JPH0784479B2 - Ｌ１蛋白質に対する抗体、該抗体を含んで成る試薬及び該抗体を用いる測定法 - Google Patents
Ｌ１蛋白質に対する抗体、該抗体を含んで成る試薬及び該抗体を用いる測定法Info
- Publication number
- JPH0784479B2 JPH0784479B2 JP59141568A JP14156884A JPH0784479B2 JP H0784479 B2 JPH0784479 B2 JP H0784479B2 JP 59141568 A JP59141568 A JP 59141568A JP 14156884 A JP14156884 A JP 14156884A JP H0784479 B2 JPH0784479 B2 JP H0784479B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- antibody
- buffer
- acid
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、L1蛋白質に対する抗体、該抗体を含んで成
るL1蛋白質測定用試薬、及び該抗体を用いるL1蛋白質の
測定方法に関する。
るL1蛋白質測定用試薬、及び該抗体を用いるL1蛋白質の
測定方法に関する。
（発明の背景） 血球の内、白血球のみが核を有し、そして血漿中に見出
される多くの蛋白質を産生することができる。1mm3の血
液は約6,000〜10,000個の白血球を含有する。白血球の
亜群に顆粒球があり、このものはさらに全顆粒球の約95
％を占める好中多形核顆粒球、好酸性顆粒球、及び好塩
基性顆粒球に亜分類される。健康な成人においては毎日
約1011個の顆粒球が骨髄から放出されるが、深刻な感染
及び炎症状態においてはこれが10倍に増加することがあ
る。通常、白血球は、その生理的機能を発揮しそして最
終的に引退する組織に入るまでに、循環中約６時間の走
行時間を有する。アイソトープラベル顆粒球を用いる研
究、及び組織への白血球の浸潤の程度の変化を示す組織
学的研究により示されるごとく、白血球のターンオーバ
ーは健康な場合と病気の場合で相当異なる。しかしなが
ら、これらの方法はいずれも、白血球のターンオーバー
についての臨床的研究のために容易に用いられない。こ
れに代る容易に行うことができる方法は、白血球の機能
中及び／又は引退中における１又は複数の特徴的な白血
球蛋白質の放出を監視する方法である。
される多くの蛋白質を産生することができる。1mm3の血
液は約6,000〜10,000個の白血球を含有する。白血球の
亜群に顆粒球があり、このものはさらに全顆粒球の約95
％を占める好中多形核顆粒球、好酸性顆粒球、及び好塩
基性顆粒球に亜分類される。健康な成人においては毎日
約1011個の顆粒球が骨髄から放出されるが、深刻な感染
及び炎症状態においてはこれが10倍に増加することがあ
る。通常、白血球は、その生理的機能を発揮しそして最
終的に引退する組織に入るまでに、循環中約６時間の走
行時間を有する。アイソトープラベル顆粒球を用いる研
究、及び組織への白血球の浸潤の程度の変化を示す組織
学的研究により示されるごとく、白血球のターンオーバ
ーは健康な場合と病気の場合で相当異なる。しかしなが
ら、これらの方法はいずれも、白血球のターンオーバー
についての臨床的研究のために容易に用いられない。こ
れに代る容易に行うことができる方法は、白血球の機能
中及び／又は引退中における１又は複数の特徴的な白血
球蛋白質の放出を監視する方法である。
（従来技術） 先行する３つの報告において、異る疾患において濃度が
異る多くの蛋白質が白血球中に含まれていることが示唆
されている。これらの蛋白質のいくつかは、ラベルされ
たL1、特にpI6.3L1及びpI6.5L1（文献１及び２）、又は
R:6及びR:7（文献３）である。２次元電気泳動分析（IS
O-DALT）に従えば、pI6.5L1蛋白質はR:6蛋白質と同一で
あり、そしてpI6.3L1蛋白質はR:7蛋白質と同一である。
報告（１）〜（３）においては、これらの蛋白質は、数
百種類〜数千種類の他の蛋白質中に、分析的方法によっ
て見出された。報告（１）においては、定量方法の確立
及び予備的特徴付けを目的としてL1蛋白質を精製する試
みが行われた。調製用ゲル過、等電点電気泳動、及び
アフィニティークロマトグラフィーにより約51,000ドル
トンの分子量（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びゲル過による）を有する蛋白質が得られ、このもの
は非常に不安定であったが、ラビットを免疫するために
使用することができた（１）。報告（１）において適用
された精製法は非常に少い収量の51,000ドルトン蛋白質
をもたらし、そして蛋白質は操作中にしばしば失われ
た。51,000ドルトン蛋白質の注射によりラビットを免疫
することよりL1蛋白質に対する抗血清が得られたが、同
時に他の蛋白質に対する抗体がしばしば伴った。これら
の抗血清から、正常ヒト血清又はヒト組織抽出物を用い
る吸着により不所望の抗体を除去しなければならなかっ
た。報告（１）においては、酵素阻害剤をなんら添加す
ることなく、白血球の凍結／解凍、及び機械的ホモジナ
イズにより、未文画の白血球が使用された。
異る多くの蛋白質が白血球中に含まれていることが示唆
されている。これらの蛋白質のいくつかは、ラベルされ
たL1、特にpI6.3L1及びpI6.5L1（文献１及び２）、又は
R:6及びR:7（文献３）である。２次元電気泳動分析（IS
O-DALT）に従えば、pI6.5L1蛋白質はR:6蛋白質と同一で
あり、そしてpI6.3L1蛋白質はR:7蛋白質と同一である。
報告（１）〜（３）においては、これらの蛋白質は、数
百種類〜数千種類の他の蛋白質中に、分析的方法によっ
て見出された。報告（１）においては、定量方法の確立
及び予備的特徴付けを目的としてL1蛋白質を精製する試
みが行われた。調製用ゲル過、等電点電気泳動、及び
アフィニティークロマトグラフィーにより約51,000ドル
トンの分子量（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びゲル過による）を有する蛋白質が得られ、このもの
は非常に不安定であったが、ラビットを免疫するために
使用することができた（１）。報告（１）において適用
された精製法は非常に少い収量の51,000ドルトン蛋白質
をもたらし、そして蛋白質は操作中にしばしば失われ
た。51,000ドルトン蛋白質の注射によりラビットを免疫
することよりL1蛋白質に対する抗血清が得られたが、同
時に他の蛋白質に対する抗体がしばしば伴った。これら
の抗血清から、正常ヒト血清又はヒト組織抽出物を用い
る吸着により不所望の抗体を除去しなければならなかっ
た。報告（１）においては、酵素阻害剤をなんら添加す
ることなく、白血球の凍結／解凍、及び機械的ホモジナ
イズにより、未文画の白血球が使用された。
報告（３）には、R:6蛋白質及びR:7蛋白質の測定のため
の分析的方法のみが記載されており、分離又は精製方法
は開示されていない。
の分析的方法のみが記載されており、分離又は精製方法
は開示されていない。
（発明の目的） この発明は、白血球からL1蛋白質を抽出しそして精製す
るための穏和で効果的な方法を確立してその特徴付けを
行い、そしてこれらの蛋白質に対する単一特異性抗血清
又は抗体を提供することを目的とする。この発明の他の
目的は、該抗体を含んで成るL1蛋白質測定用試薬、及び
該抗体を用いてのL1蛋白質の測定方法を提供することで
ある。
るための穏和で効果的な方法を確立してその特徴付けを
行い、そしてこれらの蛋白質に対する単一特異性抗血清
又は抗体を提供することを目的とする。この発明の他の
目的は、該抗体を含んで成るL1蛋白質測定用試薬、及び
該抗体を用いてのL1蛋白質の測定方法を提供することで
ある。
（発明の概要） 驚くべきことに、顆粒球のみを分離源として使用し、そ
して顆粒球中のリソゾームが同時に破壊されない条件下
で顆粒球を破壊した場合に、L1蛋白質が純粋且つ安定な
状態で得られることが見出された。この技術は、酵素阻
害剤及びリソゾーム膜を安定化する薬剤の存在下で顆粒
球を加圧ホモジナイズすることにより達成される。
して顆粒球中のリソゾームが同時に破壊されない条件下
で顆粒球を破壊した場合に、L1蛋白質が純粋且つ安定な
状態で得られることが見出された。この技術は、酵素阻
害剤及びリソゾーム膜を安定化する薬剤の存在下で顆粒
球を加圧ホモジナイズすることにより達成される。
従ってこの発明は、純粋なpI6.3L1蛋白質及び純粋なpI
6.5L1蛋白質、及びこれらの混合物；酵素阻害剤及びリ
ソゾーム膜を安定化する薬剤の存在下で顆粒球を加圧ホ
モジナイズすることによる顆粒球からの前記蛋白質の抽
出、及び種々の方法によるこれらの精製のための方法；
単一特異性抗血清又は抗体を製造するための前記蛋白質
の使用；前記L1蛋白質により実験動物を免疫することに
より前記単一特異性抗血清又は抗体を製造する方法；単
一特異性抗血清及び抗体等；細胞、組織及び体液中のL1
蛋白質の定性及び／又は定量測定のための前記抗血清又
は抗体及び／又は純粋なL1蛋白質の作用；並びに、場合
によっては放射性同位元素又は酵素によりラベルされた
純粋なL1蛋白質、抗血清及び／又は抗体を含んで成る試
験キットに関する。
6.5L1蛋白質、及びこれらの混合物；酵素阻害剤及びリ
ソゾーム膜を安定化する薬剤の存在下で顆粒球を加圧ホ
モジナイズすることによる顆粒球からの前記蛋白質の抽
出、及び種々の方法によるこれらの精製のための方法；
単一特異性抗血清又は抗体を製造するための前記蛋白質
の使用；前記L1蛋白質により実験動物を免疫することに
より前記単一特異性抗血清又は抗体を製造する方法；単
一特異性抗血清及び抗体等；細胞、組織及び体液中のL1
蛋白質の定性及び／又は定量測定のための前記抗血清又
は抗体及び／又は純粋なL1蛋白質の作用；並びに、場合
によっては放射性同位元素又は酵素によりラベルされた
純粋なL1蛋白質、抗血清及び／又は抗体を含んで成る試
験キットに関する。
（発明の具体的な記載） 本発明において、L1蛋白質抗原は、次の（１），（２）
又は（３）のいずれかの蛋白質抗原である。
又は（３）のいずれかの蛋白質抗原である。
（１） 次の性質： （ａ） ゲル濾過及び密度勾配遠心により測定した分子
量が36,500ドルトンである、 （ｂ） ポリアクリルアミドゲル上でのSDS−電気泳動
において、12,500ドルトンのおよそ同一の分子量を有す
る３個のポリペプチドを示す、 （ｃ） 等電点6.3を有する、 を有する蛋白質（pI6.3L1）、 （２） 前記（ａ）及び（ｂ）の性質並びに等電点約6.
5を有する蛋白質（pI6.5L1）、または （３） 前記蛋白質（１）と蛋白質（２）との混合物。
量が36,500ドルトンである、 （ｂ） ポリアクリルアミドゲル上でのSDS−電気泳動
において、12,500ドルトンのおよそ同一の分子量を有す
る３個のポリペプチドを示す、 （ｃ） 等電点6.3を有する、 を有する蛋白質（pI6.3L1）、 （２） 前記（ａ）及び（ｂ）の性質並びに等電点約6.
