CH661048A5

CH661048A5 - Humanproteine, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende testkits.

Info

Publication number: CH661048A5
Application number: CH3229/84A
Authority: CH
Inventors: Magne K Dr Fagerhol; Inge Dr Dale; Inger Naesgaard
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-07-04
Publication date: 1987-06-30
Also published as: DE3425186C2; DK338484A; SE8403630L; FR2550205B1; BE900119A; DK338484D0; IT1177889B; FR2550205A1; JPS6051113A; JPH0784479B2; US4833074A; GB2143239A; DK169439B1; JP2558442B2; GB2143239B; DE3425186A1; SE500219C2; GB8318754D0; NL8402182A; GB8417338D0

Description

Die Erfindung betrifft zwei reine Humangranulozyten-proteine, Verfahren zu deren Isolierung und Reinigung, deren Verwendung, Antisera, die gegen diese Proteine erzeugt wurden, Methoden zur Herstellung dieser Antisera, die Verwendung dieser Antisera und Testkits, die diese Antisera enthalten.

Von den Blutzellen haben nur die weissen Blutkörperchen, die Leukozyten, Kerne und sind fähig, die zahlreichen im Blutplasma gefundenen Proteine zu erzeugen. 1 mm3 Blut enthält etwa 6000 bis 10 000 Leukozyten. Eine Untergruppe der Leukozyten sind die Granulozyten, die wiederum in neu-trophile polymorph-kernige Granulozyten, die etwa 95% aller Granulozyten ausmachen, eosinophile Granulozyten und basophile Granulozyten unterteilt werden. Beim gesunden Erwachsenen werden etwa 10" Granulozyten täglich aus dem Knochenmark freigesetzt, jedoch kann dies während schwerer Infektionen und Entzündungszuständen zehnfach gesteigert werden. Normalerweise haben die Leukozyten eine Durchgangszeit von etwa 6 h im Kreislauf, bevor sie in die Gewebe eintreten, wo sie ihre biologischen Funktionen durchführen und gegebenenfalls abgesondert werden. Der Umsatz der Leukozyten kann bei Gesundheit und Erkrankung beträchtlich variieren, was durch Untersuchungen unter Verwendung von mit Isotopen markierten Granulozyten, sowie durch histologische Methoden gezeigt wurde, die das variierende Ausmass der Leukozyten-Infiltration in Gewebe zeigen. Jedoch ist keine dieser Methoden leicht für klinische Untersuchungen des Leukozytenumsatzes verfügbar. Eine alternative und leichter verfügbare Methode kann die Überwachung der Freisetzung von einem oder mehreren charakteristischen Leukozytenproteinen während der Funktion und/oder Sequestration der Leukozyten sein.

Drei Veröffentlichungen zeigen den Befund, der darauf schliessen lässt, dass Leukozyten eine Anzahl von Proteinen enthalten, die während verschiedener Erkrankungen in ihrer Konzentration variieren können. Einige dieser Proteine wurden als LI, insbesondere pl 6,3 und pl 6,5 LI (Literaturstellen 1 und 2) oder R:6 und R:7 (Literaturstelle 3) bezeichnet. Gemäss Analyse durch zweidimensionale Elektrophorese (ISO-DALT) ist das pl 6,5 Li Protein identisch mit dem R:6 Protein und das pl 6,3 LI Protein ist identisch mit dem R:7 Protein. In den Veröffentlichungen 1 bis 3 wurden die Proteine bei analytischen Methoden unter Hunderten bis Tausenden von anderen Proteinen festgestellt. In der Veröffentlichung 1 wurden Versuche unternommen, die LI Proteine zwecks Bereitstellung quantitativer Methoden und einleitender Charakterisierungen zu reinigen. Die präparative Gelfiltration, die isoelektrische Fokussierung und die Affinitätschromatographie ergaben ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 51 000 Dalton (gemäss SDS-Polyacryl-amidgel-Eloktrophorese und Gelfiltration), das sehr instabil war, das jedoch zur Immunisierung von Kaninchen verwendet werden konnte (1). Die Isolierungs- und Reinigungsmethoden, die in der Literaturstelle 1 angewendet wurden, ergaben nur eine sehr geringe Ausbeute des Proteins mit 51 000 Dalton, und häufig ging das Protein während der Verfah-

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rensschritte verloren. Die Immunisierung von Kaninchen durch Injektion des 51 000 Dalton Proteins ergab ein Antise-rum für die LI Proteine, jedoch häufig auch Antikörper gegen andere Proteine. Diese Antisera mussten von unerwünschten Antikörpern befreit werden durch Adsorption mit normalem Humanserum oder Humangewebsextrakten. In der Veröffentlichung 1 wurden nichtfraktionierte Leukozyten durch Gefrieren/Auftauen und mechanisches Homogenisieren der Leukozyten ohne Zusatz von jeglichen Enzyminhibitoren extrahiert.

In der Veröffentlichung 3 sind lediglich analytische Methoden der Bestimmung der R:6 und R:7 Proteine beschrieben, jedoch keine Isolierungs- oder Reinigungsverfahren.

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von milden und wirksamen Methoden zur Extraktion und Reinigung der LI Proteine aus Leukozyten, um deren Charakterisierung zu ermöglichen, und die Bereitstellung monospezifischer Antisera oder Antikörper gegen diese Proteine. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Testkits bzw. Testausrüstungen, die derartige Antisera und/oder derartige gereinigte LI Proteine enthalten, gegebenenfalls markiert mit einem radioaktiven Isotop oder mit einem Enzym, das für quantitative Assays bzw. Bestimmungen von LI Proteinen in Körperflüssigkeiten oder Zell- oder Gewebsextrakten geeignet ist.

Uberraschenderweise wurde gefunden, dass die LI Proteine in reinem und stabilem Zustand erhalten werden können, wenn nur Granulozyten als Ausgangsmaterial verwendet werden und wenn die Granulozyten unter derartigen Bedingungen zerstört werden, dass die Lysosomen in den Granulozyten nicht gleichzeitig zerstört werden. Dieses Ziel wird durch Aufbrechen, z.B. durch Druckhomogenisation, der Granulozyten in Anwesenheit eines Enzyminhibitors und eines Mittels, das die Lysosomenmembranen stabilisiert, erreicht.

