellter Größe herstellen lassen. Die so »aufgezogenen« Antikörper fi.s haben (zusammen mit dem Träger) ein höheres Molekulargewicht als die y-Globuline der Antiseren allein und agglutinieren das Isoenzym leichter. Anstatt der Latex-Partikeln können auch mit einem Tannin (ζ. Β m-Digallussäure) behandelte Erythrocyten als Antikörperträger verwendet werden.

Die Enzymaktivität der Testflüssigkeit wird vor und nach der Präzipitation durch Zugabe eines bekannten Mittels nach einer Standard-Methode bestimmt Bevorzugt sind solche Enzymaktivitäts-Bestimmungsmethoden, die sich auf Messungen im UV-licht zurückführen lassen. Für einige Enzyme, z. B. Hexokinase, eignen sich jedoch auch photometrische Methoden. Auch titrimetrische Testmethoden sind verwendbar. Eine Sammlung derartiger Methoden findet man z. B. in »Methoden der enzymatischen Analyse«, 2. Auflage, Band I₁ Weinheim/ Bergstraße, 1970, herausgegeben von Hans Ulrich Bergmeyer.

Zur Präzipitation der Isoenzyme kann ein bis zu lOfacher Überschuß des Antiserums zur Testflüssigkeit gegeben werden; gewöhnlich arbeitet man jedoch mit der 2- bis 5fachen, insbesondere der doppelten Menge. Geringere oder höhere Antiserumkonzentrationen können unvollständige bzw. lösliche Präzipitate ergeben, die beide erfindungsgemäß unbrauchbar sind. Der Titer der Antiseren kann mit Hilfe der Heidelberger-Kurve ermittelt werden, die sich durch Titration einer bestimmten Volumenmenge Antiserum mit steigenden Mengen Isoenzym und Messung der Trübungen erhalten läßt. Das Maximum der Heidelberger-Kurve gibt die Menge Antiserum an, die eine bestimmte Menge Antigen völlig präzipitiert Da der Titer der Antiseren je nach Tier und Art der Immunisierung schwankt, ist es zweckmäßig, den Antikörpergehalt jedes einzelnen Serums oder auch eines pools aus mehreren Seren vermittels Immuntitration mit standardisiertem Isoenzym zu ermitteln. Daraus läßt sich der erforderliche Antiserum-Überschuß festlegen.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren durch die Beschreibung der praktischen Durchführung einer Isoenzym-Bestimmung im Serum beispielsweise näher erläutert:

Zunächst wird die Enzymgesamtaktivität im Serum nach einer bekannten Bestimmungsmethode, z. B. einer UV-Methode ermittelt. Darauf werden mehrere Serumproben, z. B. eine den diagnostisch relevanten Isoenzymen entsprechende Anzahl mit entsprechenden Antiseren, die gegen reine menschliche Isoenzyme gewonnen wurden, versetzt. Die jeweilige Menge Antiserum richtet sich ungefähr nach dem zu erwartenden Titer und wird mit einer vorhergehenden Titer-Bestimmung (Heidelberger-Kurve) ermittelt Man verwendet bevorzugt etwa den doppelten Überschuß Antiserum. Anschließend wird eine für die Präzipitation günstige Kochsalzkonzentration, die zwischen 0,1 und 10%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 5% und insbesondere zwischen 2,5 und 4% liegt, eingestellt und 1 Minute bis 5 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, bei 25 bis 45°, vorzugsweise bei 37°, inkubiert Darauf läßt man einige Zeit, z.B. 1-5 Stunden, in der Kälte, z.B. bei Kühlschranktemperatur stehen und zentrifugiert das Präzipitat bei 5000-40 000, vorzugsweise bei etwa 20 000 U ab. Die Zentrifugation dauert zwischen '/2 Minute und 2 Stunden; das Präzipitat hat sich gewöhnlich schon nach etwa 10 Minuten abgesetzt. Im Überstand wird eine zweite Bestimmung zur Ermittlung der Restaktivität durchgeführt. Die Differenz zur Gesamtaktivität ergibt die Aktivität des präzipitierten Isoenzyms.

Bei einigen Enzymen ist es möglich, das Isoenzymmu ster der Testflüssigkeit vollständig zu erfassen, so z. B.

bei Aldolase. Bei anderen Enzymen sind jedoch nicht alle verschiedene Isoenzymtypen bekannt, bzw. sie sind wissenschaftlich umstritten. Es kann dann schwierig sein, die reinen Isoenzyme zu isolieren und ihre Einheitlichkeit nachzuweisen. Einige Isoenzyme haben einen relativ geringen Anteil an der Gesamtaktivität, z. B. unter 5%. In diesen Fällen werden nur die in ausreichender Aktivität auftretenden und gesicherten, d. h. die diagnostisch relevanten Isoenzyme für die Diagnose herangezogen. ι ο

Ist ein Isoenzym organ- bzw. gewebsspezifisch, dann kann bei Erkrankung des jeweiligen Organs bzw. Gewebes der Anstieg der betreffenden Isoenzymaktivität im Serum allein schon krankheitsspezifisch sein. Die Diagnose kann dann auf das eine Isoenzym beschränkt werden. In der Regel muß die Diagnose aber durch Heranziehen mehrerer diagnostisch relevanter Isoenzyme abgesichert werden.

Ein besonderes Problem sind die »hybriden Isoenzyme«. Sie entstehen durch Kombination von Untereinheiten verschieden reiner Isoenzyme in unterschiedlichen Proportionen. Da Hybride Mischformen von reinen Isoenzymen sind, können sie auch in unterschiedlichem Maß von mehreren gegen die reinen Isoenzyme gerichteten Antiseren präzipitiert werden. So können Enzymaktivitäten vorgetäuscht werden, die höher sind als die Summe der effektiv vorhandenen Isoenzymaktivitäten.

Sind Hybride organspezifisch, so können sie die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöhen. Die Aldolase tritt z. B. nur im Herzmuskel und Gehirn als Hybrid auf; liegt nun die Summe der Isoenzymaktivitäten wesentlich über 100%, so ist ein eindeutiger Hinweis auf Herzmuskel oder Gehirn als Ursprungsorgane gegeben. Bei vielen anderen Enzymen, ζ. B. Hexokinase, spielen Hybride dagegen eine geringere Rolle und haben weniger Einfluß auf die Enzymdiagnostik. Eine Verminderung der Organspezifität kann auch auftreten, wenn Hybride regelmäßig in mehreren Organen auftreten; es ist dann unter Umständen vorteilhaft, ein anderes isoenzymhaltiges Enzym zur Diagnose heranzuziehen.

Die Methode der Erfindung ist für größere Institute oder Kliniken geeignet, die in der Lage sind, Immunseren herzustellen. Werden die Reagenzien industriell in Testpackungen verfertigt, kann sie auch kleinere Institute bzw. den praktischen Arzt ansprechen. Eine Testpackung kann alle zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Reagenzien enthalten. Das Verfahren kann deswegen mit geringstmöglichem Aufwand durchgeführt werden. Bestandteile einer industriell verfertigten Testpackung sind z. B. Antiseren gegen einige (oder alle) diagnostisch relevanten Isoenzyme eines bestimmten Enzyms und ein Reagenziensatz zur Enzymaktivitätsbestimmung vor und nach Präzipitation.

Die folgenden speziellen Beispiele erläutern die Erfindung noch näher:

Beispiel 1

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Aldolase
A. Herstellung und Reindarstellung der Reagenzien

1. Organe

Skelettmuskulatur, Leber und Gehirn werden ca. 8-12 Stunden nach dem Eintritt des Todes menschlichen Leichen entnommen und bei -20⁰C eingefroren.

2. Isolierung der drei Aldolasetypen
a) Isolierung der Aldolase »A«

500 g menschlicher Skelettmuskel werden mit einem Fleischwolf zerkleinert und mit 2 I eiskaltem 0,01 M Tris-Puffer [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer pH 7,5 verrührt. Portionen von 300 ml werden be 20 000 U mit einem Mixer homogenisiert und da: Homogenat anschließend bei 0⁰C und bei 13 000 g abzentrifugiert. Das Sediment wird mit 1 I eiskalterr Puffer extrahiert und bei O⁰C zentrifugiert. Dei Überstand wird bei O⁰C mit festem Ammoniumsulfai versetzt, bis eine Sättigung von 0,30 erreicht ist. Nach einer Stunde bei O⁰C wird die Lösung bei 20 000 g zentrifugiert, das Sediment verworfen und der Überstand durch weitere Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 0,65 gebracht. Nach Zentrifugieren wird das Sediment in 200 ml 0,01 M Tris-Puffer gelöst und 24 Stunden gegen 101 de: gleichen Puffers dialysicrt. Die dialysierte Lösung wire zur weiteren Reinigung auf einer Phospho-Cellulose Säule (40 χ 500 mm) aufgetragen, die zuvor mit 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 äquilibriert wurde. Die Säule wird se lange mit dem Puffer gewaschen, bis kein Protein irr Eluisachzuweisen j_st Weitere unerwünschte Proteine z. B. Hämoglobin, werden durch Eluieren mit 0,1 Vl Tris-Puffer entfernt. Schließlich wird die Aldolase durch Elution mit 0,01 M Tris-Puffer, der 3 mM Fructose-1,6-diphosphat enthält, eluiert. Durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 0,5 wird das Enzym ausgefällt. Nach Abzentrifugieren wird die Aldolase »A« in 0,1 M Tris-Puffer gelöst und das Aussalzen zweimal wiederholt.

b) Isolierung der Aldolase »B«

Die folgenden Operationen werden bei O⁰C ausge führt: 1000 g menschlicher Leber werden mit einem Fleischwolf zerkleinert, mit 2,51 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 gemischt und portionsweise in einem Mixer 5 Minuten homogenisiert. Das Homogenat wird 30 Minuten bei 13 000 g zentrifugiert. Durch Zugabe von 1 M Tris-Puffer pH 7,5 wird die Molarität des Puffers im Überstand auf 0,05 M erhöht und 1 1 Calcium-Phosphat-Gel (50 mg/ml) zugegeben. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt, abzentrifugiert und das Gel verworfen. Mit festem Ammoniumsulfat wird der Überstand auf eine Sättigung von 03 gebracht und analog der unter a) angegebenen Methode aufgearbeitet Man erhält Aldolase »B«.

c) Isolierung der Aldolase »C«

1500 g menschliches Gehirn werden porüonsweis« mit 2,5 1 eiskaltem 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 in eineir Mixer homogenisiert, anschließend 1 Stunde be 30 000 g zentrifugiert und der klare Überstand durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 0,4 gebracht Nach 1 Stunde bei 0⁰C wird be; 30 000 g zentrifugiert und der Überstand durch Zugabe von Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 0,7 gebracht Es wird erneut zentrifugiert und dei Niederschlag in 300 ml 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst

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Nun wird gegen mehrere Portionen des gleichen Puffers dialysiert, auf eine DEAE-Cellulose Säule, die mit 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 äquilibriert ist, aufgetragen und so lange mit dem gleichen 'Puffer gewaschen, bis im Eluat kein Protein mehr nachzuweisen ist. Dabei werden s Aldolase A und das Aldolase-Hybrid A3C ausgewaschen. Unter Verwendung eines linearen Kochsalzgradienten zwischen 0 und 0,35 M und in Gegenwart von 3 mM Fructose-1,6-diphosphat wird eluiert und alle Fraktionen mit Aldolaseaktivität werden gesammelt, m Darauf wird mit Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 0,7 gebracht und zentrifugiert. Das Sediment wird in 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst und 24 Stunden gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das Dialysat wird auf eine Säule mit Phospho-Cellulose, die zuvor mit dem obigen Puffer äquilibriert war, aufgetragen und mit 0,2 M Tris-Puffer pH 7,5, der 3 mM Fructose-1,6-diphosphat enthält, eluiert. Die Fraktionen mit Aldolaseaktivität werden mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, der Niederschlag abzentrifugiert, in 0,01 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst und 24 Stunden gegen diesen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf eine DEAE-Cellulose Säule aufgetragen und mit einem linearen Kochsalzgradienten zwischen 0 und 0,3 M, der 3 mM Fructose-1,6-diphosphat enthält, eluiert. Die letzte Fraktion, welche die Aldolase »C« enthält, wird mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, abzentrifugiert und der Niederschlag im Puffer gelöst. Die Enzymlösung wird dann auf eine Ammoniumsulfat-Sättigung von 0,55 eingestellt, wobei die Aldolase »C« präzipitiert.

