DE3425186C2

DE3425186C2 - Reines pI 6,3 und pI 6,5 L1-Protein, deren Herstellungsverfahren und deren Verwendung

Info

Publication number: DE3425186C2
Application number: DE3425186A
Authority: DE
Inventors: Magne K Dr Fagerhol; Inge Dr Dale; Inger Naesgaard
Original assignee: Fagerhol Magne K; Inge Dr Dale
Current assignee: FAGERHOL, MAGNE K. DALE, INGE, OSLO, NO
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-07-09
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2004-07-10
Also published as: DK338484A; SE8403630D0; GB8318754D0; JPH0784479B2; IT8448540A0; US4833074A; CH661048A5; JPS6051113A; JP2558442B2; GB2143239A; GB2143239B; GB8417338D0; NL192456B; JPH07278194A; BE900119A; DK169439B1; SE8403630L; NL192456C; FR2550205B1; SE500219C2

Description

Die Erfindung betrifft zwei reine Humangranulozyten proteine, Verfahren zu deren Isolierung und Reinigung, deren Verwendung.

Von den Blutzellen haben nur die weißen Blutkörperchen, die Leukozyten, Kerne und sind fähig, die zahlreichen im Blutplasma gefunden Proteine zu erzeugen. 1 mm³ Blut enthält etwa 6000 bis 10 000 Leukozyten. Eine Unter gruppe der Leukozyten sind die Granulozyten, die wiederum in neutrophile polymorph-kernige Granulozyten, die etwa 95% aller Granulozyten ausmachen, eosinophile Granulo zyten und basophile Granulozyten unterteilt werden. Beim gesunden Erwachsenen werden etwa 10¹¹ Granulozyten täg lich aus dem Knochenmark freigesetzt, jedoch kann dies während schwerer Infektionen und Entzündungszustände zehnfach gesteigert werden. Normalerweise haben die Leu kozyten eine Durchgangszeit von etwa 6 h im Kreislauf, bevor sie in die Gewebe eintreten, wo sie ihre biologi schen Funktionen ausüben und gegebenenfalls abgesondert werden. Der Umsatz der Leukozyten kann bei Gesundheit und Erkrankung beträchtlich variieren, was durch Unter suchungen unter Verwendung von mit Isotopen markierten Granulozyten, sowie durch histologische Methoden gezeigt wurde, die das variierende Ausmaß der Leukozyten-In filtration in Gewebe zeigen. Jedoch ist keine dieser Methoden leicht für klinische Untersuchungen des Leukozytenumsatzes verfügbar. Eine alternative und leichter verfügbare Methode kann die Überwachung der Freisetzung von einem oder mehreren charakteristischen Leukozytenproteinen während der Funktion und/oder Seque stration der Leukozyten sein.

Drei Veröffentlichungen zeigen den Befund, der darauf schließen läßt, daß Leukozyten eine Anzahl von Proteinen enthalten, die während verschiedener Erkrankungen in ihrer Konzentration variieren können. Einige dieser Proteine wurden als L1, insbesondere pI 6,3 und pI 6,5 L1 (Literaturstellen 1 und 2) oder R: 6 und R: 7 (Literatur stelle 3) bezeichnet. Gemäß Analyse durch zweidimensio nale Elektrophorese (ISO-DALT) ist das pI 6,5 Li Protein identisch mit dem R: 6 Protein und das pI 6,3 L1 Protein ist identisch ist mit dem R: 7 Protein. In den Veröffent lichungen 1 bis 3 wurden die Proteine bei analytischen Methoden unter Hunderten bis Tausenden von anderen Proteinen festgestellt. In der Veröffentlichung 1 wurden Versuche unternommen, die L1-Proteine zwecks Bereitstel lung quantitativer Methoden und einleitender Charak terisierungen zu reinigen. Die präparative Gelfiltration, die isoelektrische Fokussierung und die Affinitäts chromatographie ergaben ein Protein mit einem Molekular gewicht von etwa 51 000 Dalton (gemäß SDS-Polyacrylamid gel-Elektrophorese und Gelfiltration), das sehr instabil war, das jedoch zur Immunisierung von Kaninchen verwendet werden konnte (1). Die Isolierungs-und Reinigungs methoden, die in der Literaturstelle 1 angewendet wurden, ergaben nur eine sehr geringe Ausbeute des Proteins mit 51 000 Dalton, und häufig ging das Protein während der Verfahrensschritte verloren. Die Immunisierung von Kaninchen durch Injektion des 51 000 Dalton Proteins ergab ein Antiserum für die L1-Proteine, jedoch häufig auch Antikörper gegen andere Proteine. Diese Antisera mußten von unerwünschten Antikörpern befreit werden durch Adsorption mit normalem Humanserum oder Human gewebsextrakten. In der Veröffentlichung 1 wurden nicht fraktionierte Leukozyten durch Gefrieren/Auftauen und mechanisches Homogenisieren der Leukozyten ohne Zusatz von jeglichen Enzyminhibitoren extrahiert.

In der Veröffentlichung 3 sind lediglich analytische Methoden der Bestimmung der R: 6 und R: 7 Proteine be schrieben, jedoch keine Isolierungs- oder Reinigungs verfahren.

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von milden und wirksamen Methoden zur Extraktion und Reinigung der L1-Proteine aus Leukozyten, um deren Charakterisierung zu ermöglichen, und die Verwendung monospezifischer Antisera oder Antikörper gegen diese Proteine zu deren qualitativer und quantitativer Bestimmung. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die genannte Verwendung in Form von Testkits bzw. Testausrüstungen, die derartige Antisera und/oder derartige gereinigte L1-Proteine enthalten, gegebenenfalls markiert mit einem radioaktiven Isotop oder mit einem Enzym, das für quantitative Assays bzw. Bestimmungen von L1-Proteinen in Körperflüssigkeiten oder Zell- oder Gewebsextrakten geeignet ist.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die L1-Proteine in reinem und stabilem Zustand erhalten werden können, wenn nur Granulozyten als Ausgangsmaterial verwendet werden und wenn die Granulozyten unter derartigen Be dingungen zerstört werden, daß die Lysosomen in den Granulozyten nicht gleichzeitig zerstört werden. Dieses Ziel wird durch Druckhomogenisation der Granulozyten in Anwesenheit eines Enzyminhibitors und eines Mittels, das die Lysosomenmembranen stabilisiert, erreicht.