Dementsprechend betrifft die Erfindung reine pl 6,3 und pl 6,5 LI Proteine und Gemische davon, Verfahren zu deren Extraktion aus Granulozyten durch Aufbrechen, z. B. durch Druckhomogenisation, der Granulozyten in Anwesenheit eines Enzyminhibitors und eines Mittels, das die Lysosomenmembranen stabilisiert, sowie deren Reinigung durch verschiedene Methoden, die Verwendung dieser Proteine zur Herstellung monospezifischer Antisera oder Antikörper, Verfahren zur Herstellung dieser monospezifischen Antisera oder Antikörper durch Immunisieren von Versuchstieren mit den LI Proteinen, die monospezifischen Antisera und Antikörper als solche, die Verwendung dieser Antisera oder Antikörper und/oder der gereinigten LI Proteine zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der LI Proteine in Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten, und Testkits bzw. Testausrüstungen, die diese reinen LI Proteine, Antisera und/oder Antikörper, gegebenenfalls markiert durch radioaktive Isotope oder durch Enzyme, enthalten.

Die Erfindung betrifft reine pl 6,3 und pl 6,5 LI Proteine, dadurch charakterisiert, dass ihr Molekulargewicht etwa 36 500 Dalton beträgt, dass jedes aus drei Polypeptiden vom Molekulargewicht von etwa 12 500 Dalton bestehen, die am N-Terminal die Aminosäuresequenz

Met-Leu-Thr-Glu haben,

Gemische bestehend aus den beiden LI-Proteinen, und Salze davon.

Salze der LI Proteine sind insbesondere nicht-toxische, pharmazeutisch brauchbare Salze oder auch solche, die zur Ausfällung und/oder für Reinigungsverfahren für die LI Proteine verwendet werden können.

Derartige Salze sind beispielsweise Metallsalze, wie Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium-, Kalium-,

Magnesium- oder Calciumsalze oder Zinksalze und dgl,

oder Ammoniumsalze mit Ammoniak oder primären, sekundären oder tertiären Aminen, beispielsweise Salze mit aliphatischen, cycloaliphatischen, cycloaliphatischaliphatischen oder araliphatischen primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie mit niedrig-Mono-, Di- oder Tri-niedrig-alkyl-aminen, z. B. Triethylamin, Hydroxy-niedrig-alkylaminen. z.B. 2-Hydroxyethylamin, Bis-(2-hydroxyethyl)-amin oder Tris-(2-hydroxyethyl)-amin oder mit basischen aliphatischen Estern von Carbonsäuren, z. B. Ethylendiamintetraessigsäu-re-niedrig-alkylester, z.B. dem Tetraethylester und dgl.

Weitere Salze sind Säureadditionssalze mit anorganischen Säuren, insbesondere Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Sulfo-säuren, gegebenenfalls substituierte niedrig-Alkancarbon-säuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure. Malonsäu-re, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure oder gegebenenfalls substituierte aromatische Säuren, z. B. Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Embonsäu-re, Nicotinsäure, Isonicotinsäure oder Aminosäuren, nied-rig-Alkansulfonsäuren, z.B. Methansulfonsäure, Ethansul-fonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 4-Methylbenzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Ascorbinsäure und dgl.

Beide Proteine sind dadurch charakterisiert, dass ihre isoelektrischen Punkte beim pH-Wert 6,3 bzw. beim pH-Wert 6,5 liegen. Das Molekulargewicht beider Proteine, wie bestimmt durch Gelfiltration und Dichtegradienten-Ultra-zentrifugieren, ist gleich und beträgt etwa 36 500 Dalton. Die SDS-Elektrophorese an Polyamidgel zeigt, dass die Proteine aus drei Polypeptiden von etwa identischem Molekulargewicht von 12 500 Dalton bestehen. Jede dieser Polypeptidketten weist die folgende Aminosäuresequenz, ausgehend vom N-Terminal auf: Meth-Leu-Thre-Glu, wie durch die Standard-Edman-Verfahrensweise gezeigt. Die elektrische Gesamtladung und die Verfügbarkeit antigener Stellen an den LI Proteinen werden stark durch die Abwesenheit oder Anwesenheit von Calciumionen beeinflusst. Die Proteine reagieren wesentlich stärker als Antigene in vitro in Anwesenheit von Calciumionen.

Die Wärmestabilität der LI Proteine ist bei neutralem und alkalischem pH-Wert hoch. Bei 15minütigem Sieden in wässrigem 5 m-molarem EDTA vom pH-Wert 8,5 bleiben 90% des Proteins erhalten. Die LI Proteine werden teilweise durch Ethanol bei saurem pH-Wert, z.B. zwischen etwa 4 und 5 ausgefällt.

Die LI Proteine haben eine charakteristische Verteilung im menschlichen Körper, sie werden in grossen Mengen in neutrophilen Granulozyten, Monozyten und squamösen Epithelzellen, mit Ausnahme normaler Haut, gefunden. Sie werden auch in zahlreichen Krebszellen des squamösen Epitheltyps und in einigen Leukämie- und Lymphom-Zellen gefunden, insbesondere solchen vom myelogenen leukämischen Typ und vom monocytischen Lymphomtyp. LI Proteine finden sich in grosser Überzahl in squamösem Krebs des Harntrakts und der Lungen. Die LI Proteine sind auch in normalen Körperflüssigkeiten in relativ niedrigen Konzentrationen bei gesunden Individuen vorhanden, jedoch in steigenden Konzentrationen bei erhöhtem Entzündungsgrad. In weissen Blutkörperchen sind die LI Proteine bis zu 90% in der Cytosolfraktion vorhanden.

Die LI Proteine können als Marker-Proteine, insbesondere in radioaktiv markierter Form, z. B. mit J125 oder P32, zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung des LI

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Proteingehalts in Körperflüssigkeiten, Zellen und Geweben, verwendet werden.

Die LI Proteine sind gute Immunogene bei Tieren, beispielsweise Kaninchen.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung der reinen pl 6,3 oder pl 6,5 Ll-Proteine, Gemischen der beiden Proteine und Salze davon, dadurch gekennzeichnet, dass man Humangranulozyten in einem Puffersystem enthaltend Enzyminhibitoren, die die Digestion der Ll-Proteine verhindern, und ein Mittel, das das gleichzeitige Aufbrechen der Lysosomenmembran verhindert, aufbricht, nichtlösliches Zellmaterial entfernt und die überstehende Flüssigkeit a) einem isoelektrischen Fokussieren und Eluieren der das pl 6,3 und/oder das pl 6,5 Ll-Protein enthaltenden Banden mit einem Puffer, oder b) einer Anionenaustauschchromatographie mit einem EDTA-enthaltenden Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und Eluieren der gewünschten Ll-Proteine mit einem Calciumionen enthaltenden Puffer, oder c) einer Affinitätschromatographie, oder d) einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese, oder e) einer Kationenaustauschchromatographie, oder f) einer Gelfiltration oder g) einer reversiblen Ausfällung mit Zn ++, oder jeglicher Kombination der Stufen a) bis g) unterwirft, die Eluate von jeglichen Ampholyten und/oder Salzen befreit, die erhaltene Lösung der reinen Ll-Proteine konzentriert und die erhaltenen Ll-Proteine in Form ihrer Salze oder als freie Proteine isoliert.