3. Reinigung der drei Aldolasetypen
durch präparative Elektrofokusierung

Die präparative Reinigung durch Elektrofokusierung wird mit einem pH-Gradienten von pH 7 — 10(1% Gel pH 7 — 10) durchgeführt- Der Dichtegradient wird mit Saccharose eingestellt. Eingesetzt werden ca. 200 mg Aldolase im Gemisch mit der Dichtelösung. Bei 600 V Spannung ist die Trennzeit bei 0⁰C 72 Stunden.

4. Kristallisation

Kleine Volumina (ca. 1 ml) Aldolase »A«, »B« und »C« (10 mg/ml) werden mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung langsam vernetzt, bis sich eine schwache Trübung bildet, die abzentrifugiert wird. Der Überstand wird in siliconisierten Reagenzröhrchen (6 χ 120 mm) mit wasserfreiem n-Butanol überschichtet und bei 4° C etwa 10 Tage stehengelassen. Man erhält Aldolase »A« in Nadeln mit einer spezifischen Aktivität von 5,50 U/mg und einem Molekulargewicht von 160 000. Aldolase »B« wird in Rhomben mit einer spezifischen Aktivität von 0,95 U/mg; und einem Molekulargewicht von 162 000 erhalten. Aldolase »C« bleibt amorph. Die spezifische Aktivität beträgt 3,80 U/mg; das Molekulargewicht 155000.

5. Gewinnung von Antiseren

Antiseren gegen Aldolase »A«, »B« und »C« werden durch Immunisierung von Puten mit den reinsten Aldolasetypen gewonnen. Hierzu gibt man eine geeignete Menge physiologischer Kochsalzlösung und komplettes Freundsches Adjuvans im Verhältnis 1 :1 zusammen und emulgiert die Mischung durch Ultraschall bis zur Bildung einer stabilen Wasser/Öl-Emulsion. Hierauf wird Aldolase »A«, »B« oder »C« hinzugegeben und von Hand weiter emulgiert. — Puten mit einem Gewicht von 10—15 kg werden nun mit einem Anteil dieser Emulsion, der 5 mg Antigen entspricht, durch intramuskuläre Injektion in die Brustmuskulatur immunisiert. Nach sechs Wochen wird eine Sekundärinjektion in die Flügelvene vorgenommen, bei der 5 mg Aldolase in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung benutzt werden. 8 Tage später entnimmt man ca. 200 ml Blut pro Tier aus der Flügelvene und füllt in heparinisierte Flaschen ab. Das Blut wird darauf bei 15 000 U 15 Minuten zentrifugiert und das Plasma durch Zugabe von Thrombokinase aus Kaninchenhirn vom Fibrin befreit. Das erhaltene Serum wird in tiefgefrorenem Zustand aufbewahrt.

6. Bestimmung des Antikörpertiters

Diese Bestimmung wird mit Hilfe einer Heidelberger-Kurve vorgenommen. Konstante Mengen des Antiserums werden mit steigenden Mengen des homologen Antigens (Aldolase »A«, »B« oder »C«) gemischt und festes Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 4% zugefügt.

Nach einstündiger Inkubation bei 37°C und 2 Stunden im Kühlschrank werden die durch Immunpräzipitation entstandenen Trübungen in einem Photometer bei 436 nm unter Benutzung einer 1-cm-Küvette gegen einen Blindwert gemessen. Nach Abzentrifugieren des Immunpräzipitates kann im klären Überstand die Aktivität der nicht präzipitierten Aldolase bestimmt werden.

Bei den im folgenden beschriebenen Versuchen vermochte je 1 ml der Antiseren Anti-»A«, Anti-»B« bzw. Anti-»C« jeweils 24OmU Aldolase »A«, 100 mU Aldolase »B« bzw. 160 mU Aldolase »C« vollständig zu präzipitieren.

B. Bestimmung von Aldolaseaktivitäten
in biologischen Flüssigkeiten

2,5 ml einer aus 4 mM Fructose-1,6-diphosphat, 03 mM Jodacetat (Natriumsalz der Monojodessigsäure) und 55 mM Kollidinpuffer (0,55 mM KoUidin, mit Salzsäure auf pH 7,4 eingestellt) bestehenden Lösung

werden mit 0,05 ml einer 15 mM ß-Nicotin-ämid-adehiiidinucleotid-Lösung und 0,01 ml einer Suspension, bestehend aus 0,28 U/ml Glycerin-3-phosphat-dehydrögenase, 1,7 U/ml Triosephösphat-isomerase und 0,65 U/l Lactat-dehydrogenase in 2,8 M Ammohiumsül·

fatlösung, versetzt Hierzu gibt man 0,20 ml des zu untersuchenden Serums, mischt und hält 5 Minuten auf +37⁰C. Man mißt die Extinktion E\ gegen einen Leerwert und läßt genau 20 Minuten stehen. Darauf wird die Extinktion E₂ gegen einen Leerwert gemessen.

Der Leerwert enthält nur 0,20 ml des zu untersuchenden Serums und 2,5 ml 0,9%ige Natriumchlorid-Lösung.

Der Aldelase-Gehalt errechnet sich nach folgender Formel:

Volumenaktivilät =

1 (XK) ·

[Hierin bedeuten

V = Teslvolunien,

/ = Extinktionskoeffizicnl (αττ/μΜοΙ).

(I = Schichtdicke (cm),
(/,-I₁) = Meßzeitintervall (Minuten).]

C. Ermittlung des Gehaltes der Aldolase-Isoenzyme
in Rohextrakten von menschlichen Organen

1 ml eines menschlichen Skelettmuskel-Rohextraktes mit einer Aldolase-Aktivität von 40,8 mU/ml wird mit

1 ml eines Anti-»A«-Serums versetzt und die Natriumchlorid-Endkonzentration auf 4% eingestellt. Es wird 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend

2 Stunden bei +4⁰C aufbewahrt. Nach Abzentrifugieren des Immunpräzipitats bei 20 000 U bestimmt man die Aldolase-Aktivität des Überstandes nach der oben angegebenen Aldolase-Bestimmungsmethode. Sie beträgt 1,5 mil (3,7% der ursprünglichen Serumaktivität).

Analog wird mit 1 ml Anti- »Β« bzw. Anti- »C« der in 1 ml Skelettmuskel-Rohextrakt enthaltene Anteil an Aldolase »B« bzw. Aldolase »C« präzipitiert und die verbleibende Aldolase-Restaktivität im Überstand bestimmt. Sie heträgt 41,2 mU für Anti-»B« und 42,05 mU für Anti-»C«. Im Skelettmuskel-Rohextrakt ist also in beiden Fällen praktisch alle Aldolase-Aktivität erhalten geblieben.

Aus diesen Werten erhält man die folgende Verteilung der Aldolase-Isoenzyme im menschlichen Skelettmuskel:

D. Anwendungsbeispiele

Beispiel a)
Muskel-Dystrophie

1 ml eines Serums mit einer Aldolasegesamtaktivität von 64,2 mU/ml werden mit 2 ml des nach A hergestellten Anti-»A«-Serums versetzt und mit Hilfe von 10%iger Kochsalzlösung auf eine NaCI-Endkonzentratration von 2,5% gebracht. Darauf wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend 3 Stunden bei + 4⁰C aufbewahrt. Nach Abzentrifugieren des Präzipitates bei 20 000 U während 10 Minuten bestimmt man die Aldolase-Aktivität nach der beschriebenen Bestimmungsmethode. Sie beträgt 5,4 mU (8,4% der ursprünglichen Serumaktivität).

Analog wird mit 1 ml Anti- »Β« bzw. Anti- »C« der vorhandene Anteil an Aldolase »B« bzw. Aldolase »C« präzipitiert und die verbleibende Restaktivität im Überstand bestimmt. Sie beträgt 62,0 mU für Anti- »Β« und 60 mU für Anti-»C«. Im Serum sind also 96,5% bzw. 93,5% der ursprünglichen Aldolaseaktivität erhalten geblieben. Daraus ergibt sich folgende Isoenzym-Verteilung:

.10

	Muskcl-Dyslrophie	normal
	Patient A	79,2
Aldolase A	91,6	17,0
B	3,5	X-S
C	6.5

Aldolase A	963%
B	0%
C	0%

Analog wurde auch der prozentuale Gehalt der Aldolase-isoenzyme im Rohextrakt anderer menschlicher Organe ermittelt:

.15

40 Verglichen mit den Normalwerten stellt man ein ausgeprägtes Überwiegen an Aldolase »A« fest. Dies bedeutet auf progressive Muskel-Dystrophie hin (diese Diagnose konnte klinisch bestätigt werden).

In Analog-Bestimmungen mit den Seren zweier weiterer Patienten (B und C) wurden folgende prozentuale Verteilungen der Aldolase-Isoenzyme ermittelt:

	Aldolase	»B«	»c«	45	Aldolase	50	Auch	A	Patient B	Patient C	pi cniol li\	bestätigt werden
	»A«	98	0			klinische	B	86,4	96,9
Leber	1	11	27		55 konnte.	C	3	3,2
Herzmuskel	80	0	54			9	1
Gehirn	84	27	22
Lunge	76	75	5
Niere	20	0	13			hier liegt Muskel-Dystrophie vor, wie durch
Milz	91	1	18	Untersuchungsmethoden
Testis	92	73	0
Haut	33	0	16
Erythrocyten	96	5	35	R
Sjermatozoen	97

Man sieht, daß die Skelettmuskulatur fast nur Aldolase »A« enthält, die Leber dagegen nur den Typ »B«. Gehirn, Milz, Testis und Erythrocyten enthalten Aldolase »A« und »C«, die Haut die Typen »A« und »B« und in den anderen Organen sind alle drei Typen in verschiedenen Verhältnissen vorhanden.