Dementsprechend betrifft die Erfindung reine pI 6,3 und pI 6,5 L1-Proteine und Gemische davon, Verfahren zu deren Extraktion aus Granulozyten durch Druckhomogenisation der Granulozyten in Anwesenheit eines Enzyminhibitors und eines Mittels, das die Lysosomenmembranen stabilisiert, sowie deren Reinigung durch verschiedene Methoden, die Verwendung monospezifischer anti-L1-Antisera oder Antikörper zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der L1-Pro teine in Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten, insbesondere in Form von Testkits bzw. Testausrüstungen, die diese reinen L1-Proteine, Antisera und/oder Antikörper, gegebenenfalls mar kiert durch radioaktive Isotope oder durch Enzyme, enthalten.

Salze der L1-Proteine sind insbesondere nicht-toxische, pharmazeutisch brauchbare Salze oder auch solche, die zur Ausfällung und/oder für Reinigungsverfahren für die L1- Proteine verwendet werden können.

Derartige Salze sind beispielsweise Metallsalze, wie Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, z. B. Natrium- Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze oder Zinksalze und dgl., oder Ammoniumsalze mit Ammoniak oder primären, sekundären oder tertiären Aminen, beispielsweise Salze mit aliphatischen, cycloaliphatischen, cycloaliphatisch aliphatischen oder araliphatischen primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie mit niedrig-Mono- oder Di niedrig-alkylaminen, z. B. Triethylamin, Hydroxy niedrig-alkylaminen, z. B. 2-Hydroxyethylamin, Bis-(2- hydroxyethyl)-amin oder Tris-(2-hydroxyethyl)-amin oder mit basischen aliphatischen Estern von Carbonsäuren, z. B. Ethylendiamintetraessigsäure-niedrig-alkylester, z. B. der Tetraethylester und dgl.

Weitere Salze sind Säureadditionssalze mit anorganischen Säuren, insbesondere Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Sulfosäuren, gegebenenfalls substituierte niedrig-Alkancarbon säuren-, z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure, Malonsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure oder gegebenenfalls substituierte aromatische Säuren, z. B. Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxy benzoesäure, Embonsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure oder Aminosäuren, niedrig-Alkansulfonsäuren, z. B. Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, 2-Hydroxyethan sulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 4-Methylbenzolsulfon säure, Naphthalinsulfonsäure oder Ascorbinsäure und dgl.

Beide Proteine sind dadurch charakterisiert, daß ihre isoelektrischen Punkte beim pH-Wert 6,3 bzw. beim pH- Wert 6,5 liegen. Das Molekulargewicht beider Proteine, wie bestimmt durch Gelfiltration und Dichtegradienten- Ultrazentrifugieren, ist gleich und beträgt etwa 36 500 Dalton. Die SDS-Elektrophorese an Polyamidgel zeigt, daß die Proteine aus drei Polypeptiden von etwa identischem Molekulargewicht von 12 500 Dalton bestehen. Jede dieser Polypeptidketten weist die folgende Amino säuresequenz, ausgehend vom N-Terminal auf: Meth-Leu- Thre-Glu, wie durch die Standard-Edman-Verfahrensweise gezeigt. Die elektrische Gesamtladung und die Verfüg barkeit antigener Stellen an den L1-Proteinen werden stark durch die Abwesenheit oder Anwesenheit von Calcium ionen beeinflußt. Die Proteine reagieren wesentlich stärker als Antigene in vitro in Anwesenheit von Calciumionen.

Die Wärmestabilität der L1-Proteine ist bei neutralem und alkalischem pH-Wert hoch. Bei 15minütigem Sieden in wäßrigem 5 m-molarem EDTA vom pH-Wert 8,5 bleiben 90% des Proteins erhalten. Die L1-Proteine werden teilweise durch Ethanol bei saurem pH-Wert, z. B. zwischen etwa 4 und 5 ausgefällt.

Die L1-Proteine haben eine charakteristische Verteilung im menschlichen Körper. Sie werden in großen Mengen in neutrophilen Granulozyten, Monozyten und squamösen Epithelzellen, mit Ausnahme normaler Haut, gefunden. Sie werden auch in zahlreichen Krebszellen des squamösen Epitheltyps und in einigen Leukämie- und Lymphom-Zellen gefunden, insbesondere solchen vom myelogenen leukämi schen Typ und vom monocytischen Lymphomtyp. L1-Proteine finden sich in großer Überzahl in squamösem Krebs des Harntrakts und der Lungen. Die L1-Proteine sind auch in normalen Körperflüssigkeiten in relativ niedrigen Kon zentrationen bei gesunden Individuen vorhanden, jedoch in steigenden Konzentrationen bei erhöhtem Entzündungs grad. In weißen Blutkörperchen sind die L1-Proteine bis zu 90% in der Cytosolfraktion vorhanden.

Die L1-Proteine können als Marker-Proteine, insbesondere in radioaktiv markierter Form, z. B. mit J¹²⁵ oder P³² zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung des L1-Proteingehalts in Körperflüssigkeiten, Zellen und Geweben, verwendet werden.

Die L1-Proteine sind gute Immunogene bei Tieren, bei spielsweise Kaninchen.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung der reinen pI 6,3 und pI 6,5 L1-Proteine, der Gemische davon und von Salzen davon, das darin be steht, Humangranulozyten in einem geeigneten Puffer system aufzubrechen, nicht lösliches Zellmaterial zu entfernen und die überstehende Flüssigkeit einer Diethyl aminoethyl-Sepharose Anionenaustauschchromatographie mit einem EDTA-enthaltenden Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und Eluieren der gewünschten L1-Proteine mit einem Calcium ionen enthaltenden Puffer sowie gegebenenfalls jeglicher Kombination der folgenden Stufen a) bis f) zu unterwerfen:

a) einer isoelektrischen Fokussierung und Eluieren der Banden, die das pI 6,3 und/oder das pI 6,5 L1-Protein enthalten, mit einem Puffer, oder
b) der Affinitätschromatographie oder
c) einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese oder
d) einer Kationenaustauschchromatographie oder
e) einer Gelfiltration oder
f) einer reversiblen Ausfällung mit Zn++ oder

die Eluate von jeglichen Ampholyten und/oder Salzen zu befreien, die erhaltene Lösung der reinen L1-Proteine zu konzentrieren, falls gewünscht, die erhaltene kon zentrierte Lösung zu lyophilisieren und, falls gewünscht, die erhaltenen L1-Proteine in ein Salz umzuwandeln oder das erhaltene Salz in die freien Proteine umzuwandeln.