Die als Ausgangsmaterial für die Extraktion der LI Proteine verwendeten Granulozyten werden aus frischem menschlichem Blut nach irgendeiner der üblichen Methoden erhalten, beispielsweise durch Dextransedimentation und Dichtegradienten-Zentrifugieren.

Das Puffersystem, in dem die Granulozyten aufgebrochen werden, enthält ein Mittel, das das gleichzeitige Aufbrechen der Lysosomen verhindert, wie Glycerin, Dextrane und vorzugsweise Saccharose, in einer Konzentration, die ausreicht, um den osmotischen Druck vor und nach dem Aufbrechen der Zellwandungen zu stabilisieren. Beispielsweise wird Saccharose in einer Konzentration von 0,27 bis 0,34 m verwendet. Das Puffersystem enthält darüber hinaus Enzyminhibitoren, die die Digestion der LI Proteine verhindern, wie Diisopropylfluorphosphat (DFP), Sojabohnen-Trypsininhibitor, TrasiloP, Quecksilberbenzoat, Pepstatin A und vorzugsweise Phenylmethylsulfonylfluorid (PMFS), und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Gemische davon.

Das Aufbrechen der Zellwandung kann in üblicher Weise erfolgen, beispielsweise mechanisch, z.B. durch einen Rotationsmischer, einen Mörser (Potter-Elvelyem-Methode), durch Ultraschall, Gefrieren und Auftauen, oder durch Kombination dieser Methoden. Bei einer bevorzugten Methode werden die Granulozyten durch Druckhomogenisation aufgebrochen.

Nach dem Aufbrechen der Granulozyten werden unlösliche Materialien, wie nicht gebrochene Zellen, Zelltrümmer und Lysosomen entfernt, beispielsweise durch Ultrazentrifu-gieren.

Die LI Proteine werden in reiner Form aus dem rohen Granulozytenextrakt nach einem beliebigen der folgenden Reinigungsverfahren erhalten.

a) Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung wird vorzugsweise in einem granulierten Gel, wie Agarose- oder polymerisierte Dextranperlen. durchgeführt, das ein geeignetes Gemisch von handelsüblichen Ampholyten enthält, um einen stabilen pH-Gradienten von etwa pH 5 bis 8 während des Verfahrens zu ergeben. Die isoelektrische Fokussierungsmethode wird mit einer maximalen Spannung von etwa 25 V/cm während etwa 10 bis 20 h bei einer Temperatur von etwa 5 bis 15° durchgeführt. Ein bevorzugtes Gel ist Ultrodex®, und der bevorzugte Ampholyt ist Ampholine®.

Die Probe wird vorzugsweise an der Kathodenseite des Gels aufgebracht. Die Lokalisierung der LI Proteinbanden kann durch pH-Wert-Messungen längs der Geloberfläche oder durch fleckenbildende Filterpapierabdrücke der Topoberfläche, beispielsweise mit Koomassie-Blau, erfolgen.

Die die LI Proteine enthaltenden Banden werden abgekratzt und mit einem geeigneten Puffer, der EDTA enthält, bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,5, eluiert.

Das Eluat wird von den Ampholyten und den Salzen durch Dialyse und/oder Gelfiltration befreit und durch Ul-trafiltration und/oder Lyophilisieren konzentriert.

b) Anionenaustauschchromatographie Die Anionenaustauschermaterialien, die bei dieser Methode verwendet werden, enthalten beispiele tertiäre oder quaternäre Aminogruppen und sind beispielse Diethylami-noethylcellulose, z. B. Diethylaminoethyl-Sepharose®, oder QAE-Cellulose (quaternäre Aminoethylcellulose). Der Granulozytenextrakt, der die LI Proteine enthält, wird auf die Säule in einem Puffer mit geringer Ionenstärke, der EDTA enthält, und mit einem pH-Wert von etwa 8,5 aufgetragen. Die LI Proteine werden spezifisch durch Calciumionen enthaltenden Puffer, beispielsweise einen Puffer, der 30 m-mola-res Barbital und 5 m-molares Calciumchlorid enthält,

eluiert.

c) Affinitätschromatographie Eine dritte Methode zur Reinigung des LI Proteins basiert auf der Affinitätschromatographie. Diese kann an Glasperlen mit gesteuerten Poren, mit einer grossen Oberfläche, z.B. von etwa 50 m2/g durchgeführt werden. Die Glasperlen werden in eine Säule eingesetzt und der rohe Granulozytenextrakt wird in einem geeigneten Puffer mit niedriger Molarität, der Calciumionen enthält, bei neutralem oder leicht saurem pH-Wert, z.B. von etwa pH-Wert 6 bis 7, aufgetragen. Die LI Proteine werden mit einem alkalischen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,5 bis 8,5, der etwa 50 m-molares EDTA und Polyethylenglykol oder Lithiumbromid enthält, eluiert.

Eine andere affinitätschromatographische Methode verwendet die anti-Ll Antikörpersäule. Die LI Proteine werden an den Antikörpern adsorbiert, wohingegen andere Proteine mit einem Puffer durchgewaschen werden. Anschliessend werden die LI Proteine mit einer Salzlösung, wie mit einem wässrigen Puffer vom pH-Wert etwa 3,5, der ein Salz enthält, wie Natriumchlorid oder Natriumjodid, eluiert.

d) Präparative Agarosegel-Elektrophorese Flachbett-Agarosegels mit geeigneten Abmessungen, die 75 m-molaren Barbital-/2,5 m-molaren EDTA-Puffer vom pH-Wert 8,5 enthalten, werden verwendet. Die Elektrophorese erfolgt bei 4 V/cm während 10 —18 h. Die LI Proteinbanden werden durch Fleckenbildung auf Filterpapierabdrücken der Geltopoberfläche lokalisiert. Die LI Proteinbanden werden in dem ch-Globulingebiet gefunden und werden durch Gefrieren/Auftauen und Zentrifugieren der relevanten Streifen des Agarosegels eluiert.