5を有する蛋白質（pI6.5L1）、または （３） 前記蛋白質（１）と蛋白質（２）との混合物。
上記の蛋白質抗原を「L1」と称し、この内等電点が6.3
のものを「pI6.3L1」、「pI6.3蛋白質」、「pI6.3」等
と称し、また等電点が6.5のものを「pI6.5L1」、「pI6.
5蛋白質」、「pI6.5」等と称する場合がある。また、こ
れらの抗原に対する抗体を「抗−L1抗体」と称し、抗血
清の形態の該抗体を「抗−L1抗血清」と称する。
のものを「pI6.3L1」、「pI6.3蛋白質」、「pI6.3」等
と称し、また等電点が6.5のものを「pI6.5L1」、「pI6.
5蛋白質」、「pI6.5」等と称する場合がある。また、こ
れらの抗原に対する抗体を「抗−L1抗体」と称し、抗血
清の形態の該抗体を「抗−L1抗血清」と称する。
L1蛋白質の塩は、特に、非毒性の医薬として許容される
塩、あるいはL1蛋白質の沈澱及び／又は精製方法に使用
することができる塩である。
塩、あるいはL1蛋白質の沈澱及び／又は精製方法に使用
することができる塩である。
このような塩は、例えば金属塩、例えばアルカリ金属塩
又はアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム又はカルシウム塩又は亜鉛塩、及びこ
れらの類するもの、又はアンモニア、又は第一級、第二
級又は第３級アミンとのアンモニウム塩、例えば脂肪
族、脂環族、脂環−脂肪族又は芳香脂肪族の第二級又は
第三級アミン、例えばモノ−，ジ−もしくはトリ−低級
アルキルアミン、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ
低級アルキルアミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミ
ン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミン又はトリス
−（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩、又はカルボ
ン酸の塩基性脂肪族エステル、例えばエチレンジアミン
四酢酸低級アルキルエステル、例えばテトラエチルエス
テル等との塩である。
又はアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム又はカルシウム塩又は亜鉛塩、及びこ
れらの類するもの、又はアンモニア、又は第一級、第二
級又は第３級アミンとのアンモニウム塩、例えば脂肪
族、脂環族、脂環−脂肪族又は芳香脂肪族の第二級又は
第三級アミン、例えばモノ−，ジ−もしくはトリ−低級
アルキルアミン、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ
低級アルキルアミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミ
ン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミン又はトリス
−（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩、又はカルボ
ン酸の塩基性脂肪族エステル、例えばエチレンジアミン
四酢酸低級アルキルエステル、例えばテトラエチルエス
テル等との塩である。
前記以外の塩は、無機酸との酸付加塩、特に鉱酸、例え
ば塩酸、硫酸、燐酸との酸付加塩、又は有機酸との酸付
加塩、例えばカルボン酸、スルホン酸又はスルホ酸、場
合によっては置換されている低級アルカンカルボン酸、
例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン
酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、マロン
酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、又は場合によっては
置換されてる芳香族酸、例えば安息香酸、桂皮酸、マン
デル酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、２−フ
ェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン
酸、ニコチン酸、イソ−ニコチン酸、又はアミノ酸、低
級アルカンスルホン酸、例えばメタンスルホン酸、エタ
ンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベン
ゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフ
タリンスルホン酸、又はアスコルビン酸等との酸付加塩
である。
ば塩酸、硫酸、燐酸との酸付加塩、又は有機酸との酸付
加塩、例えばカルボン酸、スルホン酸又はスルホ酸、場
合によっては置換されている低級アルカンカルボン酸、
例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン
酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、マロン
酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、又は場合によっては
置換されてる芳香族酸、例えば安息香酸、桂皮酸、マン
デル酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、２−フ
ェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン
酸、ニコチン酸、イソ−ニコチン酸、又はアミノ酸、低
級アルカンスルホン酸、例えばメタンスルホン酸、エタ
ンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベン
ゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフ
タリンスルホン酸、又はアスコルビン酸等との酸付加塩
である。
両蛋白質は、それぞれpH6.3及びpH6.5の等電点により特
徴付けられる。両蛋白質の分子量は、ゲル過及び密度
勾配遠心により測定した場合、同一であり、そして約3
6,500ドルトンである。ポリアクリルアミドゲル上でのS
DS−電気泳動により、蛋白質が12,500ドルトンのおよそ
同一の分子量を有する３個のポリペプチドから成ること
が示される。これらのポリペプチドの各々は、標準的エ
ドマン（Edman）法において、Ｎ−末端から始まるアミ
ノ酸配列:Meth-Leu-Thre-Gluを有する。正味電荷及びL1
蛋白質上の抗原部位の利用性は、カルシウムイオンの存
否に大きく影響される。これらの蛋白質は、カルシウム
イオンの存在下で、試験管内において、抗原として非常
に強く反応するであろう。
徴付けられる。両蛋白質の分子量は、ゲル過及び密度
勾配遠心により測定した場合、同一であり、そして約3
6,500ドルトンである。ポリアクリルアミドゲル上でのS
DS−電気泳動により、蛋白質が12,500ドルトンのおよそ
同一の分子量を有する３個のポリペプチドから成ること
が示される。これらのポリペプチドの各々は、標準的エ
ドマン（Edman）法において、Ｎ−末端から始まるアミ
ノ酸配列:Meth-Leu-Thre-Gluを有する。正味電荷及びL1
蛋白質上の抗原部位の利用性は、カルシウムイオンの存
否に大きく影響される。これらの蛋白質は、カルシウム
イオンの存在下で、試験管内において、抗原として非常
に強く反応するであろう。
L1蛋白質の熱安定性は中性及びアルカリ性pHにおいて高
い。5mM EDTA水溶液中、pH8.5における15分間の煮沸に
おいて90％の蛋白質が残存する。L1蛋白質は、例えば約
４〜５の酸性pHにおいてエタノールにより部分的に沈澱
する。
い。5mM EDTA水溶液中、pH8.5における15分間の煮沸に
おいて90％の蛋白質が残存する。L1蛋白質は、例えば約
４〜５の酸性pHにおいてエタノールにより部分的に沈澱
する。
L1蛋白質は人体中で特異的な分布を示し、好中顆粒球、
単球、及び正常な皮膚以外の扁平上皮細胞中に大量に見
出される。これらの蛋白質はさらに、扁平上皮型の多く
の癌細胞、並びに白血病細胞及びリンパ腫細胞、特に骨
髄性白血病型細胞及び単球リンパ腫型の細胞中にも見出
される。L1蛋白質は、尿路及び肺の扁平癌の大部分にお
いて見出される。L1蛋白質はまた、健康な個体の正常な
体液中に相対的に低濃度で存在し、増加した程度の炎症
を伴う条件下において増加した濃度で存在する。白血球
において、L1蛋白質は細胞質ゾル画分中に90％に存在す
る。
単球、及び正常な皮膚以外の扁平上皮細胞中に大量に見
出される。これらの蛋白質はさらに、扁平上皮型の多く
の癌細胞、並びに白血病細胞及びリンパ腫細胞、特に骨
髄性白血病型細胞及び単球リンパ腫型の細胞中にも見出
される。L1蛋白質は、尿路及び肺の扁平癌の大部分にお
いて見出される。L1蛋白質はまた、健康な個体の正常な
体液中に相対的に低濃度で存在し、増加した程度の炎症
を伴う条件下において増加した濃度で存在する。白血球
において、L1蛋白質は細胞質ゾル画分中に90％に存在す
る。
L1蛋白質は、体液、細胞及び組織中のL1蛋白質含量の定
量的及び／又は定性的測定のためのマーカー蛋白質とし
て、例えばI125又はP32により放射性ラベルされた形で
使用することができる。
量的及び／又は定性的測定のためのマーカー蛋白質とし
て、例えばI125又はP32により放射性ラベルされた形で
使用することができる。
L1蛋白質は、動物、例えばラビットにおける良好な免疫
原である。
原である。
この発明はさらに純粋なpI6.3L1蛋白質及び純粋なpI6.5
L1蛋白質、これらの混合物、並びにこれらの塩の製造方
法に関し、この方法は、ヒト顆粒球を適切な緩衝液系に
おいて破砕し、非溶解細胞物質を除去し、そして上清液
を （ａ） 等電点電気泳動に付し、そしてpI6.3L1蛋白質
及び／又はpI6.5L1蛋白質を含有するバンドを緩衝液で
溶出し；あるいは、 （ｂ） 約8.5のpHにおいてEDTA含有緩衝液を用いて陰
イオン交換クロマトグラフィーに付し、そしてカルシウ
ムイオンを含有する緩衝液を用いて目的とするL1蛋白質
を溶出し；あるいは、 （ｃ） アフィニティークロマトグラフィーに付し；あ
るいは、 （ｄ） 調製用アガロースゲル電気泳動に付し；あるい
は、 （ｅ） 陽イオン交換クロマトグラフィーに付し；ある
いは、 （ｆ） ゲル過に付し；あるいは、 （ｇ） Znを用いて可逆的沈澱を行い；あるいは、 段階（ａ）〜（ｇ）を任意に組合わせて行い、溶出物を
両性電解質及び／又は塩から遊離せしめ、純粋なL1蛋白
質の得られた溶液を濃縮し、所望により得られた濃縮液
を凍結乾燥し、そして所望により得られたL1蛋白質を塩
に転換し、又は得られた塩を遊離蛋白質に転換すること
を特徴とする。
L1蛋白質、これらの混合物、並びにこれらの塩の製造方
法に関し、この方法は、ヒト顆粒球を適切な緩衝液系に
おいて破砕し、非溶解細胞物質を除去し、そして上清液
を （ａ） 等電点電気泳動に付し、そしてpI6.3L1蛋白質
及び／又はpI6.5L1蛋白質を含有するバンドを緩衝液で
溶出し；あるいは、 （ｂ） 約8.5のpHにおいてEDTA含有緩衝液を用いて陰
イオン交換クロマトグラフィーに付し、そしてカルシウ
ムイオンを含有する緩衝液を用いて目的とするL1蛋白質
を溶出し；あるいは、 （ｃ） アフィニティークロマトグラフィーに付し；あ
るいは、 （ｄ） 調製用アガロースゲル電気泳動に付し；あるい
は、 （ｅ） 陽イオン交換クロマトグラフィーに付し；ある
いは、 （ｆ） ゲル過に付し；あるいは、 （ｇ） Znを用いて可逆的沈澱を行い；あるいは、 段階（ａ）〜（ｇ）を任意に組合わせて行い、溶出物を
両性電解質及び／又は塩から遊離せしめ、純粋なL1蛋白
質の得られた溶液を濃縮し、所望により得られた濃縮液
を凍結乾燥し、そして所望により得られたL1蛋白質を塩
に転換し、又は得られた塩を遊離蛋白質に転換すること
を特徴とする。
L1蛋白質の抽出源として使用される顆粒球は、新鮮なヒ
ト血液から、任意の常法に従って、例えばデキストラン
沈澱及び密度勾配遠心により得られる。
ト血液から、任意の常法に従って、例えばデキストラン
沈澱及び密度勾配遠心により得られる。