Die als Ausgangsmaterial für die Extraktion der L1-Pro teine verwendeten Granulozyten werden aus frischem menschlichem Blut nach jeglicher üblichen Methode erhal ten, beispielsweise durch Dextransedimentation und Dichtegradienten-Zentrifugieren.

Das Puffersystem, in dem die Granulozyten aufgebrochen werden, enthält ein Mittel, das das gleichzeitige Auf brechen der Lysosomen verhindert, wie Glycerin, Dextrane und vorzugsweise Saccharose, in einer Konzentration, die ausreicht, um den osmotischen Druck vor und nach dem Auf brechen der Zellwandungen zu stabilisieren. Beispiels weise wird Saccharose in einer Konzentration von 0,27 bis 0,34 m verwendet. Das Puffersystem enthält darüber hinaus Enzyminhibitoren, die die Digestion der L1-Proteine verhindern, wie Diisopropylfluorphosphat (DFP), Soja bohnen-Trypsininhibitor, Aprotinin (Trasilol®), Quecksilberbenzoat, Pepstatin A und vorzugsweise Phenylmethylsulfonyl fluorid (PMFS), und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Gemische davon.

Das Aufbrechen der Zellwandung kann in üblicher Weise erfolgen, beispielsweise mechanisch, z. B. durch einen Rotationsmischer, einen Mörser (Potter-Elvelyem- Methode), durch Ultraschall, Gefrieren und Auftauen, oder durch Kombination dieser Methoden. Bei einer be vorzugten Methode werden die Granulozyten durch Druck homogenisation aufgebrochen.

Nach dem Aufbrechen der Granulozyten werden unlösliche Materialien, wie nicht gebrochene Zellen, Zelltrümmer und Lysosomen entfernt, beispielsweise durch Ultra zentrifugieren.

Die L1-Proteine werden in reiner Form aus dem rohen Granulozy tenextrakt nach der Antionenaustauschchromatographie und gege benenfalls Durchführung jeglicher Kombination der Stufen a) bis f), die wie folgt durchgeführt werden können, erhalten.

Anionenaustauschchromatographie

Das Anionenaustauschermaterial, das bei dieser Methode verwen det wird, ist Diethylaminoethylcellulose in Form von Diethyl aminoethyl-Sepharose®. Der Granulozytenextrakt, der die L1- Proteine enthält, wird auf die Säule in einem Puffer mit geringer Ionenstärke, der EDTA enthält, und mit einem pH-Wert von etwa 8,5 aufgetragen. Die L1-Pro teine werden spezifisch durch Calciumionen enthalten den Puffer, beispielsweise einen Puffer, der 30 m-molares Barbital und 5 m-molares Calciumchlorid enthält, eluiert.

a) Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung wird vorzugsweise in einem granulierten Gel, wie Agarose- oder polymeri sierte Dextranperlen, durchgeführt, das ein geeig netes Gemisch von handelsüblichen Ampholyten enthält, um einen stabilen pH-Gradienten von etwa pH 5 bis 8 während des Verfahrens zu ergeben. Die isoelektrische Fokussierungsmethode wird mit einer maximalen Span nung von etwa 25 V/cm während etwa 10 bis 20 h bei einer Temperatur von etwa 5 bis 15° durchgeführt. Ein bevorzugtes Gel ist Ultrodex®, und der bevorzugte Ampholyt ist einer auf Basis von Polyaminopolycarbonsäuren (Ampholine®).

Die Probe wird vorzugsweise an der Kathodenseite des Gels aufgebracht. Die Lokalisierung der L1-Protein banden kann durch pH-Wert-Messungen längs der Gel oberfläche oder durch fleckenbildende Filterpapier abdrücke der Topoberfläche, beispielsweise mit Koomassie-Blau, erfolgen.

Die die L1-Proteine enthaltenden Banden werden abge kratzt und mit einem geeigneten Puffer, der EDTA ent hält, bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9, vor zugsweise bei einem pH-Wert von 8,5, eluiert.

Das Eluat wird von den Ampholyten und den Salzen durch Dialyse und/oder Gelfiltration befreit und durch Ultrafiltration und/oder Lyophilisieren konzentriert.

b) Affinitätschromatographie

Eine weitere Methode zur Reinigung des L1-Proteins basiert auf der Affinitätschromatographie. Diese kann an Glasperlen mit gesteuerten Poren, mit einer großen Oberfläche, z. B. von etwa 50 m²/g durchgeführt werden. Die Glasperlen werden in eine Säule einge setzt und der rohe Granulozytenextrakt wird in einem geeigneten Puffer mit niedriger Molarität, der Calcium ionen enthält, bei neutralem oder leicht saurem pH- Wert, z. B. von etwa pH-Wert 6 bis 7, aufgetragen. Die L1-Proteine werden mit einem alkalischen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,5 bis 8,5, der etwa 50 m-molares EDTA und Polyethylenglykol oder Lithium bromid enthält, eluiert.

Eine andere affinitätschromatographische Methode ver wendet die anti-L1-Antikörpersäule. Die L1-Proteine werden an den Antikörpern adsorbiert, wohingegen andere Proteine mit einem Puffer durchgewaschen werden. Anschließend werden die L1-Proteine mit einer Salz lösung, wie mit einem wäßrigen Puffer vom pH-Wert etwa 3,5, der ein Salz enthält, wie Natriumchlorid oder Natriumjodid, eluiert.

c) Präparative Agarosegel-Elektrophorese

Flachbett-Agarosegels mit geeigneten Abmessungen, die 75 m-molaren Barbital /2,5 m-molaren EDTA-Puffer vom pH-Wert 8,5 enthalten, werden verwendet. Die Elektro phorese erfolgt bei 4 V/cm während 10-18 h. Die L1- Proteinbanden werden durch Fleckenbildung auf Filter papierabdrücken der Geltopoberfläche lokalisiert. Die L1-Proteinbanden werden in dem α₂-Globulingebiet gefunden und werden durch Gefrieren/Auftauen und Zentrifugieren der relevanten Streifen des Agarose gels eluiert.