e) Kationenaustauschchromatographie Die Kationenaustauschchromatographie wird an Kationenaustauscherharzen, wie Sulfonylpropyl-substituierte-

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Cellulose oder polymerisiertes Dextran durchgeführt. Der rohe Granulozytenextrakt wird auf die Säule nach dem Vermischen mit einem Puffer mit niedriger Ionenstärke, der Calciumionen enthält, und mit einem pH-Wert von etwa 6 aufgetragen. Nicht adsorbierte Proteine werden mit dem Ausgangspuffer weggewaschen, und die LI Proteine werden mit einem Puffer, der EDTA und steigende Konzentrationen an Natriumionen enthält, eluiert.

f) Gelfiltration

Für die Gelfiltration werden Sephadex® G75 bis G200-Agarosegels (Sepharosegels), wie Ultragel®, oder Polyacryl-amidgel-Perlen, wie Bio-Gel® P-60 verwendet. Die Säule ist vorzugsweise eine lange Säule. Die Länge der Säule sollte etwa das 50fache des Durchmessers betragen. Der rohe Granulozytenextrakt wird als solcher aufgetragen, und die LI Proteine werden chromatographiert. Zum Füllen der Kolonne und zur Verarbeitung wird ein Puffer verwendet, der vorzugsweise 0,1 m Natriumeitrat, 2,5 m-molares EDTA-K2 und 0,25 m-molares Thimerosal enthält, pH 8,5. Die LI Proteine finden sich in einer Fraktion, die einem Molekulargewicht von 35 000 bis 40 000 Dalton entspricht.

g) Reversible Ausfällung mit Zn+ +

Die LI Proteine werden quantitativ aus wässrigen Lösungen mit neutralem oder alkalischem pH-Wert durch Behandeln mit Zn+ +-Ionen, insbesondere in der Form von wasserlöslichen Zinksalzen, wie Zinkacetat oder Zinkchlorid, ausgefällt. Beispielsweise kann eine wässrige Lösung, die die Ll-Proteine enthält, bei einem pH-Wert von etwa 8,5 mit einer etwa 10 m-molaren bis 100 m-molaren wässrigen Lösung von Zinkacetat behandelt werden. Das ausgefällte Ll-Zinksalz wird gesammelt, falls notwendig mit der wässrigen Pufferlösung gewaschen, mit einer komplexbildenden Säure behandelt, beispielsweise einer etwa 100 m-molaren wässrigen Diakalium-ethylendiamintetraessigsäurelösung vom pH-Wert 8,5, und zur Gewinnung der freien LI Proteine wird die Lösung durch eine Ionenaustauschersäule, beispielsweise Pharmacia PD-10, filtriert und lyophilisiert.

Die Salze des LI Proteins werden nach üblichen Methoden erhalten, z. B. durch Behandeln mit den relevanten Ionen, z.B. einer Base, einer Säure oder einem Salz, die bzw. das die gewünschten Ionen enthält, oder durch Ionenaustauscherbehandlung. Ein sehr unlösliches Mangansalz kann beispielsweise hergestellt werden durch Zusatz von Mn++-lonen, beispielsweise in der Form von einer etwa 10 m-molaren bis 100 m-molaren wässrigen Lösung von Manganacetat oder einem anderen wasserlöslichen Mangansalz zu einer wässrigen Lösung der LI Proteine.

Die Erfindung betrifft auch die monospezifischen Antisera gegen das LI Protein und die Antikörper enthaltenden Immunglobuline, insbesondere solche, wie sie durch Kaninchen erzeugt werden.

Monospezifische Antisera werden durch übliche Methoden erzeugt, z.B. durch wöchentliche Injektion der reinen LI Proteine mit vollständigem Freund's Adjuvans z. B. subkutan oder intramuskulär, in Dosierungen von etwa 100 |xg pro Kaninchen pro Woche während etwa 8 bis 16 Wochen. Das Serum wird dann aus den Tieren z. B. durch Venensektion und Gerinnung gewonnen. Anstelle von Kaninchen können auch andere nicht-menschliche warmblütige Tiere, insbesondere Säuger, z. B. Schafe, Ziegen, Ratten, Mäuse, Pferde und dgl. verwendet werden.

Die monospezifische Antikörper enthaltende Globulinfraktion kann aus dem Serum durch übliche Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Ionenaustauschchromato-graphie.

Zur Erzeugung der mo'nospezifischen anti-Ll Antikörper wird das monospezifische Antikörper enthaltende Antiserum oder die Globulinfraktion davon durch eine Säule geführt, in der die gereinigten LI Proteine an ein geeignetes Material, wie Agarose- oder Cellulosegel, konjugiert wurden. Nach dem Wegwaschen der nichtadsorbierten Proteine werden die anti-Ll Antikörpermoleküle durch einen Puffer mit einem pH-Wert von 3,5, der Natriumchlorid oder Na-triumjodid enthält, eluiert.

Die relevanten Fraktionen werden auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt, dialysiert und konzentriert.

Die anti-Ll Antikörper werden entweder gereinigt oder in roher Form, wie in der Form der Antiserum- oder Globu-linfraktionen davon, für qualitative oder quantitative Methoden zur Bestimmung von LI Proteinen in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten verwendet. Derartige Methoden umfassen die Ausfallung in Gele, die Nephelometrie, Radioimmunassay, Enzymimmunassay, Immunfluoreszenz und Immunperoxidase-zytohistochemische Techniken in üblicher Weise.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus Testkits bzw. Testausrüstungen, die den reinen monospezifischen anti-Ll Antikörper oder die anti-Ll Antikörper-Globulinfraktion oder das den anti-Ll Antikörper enthaltende Antiserum umfassen. Derartige Testkits sind vom üblichen Typ und zielen ab auf Einzel-Radioimmundiffusion, Latexagglutinatin, Spottest, Radioimmunassays, Enzymimmunassays, Immunfluoreszenz- und Enzymimmunhistochemische-Tests.