Bei manchen Organen und Geweben erhält man bei der Addition Werte, die größer als 100% sind. Der Grund ist, daß hier neben den reinen Enzymtypen auch noch Hybride vorliegen.

Hepatitis infectiosa

1 ml eines Serums mit einer Aldolase-Gesamtaktivitäi von 21,8 mU/ml wird mit 0,3 ml eines Antiserums Anti- »A« versetzt In zwei weiteren Proben werden jeweils 0,5 ml Anti-»B« bzw. 03 ml Anti-»C« zugegeben. Die Isoenzymbestimmung wird dann analog zu Beispiel 1 durchgeführt Die Ergebnisse dieser Testreihe und zweier weiterer Testreihen mit anderen Seren sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:

Serum	Serumaktivität	Anliscrum	Anliscrum	Aktivität des	Uberstandes	Aldolaseaktivität
	in U/ml			in mU	in % der Serum- aktivitiit	in % der Serum- aktivitäl
		(Typ)	(ml)
I	21,8	Anti A	0,3	19,2	88,2	A: 11,8
	21,8	Anti B	0,5	1,75	8,05	C: 91,95
	21,8	Anti C	0,3	21,8	100	C: 0
II	18,8	Anti A	0,5	17,6	93,5	A: 6,5
	18,8	Anti B	0,5	1,8	9,6	B: 90,4
	18,8	Anti C	0,5	17,5	93,0	C: 6,0
!!!	24,7	Anti A	1,0	22,6	91,5	A: 8,5
	24,7	Anti B	1,0	1,8	7,3	B: 92,7
	24,7	Anti C	1,0	24,2	98,0	C: 2
Normalserum	2,4	Anti A	0,3	0,5	20,8	A: 79,2
		Anti B	0,3	2,0	83	B: 17,0
	2,4	Anti C	0,3	2,2	91,5	C: 8,5

Die hohen Aldolase-wBw-Werte deuten auf Hetapitis infectiosa hin (diese Diagnose konnte klinisch bestätigt werden).

Beispiel c)
Myokardinfarkt
Analog dem Verfahren vom Beispiel a) und b) wurde der Aldolasegehalt fünf verschiedener Seren bestimmt:

Serumaktivität Antiserum Antiserum Aktivität des Überstandes Aldolaseaktivitiit

^inU/ml =--' in % der Serum- ^{in % der Scrunv}

in mil

aktivität

aktivität

(Typ)

(ml)

I	58,4	Anti A	0,6	23,45	40.0	A:	60
	58,4	Anti B	0,6	22,6	38,7	B:	61,3
	58,4	Anti C	0,6	42,9	73,5	C:	26,5
II	21,0	Anti A	0,5	4,3	20,5	A:	79,5
	21,0	Anti B	0,5	18,1	86,2	B:	13,8
	21,0	Anti C	0,5	17,6	84,0	C:	16,0
III	18,8	Anti A	0,5	3.8	20,2	A:	79,8
	18,8	Anti B	0,5	15,2	81,0	B:	19,0
	18,8	Anti C	0,5	13,9	74,0	C:	26,0
IV	6,8	Anti A	0,2	1,7	25,0	A:	75,0
	6,8	Anti B	0,2	5,0	73,4	B:	26,6
	6,8	AnUC	0,2	6,1	89,8	C:	10,2
V	6,8	Anti A	0,3	1,9	28,0	A:	72,0
	6,8	anti B	0,3	5,5	81,0	B:	19,0
	6,8	Anti C	0,3	5,7	84,0	C:	16,0
Normalserum	2,4	Anti A	0,3	0,5	20,8	A:	79,2
	2,4	Anti B	0,3	2,0	83	B:	17,0
	2,4	Anti C	0,3	2,2	91,5	C:	8,5

Die erhöhten Werte an Aldolase »C« bzw. die häufig über 100% liegenden Aldolase-Aktivitäts-Werte deuten auf Herzinfarkt hin (diese Diagnosen konnten klinisch bestätigt werden).

10

Beispiel d)

Testpackung zur Bestimmung des Aldolase-lsoenzymmuster

iestandteile:

1. 3 Fläschchen enthaltend

a) 10 ml Anti-»A«-Serum

(1 ml präzipititrt ca. 240 mU Aldolase),

b) 5 ml Anti-»B«-Serum

(1 ml präzipitiert ca. 100 mU Aldolase),

c) 5 ml Anti-»C«-Serum

(1 ml präzipitiert ca. 160 mU Aldolase).

2. Vollständiger Reagenziensatz zur Bestimmung der Aldolase-Aktivität (für ca. 25 Bestimmungen), bestehend aus:

a) 80 ml Puffer-Substratlösung
(55 mM Kollidinpuffer pH 7,4,

3 mM Fructose- 1,6-diphosphat.

0,3 mM Jodacetat),

b) 30 mg NADH₂-Dinatriumsalz, lyophilisiert,

c) 1 ml einer 2,8 M Ammoniumsulfatlösung, enthaltend:

0,25-0,30 U Glycerin-3-phosphat-

Dehydrogenase,

1,5 - 2,0 U Triosephosphat-1 somerase,

0,5-1,0 U Lactat-Dehydrogenase,

d) 80 ml physiologische Kochsalzlösung.

NADH₂ wird in 2 ml bidestilliertem Wasser gelöst, alle übrigen Reagenzien sind gebrauchsfertig.

Beispiel 2
Hexokinase

A. Isolierung und Reinigung
der Hexokinase-Isoenzyme

Aus menschlichen Organen (z. B. Herz, Niere, Lunge, Milz, Leber) werden analog zu den oben beschriebenen Methoden die Hexokinase-Isoenzyme »HKI« und »HK III« isoliert und bis zur elektrophoretischen und immunologischen Einheitlichkeit gereinigt. Neben diesen definierten Isoenzymen verbleibt in einigen Geweben eine Hexokinase-Restaktivität, die vielleicht mehreren weiteren Isoenzymen zugehört. Diese Restaktivität wird vorläufig mit »UI« (unidentifiziert) bezeichnet.

C. Bestimmung der Hexokinase-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten

Die Bestimmung erfolgt nach der von Th. Bücher, W. Luh und D. Pette in Hoppe-Sey fer/ Thierfelder: »Handbuch der physiologischen und pathologisch-chemischen Analyse«, Springer-Verlag, 1964, Band SVI, Seite 318 beschriebenen Methode.

D. Verteilungsmuster von Hexokinase-Jsoenzymen in menschlichen Organen

Aus verschiedenen menschlichen Organen werden durch Homogenisieren in eiskaltem Tris-Puffer pH 7,5 Rohextrakte hergestellt. Im klären Rohextrakt wird nach der unter c) angegebenen Methode die Hexokinase-Aktivität bestimmt. Danach werden je 1 ml des Extraktes mit

a) 0,5 ml Anti-»HK I«,

b) 0,5mlAnti-»HKIII«,

c) 0,5 ml Anti-»HK I« und0,5 ml Anti-»HK III«

versetzt und in allen Proben die NaCl-Endkonzentratiön auf 4% eingestellt. Nach Inkubation und Zentrifugieren wie oben beschrieben wird im Überstand der drei Serumproben a), b) und c) wiederum die Hexokinase-Aktivität bestimmt. Die erhabenen Werte ergeben folgende Verteilung der Hexokinase-Isoenzyme in den Geweben:

3° Organ »HK I« »HK 111«

»U I«

Summe der Aktivitäten

(in %)

35 Herz	98	0	0	98
Niere	81	0	19	100
Lunge	78	17	2	97
Milz	49	43	10	102
Leber	28	55	20	103

B. Herstellung der Antikörper
gegen die Hexokinase-Isoenzyme »HK I« und »HK III«

Analog zu den oben beschriebenen Methoden werden durch zweifache Immunisierung von Puten mit jeweils einer Emulsion von »HK I« und »HK III« mit Freundschem Adjuvans Antiseren gegen die beiden genannten Isoenzyme hergestellt.

Hierbei wird jeweils eine Menge Emulsion eingesetzt, die 10 mg der beiden reinen Isoenzyme entspricht. Der Antikörpertiter wird anhand einer Heidelberger-Kurve bestimmt. Je 1 ml der Antiseren Anti-»HK I« und Anti-»HK III« präzipitieren 8OmU Hexokinase I bzw. 65 mU Hexokinase III.

Durch Bestimmung des Isoenzymmusters in Seren von Patienten mit verschiedenen Krankheiten und Vergleich mit dem Isoenzym-Muster des Serums von Normalpersonen können — ebenso wie bei der Aldolase beschrieben — organspezifische bzw. krankheitsspezifische Differentialdiagnosen für verschiedene Krankheiten gestellt werden.

Beispiel 3 so Lactat-Dehydrogenase (LDH)

A. Herstellung der Antigene l)LDH-IsoenzymH₄( = LDH I)

2,5 kg zerkleinerter und gefrorener menschlicher Herzmuskel werden in einem Mixer mit 2 Volumina destilliertem Wasser homogenisiert und '/2 Stunde lang unter Rühren bei 4⁰C extrahiert. Das aufgeschlossene Gewebe wird in einer Kühlzentrifuge bei 5000 g abzentrifugiert und einmal mit destilliertem Wasser to nachextrahiert. Der pH-Wert der vereinigten Überstände wird mit Eisessig auf pH 4,85 eingestellt und der entstehende Niederschlag abzentrifugiert. Der pH-Wert des klaren Überstandes wird mit Natronlauge auf 7 eingestellt. Danach werden 4,5 g/l Calcium-phosphat-Gel in den Überstand eingerührt.