d) Kationenaustauschchromatographie

Die Kationenaustauschchromatographie wird an Kationen austauscherharzen, wie Sulfonylpropyl-substituierte Cellulose oder polymerisiertes Dextran durchgeführt. Der rohe Granulozytenextrakt wird auf die Säule nach dem Vermischen mit einem Puffer mit niedriger Ionen stärke, der Calciumionen enthält, und mit einem pH- Wert von etwa 6 aufgetragen. Nichtadsorbierte Proteine werden mit dem Ausgangspuffer weggewaschen, und die L1-Proteine werden mit einem Puffer, der EDTA und steigende Konzentrationen an Natriumionen enthält, eluiert.

e) Gelfiltration

Für die Gelfiltration werden Sephadex® G75 bis G200- Agarosegels (Sepharosegels), wie Ultragel®, oder Polyacrylamidgel-Perlen, wie Bio-Gel® P-60 verwendet. Die Säule ist vorzugsweise eine lange Säule. Die Länge der Säule sollte etwa das 50fache des Durch messers betragen. Der rohe Granulozytenextrakt wird als solcher aufgetragen, und die L1-Proteine werden chromatographiert. Zum Füllen der Kolonne und zur Verarbeitung wird ein Puffer verwendet, der vorzugs weise 0,1 m Natriumcitrat, 2,5 m-molares EDTA-K₂ und 0,25 m-molares Thimerosal enthält, pH 8,5. Die L1- Proteine finden sich in einer Fraktion, die einem Molekulargewicht von 35 000 bis 45 000 Dalton ent spricht.

f) Reversible Ausfällung mit Zn⁺⁺

Die L1-Proteine werden quantitativ aus wäßrigen Lösungen mit neutralem oder alkalischem pH-Wert durch Behandeln mit Zn⁺⁺-Ionen, insbesondere in der Form von wasserlöslichen Zinksalzen, wie Zinkacetat oder Zinkchlorid, ausgefällt. Beispielsweise kann eine wäßrige Lösung, die die L1-Proteine enthält, bei einem pH-Wert von etwa 8,5 mit einer etwa 10 m-molaren bis 100 m-molaren wäßrigen Lösung von Zinkacetat behandelt werden. Das ausgefällte L1-Zinksalz wird gesammelt, falls notwendig mit der wäßrigen Puffer lösung gewaschen, mit einer komplexbildenden Säure behandelt, beispielsweise einer etwa 100 m-molaren wäßrigen Di -kalium-ethylendiamintetraessigsäure lösung vom pH-Wert 8,5, und zur Gewinnung der freien L1-Proteine wird die Lösung durch eine Ionenaustau schersäule, beispielsweise Pharmacia PD-10, filtriert und lyophilisiert.

Die Salze des L1-Proteins werden nach üblichen Metho den erhalten, z. B. durch Behandeln mit den relevan ten Ionen, z. B. einer Base, einer Säure oder einem Salz, die bzw. das die gewünschten Ionen enthält, oder durch Ionenaustauscherbehandlung. Ein sehr un lösliches Mangansalz kann beispielsweise hergestellt werden durch Zusatz von Mn⁺⁺-Ionen, beispielsweise in der Form von einer etwa 10 m-molaren bis 100 m- molaren wäßrigen Lösung von Manganacetat oder einem anderen wasserlöslichen Mangansalz zu einer wäßrigen Lösung der L1-Proteine.

Die bei der Erfindung eingesetzten monospezifischen Anti sera gegen das L1-Protein und die Antikörper ent haltenden Immunglobuline sind insbesondere solche, wie sie durch Kaninchen erzeugt werden.

Monospezifische Antisera werden durch übliche Methoden erzeugt, z. B. durch wöchentliche Injektion der reinen L1-Proteine mit vollständigem Freund′s Adjuvans z. B. subkutan oder intramuskulär, in Dosierungen von etwa 100 µg pro Kaninchen pro Woche während etwa 8 bis 16 Wochen. Das Serum wird dann aus den Tieren z. B. durch Venensektion und Gerinnung gewonnen. An stelle von Kaninchen können auch andere nicht-mensch liche warmblütige Tiere, insbesondere Säuger, z. B. Schafe, Ziegen, Ratten, Mäuse, Pferde und dgl. ver wendet werden.

Die monospezifische Antikörper enthaltende Globulin fraktion kann aus dem Serum durch übliche Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Ionenaustausch chromatographie.

Zur Erzeugung der monospezifischen anti-L1-Antikörper wird das monospezifische Antikörper enthaltende Anti serum oder die Globulinfraktion davon durch eine Säule geführt, in der die gereinigten L1-Proteine an ein geeignetes Material, wie Agarose- und Cellulosegel, konjugiert wurden. Nach dem Wegwaschen der nicht adsorbierten Proteine werden die anti-L1-Antikörpermole küle durch einen Puffer mit einem pH-Wert von 3,5, der Natriumchlorid oder Natriumjodid enthält, eluiert.

Die relevanten Fraktionen werden auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt, dialysiert und konzentriert.

Die anti-L1-Antikörper werden entweder gereinigt oder in roher Form, wie in der Form der Antiserum- oder Globulinfraktionen davon, für qualitative oder quanti tative Methoden zur Bestimmung von L1-Proteinen in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten verwendet. Der artige Methoden umfassen die Ausfällung in Gels, die Nephelometrie, Radioimmunassay, Enzymimmunassay, Immun fluoreszenz und Immunperoxidase-zytohistochemische Tech niken in üblicher Weise.

Die Erfindung betrifft insbesondere die vorstehende Verwendung in Form von Testkits bzw. Testausrüstungen, die den reinen monospezifischen anti- L1-Antikörper oder die anti-L1-Antikörper-Globulinfrak tion oder das den anti-L1-Antikörper enthaltende Anti serum umfassen. Derartige Testkits sind vom üblichen Typ und zielen ab auf eine Einzel-Radioimmundiffusion, Latexagglutination, Spottest, Radioimmunassays, Enzymimmunassays, Immunfluoreszenz- und Enzymimmun histochemische-Tests.