Derartige Kits können zusätzlich zu anti-Ll Antikörpern in reiner oder roher Form, getrocknet oder lyophilisiert in einem geeigneten Puffer, vorgefertigte Gele, Latex, Polystyrol, mit Formalin stabilisierte tierische rote Blutkörperchen oder ähnliche Teilchen, Enzyme, wie Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Enzymsubstrate, Fluoreszenz- oder Enzym-konjugierte-Antikörper und Materialien, die zur Abtrennung von Antikörper-gebundenen LI Molekülen von freien LI Molekülen geeignet sind, wie abgetötete Stämme von Staphylococcus aureus, die zu den Stämmen gehören, die Staphylococcus-Protein A erzeugen, Aktivkohle (die das freie LI Protein, jedoch nicht den Antikörper-Protein-Komplex adsorbiert), oder einen zweiten Antikörper, wie Ziegen- oder Anti-Kaninchen-Immunglobulin oder Ll-Proteine, markiert mit radioaktiven Isotopen, wie J125 oder mit Enzymen, wie Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase, enthalten. Der Kit kann auch Träger enthalten, auf denen monospezifische anti-Ll Antikörper an einer Oberfläche fixiert sind, z.B. die innere Oberfläche von Test-röhrchen, die Oberfläche von Glas- oder Kunststoffkügel-chen, Stücke von Filterpapier, Celluloseazetatmembranen oder ähnliche Materialien, sowie Puffer für derartige Methoden.

Vorstehend und nachfolgend werden folgende Abkürzungen verwendet:

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese

SDS Natriumdodecylsulfat

IEF isoelektrisches Fokussieren

SRID Einzel — Radioimmundiffusion

NHS normales Humanserum

ACD Säure-Citrat-Dextrose

DFP Diisopropylfluorphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EDTA-K2Dikaliumsalz von EDTA

DEAE Diethylaminoethyl

RIA Radioimmunassay

PBS mit Phosphat gepufferte Salzlösung

PASA Protein A enthaltender Staph. aureus

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Beispiel 1 : Isolierung von Granulozyten a) Ein Gemisch aus 435 ml frischem menschlichem Blut, 65 ml einer wässrigen Lösung, die 2,2% Trinatriumcitratdi- -hydrat enthält, 0,8% wasserfreier Zitronensäure und 2,45% Dextrose, 250 ml Dextran mit hohem Molekulargewicht (DextravenM50) und 23 ml einer Lösung, die 2,5 mM Zitronensäure, 45 mM Trinatriumcitrat, 80 mM Glucose und 15 mM Natriumchlorid enthält, lässt man 1 h bei 4 :C sedi-mentieren. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und bei 200 x g während 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Sediment wird mit 50 ml eisgekühltem destilliertem Wasser behandelt, wodurch die roten Blutkörperchen aufgelöst werden. Nach 30 s wird die Isotonie durch Zusatz von 16,5 ml eiskaltem 0,6 m Natriumchlorid wieder hergestellt. Die verbleibenden Leukozyten werden zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Die Granulozyten werden von den mononuklearen Zellen durch Zentrifugieren an Lymphoprep® [Material für das Zentrifugieren mit Dichtegradienten, bestehend aus 9,6% (Gew./Vol) Natriummetrizoat-Lösung, enthaltend 5,6% (Gew./Vol.) eines Erythrozyten-aggregieren-den Polysaccharids (Ficoll)], gefolgt vom Zentrifugieren bei 800 x g während 20 min bei 20 °C abgetrennt. Diese Verfahrensweise ergibt eine Ausbeute von etwa 5 x 108 Zellen, wobei etwa 95% Granulozyten sind.

b) Granulozytenextraktion Die wie unter a) erhaltenen Zellen werden erneut in 0,27 m Saccharose, enthaltend 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-K, und 0,25 mM Thimerosal, versetzt mit Trispuffer auf den pH-Wert 8,5, suspendiert. Anschliessend werden die Zellen nach French und Holm (4) durch Anlegen von 27,4 • 105Pa (28 kg/cm2) Druckluft während zwei Perioden von 2 min, wobei sie aus der Druckkammer in einer Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde entweichen können, homogenisiert. Während dieser Verfahrensweise wurden die Zellbehälter in Nasseis gehalten. Etwa 90% der Zellen werden aufgebrochen, und nach dem Zentrifugieren bei 100 000 x g während 1 h fanden sich etwa 90% des gesamten LI Proteins in der klaren überstehenden Flüssigkeit. Letztere wird als roher Granulozytenextrakt bezeichnet. Der gesamte Proteingehalt beträgt etwa 3 mg/ml, wobei 30% davon LI Proteine sind.

c) Präparative isoelektrische Fokussierung (IEF) Für die präparative IEF werden 110 x 240 x 5 mm Gelplatten verwendet, die aus Ultradex® (Dextran G75, verfeinert), enthaltend 2% (Gew./Vol.) Ampholine®, pH 5—8 (ein Gemisch von synthetischen Ampholyten mit Pufferkapazitäten an ihren isoelektrischen Punkten) bestehen. Die Proben [5 ml der überstehenden Flüssigkeit gemäss b)] werden mit einem gleichen Volumen von Ultradex®-Gel vermischt und 5 cm von der Kathode entfernt auf die Gelplatten aufgetragen. Die Trennung erfolgt während 18 h mit maximal 25 V cm-1,15 m A und 10 W. Die Proteinbanden werden sowohl durch Koomassie-Blau-Fleckenbildung auf einem Filterpapierabdruck der Gelplatte, als auch durch pH-Wertmessungen der Geltopoberfläche, lokalisiert. Die LI Proteine in dem pH 6,3 und 6,5 Abschnitt werden mit einem gleichen Volumen einer wässrigen Lösung, die 0,1 M Natriumacetat, 2,5 mM EDTA-K2 und 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5, enthält, durch Zentrifugieren bei 2000 x g während 20 min durch 0,45 um Milli pore" Filter eluiert. Die Ampholyte werden durch Dialyse gegen den Elutionspuffer über Nacht entfernt. Das verbleibende Protein und die Puffer enthaltenden Lösungen werden durch Ultrafiltration an Minicon1' Zellen (semipermeable Membran) konzentriert. Die Ausbeute dieser Verfahren beträgt etwa 20% des LI Proteins, das auf das präparative IEF-Gel aufgetragen wurde. 2,5 ml dieser Lösung werden auf eine Pharmacia" PD-10 Säule (Sephadex®

G25 M), equilibriert mit destilliertem Wasser, aufgetragen, und die LI Proteine werden mit 3,5 ml destilliertem Wasser eluiert und lyophilisiert, unter Bildung von 1 mg reinem LI Protein pl 6,3 und 6,5.

5 Das pl 6,3 und das pl 6,5 L1 Protein können auch getrennt nach dieser Methode gereinigt werden, unter Bildung von etwa 0,67 mg des pl 6,5 und etwa 0,33 mg des pl 6,3 Ll-Proteins.

io Beispiel _2

Die Methode nutzt die starke Änderung des isoelektrischen Punktes des LI Proteins aus, wenn es Calciumionen aufnehmen kann (2). Das Protein bindet in rohen Granulozytenextrakten an einen Anionenaustauscher, beispielsweise i5 des Diethylaminoethyltyps, bei alkalischem pH-Wert und mit einer Ethylendiamintetraessigsäure, in ausreichenden Mengen zur Bindung von Calciumionen, enthaltenden Puffer. Die LI Proteine können anschliessend spezifisch durch Zusatz von Calciumchlorid zu dem Puffer eluiert werden, 2o um eine Endkonzentration von etwa 5 — 10 mM pro Liter sicherzustellen.