Nach '/2Stündigem Rühren wird das Gel abzentrifugiert und 2mal mit je 350 ml 0,3 M Phosphatpuffer pH 7,2, extrahiert (suspendieren, '/2 Stunde rühren, abzen-

709 526/358

trifugieren). Die vereinigten Extrakte werden bei 4° C bis 0,5 s mit Ammo i'iumsulfat gesättigt Anschließend wird '/σ Stunde gerü'.irL Der Niederschlag wird in einer Kühlzentrifuge bei 2;5 00t) g abzentrifugiert und verworfen. Aus dem Überstand wird die gesamte LDH-Aktivität durch weitere Zugi be von Ammoniumsulfat bis 0,65 s gefällt. Der auf d|r Kühlzentrifuge gesammelte Niederschlag wird in 4O^oiger (0,4 s) Ammoniumsulfatlösung aufgenommen. Lurch langsames Erhöhen der Ammoniumsulfatkonzen ration auf 0,6 s erhält man bereits kristalline LDH, d ;ren Gehalt an Isoenzymen 111, IV und V durch mehrfaches Umkristallisieren angereichert wird. Nun wird die LDH in 0,03 M Phosphatpuffer pH 7,2 gelöst und gegen denselben Puffer bis zur Ammoniumsulfatfreiheit dialysierL Danach wird die LDH an 15 g einer Säule auf Basis eines Anionenaustauschers mit dreidimensional vernetzten! Dextran (2 χ 60 cm Säule) Chromatographien und mit 0,03 M Phosphatpuffer pH 7,2 äquilibriert Die Elution erfolgt durch einen NaCl-Gradienten, wobei die LDH-H₄ bei einer Konzentration von 0,4 M NaCl als letztes der 5 Isoenzyme die Säule verläßt. Die LDH-H₄-Fraktion ( = Bändel) wird noch mehrmals umkristallisiert. Bei der Rechromatographie an einer Säule auf Basis eines Anionenaustauschers mit dreidimensional vernetzten! Dextran erhält man nur noch 1 einheitliche Bande. Die Ausbeute beträgt 185 mg LDH-H₄ (I) mit einer spezifischen Aktivität von 270 U/mg.

2)LDH-IsoenzymM₄( =

V)

2,5 kg zerkleinerte frische Leber werden im Mixer mit 2 Volumina destilliertem Wasser bei 4°C homogenisiert und anschließend ' h Stunde gerührt. Das aufgeschlossene Lebergewebe wird in einer Kühlzentrifuge bei 5000 g abzentrifugiert. Der pH-Wert des klaren Überstandes wird mit Essigsäure auf pH 4,8 eingestellt. Nach '/2Stündigem Rühren wird der Niederschlag abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wird mit Natronlauge neutralisiert und bei 12 000 g klarzentrifugiert. Danach werden in den Überstand 11 g/l Ca-phosphat-Gel eingerührt, um die LDH zu adsorbieren. Nach 72 Stunde wird das Gel abzentrifugiert und zweimal mit je 850 ml 0,3 M Phosphatpuffer pH 7,2 extrahiert (suspendieren, '/2 Stunde rühren, abzentrifugieren). Die vereinigten Extrakte werden bei 4°C bis 0,45 s mit Ammoniumsulfat gesättigt und '/2 Stunde gerührt. Der Niederschlag wird in einer Kühlzentrifuge bei 25 000 g abzentrifugiert und verworfen. Aus dem klaren Überstand wird die gesamte LDH-Aktivität durch weitere Zugabe von Ammoniumsulfat bis 0,65 s gefällt. Der auf der Kühlzentrifuge gesammelte Niederschlag wird in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 aufgenommen. Die LDH-Lösung wird an einer Säule von dreidimensional vernetztem Dextran (4 χ 60 cm; 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,2) entsalzt und anschließend an einer Säule auf Basis eines Anionenaustauschers mit dreidimensional vernetztem Dextran Chromatographien. Die Säule (5 χ 60 cm) enthält 60 g Dextran und ist mit 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,2 äquilibriert. Die LDH-M₄, die von dem Dextran nicht adsorbiert wird, wird mit der 1. Proteinfraktion eluiert und daraus mit Ammoniumsulfat gefällt. Der abzentrifugierte Niederschlag wird in wenig Wasser gelöst und 3 Minuten auf 72°C erhitzt. Es wird zentrifugiert und der Überstand an einer Säule von dreidimensional vernetztem Dextran entsalzt, die mit 0,005 M Trispuffer pH 7 äquilibriert ist.

Die LDH-Lösung wird nun an dreidimensional vernetztem Dextran Chromatographien (Säule 2,5 χ 60 cm; 0,005 M Trispuffer, pH 7). Die Elution der LDH-M₄ erfolgt durch einen NaCl-Graditnten (0 bis 0,2 M NaCI in 0,005 M Trispuffer pH 7). Die LDH-M₄-Fraktion wird gesammelt und die LDH daraus mit Ammoniumsulfat gefällt Der Niederschlag wird in 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,2 gelöst und die LDH-M₄ durch Fällen mit Ammoniumsulfat bis zu einer spezifischen Aktivität von 580 U/mg umkristallisiert. Die Ausbeute beträgt 135 mg LDH-M₄ (V).

B. Herstellung der Antiseren

Antikörper gegen die reinen Antigene werden nach bekannten Methoden an Hammeln gewonnen. Die Antiseren zeigen bei Analyse mit der Immundifussions-Methode nur eine Präzipitationsbande, d. h„ sie sind rein und einheitlich.

Das Immunglobulin G dieser Antiseren wird mit Hilfe von Immunadsorbentien (siehe Beispiel 10, Abschnitt B 3) gewonnen. Zur Titerbestimmung werden je 10μ1

Immunglobulin-G-Lösung (10 mg/ml) mit 50 μΙ Enzymlösung (steigende Konzentrationen; 500-5000 μg) gemischt, eine Stunde bei 37° C und 2 Stunden bei 4° inkubiert. Durch anschließende Elektrophorese (0,8% Agarose-Gel, 5,5-Diäthylbarbitursäurepuffer pH 8,6)

und enzymspezifische Anfärbung wird der Bildungstiter der lmmunglobulin-G-Fraktion nach bekannten Methoden bestimmt.

C. Verteilungsmusiter der Isoenzyme

1) Ausfällung von LDH-Isoenzymen und deren
Hybriden mit den Antiseren Anti-H₄ und Anti-M₄

Aus den reinen LDH-Isoenzymen H₄ und M₄ erhält man nach den üblichen Methoden der Hybridisierung (erhöhte Salzzugabe und Einfrieren/Auftauen sowie durch hohen Druck; die LDH-Hybriden H₃M, H₂M₂ und HM₃ und reinigt sie durch Ionenaustauschchromatographie. Die Hybriden verhalten sich in ihren immunologisehen Eigenschaften fast identisch wie die entsprechenden natürlichen isolierten Hybriden. Zur Reaktion werden 10 U der Isoenzyme und Hybriden mit den wie in Abschnitt b) beschriebenen festgelegten Mengen Antikörper-Konzentrat versetzt, es wird eine Stunde bei 37°C und 2 Stunden bei 4°C inkubiert, anschließend hochtourig abzentrifugiert und im Überstand die Restaktivität ermittelt.

Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgt nach den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie (Z. Klin. Chemie und KHn. Biochemie, 8 [1970] Seite 658).

Die Präzipitation der verschiedenen Isoenzyme und Hybriden der LDH mit den gegen LDH-H₄ und LDH-M₄ gerichteten Antiseren erfolgt mit einerr 4fachen Überschuß an Antiserum, bezogen auf die anhand der Heidelberger-Kurve ermittelten Äquivalenzmenge.

Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Tabelle

Antiserum	"/o-Auslallung der	HjM	LDH-Isoenzyme	HM3	M4
	H4	(H)	H2M2	(IV)	(V)
	(I)	96	(III)	26	<,
Anti-H4	99	9	75	98	99
Anti-M4	< ι	84

Man erfaßt durch Präzipitation mit AnU-H₄ also die LDH-Isoenzyme 1,11 und III und durch Präzipitation mit AnU-M₄die LDH-Isoenzyme III, IV und V.

2) Verteilungsmuster der LDH-Isoenzyme in verschiedenen Organen

In verdünnten Homogenaten menschlicher Organe werden nach der unter 1) beschriebenen Methode die LDH-Aktivität vor und nach Präzipitation mit Anti-H« sowie AnU-M₄ bestimmt. Zur Fällung wird ebenfalls ein 4facher Überschuß an Antiserum, bezogen auf die Äquivalenzmenge, verwendet. Parallel wird durch elektrophoretische Trennung der Isoenzyme, Anfärbung der Banden und densitometrische Auswertung dei Anteil der Isoenzyme I und V in den Organextrakten sowie die Summe der Hybriden bestimmt. Man erhält die Ergebnisse der folgenden Tabelle:

Organ	LDHl	1	Hybriden	I	LDH-V	I	2
	E	58	E	40	E	2
Herz	60	50	39	48	1	2
Niere	46	33	53	65	1	56
Gehirn	34	2	66	42	1	88
Muskel	3	1	41	U	56	37
Leber	1	5	11	58	88	27
Milz	6	5	64	68	30	18
Lunge	7	6	73	76	20
Schilddrüse	7	83	1(J

Aus den beiden Tabellen geht hervor, daß sich mit der Methode der immunologischen Isoenzym-Bestimmung primär 3 Organgruppen (Herz/Niere/Gehim, Muskel/ Leber und Milz/Lunge/Schilddrüse) mit Bevoirzugung der Isoenzyme LDH-I, LDH-V bzw. der Hybriden LDH-II, IJDH-IIl und LDHiV klar unterscheiden lassen. Sekundär sind innerhalb dieser Gruppen folgende Organ-Typen voneinander zu unterscheiden:

Herz/Niere von Gehirn (LDH-I und Hybriden) Muskel von Leber (Hybriden und LDH-V)

Milz/Lunge von Schilddrüse (Hybriden und LDH-V).

Beispiel 4 Creatin-Kinase(CK)

A. Isolierung der CK-Isoenzyme 1)CK-lsoenzym BB, Gehirntyp

1,4 kg menschliches Gehirn (18 Stunden nach Unfalltod entnommen) werden in 2,81 eiskaltem 0,05 M Tris-Puffer pH 8,0 (enthaltend 0,001 M EDTA, 0,01 M KCI, 0,02 M Mercaptoäthanol) homogenisiert und über Nacht stehengelassen. Danach wird unter starkem Rühren bei —30° mit gekühltem Aceton versetzt, bis eine Endkonzentration von 37% Aceton erreicht ist Der Niederschlag wird zentrifugiert (6-l-Zentrifuge, 8000 U/Minute, 30 Minuten) und verworfen. Der klare Überstand wird bei etwa 1 Torr und 25° eingedampft, bis das Aceton entfernt ist. Die wässerige Phase wird auf + 4⁰C abgekühlt und unter Rühren mit Ammoniumsilfat bis zu einer Sättigung von 40% versetzt Der Niederschlag wird abzentrifugiert und die Fällung im klaren Überstand nach erneuter Abkühlung mit Ammoniumsulfat bis zu einer 75%igen Sättigung fortgeführt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wird in 200 ml 0.1 M Tris-Puffer pH 8.0 (enthaltend 0,001 M EDTA und 0.02 M Mercaptoäihanol) gelöst und über Nacht bei +4° gegen 41 vom gleichen Puffer dialysiert. Das Dialysat wird auf eine Säule (12 χ 200 cm) mit einem

> Anionenaustauscher auf Basis eines dreidimensional vernetzten Dextrans (äquilibriert mit 0,1 M Tris-Puffer pH 8,0, Zusätze wie oben) gegeben. Es wird mit dem gleichen Puffer unter Zusatz von 0,1 M NaCI eluiert, bis der eiste Protein-Peak erscheint Dann wird die

■ο NaCl-Konzentration im gleichen Puffer als Gradient auf 0.4 M erhöht EHe Elutionsgeschwindigkeit beträgt 0,5 ml/Minute. Bei einer NaCI-Konzentration von 0,3 M erscheint das Isoenzym CK-BB als getrennte Fraktion. Diese wird auf einer Cellulose-Säule (6 χ 65 cm) unter gleichen Bedingungen mit einem NaCl-Gradienten von 0—0,2M rechromatographiert Anschließend wird an einer Säule (3 χ 40 cm) mit dreidimensional vernetzten! Dextran durch Ehition mit 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,0 (Zusätze wie oben) gereinigt Aus dem Eluat wird das Enzymprotein durch 75% Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgefällt und als 70%ige Ammoniumsulfat-Suspension bei 4° aufbewahrt Ausbeute: 0,6 g feuchter Niederschlag von humanem Isoenzym CK-BB.