Derartige Kits können zusätzlich zu anti-L1-Antikörpern in reiner oder roher Form, getrocknet oder lyophilisiert in einem geeigneten Puffer, vorgefertigte Gels, Latex, Polystyrol, mit Formalin stabilisierte tierische rote Blutkörperchen oder ähnliche Teilchen, Enzyme, wie Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Enzym substrate, Fluoreszenz- oder Enzym-konjugierte-Anti körper und Materialien, die zur Abtrennung von Anti-. körper-gebundenen L1-Molekülen von freien L1-Molekülen geeignet sind, wie abgetötete Stämme von Staphylococcus aureus, die zu den Stämmen gehören, die Staphylococcus- Protein A erzeugen, Aktivkohle (die das freie L1-Protein, jedoch nicht den Antikörper-Protein-Komplex adsorbiert), oder einen zweiten Antikörper, wie Ziegen- oder Anti- Kaninchen-Immunglobulin oder L1-Proteine, markiert mit radiaktiven Isotopen, wie J¹²⁵ oder mit Enzymen, wie Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ent halten. Der Kit kann auch Träger enthalten, auf denen monospezifische anti-L1-Antikörper an einer Oberfläche fixiert sind, z. B. die innere Oberfläche von Test röhrchen, die Oberfläche von Glas- oder Kunststoffkügel chen, Stücke von Filterpapier, Celluloseazetatmembranen oder ähnliche Materialien, sowie Puffer für derartige Methoden.

Vorstehend und nachfolgend werden folgende Abkürzungen verwendet:

PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
PAGE	Polyacrylamidgel-Elektrophorese
SDS	Natriumdodecylsulfat
IEF	isolektrisches Fokussieren
SRID	Einzel-Radioimmundiffusion
NHS	normales Humanserum
ACD	Säure-Citrat-Dextrose
DFP	Diisopropylfluorphosphat
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure
EDTA-K₂	Dikaliumsalz von EDTA
DEAE	Diethylaminoethyl
RIA	Radioimmunassay
PBS	mit Phosphat gepufferte Salzlösung
PASA	Protein A enthaltender Staph. aureus

Beispiel 1: Isolierung von Granulozyten

a) Ein Gemisch aus 435 ml frischem menschlichem Blut, 65 ml einer wäßrigen Lösung, die 2,2% Trinatriumcitrat dihydrat enthält, 0,8% wasserfreier Zitronensäure und 2,45% Dextrose, 250 ml Dextran mit hohem Molekularge wicht (Dextraven ®-₁₅₀) und 23 ml einer Lösung, die 2,5 mM Zitronensäure, 45 mM Trinatriumcitrat, 80 mM Glucose und 15 mM Natriumchlorid ent hält, läßt man 1 h bei 4°C sedimentieren. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und bei 200 × g während 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Sediment wird mit 50 ml eis gekühltem destilliertem Wasser behandelt, wodurch die roten Blutkörperchen aufgelöst werden. Nach 30 s wird die Isotonie durch Zusatz von 16,5 ml eiskaltem 0,6 m Natriumchlorid wieder hergestellt. Die verbleibenden Leukozyten werden zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Die Granulozyten werden von den mononuklearen Zellen durch Zentrifugieren an Lymphoprep® [Material für das Zentrifugieren mit Dichtegradienten, bestehend aus 9,6% (Gew./Vol) Natriummetrizoat-Lösung, enthaltend 5,6% (Gew./Vol.) eines Erythrozyten-aggregierenden Polysaccharids (Ficoll)], gefolgt vom Zentrifugieren bei 800 × g während 20 min bei 20 °C abgetrennt. Diese Verfahrensweise ergibt eine Ausbeute von etwa 5×10⁸ Zellen, wobei etwa 95% Granulozyten sind.

b) Granulozytenextraktion

Die wie unter a) erhaltenen Zellen werden erneut in 0,27 m Saccharose, enthaltend 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-K₂ und 0,25 mM Thimerosal, versetzt mit Trispuffer auf den pH-Wert 8,5, suspendiert. An schließend werden die Zellen nach French und Holm (4) durch Anlegen von 27,4·10⁵Pa (28 kg/cm²) Druckluft während zwei Perioden von 2 min, wobei sie aus der Druck kammer in einer Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde entweichen können, homogenisiert. Während dieser Ver fahrensweise wurden die Zellbehälter in Naßeis gehalten. Etwa 90% der Zellen werden aufgebrochen, und nach dem Zentrifugieren bei 100 000 × g während 1 h fanden sich etwa 90% des gesamten L1-Proteins in der klaren über stehenden Flüssigkeit. Letztere wird als roher Granulo zytenextrakt bezeichnet. Der gesamte Proteingehalt be trägt etwa 3 mg/ml, wobei 30% davon L1-Proteine sind.

c) Präparative isoelektrische Fokussierung (IEF)

Für die präparative IEF werden 110 × 240 × 5 mm Gel platten verwendet, die aus Ultradex® (Dextran G75, ver feinert), enthaltend 2% (Gew./Vol.) Ampholine®, pH 5-8 (ein Gemisch von synthetischen Ampholyten mit Puffer kapazitäten an ihren isoelektrischen Punkten) bestehen. Die Proben [5 ml der überstehenden Flüssigkeit gemäß b)] werden mit einem gleichen Volumen von Ultradex®-Gel vermischt und 5 cm von der Kathode entfernt auf die Gel platten aufgetragen. Die Trennung erfolgt während 18 h mit maximal 25 V cm^-1, 15 mA und 10 W. Die Proteinbanden werden sowohl durch Koomassie-Blau-Fleckenbildung auf einem Filterpapierabdruck der Gelplatte, als auch durch pH-Wertmessungen der Geltopoberfläche, lokalisiert. Die L1-Proteine in dem pH 6,3 und 6,5 Abschnitt werden mit einem gleichen Volumen einer wäßrigen Lösung, die 0,1 M Natriumacetat, 2,5 mM EDTA-K₂ und 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5, enthält, durch Zentrifugieren bei 2000 × g während 20 min durch 0,45 µm Millipore® Filter eluiert. Die Ampholyte werden durch Dialyse gegen den Elutionspuffer über Nacht entfernt. Das verbleibende Protein und die Puffer enthaltenden Lösungen werden durch Ultrafiltration an Minicon® Zellen (semipermeable Membran) konzentriert. Die Ausbeute dieser Verfahren be trägt etwa 20% des L1-Proteins, das auf das präpara tive IEF-Gel aufgetragen wurde. 2,5 ml dieser Lösung werden auf eine Pharmacia® PD-10 Säule (Sephadex® G25 M), equilibriert mit destilliertem Wasser, aufgetragen, und die L1-Proteine werden mit 3,5 ml destilliertem Wasser eluiert und lyophilisiert, unter Bildung von 1 mg reinem L1-Protein pI 6,3 und 6,5.