中で顆粒球を破砕する緩衝液系は、リソゾームの同時的
破砕を防止する薬剤、例えばグリセリン、デキストラ
ン、及び好ましくはシュークロースを、細胞壁の破壊の
前後において浸透圧を安定化するのに十分な濃度におい
て含有する。例えば、シュークロースは0.27M〜0.34Mの
濃度で使用する。緩衝液系はさらに、L1蛋白質の消化を
防止する酵素阻害剤、例えばジイソプロピルフルオロホ
スフェート（DFP）、大豆トリプシン阻害物質、トラシ
ロール（Trasilol）（登録商標）、安息香酸水銀、ペプ
スタチンＡ、及び好ましくはフェニルメチルスルホニル
フルオリド（MPFS）及びエチレンジアミン四酢酸（EDT
A）、又はこれらの混合物を含有する。
破砕を防止する薬剤、例えばグリセリン、デキストラ
ン、及び好ましくはシュークロースを、細胞壁の破壊の
前後において浸透圧を安定化するのに十分な濃度におい
て含有する。例えば、シュークロースは0.27M〜0.34Mの
濃度で使用する。緩衝液系はさらに、L1蛋白質の消化を
防止する酵素阻害剤、例えばジイソプロピルフルオロホ
スフェート（DFP）、大豆トリプシン阻害物質、トラシ
ロール（Trasilol）（登録商標）、安息香酸水銀、ペプ
スタチンＡ、及び好ましくはフェニルメチルスルホニル
フルオリド（MPFS）及びエチレンジアミン四酢酸（EDT
A）、又はこれらの混合物を含有する。
細胞壁の破砕は常法に従って、例えば機械的に、例えば
回転ミキサー、乳棒（Potter-Elvelyem法）により、超
音波により、凍結及び解凍により、又はこれらの方法の
組合わせにより行うことができる。好ましい方法におい
ては、顆粒球は加圧ホモジネーションにより破砕する。
回転ミキサー、乳棒（Potter-Elvelyem法）により、超
音波により、凍結及び解凍により、又はこれらの方法の
組合わせにより行うことができる。好ましい方法におい
ては、顆粒球は加圧ホモジネーションにより破砕する。
顆粒球を破砕した後、不溶解物、例えば未破砕細胞、細
胞片及びリソゾームを、例えば超遠心分離により除去す
る。
胞片及びリソゾームを、例えば超遠心分離により除去す
る。
次の精製法のいずれかを使用して粗顆粒球抽出物からL1
蛋白質が純粋な形で得られる。
蛋白質が純粋な形で得られる。
（ａ） 等電点電気泳動 等電点電気泳動は、操作中に約pH5から８の安定なpHグ
ラジエントを供する商業的に入手可能な両性電解質の適
切な混合物を含有する顆粒化ゲル、例えばアガロース又
は重合デキストリンビーズ中で行うのが好ましい。この
等電点電気泳動は約25V/cmの最高電圧において10〜20時
間、５℃〜15℃の温度において行う。好ましいゲルはウ
ルトロデックス（Ultrodex）（登録商標）であり、そし
て好ましい両性電解質はアンホライン（Ampholine）
（登録商標）である。
ラジエントを供する商業的に入手可能な両性電解質の適
切な混合物を含有する顆粒化ゲル、例えばアガロース又
は重合デキストリンビーズ中で行うのが好ましい。この
等電点電気泳動は約25V/cmの最高電圧において10〜20時
間、５℃〜15℃の温度において行う。好ましいゲルはウ
ルトロデックス（Ultrodex）（登録商標）であり、そし
て好ましい両性電解質はアンホライン（Ampholine）
（登録商標）である。
サンプルは、好ましくはゲルの陰極側に適用する。L1蛋
白質バンドの位置決定は、ゲル表面にそってpHを測定す
ることにより、又は上表面の紙プリントを例えばクー
マシーブルー（coomassieblue）により染色することに
より行う。
白質バンドの位置決定は、ゲル表面にそってpHを測定す
ることにより、又は上表面の紙プリントを例えばクー
マシーブルー（coomassieblue）により染色することに
より行う。
L1蛋白質を含有するバンドを切り出し、そしてpH約7.5
〜約９、好ましくはpH約8.5のEDTAを含有する適当の緩
衝液により溶出する。
〜約９、好ましくはpH約8.5のEDTAを含有する適当の緩
衝液により溶出する。
透析及び／又はゲル過により、溶出物から両性電解質
及び塩を除去し、限外過により濃縮しそして／又は凍
結乾燥する。
及び塩を除去し、限外過により濃縮しそして／又は凍
結乾燥する。
（ｂ） 陰イオン交換クロマトグラフィー この方法において使用される陰イオン交換体は例えば第
三アミノ基又は第四アミノ基を含有し、そして例えばジ
エチルアミノエチルセルロース、例えばジエチルアミノ
エチルセファロース（登録商標）、又はQAE−セルロー
ス（第四アミノエチルセルロース）である。L1蛋白質を
含有する顆粒球抽出物は、EDTAを含有するpH約8.5の低
イオン強度緩衝液中でカラムに適用する。L1蛋白質は、
カルシウムイオン含有緩衝液、例えば30mMバルビタール
及び5mM塩化カルシウムを含有する緩衝液により、特異
的に溶出される。
三アミノ基又は第四アミノ基を含有し、そして例えばジ
エチルアミノエチルセルロース、例えばジエチルアミノ
エチルセファロース（登録商標）、又はQAE−セルロー
ス（第四アミノエチルセルロース）である。L1蛋白質を
含有する顆粒球抽出物は、EDTAを含有するpH約8.5の低
イオン強度緩衝液中でカラムに適用する。L1蛋白質は、
カルシウムイオン含有緩衝液、例えば30mMバルビタール
及び5mM塩化カルシウムを含有する緩衝液により、特異
的に溶出される。
（ｃ） アフィニティークロマトグラフィー L1蛋白質を精製するための第３の方法はアフィニティー
クロマトグラフィーに基礎を置く。これは、大面積、例
えば約50m2/gの面積を有するコントロールされた細孔ガ
ラスビーズを用いて行うことができる。ガラスビーズを
カラムに入れ、そして中性又はわずかに酸性のpH、例え
ばpH約６〜７の、カルシウムイオン含有低モルの適当な
緩衝液中で、粗顆粒球抽出物を適用する。L1蛋白質を、
50mM EDTA及びポリエチレングリコール、又は臭化リチ
ウムを含有するpH7.5〜8.5のアルカリ性緩衝液で溶出す
る。
クロマトグラフィーに基礎を置く。これは、大面積、例
えば約50m2/gの面積を有するコントロールされた細孔ガ
ラスビーズを用いて行うことができる。ガラスビーズを
カラムに入れ、そして中性又はわずかに酸性のpH、例え
ばpH約６〜７の、カルシウムイオン含有低モルの適当な
緩衝液中で、粗顆粒球抽出物を適用する。L1蛋白質を、
50mM EDTA及びポリエチレングリコール、又は臭化リチ
ウムを含有するpH7.5〜8.5のアルカリ性緩衝液で溶出す
る。
他のアフィニティークロマトグラフィー法は抗−L1抗体
カラムを使用して行う。L1蛋白質は抗体に吸着され、他
の蛋白質は緩衝液により十分に洗浄される。この後、L1
蛋白質を塩溶液、例えば、塩、例えば塩化ナトリウム又
はヨウ化ナトリウムを含有するpH約3.5の水性緩衝液に
より溶出する。
カラムを使用して行う。L1蛋白質は抗体に吸着され、他
の蛋白質は緩衝液により十分に洗浄される。この後、L1
蛋白質を塩溶液、例えば、塩、例えば塩化ナトリウム又
はヨウ化ナトリウムを含有するpH約3.5の水性緩衝液に
より溶出する。
（ｄ） 調製用アガロースゲル電気泳動 75mMバルビタール/2.5mM EDTA緩衝液（pH8.5）を含有す
る適当な寸法のフラットベッドアガロースゲルを使用す
る。電気泳動は4V/cmにて10〜18時間行う。L1蛋白質バ
ンドを、ゲル上面の紙プリントの染色により位置決定
する。L1蛋白質バンドはα2−グロブリン領域に見出さ
れ、そしてアガロースゲルの相当するストリップの凍結
／解凍、及び遠心分離により溶出する。
る適当な寸法のフラットベッドアガロースゲルを使用す
る。電気泳動は4V/cmにて10〜18時間行う。L1蛋白質バ
ンドを、ゲル上面の紙プリントの染色により位置決定
する。L1蛋白質バンドはα2−グロブリン領域に見出さ
れ、そしてアガロースゲルの相当するストリップの凍結
／解凍、及び遠心分離により溶出する。
（ｅ） 陽イオン交換クロマトグラフィー 陽イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換樹
脂、例えばスルホプロピル置換セルロース又は重合デキ
ストラン上で行う。粗顆粒球抽出物を、カルシウムイオ
ンを含有するpH約６の低イオン強度緩衝液と混合した後
カラムに適用する。非吸着蛋白質を出発緩衝液を用いて
洗浄除去し、そしてナトリウムイオン濃度が増加するED
TA含有緩衝液を用いて溶出する。
脂、例えばスルホプロピル置換セルロース又は重合デキ
ストラン上で行う。粗顆粒球抽出物を、カルシウムイオ
ンを含有するpH約６の低イオン強度緩衝液と混合した後
カラムに適用する。非吸着蛋白質を出発緩衝液を用いて
洗浄除去し、そしてナトリウムイオン濃度が増加するED
TA含有緩衝液を用いて溶出する。
（ｆ） ゲル過 ゲル過のために、セファデックス（登録商標）G75〜G
200アガロースゲル（セファロースゲル）、例えばウル
トラゲル（登録商標）、又はポリアクリルアミドゲルビ
ーズ、例えばビオーゲル（登録商標）Ｐ−60を使用す
る。カラムは長いものを使用するのが好ましい。カラム
の長さは直径の約50倍である必要がある。粗顆粒球抽出
物を適用し、そしてL1蛋白質をクロマトグラフ分離す
る。カラムを充填し、そして操作するために、好ましく
は0.1Mクエン酸ナトリウム、2.5mM EDTA-K2及び0.2mMチ
メロサールを含有する緩衝液（pH8.5）を使用する。L1
蛋白質は、35,000〜40,000ドルトンの分子量に相当する
画分に見出される。
200アガロースゲル（セファロースゲル）、例えばウル
トラゲル（登録商標）、又はポリアクリルアミドゲルビ
ーズ、例えばビオーゲル（登録商標）Ｐ−60を使用す
る。カラムは長いものを使用するのが好ましい。カラム
の長さは直径の約50倍である必要がある。粗顆粒球抽出
物を適用し、そしてL1蛋白質をクロマトグラフ分離す
る。カラムを充填し、そして操作するために、好ましく
は0.1Mクエン酸ナトリウム、2.5mM EDTA-K2及び0.2mMチ
メロサールを含有する緩衝液（pH8.5）を使用する。L1
蛋白質は、35,000〜40,000ドルトンの分子量に相当する
画分に見出される。
（ｇ） Znによる可逆的沈澱 Znイオンにより、特に水溶性亜鉛塩、例えば、酢酸亜
鉛又は塩化亜鉛の形のZnイオンによって処理すること
により、中性又はアルカリ性pHを有する水溶液からL1蛋
白質を定量的に沈澱せしめる。例えば、L1蛋白質含有水
溶液を約8.5のpHにおいて、約10mM〜100mM酢酸亜鉛水溶
液で処理することができる。沈澱したL1亜鉛塩を集め、
必要であれば水性緩衝液で洗浄し、そして錯形成酸、例
えば約100mMエチレンジアミン四酢酸２カリウム水溶液
（pH8.5）で処理し、そしてこの溶液をイオン交換カラ
ム、例えばファルマシアPD-10を通して過することに
より遊離L1蛋白質を回収し、そして凍結乾燥する。
鉛又は塩化亜鉛の形のZnイオンによって処理すること
により、中性又はアルカリ性pHを有する水溶液からL1蛋
白質を定量的に沈澱せしめる。例えば、L1蛋白質含有水
溶液を約8.5のpHにおいて、約10mM〜100mM酢酸亜鉛水溶
液で処理することができる。沈澱したL1亜鉛塩を集め、
必要であれば水性緩衝液で洗浄し、そして錯形成酸、例
えば約100mMエチレンジアミン四酢酸２カリウム水溶液
（pH8.5）で処理し、そしてこの溶液をイオン交換カラ
ム、例えばファルマシアPD-10を通して過することに
より遊離L1蛋白質を回収し、そして凍結乾燥する。
L1蛋白質の塩は常法により、例えば該当するイオン、例
えば所望のイオンを含有する塩基、酸又は塩で処理する
ことにより、あるいはイオン交換処理により製造され
る。非常に難溶なマンガン塩は、例えば、L1蛋白質の水
溶液に、Mnイオン、例えば酢酸マンガン又は他の水溶
性マンガン塩の約10mM〜100mM水溶液の形のMnイオン
を加えることにより製造することができる。
えば所望のイオンを含有する塩基、酸又は塩で処理する
ことにより、あるいはイオン交換処理により製造され
る。非常に難溶なマンガン塩は、例えば、L1蛋白質の水
溶液に、Mnイオン、例えば酢酸マンガン又は他の水溶
性マンガン塩の約10mM〜100mM水溶液の形のMnイオン
を加えることにより製造することができる。
この発明はまた、特にラビットにより産生されるよう
な、L1蛋白質に対する単一特異性抗血清、及び抗体含有
免疫グロブリンに関する。