2) CK-Isoenzym MM (Muskeltyp)

1,006 kg tiefgefrorener menschlicher Skelettmuskel werden langsam bei 20° aufgetaut und im Fleischwolf zerkleinert Das Produkt wird portionsweise in 31 0,05 M Tris-Puffer, pH 8.0 (Zusätze 0,01 M KCl, 0,001 M EDTA, 0,001 M Mercaptoäthanol) im Mixer homogenisiert und anschließend 1 Stunde unter Eiskiihlung gerührt Danach wird bei 12 000 U/Minute zentrifugiert und der Überstand durch ein Papierfilter klar filtriert. Das Filirat wird analog Abschnitt 1) aufgearbeitet (Ammoniumsulfatfällungen und chromatographische Trennungen). Ausbeute:8 ml feuchter Niederschlag von humanem Isoenzym CK-MM (Proteingehalt 1,05 g) mit einer Aktivität von 400 U/ml.

B. Herstellung von Antiseren Ziegen erhalten als Primärinjektion

e 2 mg der

Antigene zusammen mit Freunds kompletten Adjuvans intramuskulär in fünf verschiedenen Stellen des Rückens. 3 weilere Antigeninjektionen erfolgen im Abstand von jeweils 4 Wochen auf gleiche Weise 19 Tage nach der letzten Antigeninjektion wird der Ziegen durch Venenpunktion Blut entnommen und nach bekannten Methoden Serum gewonnen. Mit Hilfe von Immunadsorbentien aus Kaninchen Anti-Ziegen-Imungtobulin-Seren wird das lmmunglobu lin der Antiseren von den übrigen Serumproteiner abgetrennt Die gewonnene Immunglobulinfraktior wird bei —18° in physiologischer Kochsalzlösunj eingefroren und aufbewahrt

Vor Verwendung wird der Titer der CK-spezifischet Antikörper, wie oben in Beispiel 1 A, Abschnitt 6

beschrieben, ermittelt Man erhält Titer voi 1000-3000 μg/ml Antiserum.

Durch entsprechende Verdünnung mit lmmunglobu

Hn aus nicht immunisierten Ziegen werden anschließen« die für die praktische Anwendung erforderlichen Tite eingestellt.

C. Berechnung des Anteils von CK-Isoenzymen und -Hybriden durch Aktivitätsmessungen vor und nach Immunpräzipitation

Das Antiserum Anti-CK-MM präzipitiert das Isoen zym CK-MM vollständig; ebenso präzipitiert da

Antiserum Anti-CK-BB das Isoenzym CK-BB vollständig. Das Hybrid CK-MB wird von Anti-CK-MM im 2fachen Überschuß zu 90% präzipitiert fX=0,9), von Anti-CK-BB im 5fachen Überschuß dagegen zu 80% (V-0,8). Die Fällbarkeit des Hybrids MB durch f. Anli-CK-MM und Anti-CK-BB kann von Charge zu Charge schwanken; die resultierenden Werte für λ" und Y werden daher für jede Charge der Antiseren neu bestimmt. Durch Anwendung eines größeren Überschusses der Antiseren Anti-CK-MM und Anti-CK-BB kann das Hybrid CK-MB quantitativ präzipiert werden.

Die CK-Aktivität wird mit der optimierten Standardmethode nach den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie (Z. klin. Chem. u. klin. Biochemie, 8 [1970], Seite 658) bestimmt- ι s

Die Analyse der Isoenzyme und -Hybriden wird nach folgender Methode durchgeführt:

In einer Probe des zu untersuchenden Serums bzw.

Immunpräzipitation von CK-Isoenzymen und -Hybriden Organextrakts wird mit der oben angegebenen Methode die CK-Gesamtaktivität bestimmt. Danach wird der Rest in 3 gleiche Portionen aufgeteilt. Portion \ wird mit Anti-CK-MM versetzt (doppelte Menge der mittels Heidelberger-Kurve ermittelten Äquivalenzmenge), Portion 2 wird mit Anti-Ck-BB versetzt (5fache Menge der durch Heidelberger Kurve gegen CK-BB ermittelten Äquivalenzmenge), Portion 3 dient als Kontrolle. Danach wird inkubiert und abzentrifugiert. In abgemessenen Volumina des klaren Überstandes der Portion 1,2 und 3 wird wiederum die CK-Aktivität bestimmt, wie in Abschnitt e) beschrieben.

Da der Gehirntyp CK-BB in Lösung rasch Enzymaktivität verliert, wird sowohl bei Modellversuchen mit isoliertem CK-BB als auch bei CK-BB-haltigen Organextrakten vor der Enzymaktivitätsbestimmung 10 Minuten lajig mit 0,02 M Mercaptoäthanol vorinkubiert.

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Zusammensetzung der	MB	Probe	BU	Σ	Rcstaktivitiit	nach Prä/ipitation	mil den Antiseren	ge Tun de η
(U/l)				300	(U/l)			290
MM	0		0	300	Anti-MM		Anti-BB	225
	100		0	300	Thorie	gefunden	Theorie	<10
300	0		300	500	0	<10	300	25
200	100		200	300	10	10	220	120
0	100		100	300	305	0
0			210	200	20
100			120	120	110

Die Anteile der Isoenzyme MM und BB sowie der Anteil der Hybride MB können bei bekanntem Wert für X und Y aus den Aktivitätsbestimmungen mit Anti-CK-MM und Anti-CK-BB errechnet werden. Es gelten (G=Gesamtaktivität vor Immunpräzipitation; RMM = Restaktivität nach Präzipitation mit Anti-MM-, RBB = Restaktivität nach Präzipitation mit Anti-BB):

Anteil MB = -

G - RMM - RBB

X + Y- 1

(U/l)

Anteil MM= RBB -(I - K)MB (U/l)
Anteil B3 = RMM - (1 - X) MB (U/l)

D. Bestimmung von CK-Isoenzymen bzw. -Hybriden in Organextrakten und Seren

Mit Hilfe der in Abschnitt c) dargestellten Methode wird in Extrakten menschlicher Organe und in Humanseren der Anteil der CK-Isoenzyme bzw. -Hybriden bestimmt:

MM

MB

BB

Organextrakte

Skelettmuskel
Herz
Gehirn
Lunge

Humanseren

Normal (1)
Herzinfarkt (2)

91	<2	<2
69	37	<2
<2	<2	92
50	17	30
96	<5	<5
72	31	<5

MM

MB

Muskeldystrophie (3)
(Duchenne-Typ)

100

<5

(1) CK-Aktivität des Serums 36 U/l

(2) CK-Aktivitäl des Serums 380 U/l

(3) CK-Aktivität des Serums 170 U/l

E. Testpackung zur quantitativen Bestimmung

derCreatinkinase-Isoenzyme MM, MB und BB

in Körperflüssigkeiten und Organextrakten

1) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 10 χ 4 Aktivitätsbestimmungen (pro Serum 4 Bestimmungen: 1 Bestimmung der Gesamtaktivität, je 1 Bestimmung nach Präzipitation mit Anti-MM- bzw. Anti-BB-Serum, 1 Bestimmung als Bezugswert für die Aktivität nach Inkubation). Die Packung enthält: 1 Flasche Puffer-Sub strat-Lösung für 40 Bestimmungen, 1 Flasche Anti-CK MM-Serum, 1 Flasche Anti-CK-BB-Serum, 40 Flascher mit lyophilisiertem Reagenz für je 1 Bestimmung.

Puffer-Substrat-Lösung
Die gebrauchsfertige Reagenzlösung pH 7,0 enthält:

Triäthanolamin-acetat

Glucose

Magnesiumacetat

105 inM
21 mM
10,5 mM

Anti-CK-MM-Serum

1 ml Antiserum, Titer 1000 y/ml, Endkonzentration an NaCl = 5%.

Anti-CK-BB-Serum

5 ml Antiserum, Titer 2500 y/ml, Endkonzentration an NaCl = 5%.

Testreagenz
Jede Flasche enthält:

Creatinphosphat-Dinatriumsalz,

Hexahydrat 26,69 mg

Glutathion reduziert 5,8 mg

Adenosinphosphat, Dinatriumsalz 1,04 mg

Nicotinamid-adenin-dinucleotid-

phosphat, Dinatriumsalz 0,99 mg

Adenosin-monophosphat,

Dinatriumsalz 8,21 mg

Hexokinase 3 U

Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase 3 U

2) Ausführung der Bestimmung
Immunpräzipitation

3 Ansätze zu je 0,5 ml Serum (bzw. andere Körperflüssigkeit) + 0,25 ml 7,5%ige NaCl, zumischen in je einen Ansatz: je 0,05 ml Anti-CK-MM, Anti-CK-BB, dritter Ansatz 0,05 ml physiol. NaCl-Lösung.

30 Minuten bei 25°, anschließend 12 Stunden bei 4° inkubieren. Ansätze 10 Minuten bei 10 000 U/Minute zentrifugieren, klaren Überstand abpipettieren.

Aktivita" tsbestimmung

entsprechend nachfolgendem Schema in je eine Flasche mit lyophilisiertem Reagenz pipettieren:

Flasche 1	Flasche 2	Flasche 3	Flasche 4
Gesamtaktivität	Serum-Blindwert	Aktivität nach	Aktivität nach
		Präzipitation MM	Präzipitation MB
(in ml)	(in ml)	(in ml)	(in ml)

Puffer-Substrat 2,0 2,0

Serum 0,1

Serum nach Inkubation - 0,1

Überstand nach Präzipitation MM - -

Überstand nach Präzipitation MB -

Ansätze mischen, 10 Minuten bei 25° inkubieren, danach in eine Küvette gießen und bei 25° die Extinktionsänderung 5 Minuten lang messen. Wellenlänge 334 nm. Schichtdicke 1 cm.

Die Berechnung der Anteile an CK-MM, -MB und -BB erfolgt mit Hilfe der in Abschnitt c) angegebenen Formeln.