Das pI 6,3 und das pI 6,5 L1-Protein können auch getrennt nach dieser Methode gereinigt werden, unter Bildung von etwa 0,67 mg des pI 6,5 und etwa 0,33 mg des pI 6,3 L1- Proteins.

Beispiel 2

Die Methode nutzt die starke Änderung des isoelektri schen Punktes des L1-Proteins aus, wenn es Calciumionen aufnehmen kann (2). Das Protein bindet in rohen Granulocy tenextrakten an einen Anionenaustauscher, beispiels weise des Diethylaminoethyltyps, bei alkalischem pH-Wert und mit einer Ethylendiamintetraessigsäure, in ausrei chenden Mengen zur Bindung von Calciumionen, enthaltenden Puffer. Die L1-Proteine können anschließend spezifisch durch Zusatz von Calciumchlorid zu dem Puffer eluiert werden, um eine Endkonzentration von etwa 5-10 mM pro Liter sicherzustellen.

Die rohen Granulozytenextrakte werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Ihr gesamter Proteingehalt liegt bei etwa 2-5 g pro Liter, wovon etwa 60% L1- Protein ist.

DEAE-Sephacel® (Pharmacia, Schweden) wird mit 60 m- molarem Barbitalpuffer (7,7 g Diethylbarbitursäure und 10,5 g des Natriumsalzes davon in 1 l Wasser), enthaltend 1 g 1 EDTA-K₂, pH 8,5, equilibriert und in eine Chroma tographiesäule mit den Abmessungen 1,5 × 5 cm, d. h. einem Volumen von etwa 9 ml, gefüllt.

Die Probe, etwa 10 ml roher Granulozytenextrakt, verdünnt mit 30 ml EDTA-K₂ Barbitalpuffer vom pH-Wert 8,5 wird mit einer Schlauchpumpe, die eine Strömungsgeschwindig keit von etwa 2 ml/min ergibt, aufgetragen. Nicht adsorbierte Proteine werden mit 100 ml Barbitalpuffer ausgewaschen. Vor dem Eluieren der L1-Proteine wird die Säule ebenfalls mit 30 ml Barbitalpuffer ohne EDTA-K₂ gewaschen. Die L1-Proteine werden anschließend mit 60 m- molarem Barbitalpuffer, der 5 mM CaCl₂ enthält, pH 8,5, eluiert.

Die Fig. 1 zeigt das Gesamtprotein- und L1-Protein- Elutionsprofil einer derartigen Ionenaustauschchromato graphie, und in der Fig. 2 ist das Proteinbanden-Muster dargestellt, wenn roher Leukozytenextrakt und gereinigtes L1-Protein der analytischen Agarosegel-Elektrophorese unterworfen wird. Es ist ersichtlich, daß das gereinigte L1-Protein zwei Hauptbanden, wie vorstehend beschrieben, entsprechend pI 6,3 und pI 6,5 ergibt.

Die mit dem Calcium enthaltenden Puffer eluierte Menge an L1-Protein liegt nahe bei 50% der in der Probe auf getragenen und wird in einem Gesamtvolumen von etwa 20 ml gefunden. Diese Lösung kann zweckmäßig durch Ultrafil tration unter Verwendung von Millipore® CX-10 Membranen konzentriert werden. Dies führt zu einem gewissen Proteinverlust, in Abhängigkeit davon, ob EDTA zugesetzt wird oder nicht, um die Bindung von L1-Protein an die Membranen zu verhindern. Selbst ohne Zusatz von EDTA kann eine Gesamtausbeute von etwa 35% erzielt werden.

Wie in der Fig. 1 gezeigt, wird ein Teil des L1-Proteins mit 60 m-molarem Barbitalpuffer, der 5 mM CaCl₂ und 125 mM NaCl enthält, pH 8,5, eluiert, jedoch ergibt dieses Protein Banden, die hauptsächlich anodal und kathodal von den Haupt-L1-Banden liegen und teil weise denaturiertes oder komplexes L1-Protein zusätzlich zu verschiedenen Proteinen darstellen dürften.

Methoden in großem Maßstab

Die vorstehend beschriebene Methode kann erfolgreich im Maßstab vergrößert werden, um 50 ml rohe Granulozyten extrakte zu handhaben. Dies wird erzielt unter Verwen dung einer Säule, die etwa 50 ml DEAE-Sephacel® (etwa 2,5 × 10 cm) enthält und proportionale Steigerung der wie vorstehend angegebenen Puffervolumina.

b) Hier wird ausgenützt, daß eine reversible Ausfällung der L1-Proteine durch Zusatz von 10 mM Zn⁺⁺ er zielt werden kann. Zu 10 ml rohem Leukozytenextrakt werden 90 ml Barbitalpuffer, 75 mM, pH 8,5, und 10 ml einer 100 mM Zn-Acetatlösung in Wasser gefügt. Die Ausfällung wird mehrfach, beispielsweise fünfmal, mit 75 m-molarem Barbitalpuffer, pH 8,5, mit 10 m-molarem Zn-Acetat gewaschen. Schließlich wird die Ausfällung mit 75 m-molarem Barbitalpuffer, pH 8,5, gewaschen und durch tropfenweise Zugabe einer Lösung von 100 m-molarem EDTA-K₂ in Wasser, pH-Wert durch 5 mM Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt, gelöst. Diese Proteinlösung wird auf eine Pharmacia PD-10-Säule aufge tragen, die mit destilliertem Wasser equilibriert ist, und die L1-Proteine werden mit 3,5 ml destilliertem Wasser eluiert und lyophilisiert, unter Bildung von etwa 10 bis 20 mg reinen L1-Proteinen.

Beispiel 3: Herstellung von Antiserum für gereinigtes L1

Eine Lösung, die etwa 1 mg/ml gereinigtes pI 6,3 und pI 6,5 L1-Protein (erhalten gemäß Beispiel 1 oder 2) in 0,1 M Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5, enthält, wird mit vollständigem Freund′s Adjuvans homogenisiert. Ein Volumenteil dieses Gemischs, der etwa 100 µg L1-Proteine enthält, wird Kaninchen subkutan an verschiedenen Stellen einmal pro Woche während 6 Wochen injiziert. Die Kaninchen werden durch Venenpunktur ausgeblutet. Man läßt das Blut bei Raumtemperatur über Nacht gerinnen. Das Serum wird ge wonnen und auf die L1-Antiserum-Aktivität getestet.