な、L1蛋白質に対する単一特異性抗血清、及び抗体含有
免疫グロブリンに関する。
単一特異性抗血清は常法に従って、例えば、純粋なL1蛋
白質を完全フロインドアジュバントと共に、例えば皮下
投与により又筋肉内投与により、ラビット当り及び１週
間当り約100μｇの投与量において、８〜16週間にわた
り毎週注射することによって産生される。次に、例えば
瀉血、及び凝血により動物から血清を採取する。ラビッ
トのほかに、ヒト以外の温血動物、特に哺乳動物、例え
ばヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、ウマ等を使用するこ
とができる。
白質を完全フロインドアジュバントと共に、例えば皮下
投与により又筋肉内投与により、ラビット当り及び１週
間当り約100μｇの投与量において、８〜16週間にわた
り毎週注射することによって産生される。次に、例えば
瀉血、及び凝血により動物から血清を採取する。ラビッ
トのほかに、ヒト以外の温血動物、特に哺乳動物、例え
ばヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、ウマ等を使用するこ
とができる。
単一特異性抗体含有グロブリン画分は、常法に従って、
例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、血清から
分離することができる。
例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、血清から
分離することができる。
前記の単一特異性抗−L1抗体の製造のために、単一特異
性抗体を含有する抗血清又はそのグロブリン画分を、精
製されたL1蛋白質が適当な材料、例えばアガロースゲル
又はセルロースゲルに接合しているカラムに通す。非吸
着蛋白質を洗浄除去した後、抗−L1抗体分子を、塩化ナ
トリウム又はヨウ化ナトリウムを含有するpH約3.5の緩
衝液により溶出する。
性抗体を含有する抗血清又はそのグロブリン画分を、精
製されたL1蛋白質が適当な材料、例えばアガロースゲル
又はセルロースゲルに接合しているカラムに通す。非吸
着蛋白質を洗浄除去した後、抗−L1抗体分子を、塩化ナ
トリウム又はヨウ化ナトリウムを含有するpH約3.5の緩
衝液により溶出する。
該当する画分をpH約７に調整し、透析し、そして濃縮す
る。
る。
精製された形の抗−L1抗体、又は粗製の、例えば抗血清
の形もしくはそのグロブリン画分の形の抗−L1抗体は、
細胞、組織、又は体液中のL1蛋白質の検出のための定性
的方法又は定量的方法のために使用される。これらの方
法には、ゲル中沈澱、比濁法、ラジオイムノアッセイ、
酵素イムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、及びイ
ムノパーオキシダーゼサイトヒストケミカル法等の常用
法が含まれる。
の形もしくはそのグロブリン画分の形の抗−L1抗体は、
細胞、組織、又は体液中のL1蛋白質の検出のための定性
的方法又は定量的方法のために使用される。これらの方
法には、ゲル中沈澱、比濁法、ラジオイムノアッセイ、
酵素イムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、及びイ
ムノパーオキシダーゼサイトヒストケミカル法等の常用
法が含まれる。
この発明はさらに、純粋な単一特異性抗−L1抗体、抗−
L1抗体グロブリン画分、又は抗−L1抗体含有抗血清を含
んで成る試験キットに関する。このような試験キットは
常用のタイプのものであり、そして単純放射免疫拡散、
ラテックス凝集、スポットテスト、ラジオイムノアッセ
イ、酵素イムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、又
は酵素イムノヒストケミカル試験に向けられるであろ
う。
L1抗体グロブリン画分、又は抗−L1抗体含有抗血清を含
んで成る試験キットに関する。このような試験キットは
常用のタイプのものであり、そして単純放射免疫拡散、
ラテックス凝集、スポットテスト、ラジオイムノアッセ
イ、酵素イムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、又
は酵素イムノヒストケミカル試験に向けられるであろ
う。
これらのキットは、乾燥した又は便利な緩衝液中で可溶
化された純粋な形又は粗製の抗−L1抗体のほかに、あら
かじめ作られたゲル、ラテックス、ポリエチレン、ホル
マリン安定化動物赤血球、又は同様の粒子、酵素、例え
ばセイヨウワサビ−パーオキシダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼ、酵素基質、蛍光物質又は酵素接合抗体、及
び抗体結合L1−分子を遊離L1−分子から分離するのに適
当な材料、例えばスタフィロコッカスプロテインＡを産
生する菌株に属するスタフィロコッカス．アウレウスの
死菌、木炭（このものは遊離L1−蛋白質を吸着するが抗
体−蛋白質複合体を吸着しない）、又は第２の抗体、例
えばヤギ又は抗ラビット免疫グロブリン、又は放射性同
位元素、例えばI125で又は酵素で、例えばセイヨウワサ
ビ−パーオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼでラ
ベルされたL1−蛋白質を含む。このキットはまた、単一
特異性抗−L1抗体が表面、例えば試験管の内面、ガラス
もしくはプラスチックのビーズの表面、紙片、酢酸セ
ルロース膜、又は類似の材料に固定されている抗体、及
びこれらの方法のための緩衝剤を含むことができる。
化された純粋な形又は粗製の抗−L1抗体のほかに、あら
かじめ作られたゲル、ラテックス、ポリエチレン、ホル
マリン安定化動物赤血球、又は同様の粒子、酵素、例え
ばセイヨウワサビ−パーオキシダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼ、酵素基質、蛍光物質又は酵素接合抗体、及
び抗体結合L1−分子を遊離L1−分子から分離するのに適
当な材料、例えばスタフィロコッカスプロテインＡを産
生する菌株に属するスタフィロコッカス．アウレウスの
死菌、木炭（このものは遊離L1−蛋白質を吸着するが抗
体−蛋白質複合体を吸着しない）、又は第２の抗体、例
えばヤギ又は抗ラビット免疫グロブリン、又は放射性同
位元素、例えばI125で又は酵素で、例えばセイヨウワサ
ビ−パーオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼでラ
ベルされたL1−蛋白質を含む。このキットはまた、単一
特異性抗−L1抗体が表面、例えば試験管の内面、ガラス
もしくはプラスチックのビーズの表面、紙片、酢酸セ
ルロース膜、又は類似の材料に固定されている抗体、及
びこれらの方法のための緩衝剤を含むことができる。
この明細書においては次の略号を使用する。
PMSF:フェニルメチルスルホニルフルオリド PAGE:ポリアクリルアミドゲル電気泳動 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム IEF :等電点電気泳動 SRID:単純放射免疫拡散（法） NHS :正常ヒト血清 ACD :酸−クエン酸塩−デキストロース DFP :ジイソプロピルフルオロホスフェート EDTA:エチレンジアミン四酢酸 EDTA-K2:EDTA2カリウム塩 DEAE:ジエチルアミノエチル RIA :ラジオイムノアッセイ（法） PBS :燐酸緩衝化塩溶液 PASA:プロテインＡ含有スタフィロコッカス・アウレウ
ス 例1. （ａ） 顆粒球の分離 435mlの新鮮ヒト血液、2.2％のクエン酸３ナトリウム２
水和物、0.8％の水不含クエン酸及び2.45％のグルコー
スを含有する水溶液65ml、250mlの高分子デキストラン
〔デキストラベン（Dextraven）（登録商標）−150、並
びに2.5mMクエン酸、45mMクエン酸３ナトリウム、80mM
グリコース及び15mM塩化ナトリウムを含有する溶液23ml
を４℃にて１時間放置した沈澱を生じさせ、上層を採取
し、そして200xg、４℃にて20分間遠心分離する。沈澱
物を50mlの氷冷蒸留水で処理し、これによって赤血球細
胞を溶解（1ysis）せしめる。30秒後に、16.5mlの氷冷
0.6M塩化ナトリウムを加えることにより等張性を回復す
る。残留する白血球を等張塩溶液で２回洗浄する。リン
ポプレップ（Lymphoprep）（登録商標）〔5.6（W/V）％
の赤血球凝集ポリサッカライド（フィコール）を含有す
る9.6（W/V）％のナトリウムメトリゾエート溶液から成
る密度勾配遠心材料〕上で遠心分離し、次に20℃にて20
分間800xgにて遠心分離することにより、単核球から顆
粒球を分離する。この方法により約５×108個の細胞が
得られ、その約95％が顆粒球である。
ス 例1. （ａ） 顆粒球の分離 435mlの新鮮ヒト血液、2.2％のクエン酸３ナトリウム２
水和物、0.8％の水不含クエン酸及び2.45％のグルコー
スを含有する水溶液65ml、250mlの高分子デキストラン
〔デキストラベン（Dextraven）（登録商標）−150、並
びに2.5mMクエン酸、45mMクエン酸３ナトリウム、80mM
グリコース及び15mM塩化ナトリウムを含有する溶液23ml
を４℃にて１時間放置した沈澱を生じさせ、上層を採取
し、そして200xg、４℃にて20分間遠心分離する。沈澱
物を50mlの氷冷蒸留水で処理し、これによって赤血球細
胞を溶解（1ysis）せしめる。30秒後に、16.5mlの氷冷
0.6M塩化ナトリウムを加えることにより等張性を回復す
る。残留する白血球を等張塩溶液で２回洗浄する。リン
ポプレップ（Lymphoprep）（登録商標）〔5.6（W/V）％
の赤血球凝集ポリサッカライド（フィコール）を含有す
る9.6（W/V）％のナトリウムメトリゾエート溶液から成
る密度勾配遠心材料〕上で遠心分離し、次に20℃にて20
分間800xgにて遠心分離することにより、単核球から顆
粒球を分離する。この方法により約５×108個の細胞が
得られ、その約95％が顆粒球である。
（ｂ） 顆粒球抽出 （ａ）に記載したように得られた細胞を、10mm PMSF、
2.5mM EDTA-K2、及び0.25mMチミロサールを含有し、pH
8.5となるようにトリス緩衝を加えた0.27Mのシュークロ
ース中に再懸濁する。次に、細胞を、French及びHolmの
方法（４）に従って、28kg/cm2の圧縮空気に２分間２回
暴露し、そして１秒当り１滴の速度で圧力室から流出さ
せることによりホモジナイズする。この操作の間、細胞
容器を氷水中に保持する。約90％の細胞が破砕され、10
0,000xgにて１時間遠心分離した後、全L1蛋白質の約90
％が透明な上清液中に存在する。後者を粗顆粒球抽出物
と称する。全蛋白質含量は約3mg/mlであり、その30％が
L1蛋白質である。
2.5mM EDTA-K2、及び0.25mMチミロサールを含有し、pH
8.5となるようにトリス緩衝を加えた0.27Mのシュークロ
ース中に再懸濁する。次に、細胞を、French及びHolmの
方法（４）に従って、28kg/cm2の圧縮空気に２分間２回
暴露し、そして１秒当り１滴の速度で圧力室から流出さ
せることによりホモジナイズする。この操作の間、細胞
容器を氷水中に保持する。約90％の細胞が破砕され、10
0,000xgにて１時間遠心分離した後、全L1蛋白質の約90
％が透明な上清液中に存在する。後者を粗顆粒球抽出物
と称する。全蛋白質含量は約3mg/mlであり、その30％が
L1蛋白質である。
（ｃ） 調製用等電点電気泳動（IEF） 調製用IEFのために、110×240×5mmのゲルプレートを使
用し、このゲルプレートは、2W/V％のアンホライン（Am
pholine）（登録商標）pH5〜８（等電点において緩衝力
を有する合成両性電解質の混合物）を含有するウルトラ
デックス（Ultradex）（登録商標）（精製Dextrane G7
5）から成る。サンプル〔（ｂ）における上清液5ml〕
を、等容積のウルトラデックスゲルと混合し、そしてゲ
ルプレート上陰極から5cmのところに適用する。最高25V
cm-1、15mA、及び10Wにおいて18時間分離を行う。蛋白
質バンドの位置を、ゲルプレートの紙プリントのクマ
シーブルー染色、及びゲル上表面のpH測定の両者により
決定する。pH6.3断片及びpH6.5断片中のL1蛋白質を、0.