Die rohen Granulozytenextrakte werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Ihr gesamter Proteingehalt liegt bei etwa 2—5 g pro Liter, wovon etwa 60% LI Protein ist. 25 DEAE-Sephacel® (Pharmacia, Schweden) wird mit 60 m-molarem Barbitalpuffer (7,7 g Diethylbarbitursäure und 10,5 g des Natriumsalzes davon in 11 Wasser), enthaltend 1 g 1 EDTA-K2, pH 8,5, equilibriert und in eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 1,5 x 5 cm, d.h. einem 30 Volumen von etwa 9 ml, gefüllt.

Die Probe, etwa 10 ml roher Granulozytenextrakt, verdünnt mit 30 ml EDTA-K2 Barbitalpuffer vom pH-Wert 8,5 wird mit einer Schlauchpumpe, die eine Strömungsgeschwindigkeit von etwa 2 ml/min ergibt, aufgetragen. Nicht adsor-35 bierte Proteine werden mit 100 ml Barbitalpuffer ausgewaschen. Vor dem Eluieren der LI Proteine wird die Säule ebenfalls mit 30 ml Barbitalpuffer ohne EDTA-K2 gewaschen. Die LI Proteine werden anschliessend mit 60 m-mola-rem Barbitalpuffer, der 5 mM CaCl2 enthält, pH 8,5, eluiert. 40 Die Fig. 1 zeigt das Gesamtprotein- und LI Protein-Elutionsprofil einer derartigen Ionenaustauschchromatogra-phie, und in der Fig. 2 ist das Proteinbanden-Muster dargestellt, wenn roher Leukozytenextrakt und gereinigtes LI Protein der analytischen Agarosegel-Elektrophorese unter-45 worfen wird. Es ist ersichtlich, dass das gereinigte LI Protein zwei Hauptbanden, wie vorstehend beschrieben, entsprechend pl 6,3 und pl 6,5 ergibt.

Die mit dem Calcium enthaltenden Puffer eluierte Menge an LI Protein liegt nahe bei 50% der in der Probe aufgetra-50 genen und wird in einem Gesamtvolumen von etwa 20 ml gefunden. Diese Lösung kann zweckmässig durch Ultrafiltration unter Verwendung von Millipore® CX-10 Membranen konzentriert werden. Dies führt zu einem gewissen Proteinverlust, in Abhängigkeit davon, ob EDTA zugesetzt wird 55 oder nicht, um die Bindung von LI Protein an die Membranen zu verhindern. Selbst ohne Zusatz von EDTA kann eine Gesamtausbeute von etwa 35% erzielt werden.

Wie in der Fig. 1 gezeigt, wird ein Teil des LI Proteins mit 60 m-molarem Barbitalpuffer, der 5 mM CaCl2 und 6o 125 mM NaCl enthält, pH 8,5, eluiert, jedoch ergibt dieses Protein Banden, die hauptsächlich anodal und kathodal von den Haupt-Ll-Banden liegen und teilweise denaturiertes oder komplexes LI Protein zusätzlich zu verschiedenen Proteinen darstellen dürften.

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Methoden in grossem Massstab Die vorstehend beschriebene Methode kann erfolgreich im Massstab vergrössert werden, um 50 ml rohe Granulozy-

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tenextrakte zu handhaben. Dies wird erzielt unter Verwendung einer Säule, die etwa 50 ml DEAE-Sephacel " (etwa 2,5 x 10 cm) enthält und proportionale Steigerung der wie vorstehend angegebenen Puffervolumina.

b) Hier wird ausgenützt, dass eine reversible Ausfällung der LI Proteine durch Zusatz von 10 mM Zn + + erzielt werden kann. Zu 10 ml rohem Leukozytenextrakt werden 90 ml Barbitalpuffer, 75 mM, pH 8,5, und 10 ml einer 100 mM Zn-Acetatlösung in Wasser gefügt. Die Ausfallung wird mehrfach, beispielsweise fünfmal, mit 75 m-molarem Barbitalpuffer, pH 8,5, mit 10 m-molarem Zn-Acetat gewaschen. Schliesslich wird die Ausfällung mit 75 m-molarem Barbitalpuffer, pH 8,5, gewaschen und durch tropfenweise Zugabe einer Lösung von 100 m-molarem EDTA-K2 in Wasser, pH-Wert durch 5 mM Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt, gelöst. Diese Proteinlösung wird auf eine Pharmacia PD-10-Säule aufgetragen, die mit destilliertem Wasser equilibriert ist, und die LI Proteine werden mit 3,5 ml destilliertem Wasser eluiert und lyophilisiert, unter Bildung von etwa 10 bis 20 mg reinen LI Proteinen.

Beispiel 3:

Herstellung von Antiserum für gereinigtes LI

Eine Lösung, die etwa 1 mg/ml gereinigtes pl 6,3 und pl 6,5 LI Protein (erhalten gemäss Beispiel 1 oder 2) in 0,1 M Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5, enthält, wird mit vollständigem Freund's Adjuvans homogenisiert. Ein Volumenteil dieses Gemischs, der etwa 100 |ig LI Proteine enthält, wird Kaninchen subkutan an verschiedenen Stellen einmal pro Woche während 6 Wochen injiziert. Die Kaninchen werden durch Venenpunktur ausgeblutet. Man lässt das Blut bei Raumtemperatur über Nacht gerinnen. Das Serum wird gewonnen und auf die Ll-Antise-rum-Aktivität getestet.

Normalerweise kann ein solches Antiserum in einer Verdünnung von 1:32 für eine einzelne radiale Immunpräzipita-tion und in einer Verdünnung von 1:2000 für den Radioimmunassay verwendet werden.