Beispiel 5
Alkalische Phosphatase (A P)

A. Herstellung der Antigene
1) Dünndarm-Isoenzym

1,1 kg tiefgefrorener menschlicher Dünndarm werden aufgetaut und zerkleinert, mit 9 Liter 0,05 M Tris/HCl-Puffer pH 7,6 versetzt und mit einem Mixer homogenisiert Zum Homogenat werden im Verlauf von 1 Stunde langsam 3 Liter n-ButanoI gegeben, und die Mischung wird anschließend durch Zentrifugation (30 Minuten/ 10 000 g) geklärt Aus dem Überstand wird das Protein durch Zugabe von 26,6 Liter Aceton (70 Volumprozent) ausgefällt, durch Filtration abgetrennt und in 500 ml des oben genannten Puffers gelöst Diese Lösung wird einer fraktionierten Ammoniumsulfat-Fällung unterworfen. Das zwischen 50 und 60% Ammoniumsulfat-Sättigung ausgefällte Enzyi* wird in 80 ml 0,1 M Tris/HCI-Puffer pH 7X der zusätzlich 5% Sucrose sowie 1 mM ZnCl₂ enthält, gelöst und über eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Säule (4 χ 80 cm) von dreidimensional vernetzten! Dextran mit geringem Vernetzungsgrad chromatographiert

Die enzymatisch aktiven Fraktionen des Eluates werden vereinigt und durch Einrühren von festem 2,0

0,1

2,0

0,1

Ammoniumsulfat auf eine 70°/oige Sättigung gebracht. Die Mischung wird 1 Woche bei 4°C aufbewahrt und der Enzym-Niederschlag bei 12 000 U/Minute in der Kühlzentrifuge abgeschleudert.

Zur Abtrennung einer mit den Antiseren gegen andere Isoenzyme der alkalischen Phosphatiase kreuzreagierenden Fraktion (Anteil etwa 20% am Enzymprotein) wird das Enzymprotein in 40 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer pH 7,2 (enthaltend 1 mM ZnCl₂) gelöst und auf einer Säule (Größe 2 χ 60 cm) auf Basis eines Anionenaustauschers mit dreidimensional vernetztem Dextran chromatographiert. Die Elution erfolgt mit einem Tris-HCl-Puffer pH 7,2, der NaCI im Gradienten von 0,05 M aufwärts enthält. Nach einer enzymatisch aktiven Vorfraktion, welche die unerwünschten Anteile der Dünndarm-AP enthält, wird die Hauptfraktion eluiert Diese wird durch Rechromatographie im gleichen System gereinigt

Die Fraktionen werden mit festem Ammoniumsulfat auf 70% Sättigung gebracht und die Suspension des Dünndarm-Isoenzyms der Alkalischen Phosphatase anschließend bei 4° C aufbewahrt Die spezifische Aktivität beträgt 30 U/mg, die Ausbeute beträgt 75 mg Enzymprotein.

2) Andere Isoenzyme
Analog zu 1) werden folgende Isoenzyme hergestellt:

Alkalische Phosphatase aus Placenta
Alkalische Phosphatase aus Leber
Alkalische Phosphatase aus Niere
Alkalische Phosphatase aus Knochen

709 526/358

Bei der Präparation aus Knochen wurde als zusätzlicher Reinigungsschritt die Methode der Isoelektrischen Dünnschicht-Fokussierung angewendet (B. J. R a d ο 1 a, Biochim. Biophys. Acta, Band 194, 335-338 [1969]).

B. Herstellung der Antiseren

1) Antiserumi gegen das gereinigte

Dünndarm- Isoenzym aus Hammeln

Jeweils 2 mg des Antigens in Form der dialysierten ι ο Lösung werden mit Freundschem Adjuvans intramuskulär in fünf verschiedene Regionen des Rückens von Hammeln injiziert. 30 Tage später erfolgt eine 2. Injektion auf die gleiche Weise. 19 Tage danach wird nach bekannten Methoden Blut abgenommen und Serum gewonnen. Alle 2 bis 3 Monate erfolgt eine weitere Boosterung mit je 2 mg des dialysierten Antigens in Freundschem Adjuvans. Blut wird dann jeweils 19-21 Tage nach der Boosterung entnommen. Der Titer der Antiseren wird anhand einer Heidelberger-Kurve ermittelt. Gut präzipitierende Antikörper erhält man schon nach der 2. Boosterung.

2) Antiseren gegen die anderen Isoenzyme

In analoger Weise werden Antiseren gegen die unter A 2) genannten Isoenzyme hergestellt.

3) Immunspezifische Aufreinigung der Antiseren

Die Antiseren werden durch Inkubation bei 56°C während 30 Minuten inaktiviert und dekomplementiert. Danach werden die Antiseren durch immunspezifische Adsorption von kreuzreagierenden Antikörpern gereinigt. Hierzu wird jedes Antiserum über Säulen der verschiedenen nicht zugehörigen, trägergebundenen Antigene filtriert. (Die trägergebundenen Antigene wurden durch Umsetzung der entsprechenden AP-Antigene mit Cellulosehydrazid, welches zuvor mit Divinylsulfon aktiviert war, hergestellt.) Der Titer der resultierenden Antiseren läßt sich mit Hilfe von Heidelberger-Kurven ermitteln und wird mit inaktivierten Seren unbehandelter Tiere so eingestellt, daß pro Analyse 0,1 ml Antiserum benötigt werden. Die Antiseren werden bei - 20°C aufbewahrt.

C. Verteilung der AP-Isoenzyme
in verschiedenen Geweben und Serum

Die Analyse wird nach der im Abschnitt D. beschriebenen Methode durchgeführt. Nachfolgende Tabelle enthält die Aktivitäten der Alkalischen Phosphatase in verschiedenen Extrakten menschlicher Gewebe und Humanseren nach Präzipitation mit den Antiseren.

Immunpräzipitation von AP-Isoenzymen in Extrakten menschlicher Gewebe und in Seren

Organextrakt	Gesamt	Reaktivität	nach Präzipitation	mit den Anliseren	Niere	Knochen
	aktivität				800	810
	(U/l)	(U/l)			520	510
		Anti-AP			800	870
		Placenta	Dünndarm	Leber	35	680
Placenta	800	10	780	810	380	15
Dünndarm	500	475	25	500
Leber	900	910	890	40	60	75
Niere	700	690	710	610	55	290
Knochen	400	405	390	380	155	165
Seren
Normal (Mann)	90	90	80	55
Nephritis	300	300	285	270
Leber-Metastasen	180	180	170	50

Kontrollversuch:

Die Gesamtaktivität der Alkalischen Phosphatase aus den beschriebenen Organen und Seren wird durch ein Gemisch aus gleichen Anteilen der fünf Antiseren quanti tativ präzipitiert.

D. Testpackung zur quantitativen Bestimmung von AP-Isoenzymen in Körperflüssigkeiten

1) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 4 Bestimmungen des Isoenzymmusters in Körperflüssigkeiten bzw. Extrakten. Sie enthält:

24 Flaschen mit je 2 ml gebrauchsfertiger Pufferlösung (1000 mM Diäthanolamin, 0,5 mM Magnesiumchlorid pH 9,8).

24 Substrattabletten (20 μΜοΙ p-Nitrophenylphosphat) je 1 Flasche Antiserum und inaktives Hammelserum mit 0,5 ml.

2) Durchführung der Bestimmung
Immunpräzipitation

Mischen:

In 6 getrennten Ansätzen je 0,1 ml Serum (bzw.

Organextrakt bzw. andere Korperflüssigkeit) mit je 0,1 ml der Antiseren Anti-AP-PIacenta (II), Anti-AP-Dünndarm (III), Anti-AP-Leber {TV), Anti-AP-Niere (V), Anti-AP-Knochen (VI) und inaktiviertem Hammelserum versetzen.

Inkubieren:

1 Stunde bei 37°, über Nacht bei 4°; danach 10 Minuten bei 10 000 U/Minute abzentrifugieren, klären Oberstand abpipettieren.

Aktivitäts-Bestimmung

In je 1 Flasche Pufferlösung eine Substrattablette geben, bei 25° 5 Minuten lang stehenlassen und danach das Substrat durch Umschütteln vollständig auflösen.

Danach in die Flaschen I bis VI nach folgendem Schema pipettieren:

Flaschen (ml) I II

IH

IV

VI

Probe (Serum etc. + inaktives 0,02

Hammelserum)

Überstand Präzipitation - 0,02

Anti-AP-Placenta

Anti-AP-Dünndarm

Anti-AP-Leber

Anti-AP-Niere

Anti-AP-Knochen

Ansätze mischen, sofort in eine auf 25° temperierte änderung 3 Minuten lang messen.
Wellenlänge 405 mm, Schichtdicke 1 cm.

3) Berechnung

Für jeden Ansatz die Extinktionsänderung pro Minute ( I E/min) berechnen.

25 Isoenzym-Aktivität der Proben II bis VI

/min\
/min/

= f ' - "TFT^ J' ¹⁰° (^{% der} Gesamtaktivität), \ l£₍/min/

IE₁ = Extinktionsänderung der Probe I (Gesamtaktivität),
\E_X = Extinktionsänderung der Proben II bis VI

(jeweilige Isoenzymaktivität).

Beispiel 6
Glutamat-Oxalacetat-TransaminaseiGOT)

A. Herstellung der Antigene

0,02

0,02

0.02

0,02

Küvette gießen und nach 1 Minute Extinktions-

40

500 g zerkleinerter und gefrorener menschlicher Herzmuskel werden in 0,25 M Sucroselösung suspendiert und in einem Mixer homogenisiert. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei 8000 g erhält man ein Sediment, das auf mitochondriale GOT aufgearbeitet wird. Der Überstand der Zentrifugation dient zur Isolierung der cytoplasmatischen GOT.

1) Mitochondriale GOT (GOT-M)

Das Sediment der Zentrifugation wird in destilliertem Wasser aufgenommen, gegen destilliertes Wasser dialysiert urid anschließend durch Zusatz von Natriumsalz des oc-Ketoglutarats auf eine Konzentration von 0,4 mM gebracht Es wird darauf 10 Minuten auf 60° C erhitzt und dann auf 5⁰C abgekühlt Die geklärte Lösung wird einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung unterworfen. Die Fraktion von 0,5 bis 0,7 s enthält die Enzym-Aktivität Nach Dialyse gegen 5mM Tris-Acetat-Puffer pH 7,5 wird die Lösung an einer Cellulose-SUule (2 χ 30 cm), die zuvor mit 5mM Tris-Acetat-Puffer pH 7,5 äquilibriert war, chromatographiert Verunreinigende cyctoplasmatische GOT tritt sofort aus der Säule aus, die Hauptaktivität GOT-M wird dagegen adsorbiert Durch Erhöhen des Puffers auf eine Konzentration von 100 mM wird die GOT-M von der Säule eluiert Durch Dialyse gegen gesättigte Ammoniumsulfatlösung fällt das Enzym aus. Der Niederschlag wird in 0,3 M Maleatpuffer pH 6,0 gelöst und durch Zusatz von Ammoniumsulfat (0,75 s) erneut ausgefällt. Das Isoenzym GOT-M wird durch Rechromatographie im gleichen System vollständig gereinigt.