1M酢酸ナトリウム、2.5mM EDTA-K2、及び0.25mMチメロ
サールを含有する同容積の水溶液（pH8.5）により溶出
し、そして0.42μｍミリポア（登録商標）フィルターを
通して200xgにて20分間遠心分離する。溶出緩衝液に対
して一夜透析することにより両性電解質を除去する。残
留蛋白質及び緩衝剤を含有する溶液を、ミニコン（Mini
con）（登録商標）セル（半透性膜）を用いる限外過
により濃縮する。これらの操作におけるL1蛋白質の収率
は、調製用IEFに適用した量の約20％である。この溶液
2.5mlを、蒸留水で平衡化したファルマシア（登録商
標）PD-10カラム〔セファデックス（登録商標）G25M〕
上に適用し、そして3.5mlの蒸留水を用いてL1蛋白質を
溶出し、そして凍結乾燥することにより1mgの純粋なL1
蛋白質pI6.3及びpI6.5を得る。
用し、このゲルプレートは、2W/V％のアンホライン（Am
pholine）（登録商標）pH5〜８（等電点において緩衝力
を有する合成両性電解質の混合物）を含有するウルトラ
デックス（Ultradex）（登録商標）（精製Dextrane G7
5）から成る。サンプル〔（ｂ）における上清液5ml〕
を、等容積のウルトラデックスゲルと混合し、そしてゲ
ルプレート上陰極から5cmのところに適用する。最高25V
cm-1、15mA、及び10Wにおいて18時間分離を行う。蛋白
質バンドの位置を、ゲルプレートの紙プリントのクマ
シーブルー染色、及びゲル上表面のpH測定の両者により
決定する。pH6.3断片及びpH6.5断片中のL1蛋白質を、0.
1M酢酸ナトリウム、2.5mM EDTA-K2、及び0.25mMチメロ
サールを含有する同容積の水溶液（pH8.5）により溶出
し、そして0.42μｍミリポア（登録商標）フィルターを
通して200xgにて20分間遠心分離する。溶出緩衝液に対
して一夜透析することにより両性電解質を除去する。残
留蛋白質及び緩衝剤を含有する溶液を、ミニコン（Mini
con）（登録商標）セル（半透性膜）を用いる限外過
により濃縮する。これらの操作におけるL1蛋白質の収率
は、調製用IEFに適用した量の約20％である。この溶液
2.5mlを、蒸留水で平衡化したファルマシア（登録商
標）PD-10カラム〔セファデックス（登録商標）G25M〕
上に適用し、そして3.5mlの蒸留水を用いてL1蛋白質を
溶出し、そして凍結乾燥することにより1mgの純粋なL1
蛋白質pI6.3及びpI6.5を得る。
pI6.3蛋白質及びpI6.5蛋白質はまた、この方法により別
々に精製して約0.67mgのpI6.5L1蛋白質及び約0.33mgのp
I6.3L1蛋白質を得ることができる。
々に精製して約0.67mgのpI6.5L1蛋白質及び約0.33mgのp
I6.3L1蛋白質を得ることができる。
例2. （ａ） この方法は、L1蛋白質がカルシウムイオンを得
た場合に等電点が劇的に変化するという利点を利用す
る。蛋白質は、粗顆粒球抽出物の形で、アルカリ性pHに
おいて、そしてカルシウムイオンを結合するのに十分な
量のエチレンジアミン四酢酸を含有する緩衝液と共に陰
イオン交換体、例えばジエチルアミノエチルタイプの陰
イオン交換体に結合する。次に、緩衝液に塩化カルシウ
ムを加えて５〜10mM/lの最終濃度にすることにより、L1
蛋白質を特異的に溶出することができる。
た場合に等電点が劇的に変化するという利点を利用す
る。蛋白質は、粗顆粒球抽出物の形で、アルカリ性pHに
おいて、そしてカルシウムイオンを結合するのに十分な
量のエチレンジアミン四酢酸を含有する緩衝液と共に陰
イオン交換体、例えばジエチルアミノエチルタイプの陰
イオン交換体に結合する。次に、緩衝液に塩化カルシウ
ムを加えて５〜10mM/lの最終濃度にすることにより、L1
蛋白質を特異的に溶出することができる。
粗顆粒球抽出物を例１に記載したのと同様にして調製す
る。この全蛋白質含量は約２〜5g/lであり、その内約60
％がL1蛋白質である。
る。この全蛋白質含量は約２〜5g/lであり、その内約60
％がL1蛋白質である。
DEAE−セファセル（Sephacel）（登録商標）（ファルマ
シア、スェーデン）を1g/lのEDTA-K2を含有するバルビ
タール緩衝液（１の水中7.7gのジエチルバルビツール
酸及び10.5gのこの酸のナトリウム塩）（pH8.5）により
平衡化し、そして1.5×5cm、すなわち約9mlの容積を有
するクロマトグラフィーカラムに充填する。
シア、スェーデン）を1g/lのEDTA-K2を含有するバルビ
タール緩衝液（１の水中7.7gのジエチルバルビツール
酸及び10.5gのこの酸のナトリウム塩）（pH8.5）により
平衡化し、そして1.5×5cm、すなわち約9mlの容積を有
するクロマトグラフィーカラムに充填する。
約10mlの粗顆粒抽出物を30mlのEDTA−バルビタール緩衝
液（pH8.5）により稀釈したサンプルを、約2ml/分の流
速で、ペリスタルポンプを用いて適用する。非吸着蛋白
質を100mlのバルビター緩衝液で洗浄除去する。L1蛋白
質の溶出に先立ってカラムをさらにEDTA-K2を含まない
バルビタール緩衝液30mlにより洗浄する。次に、5mM Ca
Cl2を含有する6mMバルビタール緩衝液（pH8.5）を用い
てL1蛋白質を溶出する。
液（pH8.5）により稀釈したサンプルを、約2ml/分の流
速で、ペリスタルポンプを用いて適用する。非吸着蛋白
質を100mlのバルビター緩衝液で洗浄除去する。L1蛋白
質の溶出に先立ってカラムをさらにEDTA-K2を含まない
バルビタール緩衝液30mlにより洗浄する。次に、5mM Ca
Cl2を含有する6mMバルビタール緩衝液（pH8.5）を用い
てL1蛋白質を溶出する。
第１図は、このようなイオン交換クロマトグラフィーに
おける全蛋白質及びL1蛋白質の溶出のプロフィールを示
し、そして第２図は、粗白血球抽出物及び精製されたL1
蛋白質を分析用アガロースゲル電気泳動に付した場合の
蛋白質バンドのパターンを示す。精製されたL1蛋白質は
前記のごとくpI6.3及びpI6.5に対する２つの主バンドを
示す。
おける全蛋白質及びL1蛋白質の溶出のプロフィールを示
し、そして第２図は、粗白血球抽出物及び精製されたL1
蛋白質を分析用アガロースゲル電気泳動に付した場合の
蛋白質バンドのパターンを示す。精製されたL1蛋白質は
前記のごとくpI6.3及びpI6.5に対する２つの主バンドを
示す。
カルシウム含有緩衝液により溶出されたL1蛋白質の量は
適用したサンプル中の量の50％に近く、そして約20mlの
全容積中に見出される。この溶液は、ミリポアCX-10膜
を用いる限外過により便利に濃縮することができる。
この方法は、L1蛋白質が膜に結合するのを防止するため
にEDTAを加えたか否かに依存して幾らかの蛋白質の欠損
をもたらす。EDTAを添加しない場合でも約35％の全体収
率が達成される。
適用したサンプル中の量の50％に近く、そして約20mlの
全容積中に見出される。この溶液は、ミリポアCX-10膜
を用いる限外過により便利に濃縮することができる。
この方法は、L1蛋白質が膜に結合するのを防止するため
にEDTAを加えたか否かに依存して幾らかの蛋白質の欠損
をもたらす。EDTAを添加しない場合でも約35％の全体収
率が達成される。
第１図に示すように、L1蛋白質の幾らかは5mM CaCl2及
び125mM NaClを含有する60mMバルビタール緩衝液（pH8.
5）により溶出されるが、この蛋白質は主L1バンドの主
として陰極側及び陽極側にバンドを与え、そして部分的
に変形したL1蛋白質、又は他の蛋白質と複合したL1蛋白
質を示す。
び125mM NaClを含有する60mMバルビタール緩衝液（pH8.