Normalerweise kann ein solches Antiserum in einer Ver dünnung von 1 : 32 für eine einzelne radiale Immunpräzi pitation und in einer Verdünnung von 1 : 2000 für den Radioimmunassay verwendet werden.

Beispiel 4: Testkit für den Radioimmunassay

Der Testkit enthält (für 100 Tests):

1 Ampulle 2 ml lyophilisiertes anti-L1- Serum, erhalten gemäß Beispiel 3
1 Flasche 100 ml RIA-Puffer: 50 mM Natriumchlorid, 0,2% Rinder serumalbumin, 0,2% Natriumazid, eingestellt auf den pH-Wert 7,4
1 mit Kautschuk überzogene Ampulle 5 ml wäßrige Lösung von mit radioaktivem Jod¹²⁵ markierten L1-Proteinen, eingestellt unter Bildung von 500 cpm/ml (markiert nach der Bolton-Hunter-Methode)
1 Flasche 100 ml einer wäßrigen Suspen sion von mit Formalin behandel tem Staphylococcus aureus (PASA = Protein A enthaltender Staph aureus des Cowan I- Stammes) in mit Phosphat ge pufferter Salzlösung.
1 Flasche 2 ml einer RIA-Pufferlösung, enthaltend 50 ng L1-Protein (Bezugslösung)

Verfahrensweise zur quantitativen Bestimmung von L1-Proteinen durch RIA

Eine Reihe von Standards wird durch Zweifachverdünnung der gelieferten L1-Bezugslösung auf 7,8 ng/ml mit RIA- Puffer bereitet. In eine Reihe von Testrohren werden 25 µl Patientenplasma, verdünnt auf 1 : 30 in RIA-Puffer oder Standardbezugslösung, pipettiert. Hierzu werden 20 µl anti-L1-Serum gefügt, und die Gemische werden 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließen werden 50 µl der Lösung mit dem radioaktiv markierten L1-Protein zuge setzt, worauf 1 h bei 37 °C inkubiert wird. In jedes Röhrchen wird dann 1 ml suspendierte Staph. aureus Suspension gefügt, und es wird 10 min bei 2000 × g zen trifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abge saugt und die Radioaktivität im Sediment gemessen. Der Prozentsatz der Radioaktivität, bezogen auf die ursprünglich zugesetzte Radioaktivität, für die L1- Bezugsstandardverdünnungen so aufgetragen, daß eine Bezugskurve gezeichnet werden kann. Die Werte der Patientenproben können von dieser Kurve abgelesen werden.

Beispiel 5: Testkit für die nephelometrische Bestimmung von L1-Proteinen in Lösung

Der Testkit enthält:

1 Ampulle 1,5 ml anti-L1-Antikörperlösung in pH 7,5 Puffer (Natriumacetat puffer, enthaltend 5 mM Calciumchlorid) mit einem Titer von etwa 1 : 32 beim Test durch Doppelimmundiffusion in Agarose gel.
1 Flasche 20 ml verdünnter Puffer wie vorstehend
1 Ampulle 0,5 ml einer Lösung von L1- Protein in einer Konzentration von 400 µg/ml

Anti-L1-Serum wird mit Verdünnungspuffer auf 1:15 ver dünnt. 6 Standards L1-Protein (1 : 1 bis 1 : 64) werden durch Zweifachverdünnung der Standard L1-Lösung bereitet. Anschließend werden 250 µl Antikörperver dünnung und 10 µl der Probe oder verdünnter L1-Standard in Nephelometer-Cuvetten gemischt und 10 min bei Raum temperatur inkubiert. Die optische Dichte wird von dem Nephelometer abgelesen.

Beispiel 6: Testkit für einzelne Radialimmundiffusions analysen für L1-Protein in Lösung

Der Testkit enthält:

1 oder mehr vorbereitete Agarosegels mit einem Gehalt von 2% gleichmäßig verteilter anti-L1-Antikörper lösung mit einem Titer von etwa 1 : 32 beim Test durch Doppel diffusion in Gel, und 0,1 M Natriumacetat, 5 mM Calciumchlorid, 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5.
1 Ampulle 0,1 ml L1-Proteinlösung mit einer Konzentration von 300 µg/ml.

Das Agarosegel wird in einer geschlossenen Kammer zur Verhinderung der Austrocknung des Gels bereitgestellt. Das Gel hat 18 vorbereitete Vertiefungen zum Auftrag von 10 µl der Standardlösungen und der zu untersuchenden Proben.

Beispiel 7: Testkits für den Latex-Agglutinationsassay für eine halbquantitative Bestimmung von L1-Protein

Der Testkit enthält:

a) 1 2 ml-Flasche einer Suspension von Latex teilchen von 50 µm Durchmesser, an die gereinigtes L1-Protein fixiert wurden.
b) 1 2 ml-Flasche einer Pufferlösung von anti-L1- Antikörper, die mit den vor stehend erwähnten Latexteilchen agglutinieren, mit einem Titer von 1 : 3 bis 1 : 4.
c) 1 0,5 ml-Flasche einer Pufferlösung des L1- Proteins in einer Konzentration von 50 µg/ml

1 Tropfen von a), b) und der zu untersuchenden Patienten probe werden auf einem schwarzen Objektträger vermischt und 5 min auf die Agglutination beobachtet. Ein Nicht auftreten der Agglutination bedeutet eine L1-Konzentra tion von über 1000 ng/ml. In den positiven Kontroll ösungen werden a), b) und c) vermischt, und es sollte keine Agglutination auftreten.

Beispiel 8: Testkits für den Spot-Test

Der Testkit enthält:

10 Stück Celluloseacetat, 5×50 mm, mit zwei Flecken mit einem Durchmesser von 4 mm von getrocknetem spezi fischem anti-L1-Antikörper, im Abstand von 10 und 30 ml von einem Ende,

a) 1 Flasche 2 ml einer Pufferlösung, ent haltend spezifische anti-L1- Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase,
b) 1 Flasche 10 ml einer wäßrigen Trispuffer/isotonische Salzlösung-pH 7,4-Lösung, ent haltend 1 mg/ml Diaminobenzidin (DAB)
c) 1 Flasche 1 ml einer wässrigen Puffer lösung von L1-Protein in einer Konzentration von 50 µg/ml.