2) Cytoplasmatische GOT (GOT-C)

Der Überstand der Zentrifugation wird, wie unter 1) beschrieben, der Dialyse, dem Hitzeschritt und der Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Nach Dialyse gegen 5 mM Tris-Acetat-Puffer pH 7,5 wird die Enzymaktivität an einer Cellulose-Säule, wie unter 1) beschrieben, Chromatographien. Die Hauptaktivität der GOT-C tritt sofort aus der Säule aus, verunreinigende GOT-M wird adsorbiert. Anschließend erfolgt Dialyse, Ammoniumsulfatfällung und Rechromatographie, wie es für die GOT-M in Abschnitt 1 beschrieben wurde.

B. Herstellung der Antisercn

Spezifische Antiseren gegen die Isoenzyme GOT-M und GOT-C werden in Hammeln folgendermaßen gewonnen:

Jeweils 2 mg eines GOT-Isoenzyms werden intramuskulär mit Freunds kompletten Adjuvans in sechs verschiedene Regionen des Rückens injiziert. Im Abstand von jeweils 4 Wochen erfolgen drei weitere gleichartige Injektionen.

21 Tage nach der letzten Injektion wird nach bekannten Methoden Blut entnommen und Serum gewonnen. Alle 2-3 Monate erfolgt eine Boosterung mit jeweils 2 mg des Antigens in imkomplettem Freundschen Adjuvans (ohne Zusatz abgetötete Mycobacterien). Die Blutentnahme findet jeweils am 20. Tag nach der Injektion statt Die Titer der Antiseren werden anhand einer Heidelberger-Kurve ermittelt Alle Antiseren mit gut präzipitierenden Antikörper (alle Seren, die nach de~ zweiten Boosterung bzw. später gewonnen wurden) werden nach der Titration mit Hilfe von Schafnormalserum verdünnt Die Antiseren werden auf einen Titer von 1000 μg/ml eingestellt

C. Bestimmung der Isoenzym-Aktivitäten
1) Immunpräzipitation

Serum wird im Verhältnis von 3+1 mit 10%iger Natriumchloridlösung versetzt Dieses Serumgemisch wird nach folgendem Schema eingesetzt:

' If--

Ansatzschema

Ansatz

Serumgemisch

(ml)

Anti-M
(ml)

Anti-C

(ml)

Verdünnungsfaktor V

UO
1,0
1,0

0,05

0,05

1,00 1,05 1,05

Bei Seren über 30 U/l
durchgeführt

wird eine zusätzliche Fällung

1,0
1,0

0,1

0,1

1,1 1,1

Präzipitation

Die Ansätze werden in Eppendorf-Gefäße pipettiert, gut gemischt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Danach läßt man mindestens 3 Stunden im Kühlschrank abkühlen, zentrifugiert alle Proben scharf ab und bestimmt im klaren Überstand die Enzymaktivität.

2) Aktivitätsbestimmung

Es wird nach der in Z. klin. Chem. klin. Biochem. 8,658 (1970) empfohlenen Testvorschrift gearbeitet. Die bndkonzentrationen der Reagenzien im Test sind:

80 mM Kalium-Phosphatpuffer pH 7,4 200 mM Aspartat, Natriumsalz

12 mM a-Ketoglutarat, Natriumsalz 0,18 mM NADH₂

> U U/ml LDH
>0,6 U/ml MDH

Folgende Lösungen werden angesetzt: Puffer-Substrat-Enzym-Lösung:

96 mM Kalium-Phosphat-Puffer pH 7,4 240 mM L-Aspartat, Natriumsalz

> 1,5 U/l Lactat-Dehydrogenase

> 0,75 U/l Malat-Dehydrogenase

Ketoglutarat-Lösung:

865 mM «-Ketoglutarat, Natriumsalz Coenzym-Lösung:

13 mM NADH₂

Diese Lösungen werden nach folgendem Pipettierschema eingesetzt:

Puffer-Enzymlösung 3,00 ml Überstand von 1,2,3 und 2a, 3a 0,5 ml Coenzymlösung 0,05 ml

Mischen, etwa 5 Minuten bei 25° C stehenlassen Ketoglutarat-Lösung 0,05 ml

Sofort mischen, die UV-Messung mindestens 5 Minuten lang bei 25° C registrierend am Schreiber verfolgen. (Wellenlänge 340 oder 366 nm), Schichtdicke 1 cm. Aus dem linearen Teil der Meßkurve Δ £7min entnehmen.

Berechnung:
Volumenaktivität

= 1 E/min (366 nm) · 2180· 1,33 V (U/l)

^s Volumenaktivität

I E/min (340 nm)

1160· 1.33· V (U/l).

3) Berechnung der Anteile der Isoenzyme

Die Aktivität des Ansatzes 1 ist der Bezugswert. Von diesem Wert werden die anderen Aktivitäten abgezogen. Bei zwei Ansätzen mit dem gleichen Antiserum wird jeweils der Ansatz mit der kleineren Überstandsaktivität zur Berechnung herangezogen.

GOT-C = Aktivität 1 - Aktivität 3 oder 3a. GOT-M = Aktivität 1 — Aktivität 2 oder 2a.

D. Verteilung der GOT-lsoenzyme in Organextrakten und Seren (human)

Mit Hilfe der in Abschnitt C. beschriebenen Methode wurde die Aktivität der GOT-lsoenzyme in einem Extrakt aus Humanleber (verdünnt mit 80 mM Phosphatpuffer pH 7,4) und verschiedenen Humanseren bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Probe	Enzymaktiviläten	GOT-C	(%)	GOT-M	(%)
	Gesamt- GOT	(U/l)	57	(U/l)	43
	(U/l)	1400	70	1060	30
Leber-Extrakt	2460	7	94	3	6
Serum normal	10	414	69	2d	31
Serum akute Hepatitis	440	22		10
Serum chronische 40 Hepatitis	32	Beispiel 7 Aldolase

A) Herstellung der Aldolase-Isoenzyme

Die Herstellung von Aldolase A und Aldolase B erfolgt nach Beispiel IAl, lA2a und b). Zur Isolierung der Aldolase »C« wird folgendermaßen verfahren:

1,5 kg menschliches Hirn werden mit 41 0,01 M Tris/HCl (1 mM EDTA, 1 mM Dithioerythrit) pH 7,5 bei 2—5° C homogenisiert und das Homogenat anschließend 2 Stunden bei 10 000 g zentrifugiert Der Überstand wir4 unterhalb von 0°C einer Acetonfraktionierung unterworfen, wobei die Hirn-Aldolase zwischen 34 und 46VoL-% Aceton präzipitiert Der Niederschlag wird in 0,05 M Tris/HCl (1 mM EDTA, 1 mM Dithioerythrit) pH 7,5 gelöst und auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Cellulose-Säule (6 χ 30 cm) aufgetragen. Zunächst wird mit Startpuffer ausgewaschen. Durch Zusatz von 1 mM Fructose-l,6-diphosphat zum Waschpuffer werden dann in einem scharfen Peak Aldolase Ci zusammen mit den Hybriden A₃C und A2C2 eluiert Nach Dialyse der aktiven Eluate gegen 0,01 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 (0,1 mM Dithioerythrit) wird zur Abtrennung der Hybride eine Chromatographie an einer Säule auf Basis eines Anionenaustauschers mit dreidimensional vemetztem Dextran angeschlossen (linearer Gradient 0-03MNaQ).

Die Reinigung der 3 Aldolasetypen durch präparative Elektrofokussierung und die Kristallisation erfolgt wie oben in den Beispielen 1 A3 ur.d 1 A4 angegeben.

B) Herstellung der Antiseren s

1. Immunisierung

2-5 mg Aldolase-Isoenzyme werden Schafen als Primärinjektionen intramuskulär mit Freunds komplettem Adjuvans in 5 verschiedene Regionen des Rückens injiziert. Jeweils im Abstand von mehreren (mindestens 3) Wochen erfolgen weitere gleichartige Injektionen. Etwa 5 Wochen nach der letzten Injektion wird zur Boosterung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen jeweils 3 mg Antigen in 0,85% NaCl intravenös injiziert ,₅ Sieben Tage später wird das Antiserum präprrativ isoliert.

2. Anreicherung der Antiseren

Die erhaltenen Antiseren werden zunächst 30 Minuten auf 56° erhitzt und anschließend sofort abgekühlt Zur Anreicherung der Antikörper werden die Antiseren mit gesättigter, auf pH 6,8 neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung auf 40% Sättigung gebracht (0°C). Der Niederschlag wird gewaschen und gegen 0,02 M Phosphatpuffer pH 8,0 dialysiert. Es folgt eine Chromatographie an einem Cellulose-Anionenaustauscher in dem gleichen Puffer. Die so erhaltene einheitliche Proteinfraktion besteht aus fast reinem ImmunglobulinG.

3. Immunspezifische Reinigung der Antiseren
Herstellung der Imniunadsorbentien

5 g Cellulose-hydrazid werden in 95 ml 0,1 M NaHCC>3 kolloidal gelöst, mit 4 ml Glutardialdehyd versetzt und der pH-Wert mit 5 N-NaOH auf 9,0 eingestellt. Nach 60 Minuten erhält man bei 20° ein festes Gel, das zerkleinert, mit destilliertem Wasser auf einer Fritte ausgewaschen und dann durch ein Sieb der Maschenweite 0,8 mm gedrückt wird. Nach Waschen mit 0,2 M Triäthanolamin/HCl-Puffer pH 8,0 wird das feuchte Gel (Menge 93 g) zu einer dialysierten Lösung von 300 mg Aldolase A in 120 ml desselben Puffers (enthaltend 1 mM EDTA) gegeben und 24 Stunden bei 0° gerührt. Danach wird nicht gebundene Aldolase durch Auswaschen mit 1) 0,2 M TRIS/HCl-Puffer pH 8,0 (enthaltend 0,5 M NaCl und 1 mM EDTA), 2) 0,01 M TRIS/HCl-Puffer pH 7,5 (enthaltend 1 mM EDTA und 2 mM Dithioerythrit) entfernt.

Analog werden Immunadsorbentien mit trägergebundener Aldolase B (5 g Cellulosehydrazid und 300 mg Enzym) und trägergebundener Aldolase C (1 g Cellulosehydrazid und 50 mg Aldolase C) hergestellt.