5）により溶出されるが、この蛋白質は主L1バンドの主
として陰極側及び陽極側にバンドを与え、そして部分的
に変形したL1蛋白質、又は他の蛋白質と複合したL1蛋白
質を示す。
大量法 前記の方法をスケールアップして50mlの粗顆粒球抽出物
を処理することができる。これは、約50mlのDEAE−セフ
ァセルを収容するカラム（約2.5×10cm）、及びこれに
比例して増加する容量の上記と同じ緩衝液を使用するこ
とにより達成される。
を処理することができる。これは、約50mlのDEAE−セフ
ァセルを収容するカラム（約2.5×10cm）、及びこれに
比例して増加する容量の上記と同じ緩衝液を使用するこ
とにより達成される。
（ｂ） この方法は、10mMZnの添加によりL1蛋白質の
可逆的沈澱が得られるという事実を利用する。10mlの粗
白血球抽出物に、75mMバルビタール緩衝液（pH8.5）90m
l、及び水中100mM酢酸亜鉛10mlを加える。沈澱を数回、
例えば５回、75mMバルビタール緩衝液（pH8.5、10mM酢
酸亜鉛を含む）により洗浄する。最後に、沈澱を75mMバ
ルビタール緩衝液（pH8.5）で洗浄し、そして水中100mM
EDTA-K2の溶液（5M水酸化ナトリウムによりpHを8.5に
調整）を滴加することにより溶解する。この蛋白質溶液
を、蒸留水により平衡化したファルマシアPD-10カラム
に適用し、そして3.5mlの蒸留水によりL1蛋白質を溶出
し、そして凍結乾燥することにより約10〜20mgの純L1蛋
白質を得る。
可逆的沈澱が得られるという事実を利用する。10mlの粗
白血球抽出物に、75mMバルビタール緩衝液（pH8.5）90m
l、及び水中100mM酢酸亜鉛10mlを加える。沈澱を数回、
例えば５回、75mMバルビタール緩衝液（pH8.5、10mM酢
酸亜鉛を含む）により洗浄する。最後に、沈澱を75mMバ
ルビタール緩衝液（pH8.5）で洗浄し、そして水中100mM
EDTA-K2の溶液（5M水酸化ナトリウムによりpHを8.5に
調整）を滴加することにより溶解する。この蛋白質溶液
を、蒸留水により平衡化したファルマシアPD-10カラム
に適用し、そして3.5mlの蒸留水によりL1蛋白質を溶出
し、そして凍結乾燥することにより約10〜20mgの純L1蛋
白質を得る。
例3.精製L1に対する抗血清の調製 約1mg/mlの精製pI6.3L1蛋白質及びpI6.5L1蛋白質（例１
又は２に従って得られたもの）、0.1M酢酸ナトリウム、
2.5mM EDTA、0.25mMチメロサール含有溶液（pH8.5）を
フロインドの完全アジュバントと共にホモジナイズす
る。約100μｇのL1蛋白質を含有する容量のこの混合物
を、１週間に１回ずつ６週間にわたって、ラビットの多
数ケ所の皮下に注射する。ラビットから静脈穿刺により
採血し、この血液を室温に一夜置いて凝固せしめる。血
清を回収し、そしてL1−抗血清活性について試験する。
又は２に従って得られたもの）、0.1M酢酸ナトリウム、
2.5mM EDTA、0.25mMチメロサール含有溶液（pH8.5）を
フロインドの完全アジュバントと共にホモジナイズす
る。約100μｇのL1蛋白質を含有する容量のこの混合物
を、１週間に１回ずつ６週間にわたって、ラビットの多
数ケ所の皮下に注射する。ラビットから静脈穿刺により
採血し、この血液を室温に一夜置いて凝固せしめる。血
清を回収し、そしてL1−抗血清活性について試験する。
通常、この抗血清は、単純放射免疫沈澱においては1:32
の稀釈において、そしてラジオイムアアッセイのために
は1:2000の稀釈において使用することができる。
の稀釈において、そしてラジオイムアアッセイのために
は1:2000の稀釈において使用することができる。
例4.ラジオイムアアッセイ用試験キット この試験キット（100回の試験用）は次のものを含む。
１アンプル：例３に従って得られた凍結乾燥抗−L1血清
2ml; １ボトル:100mlのRIA−緩衝液:50mM塩化ナトリウム、0.
2％ウシ血清アルブミン、0.2％ナトリウムアジドを含
み、pH7.4に調整したもの； １ゴム栓アンプル:500cpm/mlに調整された、放射性I125
ラベルL1−蛋白質の水溶液5ml（Bolton-Hunter法により
ラベルしたもの）； １ボトル：燐酸緩衝化塩溶液中ホルマリン処理スタフィ
ロコッカス・アウレウス（PASA＝プロテイン−Ａ含有ス
タフィロコッカス・アウレウスCowan Ｉ株）の懸濁液1
00ml; １ボトル:500ngのL1蛋白質を含有するRIA−緩衝溶液
（比較溶液）2ml。
2ml; １ボトル:100mlのRIA−緩衝液:50mM塩化ナトリウム、0.
2％ウシ血清アルブミン、0.2％ナトリウムアジドを含
み、pH7.4に調整したもの； １ゴム栓アンプル:500cpm/mlに調整された、放射性I125
ラベルL1−蛋白質の水溶液5ml（Bolton-Hunter法により
ラベルしたもの）； １ボトル：燐酸緩衝化塩溶液中ホルマリン処理スタフィ
ロコッカス・アウレウス（PASA＝プロテイン−Ａ含有ス
タフィロコッカス・アウレウスCowan Ｉ株）の懸濁液1
00ml; １ボトル:500ngのL1蛋白質を含有するRIA−緩衝溶液
（比較溶液）2ml。
RIAによるL1蛋白質の定量方法 供給された比較溶液をRIA−緩衝液を用いて7.8ng/mlま
で２倍稀釈することにより一連のスタンダードを調製す
る。一連の試験管に、RIA緩衝液1:30稀釈の患者の血
漿、又はスタンダード比較溶液を25μｌずつピペットで
入れる。これに、20μｌの抗−L1血清を加え、そして混
合物を37℃にて30分間インキュベートする。次に、放射
性ラベルL1−蛋白質の溶液50μｌを加え、次に37℃にて
１時間インキュベートする。次に各試験管の1mlのスタ
フィロコッカス・アウレウスの懸濁液を加え、そして2,
000xgにて10分間遠心分離する。上清液を吸引除去し、
そして沈降物中の放射能を測定する。最初に加えた放射
能に対する放射能の％をL1比較スタンダード溶液に関し
てプロットし、比較曲線を描く。この曲線から患者のサ
ンプルの値を読み取ることができる。
で２倍稀釈することにより一連のスタンダードを調製す
る。一連の試験管に、RIA緩衝液1:30稀釈の患者の血
漿、又はスタンダード比較溶液を25μｌずつピペットで
入れる。これに、20μｌの抗−L1血清を加え、そして混
合物を37℃にて30分間インキュベートする。次に、放射
性ラベルL1−蛋白質の溶液50μｌを加え、次に37℃にて
１時間インキュベートする。次に各試験管の1mlのスタ
フィロコッカス・アウレウスの懸濁液を加え、そして2,
000xgにて10分間遠心分離する。上清液を吸引除去し、
そして沈降物中の放射能を測定する。最初に加えた放射
能に対する放射能の％をL1比較スタンダード溶液に関し
てプロットし、比較曲線を描く。この曲線から患者のサ
ンプルの値を読み取ることができる。
例5.溶液中のL1蛋白質の比濁測定のための試験キット この試験キットは次のものを含む。
１アンプル:pH7.5の緩衝液（5mMの塩化カルシウムを含
有す酢酸ナトリウム緩衝液）中抗−L1抗体の溶液であっ
て、アガロースゲル中二重免疫拡散法により試験した場
合約1:32を力価を有するもの1.5ml; １ボトル：上記の稀釈緩衝液20ml; １アンプル:400μg/mlの濃度のL1蛋白質の溶液0.5ml。
有す酢酸ナトリウム緩衝液）中抗−L1抗体の溶液であっ
て、アガロースゲル中二重免疫拡散法により試験した場
合約1:32を力価を有するもの1.5ml; １ボトル：上記の稀釈緩衝液20ml; １アンプル:400μg/mlの濃度のL1蛋白質の溶液0.5ml。
抗−L1血清を稀釈緩衝液により1:15に稀釈する。スタン
ダードL1溶液の２倍稀釈により６本のスタンダードL1蛋
白質（1:1〜1:64）を調製する。次に、比濁計キュベッ
ト中で250μｌの抗体溶液、及び10μｌのサンプル又は
稀釈されたL1スタンダードを混合し、そして室温にて10
分間インキュベートする。比較計から光学濃度を読み取
る。
ダードL1溶液の２倍稀釈により６本のスタンダードL1蛋
白質（1:1〜1:64）を調製する。次に、比濁計キュベッ
ト中で250μｌの抗体溶液、及び10μｌのサンプル又は
稀釈されたL1スタンダードを混合し、そして室温にて10
分間インキュベートする。比較計から光学濃度を読み取
る。
例6.L1蛋白質溶液の単純放射免疫拡散分析用試験キット この試験キットは次のものを含む。
１本又は複数本のあらかじめ調製したアガロースゲル：
ゲル中二重拡散により試験した場合に約1:32の力価を有
する均一に分散した抗−L1抗体２％、及び0.1M酢酸ナト
リウム、5mM塩化ナトリウム、0.25mMチメロサールを含
有する（pH8.5）； １アンプル:300μg/mlの濃度のL1蛋白質溶液0.1ml。
ゲル中二重拡散により試験した場合に約1:32の力価を有
する均一に分散した抗−L1抗体２％、及び0.1M酢酸ナト
リウム、5mM塩化ナトリウム、0.25mMチメロサールを含
有する（pH8.5）； １アンプル:300μg/mlの濃度のL1蛋白質溶液0.1ml。
アガロースゲルは密閉した容器に入れてゲルの外側が乾
燥するのを防止する。ゲルは18個のあらかじめ作られた
ウエルを有し、これに10μｌのスタンダード溶液及び被
験サンプルを適用する。
燥するのを防止する。ゲルは18個のあらかじめ作られた
ウエルを有し、これに10μｌのスタンダード溶液及び被
験サンプルを適用する。
例7.L1蛋白質の半定量測定のためのラテックス凝集試験
用試験キット のキットは次のものを含む。
用試験キット のキットは次のものを含む。
（ａ） １ボルト：精製L1蛋白質が固定された直径50μ
ｍのラテックス粒子の懸濁液2ml; （ｂ） １ボルト：上記のラテックス粒子を凝集するた
めの1:3〜1:4の力価を有する、抗−L1抗体の緩衝液2ml; （ｃ） １ボルト:50μg/mlの濃度のL1蛋白質の緩衝溶
液0.5ml。
ｍのラテックス粒子の懸濁液2ml; （ｂ） １ボルト：上記のラテックス粒子を凝集するた
めの1:3〜1:4の力価を有する、抗−L1抗体の緩衝液2ml; （ｃ） １ボルト:50μg/mlの濃度のL1蛋白質の緩衝溶
液0.5ml。
黒色スライド上で１滴の（ａ）、（ｂ）及び被験サンプ
ルを混合し、そして５分間にわたり凝集について観察す
る。凝集が生じないことにより、L1の濃度が1000ng/ml
以上であることが示される。陽性対照として溶液
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を混合する。凝集が生じて
はならない。
ルを混合し、そして５分間にわたり凝集について観察す
る。凝集が生じないことにより、L1の濃度が1000ng/ml
以上であることが示される。陽性対照として溶液
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を混合する。凝集が生じて
はならない。
例8.スポットテスト用試験キット この試験キットは次のものを含む。
酢酸セルロース片10個:5×50mm、１端から10mm及び30mm
の位置に、直径4mmの乾燥した特異的抗−L1抗体のスポ
ット２個を有するもの； （ａ） １ボトル：セイヨウワサビのパーオキシダーゼ
に接合した特異的抗−L1抗体を含有する2mlの緩衝液2m
l; （ｂ） １ボルト:1mg/mlのジアミノベンジジン（DAB）
を含有する水性トリス緩衝液／等張塩溶液（pH7.4）10m
l; （ｃ） １ボルト:50μg/mlの濃度のL1蛋白質の水性緩
衝液1ml。
の位置に、直径4mmの乾燥した特異的抗−L1抗体のスポ
ット２個を有するもの； （ａ） １ボトル：セイヨウワサビのパーオキシダーゼ
に接合した特異的抗−L1抗体を含有する2mlの緩衝液2m
l; （ｂ） １ボルト:1mg/mlのジアミノベンジジン（DAB）
を含有する水性トリス緩衝液／等張塩溶液（pH7.4）10m
l; （ｃ） １ボルト:50μg/mlの濃度のL1蛋白質の水性緩
衝液1ml。
試験を行う場合、１滴のサンプルを第１のスポットに適
用し、そして１滴の溶液（ｃ）を第２のスポットに適用
する。10分間後、試験ストリップをトリス緩衝液／塩溶
液により５分間洗浄する。この後、１滴の溶液（ａ）を
各スポットに適用し、そして室温に10分間置き、そして
ストリップをトリス緩衝液／塩溶液中で再度５分間洗浄
する。1mlの溶液（ｂ）に５μｌの30％過酸化水素を加
える。１滴のこの混合物を各スポットに適用する。３分
間後に明瞭な褐色の発色が生じた場合、サンプル中にL1
蛋白質が存在する。
用し、そして１滴の溶液（ｃ）を第２のスポットに適用
する。10分間後、試験ストリップをトリス緩衝液／塩溶
液により５分間洗浄する。この後、１滴の溶液（ａ）を
各スポットに適用し、そして室温に10分間置き、そして
ストリップをトリス緩衝液／塩溶液中で再度５分間洗浄
する。1mlの溶液（ｂ）に５μｌの30％過酸化水素を加
える。１滴のこの混合物を各スポットに適用する。３分
間後に明瞭な褐色の発色が生じた場合、サンプル中にL1
蛋白質が存在する。
サンプルの一連の稀釈を用いることにより試験を半定量
的に行うことができる。
的に行うことができる。
例9.酵素イムノアッセイによるL1蛋白質用試験キット この試験キットは次のものを含む。
ミクロタイタートレイ１個：プラスチック材料製で５×
10個のウエルを有し、ウエルの底部及び低部の内面が特
異的抗−L1抗体により被覆されているもの； （ａ） １ボルト：セイヨウワサビのパーオキシダーゼ
に接合した特異的抗−L1抗体を含有する緩衝液2ml; （ｂ） １ボトル:1mg/mlのジアミノベンジジン（DAB）
を含有する水性トリス緩衝液／等張塩溶液（pH7.4）10m
l; （ｃ） １ボトル:50μg/mlの濃度のL1蛋白質の水性緩
衝液1ml。
10個のウエルを有し、ウエルの底部及び低部の内面が特
異的抗−L1抗体により被覆されているもの； （ａ） １ボルト：セイヨウワサビのパーオキシダーゼ
に接合した特異的抗−L1抗体を含有する緩衝液2ml; （ｂ） １ボトル:1mg/mlのジアミノベンジジン（DAB）
を含有する水性トリス緩衝液／等張塩溶液（pH7.4）10m