Zum Test wird 1 Tropfen der Probelösung auf den ersten Fleck aufgetragen und 1 Tropfen der Lösung c) auf den zweiten Fleck. Nach 10 min wird der Teststreifen mit Trispuffer-Salzlösung während 5 min gewaschen. Anschlie ßend wird 1 Tropfen der Lösung a) auf jeden Fleck auf getragen, 10 min bei Raumtemperatur belassen, und der Streifen wird erneut 5 min in Trispuffer-Salzlösung ge waschen. Zu 1 ml Lösung b) werden 5 µl 30% Wasserstoff peroxid gefügt. Ein Tropfen dieses Gemischs wird auf jeden Fleck aufgetragen. Eine nach 3 min auftretende ausgeprägte Braunfärbung zeigt die Anwesenheit von L1-Proteinen in der Probe an.

Durch Serienverdünnung der Probe kann der Test halb quantitativ gestaltet werden.

Beispiel 9: Testkits für L1-Proteine durch Enzymimmunassay

Die Testkits enthalten:

1 Mikroliter-Falle mit 5 × 10 Vertiefungen aus Kunst stoffmaterial, wobei die Innenoberfläche des Bodens und des unteren Teils der Vertiefungen mit spezifischen anti-L1-Antikörpern überzogen sind.

a) 1 Flasche 2 ml einer Pufferlösung, die spezifische anti-L1-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich- Peroxidase enthalten.
b) 1 Flasche 10 ml einer wäßrigen Tris puffer/isotonische Salzlösung pH 7,4-Lösung, enthaltend 1 mg/ml Diaminobenzidin (DAB)
c) 1 Flasche 1 ml einer wäßrigen Puffer lösung von L1-Protein in einer Konzentration von 50 µg/ml

Testverfahren: 50 µl der Testprobenlösung oder der Lösung c) werden in die Vertiefungen gefügt und bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Anschließend werden die Vertiefungen mit Trispuffer/Salzlösung mit einem Gehalt von 0,5% Rinderserumalbumin gewaschen. In jede Ver tiefung werden 50 µl Lösung a) gefügt, und es wird 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden wie vorstehend gewaschen. Zu 1 ml der Lösung b) werden 5 µl 30% Wasserstoffperoxid gefügt und 50 µl dieses Gemischs werden in jede Vertiefung gefügt. Die Schale wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, und die Farb intensität in jeder Vertiefung wird photometrisch be stimmt.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1: Chromatographisches Profil von 9 ml rohem Leukozytenextrakt an einer DEAE-Sephacel®- Säule, 1,5 × 5 cm. Der Gesamtproteingehalt wurde durch UV-Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt, und die L1-Konzentration durch Einzel-Radialimmundiffusion.

Fig. 2: Die Proteinbandenmuster des rohen Granulo zytenextrakts A, der 5 m-molaren CaCl₂- Fraktion B und der 125 m-molaren NaCl- Fraktion C bei der Agarosegel-Elektrophorese in Barbitalpuffer, 75 m-molar, mit 2,5 mM EDTA-K₂, pH 8,5. Die Fraktion B enthält die beiden reinen L1-Proteine pI 6,3 und pI 6,5

Literaturangaben

(1) Magne K. Fagerhol, Inge Dale und Terje Andersson, Scand. J. Haematol. (1980) 24, 393-398
(2) M. K. Fagerhol, I. Dale, T. Andersson, Bull. europ. Physiopath. resp. 1980, 16 (suppl) 273 281.
(3) Karen E. Willard, Anne Karine Thorsrud, Eimar Munthe und Egil Jellum, Clin. Chem., Vol. 28, Nr. 4,1067- 1073 (1982)
(4) French, P. C. und Holm, R. A., (1947) Thromb. Diath. Haemorrh. 32, 432-440.

Claims

1. Reines pI 6,3 und pI 6,5 L1-Protein, deren Gemische und Salze, dadurch gekennzeichnet, daß der isoelektrische Punkt beim pH-Wert 6,3 bzw. 6,5 liegt, das Molekulargewicht, be stimmt durch Gelfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentri fugieren, etwa 36.500 Dalton beträgt, die SDS-Elektrophorese an Polyamidgel zeigt, daß das bzw. die Proteine aus drei Poly peptiden von etwa identischem Molekulargewicht von 12.500 Dal ton bestehen, und jede dieser Polypeptidketten die folgende Aminosäuresequenz, ausgehend vom N-Terminal aufweist: Meth- Leu-Thre-Glu.

2. Verfahren zur Herstellung des reinen pI 6,3 und/oder pI 6,5 L1-Proteins gemäß Anspruch 1 und Salzen davon, dadurch gekennzeichnet, daß man Humangranulozyten in einem geeigneten Puffersystem auf bricht, nicht-lösliches Zellmaterial entfernt und die über stehende Flüssigkeit einer Diethylaminoethyl-Sepharose-Anio nenaustauschchroniatographie mit einem EDTA-enthaltenden Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und Eluieren des gewünschten L1-Proteins mit einem Calciumionen enthaltenden Puffer, sowie gegebenenfalls jeglicher Kombination der folgenden Stufen a) bis f) unterwirft:

a) einem isoelektrischen Fokussieren und Eluieren der das pI 6,3 und/oder das pI 6,5 L1-Protein enthaltenden Banden mit einem Puffer, oder
b) einer Affinitätschromatographie, oder
c) einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese, oder
d) einer Kationenaustauschchromatographie, oder
e) einer Gelfiltration oder
f) einer reversiblen Ausfällung mit Zn++

die Eluate von jeglichen Ampholyten und/oder Salzen befreit, die erhaltene Lösung des bzw. der reinen L1-Proteine konzen triert, falls gewünscht, die erhaltene konzentrierte Lösung lyophilisiert und, falls gewünscht, das bzw. die erhaltenen L1-Proteine in ein Salz umwandelt oder das erhaltene Salz in das freie Protein umwandelt.

3. Verwendung monospezifischer anti-L1-Antisera und monospezi fischer anti-L1-Antikörper, erzeugt durch reines L1-Protein gemäß Anspruch 1 zur qualitativen oder quantitativen Bestim mung von L1-Protein in Zellen, Geweben oder Körperflüssig keiten.

4. Verwendung gemäß dem vorhergehenden Anspruch 3 in Form eines Testkits, enthaltend die monospezifischen anti-L1-Antikörper, anti-L1-Antikörper-Globulinfraktionen oder anti-L1-Antisera, erzeugt durch reines L1-Protein gemäß Anspruch 1.