Beispiel 4: Testkit für den Radioimmunassay Der Testkit enthält (für 100 Tests):

1 Ampulle

2 ml lyophilisiertes anti-Ll Serum, erhalten gemäss Beispiel 3 1 Flasche

100 ml RIA-Puffer: 50 mM Natriumchlorid, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Natriumazid, eingestellt auf den pH-Wert 7,4

1 mit Kautschuk überzogene Ampulle

5 ml wässrige Lösung von mit radioaktivem Jod125 markierten LI Proteinen, eingestellt unter Bildung von 500 cpm/ ml (markiert nach der Bolton-Hunter-Methode)

1 Flasche

100 ml einer wässrigen Suspension von mit Formalin behandeltem Staphylococcus aureus (PASA = Protein A enthaltender Staph aureus des Cowan I-Stammes) in mit Phosphat gepufferter Salzlösung.

1 Flasche

2 ml einer RIA-Pufferlösung, enthaltend 50 ng LI Protein (Bezugslösung)

Verfahrensweise zur quantitativen Bestimmung von LI Proteinen durch RIA

Eine Reihe von Standards wird durch Zweifachverdünnung der gelieferten LI Bezugslösung auf 7,8 ng/ml mit RIA-Puffer bereitet. In eine Reihe von Testrohren werden 25 jal Patientenplasma, verdünnt auf 1:30 in RIA-Puffer oder Standardbezugslösung, pipettiert. Hierzu werden 20 |il anti-Ll Serum gefügt, und die Gemische werden 30 min bei 37 C inkubiert. Anschliessend werden 50 |il der Lösung mit dem radioaktiv markierten LI Protein zugesetzt, worauf 1 h bei 37 °C inkubiert wird. In jedes Röhrchen wird dann 1 ml suspendierte Staph. aureus Suspension gefügt, und es wird 10 min bei 2000 x g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment gemessen. Der Prozentsatz der Radioaktivität, bezogen auf die ursprünglich zugesetzte Radioaktivität, für die LI Bezugsstandardverdünnungen so aufgetragen, dass eine Bezugskurve gezeichnet werden kann. Die Werte der Patientenproben können von dieser Kurve abgelesen werden.

Beispiel 5: Testkit für die nephelometrische Bestimmung von LI Proteinen in Lösung Der Testkit enthält:

1 Ampulle

1,5 ml anti-Ll Antikörperlösung in pH 7,5 Puffer (Na-triumacetatpuffer, enthaltend 5 mM Calciumchlorid) mit einem Titer von etwa 1:32 beim Test durch Doppelimmundiffusion in Agarosegel.

1 Flasche

20 ml verdünnter Puffer wie vorstehend 1 Ampulle

0,5 ml einer Lösung von LI Protein in einer Konzentration von 400 |ig/ml

Anti-Ll Serum wird mit Verdünnungspuffer auf 1:15 verdünnt. 6 Standards LI Protein (1:1 bis 1:64) werden durch Zweifachverdünnung der Standard LI Lösung bereitet. Anschliessend werden 250 |il Antikörperverdünnung und 10 |il der Probe oder verdünnter LI Standard in Nephelometer-Cuvetten gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte wird von dem Nephelometer abgelesen.

Beispiel 6: Testkit für einzelne Radialimmundiffusions-analysen für LI Protein in Lösung Der Testkit enthält:

1 oder mehr vorbereitete Agarosegels mit einem Gehalt von 2% gleichmässig verteilter anti-Ll Antikörperlösung mit einem Titer von etwa 1:32 beim Test durch Doppeldiffusion in Gel, und 0,1 M Natriumacetat, 5 mM Calciumchlorid, 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5.

1 Ampulle

0,1 ml LI Proteinlösung mit einer Konzentration von 300 |ig/ml

Das Agarosegel wird in einer geschlossenen Kammer zur Verhinderung der Austrocknung des Gels bereitgestellt. Das Gel hat 18 vorbereitete Vertiefungen zum Auftrag von 10 (il der Standardlösungen und der zu untersuchenden Proben.

Beispiel 7: Testkits für den Latex-Agglutinationsassay für eine halbquantitative Bestimmung von LI Protein Der Testkit enthält:

a) 1 2 ml-Flasche einer Suspension von Latexteilchen von 50 (im Durchmesser, an die gereinigtes L1 Protein fixiert wurden.

b) 1 2 ml-Flasche einer Pufferlösung von anti-Ll Antikörper, die mit den vorstehend erwähnten Latexteilchen agglutinieren, mit einem Titer von 1:3 bis 1:4.

c) 1 0,5 ml-Flasche einer Pufferlösung des LI Proteins in einer Konzentration von 50 um/ml

1 Tropfen von a), b) und der zu untersuchenden Patientenprobe werden auf einem schwarzen Objektträger vermischt und 5 min auf die Agglutination beobachtet. Ein Nichtauf5

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treten der Agglutination bedeutet eine LI Konzentration von über 1000 ng/ml. In den positiven Kontroilösungen werden a), b) und c) vermischt, und es sollte keine Agglutination auftreten.

Beispiel 8: Testkits für den Spot-Test Der Testkit enthält:

10 Stück Celluloseacetat, 5 x 50 mm, mit zwei Flecken mit einem Durchmesser von 4 mm von getrocknetem spezifischem anti-Ll Antikörper, im Abstand von 10 und 30 ml von einem Ende,

a ) 1 Flasche

2 ml einer Pufferlösung, enthaltend spezifische anti-Ll Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase,

b) 1 Flasche

10 ml einer wässrigen Trispuffer/isotonische Salzlösung-pH 7,4-Lösung, enthaltend 1 mg/ml Diaminobenzidin (DAB)

c) 1 Flasche

1 ml einer wässrigen Pufferlösung von LI Protein in einer Konzentration von 50 ng/ml.

Zum Test wird 1 Tropfen der Probelösung auf den ersten Fleck aufgetragen und 1 Tropfen der Lösung c) auf den zweiten Fleck. Nach 10 min wird der Teststreifen mit Tris-puffer-Salzlösung während 5 min gewaschen. Anschliessend wird 1 Tropfen der Lösung a) auf jeden Fleck aufgetragen, 10 min bei Raumtemperatur belassen, und der Streifen wird erneut 5 min in Trispuffer-Salzlösung gewaschen. Zu 1 ml Lösung b) werden 5 nl 30% Wasserstoffperoxid gefügt. Ein Tropfen dieses Gemischs wird auf jeden Fleck aufgetragen. Eine nach 3 min auftretende ausgeprägte Braunfarbung zeigt die Anwesenheit von LI Proteinen in der Probe an.

Durch Serienverdünnung der Probe kann der Test halbquantitativ gestaltet werden.