l; （ｃ） １ボトル:50μg/mlの濃度のL1蛋白質の水性緩
衝液1ml。
試験方法 50μｌの被験サンプル溶液又は溶液（ｃ）をウエルに加
え、そして室温にて１時間インキュベートする。次に、
ウエルを、0.5％のウシ血清アルブミンを含有するトリ
ス緩衝液／塩溶液で洗浄する。各溶液に50μｌの溶液
（ａ）を加え、そして室温にて１時間インキュベートす
る。ウエルを上記のようにして洗浄する。1mlの溶液
（ｂ）に５μｌの30％過酸化水素を加え、そして50μｌ
のこの溶液を各ウエルに加える。トレイを室温にて30分
間インキャベートし、そして各ウエルの色の強さを光度
計により測定する。
え、そして室温にて１時間インキュベートする。次に、
ウエルを、0.5％のウシ血清アルブミンを含有するトリ
ス緩衝液／塩溶液で洗浄する。各溶液に50μｌの溶液
（ａ）を加え、そして室温にて１時間インキュベートす
る。ウエルを上記のようにして洗浄する。1mlの溶液
（ｂ）に５μｌの30％過酸化水素を加え、そして50μｌ
のこの溶液を各ウエルに加える。トレイを室温にて30分
間インキャベートし、そして各ウエルの色の強さを光度
計により測定する。
例10.ゲル濾過による分子量の測定 0.1Mクエン酸ナトリウム、2.5mM EDTA-K2及び0.25mMチ
メロサールを含有する緩衝液（pH8.5）中BiO-Gel P−10
0カラム（2.5×90cm）を用い、分子量マーカーとしてオ
バルブミン（分子量45kDa）、ミオグロビン（分子量17.
8kDa）及びチトクロームＣ（分子量12.3kDa）を用いて
分子量を測定した場合、本発明のL1蛋白質は約36.5kDa
の分子量を示した。
メロサールを含有する緩衝液（pH8.5）中BiO-Gel P−10
0カラム（2.5×90cm）を用い、分子量マーカーとしてオ
バルブミン（分子量45kDa）、ミオグロビン（分子量17.
8kDa）及びチトクロームＣ（分子量12.3kDa）を用いて
分子量を測定した場合、本発明のL1蛋白質は約36.5kDa
の分子量を示した。
例11.ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量の
測定 15％（w/v）のポリアクリルアミドゲル、及び0.05％（w
/v）のSDSを含有する0.1M Tris/酢酸緩衝液（pH6.6）を
含む円筒状ゲル（５×10mm）中で次のようにして電気泳
動を行った。サンプル及び分子量標準は、40mMジチオス
レイトール及び10mM EbTA-K2を含有する40mM Tris/酢酸
緩衝液（pH6.6）中で37℃にて18時間インキュベート
し、次に0.05％（w/v）のSDSを含有する0.1M Tris/酢酸
緩衝液（pH6.6）に対して24時間透析を行った。最終蛋
白質濃度は0.2〜2mg/mlとした。電気泳動は最高90V及び
57mAにて７時間行った。分子量標準として、オバルブミ
ン（45kDa）、キモトリプシノーゲン（25kDa）、ミオグ
ロビン（17.5kDa）及びチトクロームＣ（12.3kDa）を用
いた。
測定 15％（w/v）のポリアクリルアミドゲル、及び0.05％（w
/v）のSDSを含有する0.1M Tris/酢酸緩衝液（pH6.6）を
含む円筒状ゲル（５×10mm）中で次のようにして電気泳
動を行った。サンプル及び分子量標準は、40mMジチオス
レイトール及び10mM EbTA-K2を含有する40mM Tris/酢酸
緩衝液（pH6.6）中で37℃にて18時間インキュベート
し、次に0.05％（w/v）のSDSを含有する0.1M Tris/酢酸
緩衝液（pH6.6）に対して24時間透析を行った。最終蛋
白質濃度は0.2〜2mg/mlとした。電気泳動は最高90V及び
57mAにて７時間行った。分子量標準として、オバルブミ
ン（45kDa）、キモトリプシノーゲン（25kDa）、ミオグ
ロビン（17.5kDa）及びチトクロームＣ（12.3kDa）を用
いた。
本発明のL1蛋白質は12.5kDaのおよそ同一の分子量を有
する３個のポリペプチドを示した。
する３個のポリペプチドを示した。
例12.密度勾配遠心による分子量の測定 密度勾配遠心による分子量の測定は５〜15％直線シュー
クロース勾配上で、４℃にて、ベックマンSW65ローター
中36000回転／分にて42時間行った。正常ヒト血清、チ
トクロームＣ（2mg/ml）及び精製L1（3mg/ml）の等容量
混合物200μｌを前記シュークロース勾配の頂部に適用
した。画分（0.15mlづつ）を遠心チューブの底部から取
り出し、アルブミン（67kDa）、α1−アンチトリプシン
（54kDa）及びL1の分布を、シングルラジアル免疫拡散
により試験し、この場合チトクロームＣの位置は測光法
により決定した。
クロース勾配上で、４℃にて、ベックマンSW65ローター
中36000回転／分にて42時間行った。正常ヒト血清、チ
トクロームＣ（2mg/ml）及び精製L1（3mg/ml）の等容量
混合物200μｌを前記シュークロース勾配の頂部に適用
した。画分（0.15mlづつ）を遠心チューブの底部から取
り出し、アルブミン（67kDa）、α1−アンチトリプシン
（54kDa）及びL1の分布を、シングルラジアル免疫拡散
により試験し、この場合チトクロームＣの位置は測光法
により決定した。
L1蛋白質は約36.5kDaの分子量を示した。
引用文献 （１） Magne K.Fagerhol,Inge Dale及びTerje Anders
son,Scand.J.Haematol.（1980）24,393-398。
son,Scand.J.Haematol.（1980）24,393-398。
（２） M.K.Fagerhol,I.Dale及びT.Andersson,Bull,eu
rop.Physiopath.resp.1980,16（suppl）273 281。
rop.Physiopath.resp.1980,16（suppl）273 281。
（３） Karen E.Willard,Anne Karine Thorsrud,Eimar
Munthe及びEgil Jillum,Clin.Chem.,Vol.38,No.4,1067
-1073（1982）。
Munthe及びEgil Jillum,Clin.Chem.,Vol.38,No.4,1067
-1073（1982）。
（４） French,P.C.及びHolm,R.A.,（1947）Thromb.Di
ath.Haemorrh.32,432-440。
ath.Haemorrh.32,432-440。
第１図は、DEAE−セファセルカラム（1.5×5cm）上での
9mlの粗白血球抽出物のクロマトグラフィーのプロフィ
ールを示す。全蛋白質含量は280nmにおけるUV吸収によ
り測定し、そしてL1の濃度は単純放射免疫拡散法により
測定したものである。 第２図は、粗顆粒球抽出物（Ａ）、5mM CaCl2画分
（Ｂ）、及び125mM NaCl画分の、2.5mM EDTA-K2含有75m
Mバルビタール緩衝液（pH8.5）中アガロースゲル上の電
気泳動における蛋白質バンドのパターンを示す。画分Ｂ
は２種類の純粋なL1蛋白質、すなわちpI6.3及びpI6.5を
含有する。
9mlの粗白血球抽出物のクロマトグラフィーのプロフィ
ールを示す。全蛋白質含量は280nmにおけるUV吸収によ
り測定し、そしてL1の濃度は単純放射免疫拡散法により
測定したものである。 第２図は、粗顆粒球抽出物（Ａ）、5mM CaCl2画分
（Ｂ）、及び125mM NaCl画分の、2.5mM EDTA-K2含有75m
Mバルビタール緩衝液（pH8.5）中アガロースゲル上の電
気泳動における蛋白質バンドのパターンを示す。画分Ｂ
は２種類の純粋なL1蛋白質、すなわちpI6.3及びpI6.5を
含有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 インジエル ナエスガールド ノルウエー国，オスロ ５，シーエイチア ール・ミケールセンスグト 26
Claims (13)
- 【請求項１】次の（１），（２）または（３）のいずれ
かの蛋白質抗原（L1）： （１） 次の性質： （ａ） ゲル濾過及び密度勾配遠心により測定した分子
量が36,500ドルトンである、 （ｂ） ポリアクリルアミドゲル上でのSDS−電気泳動
において、12,500ドルトンのおよそ同一の分子量を有す
る３個のポリペプチドを示す、 （ｃ） 等電点6.3を有する、 を有する蛋白質（pI6.3L1）、 （２） 前記（ａ）及び（ｂ）の性質並びに等電点6.5
を有する蛋白質（pI6.5L1）、または （３） 前記蛋白質（１）と蛋白質（２）との混合物、 に対する抗体。 - 【請求項２】単一特異性抗体である、請求項１に記載の
抗体。 - 【請求項３】抗体グロブリン画分の形態である請求項１
に記載の抗体。 - 【請求項４】抗血清の形態である請求項１に記載の抗
体。 - 【請求項５】次の（１），（２）または（３）のいずれ
かの蛋白質抗原（L1）： （１） 次の性質： （ａ） ゲル濾過及び密度勾配遠心により測定した分子
量が36,500ドルトンである、 （ｂ） ポリアクリルアミドゲル上でのSDS−電気泳動
において、12,500ドルトンのおよそ同一の分子量を有す
る３個のポリペプチドを示す、 （ｃ） 等電点6.3を有する、 を有する蛋白質（pI6.3L1）、 （２） 前記（ａ）及び（ｂ）の性質並びに等電点6.5
を有する蛋白質（pI6.5L1）、または （３） 前記蛋白質（１）と蛋白質（２）との混合物、 に対する抗体、 を含んで成る、L1蛋白質検出又は測定用試薬。 - 【請求項６】前記抗体が標識されている、請求項５に記
載の試薬。 - 【請求項７】前記標識が放射性標識である、請求項６に
記載の試薬。 - 【請求項８】前記標識が酵素標識である、請求項６に記
載の試薬。 - 【請求項９】前記抗体が凍結乾燥された形態である、請
求項５〜８のいずれか１項に記載の試薬。 - 【請求項１０】前記抗体が溶液の形態である、請求項５
〜８のいずれか１項に記載の試薬。 - 【請求項１１】前記抗体がゲル中に含有されている、請
求項５〜８のいずれか１項に記載の試薬。 - 【請求項１２】前記抗体がラテックス粒子に固定されて
いる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の試薬。 - 【請求項１３】前記抗体が固体支持体表面に結合してい
る、請求項５〜８のいずれか１項に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB838318754A GB8318754D0 (en) | 1983-07-11 | 1983-07-11 | Human proteins anti-sera test kits |
| GB8318754 | 1983-07-11 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6318730A Division JP2558442B2 (ja) | 1983-07-11 | 1994-12-21 | Ｌ１蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6051113A JPS6051113A (ja) | 1985-03-22 |
| JPH0784479B2 true JPH0784479B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
ID=10545560
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59141568A Expired - Lifetime JPH0784479B2 (ja) | 1983-07-11 | 1984-07-10 | Ｌ１蛋白質に対する抗体、該抗体を含んで成る試薬及び該抗体を用いる測定法 |
| JP6318730A Expired - Lifetime JP2558442B2 (ja) | 1983-07-11 | 1994-12-21 | Ｌ１蛋白質 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6318730A Expired - Lifetime JP2558442B2 (ja) | 1983-07-11 | 1994-12-21 | Ｌ１蛋白質 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4833074A (ja) |
| JP (2) | JPH0784479B2 (ja) |
| BE (1) | BE900119A (ja) |
| CH (1) | CH661048A5 (ja) |
| DE (1) | DE3425186C2 (ja) |
| DK (1) | DK169439B1 (ja) |
| FR (1) | FR2550205B1 (ja) |
| GB (2) | GB8318754D0 (ja) |
| IT (1) | IT1177889B (ja) |
| NL (1) | NL192456C (ja) |
| SE (1) | SE500219C2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0263072B1 (en) * | 1986-10-03 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel lymphokine related peptides |
| JPH023698A (ja) * | 1988-06-20 | 1990-01-09 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬 |
| US5211937A (en) * | 1990-07-30 | 1993-05-18 | Glycomed Incorporated | Method of determining a site of inflammation utilizing elam-1 ligands |