Reinigung der Antiseren

Die Immunadsorbentien werden mit physiologischer Kochsalzlösung (enthaltend 0,02% Natriumazid) ausgewaschen und in Säulen von 0,9 χ 27 cm Größe gepackt. Die zu reinigenden Anti-ALD-A-Seren werden über Säulen mit trägergebundener Aldolase B und trägergebundener Aldolase C geleitet. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 2,3 ml/Stunde. Die Eluate werden bei 4°C in Fraktionen von 1,6 ml gesammelt und mit Hilfe der passiven Hämagglutination auf ihre Reinheit getestet. Alle nicht mit Aldolase B und Aldolase C kreuzreagierenden Fraktionen werden vereinigt.

Analog werden Anti-ALD-B-Seren über Säulen mit trägergebundener Aldolase A und Aldolase C sowie Anti-A LD-C-Seren über Säulen mit trägergebundener Aldolase A und Aldolase B gereinigt Es werden Antiseren mit folgenden Titern erhalten:

Anti-ALD-A und Anti-ALD-B = 2 mg/ml, Anti-ALD-C= 1.2 mg/ml.

C) Analyse der Antiseren

Der Titer der Antiseren wird in an sich bekannter Weise mit Hilfe von Heidelberger-Kurven bestimmt, die durch Kombination von Präzipitationsmessungen und Enzymaktivitätsbestimmungen gewonnen werden.

D) Quantitative Differenzierung der Aldolase-Isoenzyme in biologischen Flüssigkeiten

Nachfolgende Vorschrift gilt für die Bestimmung in Humanseren; andere biologische Flüssigkeiten können nach entsprechender Vorbereitung analog eingesetzt werden.

1. Immunpräzipitation

Serum im Verhältnis 2 + 1 mit einer 7,5%igen wässerigen Kochsalzlösung, die 6% Polyäthylenglycol enthält, mischen. Diese Serummischung nach folgendem Schema einsetzen:

Ansatz	Serum-	Anti-A	Anti-B	Anti-C	Verd.
Nr.	Gemisch				Faktor
	(ml)	(ml)	(ml)	(ml)	(V)

alle	Seren
1	1
35 2	1
3	1
4	1

0,020

0,020

0,020

zusätzlich bei Gesamtaktivitäten bis 10 U/l

2a 1 0,050

3a 1 - 0,050

1,00 1,02 1,02 1,02

1,05 1,05

oder zusätzlich bei Gesamtaktivitäten über 10 U/l

2b 1 0,100 - - 1,10

3b 1 - 0,100 - 1,10

Ansätze in Küvetten pipettieren, mischen, 1 Stunde bei 37° inkubieren, 3 Stunden auf -5° kühler, und abzentnfugieren. In 0,3 ml des Überstandes Aldolase-Aktivität bestimmen.

2. Aktivitätsbestimmung

Die Messungen werden in einem Photometer vorgenommen. Bei Aldolase-Aktivitäten von <5U/I wird bei 334 nm gemessen, bei Aktivitäten von >5 U/l bei 366 nm.

Reagenzien

Puffer-Substrat:

55 mM Collidin pH 7,4

0,3 mM Jodacetat

4 mM Fructose-1,6-diphosphat

Coenzym:

15 mM NADH₂

Hilfsenzyme:

03 U/ml Glycerin^-phosphat-dehydrogenase
1,7 U/ml Triosephosphat-isomerase
0,7 U/ml Lactat-dehydrogenase

Ansatz
In 1-cm-Küvetten pipettieren:

2,50 ml Puffer-Substrat

(vortemperiert auf 37°)
0,05 ml NADH-Lösung
0,01 ml Hilfsenzyme
0,30 ml Serum bzw. Überstand

Durchführung

Mischen, 5 Minuten bei 37° inkubieren und Δ El 20 Min. ablesen. Bei hohen Aldolase-Aktivitäten geradlinigen Kurventeil auf 20 Minuten extrapolieren oder Überstand verdünnen, messen und mit Verdünnungsfaktor umrechnen.

Die Berechnung der Enzymaktivitäten wird nach der in Beispiel IB angegebenen Formel vorgenommen. Diese Formel vereinfacht sich bei Messung in 1-cm-Küvetten

a) bei 366 nm:

Volumenaktivität (U/l) = AE- 44,4 · V

b) bei 334 nm:

Volumenaktivität(Wl)=AE- 24,4 · V

Berechnung der Isoenzym-Anteile

Die Aldolase-Aktivität des Ansatzes 1 ist der Bezugswert. Von diesem Wert die anderen Aktivitäten abziehen. Von den je 2 Ansätzen nach Präzipitation mit Anti-A und Anti-B jeweils den Ansatz mit der kleineren Aldolase«Aktivität im Überstand zur Berechnung verwenden.

Aldolase A:

Aktivität 1 minus Aktivität 2,2a oder 2b
Aldolase B:

Aktivität! minus Aktivität 3,3a oder 3b
AldolasiiC:

Aktivität 1 minus Aktivität 4 oder 4a

E) Präzipitationskurven für Aldolase-Isoenzyme

Humanseren oder andere biologische Flüssigkeiten werden durch Zugabe der reinen Human-ALD-Isoenzyme A, B und C so eingestellt, daß Proben mil ALD-Gesamtaktivitäten von 5, 10 und 20 U/l mit folgenden Isoenzym-Verteilungen vorliegen:

a) ~ 20% Aldolase A, ~ 80% Aldolase B
bj -50% Aldolase A, -50% Aldolase B
c) -80% Aldolase A, -80% Aldolase B

Der Gehaltan ALD wird stets auf 0- 10% eingestellt.

Das Serum wird im Verhältnis 2+1 mit einer 7,5%igen wässerigen Kochsalzlösung, die 6% Polyäthylenglycol enthält, gemischt. Zu je 1 ml dieser Mischung gibt man jeweils steigende Mengen der Antiseren gegen die Isoenzyme A, B und C und präzipitiert nach Vorschrift. Die Messung der Aktivitäten und Auswertung erfolgt analog der Vorschrift in Abschnitt D. Anhand der erhaltenen Kurven können die verschiedenen Chargen der ALD-Antiseren so eingestellt werden, daß bei quantitativer Bestimmung der ALD-Isoenzyme nach der obigen Vorschrift trotz unterschiedlicher Verteilungsverhältnisse der Isoenzyme in verschiedenen Seren mit konstanten Volumina von Antiseren gearbeitet werden kann.

F) Ergebnisse:

Organverteilung der Aldolase-Isoenzyme
in menschlichen Geweben

Organ	Anteil	der Isoenzyme (%)	C	Σ
	A	B	0	87
Leber	23	64	0	99
Skelettmuskel	99	0	0	102
35 Herzmuskel	71	31	20	108
Gehirn	88	0	7	99
Niere	46	46	12	89
Lunge	67	10

G) Ergebnisse:

Verteilung der Aldolase-Isoenzyme
in normalen und pathologischen Humanseren

Zuerst werden normale Humanseren durch Zusatz der reinen Aldolase-Isoenzyme auf bekannte Gehalte ^4:> der einzelnen Isoenzyme eingestellt und danach analysiert.

Bestimmung der ALD-Isoenzyme in Seren mit bekannter Isoenzym-Verteilung

Serum	Enzymaktivitäten (U/l)	gefunden	ALD-B	gefunden	ALD-C	gefunden
Nr.	Gesamt ALD-A		soil		soll
	soll

1	14,7	14,0	14,2	0,7	0,8
2	12,3	0,3	0,2	12,0	11,9
3	6,5	<0,l	<0,l	<0,l	<0,l

6,5

0,1
0,1
6,0

Die Ergebnisse der Bestimmung an normalen und pathologischen Humanseren sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Aus den Daten ergibt sich ein wichtiges Ergebnis: Die Organspezifität der ALD-Isoenzymmuster ist so groß, daß noch bei Seren mit ALD-Aktivitäten im Normalbereich Organerkrankungen nachgewiesen werden können. Erklärung: Die Obergrenze des Normalbereiches für (Gesamt-)Aldolase im Human-Serum ist 3 U/l; d. h.: 96% aller gesunden Personen haben (Gesamt-)Aldolase-Aktivitäten bis zu 3 U/l im Serum (2,1% der Gesunden haben Aktivitäten über 3 U/l). Ein Analysenergebnis von 3 U/l Aldolase ist demnach noch »normal«. Aus den Daten ist zu ersehen, daß auch bei klinisch stummen Hepatitiden, bei denen die Gesamt-Aldolase-Aktivität (noch oder schon wieder) im Normalbereich ist, in der Isoenzym-Verteilung eindeutig ein Hepatitis-Muster erkannt werden kann (Seren Nr. 6).

35 * '

Verteilung der Aldolase-lsoenzyme Humanseren (n. b.: nicht bestimmt)

Nr.	Serum	Gesamt-Aktivitüt	Aldolase A	Alsolase B	Alsolase C	Mittel	Summe
		(U/l)	(%)	(%)	(%)	(%)
1	Normal	1,6	71	40	0	111
2	Normal	2,4	68	38	n. b.	(106)
3	Infarkt	2,6	77	23	8	108
4	Infarkt	6,0	89	9	n. b.	(98)
5	Infarkt	15,6	87	6	8	101
6	Hepatitis	3,0	31	68	3	102
7	Hepatitis	3,4	24	77	3	104
8	Hepatitis	4,4	21	74	1	96
9	Hepatitis	4,7	25	79	I	105
10	Hepatitis	7,0	21	79	n. b.	(101)
11	Hepatitis	7,8		63	1	97
12	Hepatitis	9,0	21	84	n. b.	(105)
13	Hepatitis	17,1	7	92	5	104
					102

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur organ- bzw. krankheitsspezifi-•schen Bestimmung des Isoenzymmusters eines in multiplen Molekularformen auftretenden Enzyms in einer Probe einer menschlichen Körperflüssigkeit, eines Gewebeextraktes bzw. eine. Ausscheidung durch quantitative Messung der Enzym-Gesamtaktivität, anschließende Präzipitation der einzelnen ι ο Isoenzyme mit homologen, vermittels von menschlichen Iscenzym-Antigenen gewonnenen Antiseren, vollständige Entfernung der jeweils gebildeten Präzipitate, Messung der verbleibenden Enzymaktivitäv mit einem an sich bekannten Mittel zur Enzymaktivitätsbestimmung und Vergleich der Enzym-Gesamtaktivität mit den sich nach Entfernen der Präzipitate ergebenden restlichen Enzymaktivitäten, dadurch gekennzeichnet, daß man alle diagnostisch relevanten Isoenzyme des Isoenzymmusters mit jeweils einem bis zu lOfachen Überschuß von zu 95 bis 100% präzipitierenden, homologen, vermittels von reinen Isoenzym-Antigenen gewonnenen Antiseren präzipitiert.

2. Diagnostisches Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem 95-100%ig präzipitierenden, homologen, vermittels von reinen menschlichen Isoenzym-Antigenen gewonnenen Antiserum gegen ein diagnostisch relevantes Isoenzym eines Isoenzymmusters.