Beispiel 9: Testkits für LI Proteine durch Enzymimmunassay Die Testkits enthalten:

1 Mikroliter-Falle mit 5 x 10 Vertiefungen aus Kunststoffmaterial, wobei die Innenoberfläche des Bodens und des unteren Teils der Vertiefungen mit spezifischen anti-Ll Antikörpern überzogen sind.

a) 1 Flasche

2 ml einer Pufferlösung, die spezifische anti-Ll Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase enthalten.

b) l Flasche

10 ml einer wässrigen Trispuffer/iso tonische Salzlösung-pH 7,4-Lösung, enthaltend 1 mg/ml Diaminobenzidin (DAB)

c) 1 Flasche

1 ml einer wässrigen Pufferlösung von LI Protein in einer Konzentration von 50 ng/ml

Testverfahren: 50 nl der Testprobenlösung oder der Lösung c) werden in die Vertiefungen gefügt und bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Anschliessend werden die Vertiefungen mit Trispuffer/Salzlösung mit einem Gehalt von 0,5% Rinderserumalbumin gewaschen. In jede Vertiefung werden 50 nl Lösung a) gefügt, und es wird 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden wie vorstehend gewaschen. Zu 1 ml der Lösung b) werden 5 nl 30% Wasserstoffperoxid gefügt und 50 nl dieses Gemischs werden in jede Vertiefung gefügt. Die Schale wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, und die Farbintensität in jeder Vertiefung wird photometrisch bestimmt.

' Legenden zu den Figuren Fig. 1: Chromatographisches Profil von 9 ml rohem Leukozytenextrakt an einer DEAE-Sephacel®-Säule,

1,5 x 5 cm. Der Gesamtproteingehalt wurde durch UV-Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt, und die LI Konzentration durch Einzel — Radialimmundiffusion.

Fig. 2: Die Proteinbandenmuster des rohen Granulozy-tenextrakts A, der 5 m-molaren CaCl2-Fraktion B und der 125 m-molaren NaCl-Fraktion C bei der Agarosegel-Elektrophorese in Barbitalpuffer, 75 m-molar, mit 2,5 mM EDTA-K,, pH 8,5. Die Fraktion B enthält die beiden reinen LI Proteine pl 6,3 und pl 6,5.

Literaturangaben

(1) Magne K. Fagerhol, Inge Dale und Teije Andersson, Scand. J. Haematol. (1980) 24,393-398

(2) M.K. Fagerhol, I. Dale, T. Andersson, Bull, europ. Phy-siopath. resp. 1980,16 (suppl) 272 281.

(3) Karen E. Willard, Anne Karine Thorsrud, Eimar Munthe und Egil Jellum, Clin. Chem., Vol. 28, Nr. 4, 1067-1073 (1982)

(4) French, P.C. und Holm, R. A., (1947) Thromb. Diath. Haemorrh. 32,432—440

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1 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Reine pi 6,3 oder pi 6,5 Ll-Proteine, dadurch charakterisiert, dass ihr Molekulargewicht etwa 36 500 Dalton beträgt, dass jedes aus drei Polypeptiden vom Molekulargewicht von etwa 12 500 Dalton besteht, die am N-Terminal die Aminosäuresequenz

Met-Leu-Thr-Glu haben, Gemische bestehend aus den beiden LI-Proteinen und Salze davon.

2. Reines pl 6,3 Ll-Protein und Salze davon gemäss Patentanspruch 1.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Reines pl 6,5 Ll-Protein und Salze davon gemäss Patentanspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung der reinen pl 6,3 oder pl 6,5 Ll-Proteine, von Gemischen der beiden Proteine, und Salzen davon, gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Humangranulozyten in einem Puffersystem enthaltend Enzyminhibitoren, die die Digestion der Ll-Proteine verhindern, und ein Mittel, das das gleichzeitige Aufbrechen der Lysosomenmembran verhindert, aufbricht, nichtlösliches Zellmaterial entfernt und die überstehende Flüssigkeit a) einem isoelektrischen Fokussieren und Eluieren der das pl 6,3 und/oder das pl 6,5 Ll-Protein enthaltenden Banden mit einem Puffer, oder b) einer Anionenaustauschchromatographie mit einem EDTA-enthaltenden Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und Eluieren der gewünschten Ll-Proteine mit einem Cal-ciumionen enthaltenden Puffer, oder c) einer Affinitätschromatographie, oder d) einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese, oder e) einer Kationenaustauschchromatographie, oder

0 einer Gelfiltration oder g) einer reversiblen Ausfällung mit Zn++, oder jeglicher Kombination der Stufen a) bis g) unterwirft, die Eluate von jeglichen Ampholyten und/oder Salzen befreit, die erhaltene Lösung der reinen Ll-Proteine konzentriert und die erhaltenen Ll-Proteine in Form ihrer Salze oder als freie Proteine isoliert.

5. Reine pl 6,3 oder pl 6,5 Ll-Proteine, Gemische bestehend aus den beiden Proteinen, oder Salz davon, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 4.

6. Verwendung der Ll-Proteine gemäss Patentanspruch 1,2,3 oder 5 zur Diagnose ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.

7. Monospezifische anti-Ll Antikörper, reagierend mit den reinen LI-Proteinen gemäss einem der Patentansprüche 1,2, 3 oder 5.

8. Monospezifische anti-Ll Antisera enthaltend monospezifische Antikörper gemäss Patentanspruch 7.

9. Verfahren zur Herstellung von anti-Ll Antisera und anti-Ll Antikörpern gemäss Patentanspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass Tiere mit reinen LI-Proteinen gemäss Patentanspruch 1,2,3 oder 5 behandelt werden.

10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die monospezifischen Antisera erzeugt werden durch wöchentliche Injektion der reinen Ll-Proteine mit vollständigem Freund's Adjuvans, z.B. subkutan oder intramuskulär, in Dosierungen von 100 jxg pro Kaninchen pro Woche während 8 bis 16 Wochen, und Gewinnen des Serums aus den Tieren durch Venensektion und Gerinnung.

11. Verfahren nach einem der Patentansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die monospezifische Antikörper enthaltenden Globulinfraktionen von den LI Antisera isoliert und als ein Ausgangsmaterial zum Isolieren der anti-Ll Antikörper verwendet werden.

12. Verwendung der anti-Ll Antisera und anti-Ll Antikörper gemäss Patentanspruch 7 oder 8 zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von LI Proteinen in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten.

13. Testkit, enthaltend reine pl 6,3 oder pl 6,5 Ll-Proteine, Gemische bestehend aus den beiden LI-Proteinen oder Salze davon, gemäss Patentanspruch 1, 2, 3 oder 5, und die monospezifischen anti-Ll Antikörper, oder anti-Ll Antisera gemäss Patentanspruch 7 oder 8.