| US5776348A (en) * | 1995-02-07 | 1998-07-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Mineral precipitation system and method for inhibiting mineral precipitate formation |
| EP0937259B1 (en) | 1996-11-01 | 2004-10-06 | Magne K. Fagerhol | Process for the extraction of proteins |
| ZA981370B (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-07 | Cerberus Developments Bv | Method and apparatus for continuous flow isoelectric focusing for purifying biological substances |
| ES2302383T3 (es) * | 1998-07-22 | 2008-07-01 | Sapporo Breweries Ltd. | Metodos para obtener anticuerpos contra las bacterias del acido lactico que deterioran la cerveza y su uso diagnostico. |
| GB0229747D0 (en) * | 2002-12-20 | 2003-01-29 | Axis Shield Asa | Assay |
| DE602004017148D1 (de) | 2003-03-28 | 2008-11-27 | Univ Laval | S100 protein als aktivator neutrophiler zellen zur verminderung der neutropenie bei der krebsbehandlung |
| MX2007000956A (es) * | 2004-07-23 | 2007-06-05 | Aspenbio Pharma Inc | Metodos y dispositivos para diagnosis de apendicitis. |
| US7659087B2 (en) * | 2004-07-23 | 2010-02-09 | Aspenbio Pharma, Inc. | Methods and devices for diagnosis of appendicitis |
| US20110212104A1 (en) * | 2008-11-03 | 2011-09-01 | Schering Corporation | Inflammatory bowel disease biomarkers and related methods of treatment |
| AU2011247567B2 (en) * | 2010-04-29 | 2014-06-19 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Purification method for divalent cation binding proteins on anion exchange resin |
| RU2018113694A (ru) | 2015-09-17 | 2019-10-17 | Эмджен Инк. | Прогноз клинического ответа на антагонисты ил-23 с использованием биомаркеров сигнального пути ил-23 |
| WO2017112536A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Amgen Inc. | Ccl20 as a predictor of clinical response to il23-antagonists |
| US11714082B2 (en) | 2017-05-09 | 2023-08-01 | Immundiagnostik Ag | Method for determination of members of the S100 family of calcium binding proteins by immunoturbidimetry |
-
1983
- 1983-07-11 GB GB838318754A patent/GB8318754D0/en active Pending
-
1984
- 1984-07-04 CH CH3229/84A patent/CH661048A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-06 GB GB08417338A patent/GB2143239B/en not_active Expired
- 1984-07-09 BE BE0/213302A patent/BE900119A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-07-09 SE SE8403630A patent/SE500219C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-07-09 DE DE3425186A patent/DE3425186C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-09 FR FR848410864A patent/FR2550205B1/fr not_active Expired
- 1984-07-10 IT IT48540/84A patent/IT1177889B/it active
- 1984-07-10 NL NL8402182A patent/NL192456C/nl not_active IP Right Cessation
- 1984-07-10 JP JP59141568A patent/JPH0784479B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-10 DK DK338484A patent/DK169439B1/da not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-11-02 US US07/117,429 patent/US4833074A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-21 JP JP6318730A patent/JP2558442B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH661048A5 (de) | 1987-06-30 |
| SE8403630L (sv) | 1985-01-12 |
| FR2550205A1 (fr) | 1985-02-08 |
| NL192456C (nl) | 1997-08-04 |
| DK338484A (da) | 1985-01-12 |
| JP2558442B2 (ja) | 1996-11-27 |
| GB2143239A (en) | 1985-02-06 |
| BE900119A (fr) | 1985-01-09 |
| DK169439B1 (da) | 1994-10-31 |
| GB2143239B (en) | 1987-11-11 |
| IT8448540A0 (it) | 1984-07-10 |
| DK338484D0 (da) | 1984-07-10 |
| JPH07278194A (ja) | 1995-10-24 |
| DE3425186A1 (de) | 1985-01-24 |
| GB8318754D0 (en) | 1983-08-10 |
| SE8403630D0 (sv) | 1984-07-09 |
| SE500219C2 (sv) | 1994-05-09 |
| US4833074A (en) | 1989-05-23 |
| FR2550205B1 (fr) | 1989-12-08 |
| NL8402182A (nl) | 1985-02-01 |
| JPS6051113A (ja) | 1985-03-22 |
| IT1177889B (it) | 1987-08-26 |
| DE3425186C2 (de) | 1995-04-20 |
| GB8417338D0 (en) | 1984-08-08 |
| NL192456B (nl) | 1997-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4507229A (en) | Tissue protein PP4, a process for isolating it and its use | |
| JP2558442B2 (ja) | Ｌ１蛋白質 | |
| US4468457A (en) | Method for producing a CSAp tryptic peptide and anti-CSAp antibodies | |
| US4514506A (en) | Method for the identification and purification of human lung tumor-associated antigens (hLTAA) and clinical detection and determination of these antigens | |
| Kass et al. | Studies on the purification of antihemophilic factor (factor viii): i. precipitation of antihemophilic factor by concanavalin A | |
| Manni et al. | The eighth component of human complement (C8): isolation, characterization, and hemolytic efficiency | |
| Sas et al. | Further investigations on antithrombin III in the plasmas of patients with the abnormality of ‘antithrombin III Budapest’ | |
| JP3362054B2 (ja) | 扁平上皮がん状物質およびその分離方法 | |
| US3956258A (en) | Carcinoembryonic antigens | |
| US4180499A (en) | Carcinoembryonic antigens | |
| US4500451A (en) | New protein PP13 extracted from human placental tissues and use thereof | |
| EP0283779B1 (en) | Method of assaying high molecular hyaluronic acid | |
| EP0108992B1 (en) | Immunoassay | |
| US4086217A (en) | Carcinoembryonic antigens | |
| US4592863A (en) | Protein PP20, a process for obtaining it, and its use | |
| US4223002A (en) | Isolation of alpha1 -fetoprotein | |
| US4599318A (en) | Tissue protein PP19, a process for obtaining it, and its use | |
| Girault et al. | Improving the quality of immunoblots by chromatography of polyclonal antisera on keratin affinity columns | |
| CA1039650A (en) | Cancer associated polypeptide antigen, process for its preparation, process for preparing antibodies, process of cancer diagnosis and composition useful as an immunizing agent | |
| US4195073A (en) | Radioimmunoassay of alpha 1 fetoprotein | |
| Braatz et al. | Characterization of a human lung tumor-associated antigen and development of a radioimmunoassay | |
| Izumi et al. | Characterization of abnormal thyroglobulin in a transplantable rat thyroid tumor | |
| Bohn et al. | Tissue protein PP 4, a process for isolating it and its use | |
| WIKLUND et al. | Further immunochemical studies of tissue polypeptide antigen (TPA) | |
| Bohn et al. | Protein PP 20, a process for obtaining it, and its use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |