DE3425186A1

DE3425186A1 - Humanproteine, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende testkits

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Publication number: DE3425186A1
Application number: DE19843425186
Authority: DE
Inventors: Inge Dr. Dale; Magne K. Dr. Fagerhol; Inger Oslo Naesgaard
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Fagerhol Magne K Dale Inge Oslo No
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-07-09
Publication date: 1985-01-24
Anticipated expiration: 2004-07-10
Also published as: JPS6051113A; BE900119A; NL192456C; CH661048A5; SE8403630D0; FR2550205A1; GB2143239B; DK169439B1; SE8403630L; US4833074A; NL192456B; GB8318754D0; GB8417338D0; JP2558442B2; GB2143239A; JPH0784479B2; NL8402182A; SE500219C2; IT1177889B; DK338484A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft zwei reine Humangranulozytenproteine, Verfahren zu deren Isolierung und Reinigung, deren Verwendung, Antisera, die gegen diese Proteine erzeugt wurden, Methoden zur Herstellung dieser Antisera, die Verwendung dieser Antisera und Testkits, die diese Antisera enthalten.

Von den Blutzellen haben nur die weißen Blutkörperchen, die Leukozyten, Kerne und sind fähig, die zahlreichen im Blutplasma gefunden Proteine zu erzeugen. 1 mm³ Blut enthält etwa 6000 bis 10 000 Leukozyten. Eine Untergruppe der Leukozyten sind die Granulozyten, die wiederum in neutrophile polymorph-kernige Granulozyten, die etwa 95 % aller Granulozyten ausmachen, eosinophile Granulozyten und basophile Granulozyten unterteilt werden. Beim gesunden Erwachsenen werden etwa 10 Granulozyten täglich aus dem Knochenmark freigesetzt, jedoch kann dies während schwerer Infektionen und Entzündungszuständen zehnfach gesteigert werden. Normalerweise haben die Leukozyten eine Durchgangszeit von etwa 6 h im Kreislauf,

ng bevor sie in die Gewebe eintreten, wo sie ihre biologischen Funktionen durchführen und gegebenenfalls abgesondert werden. Der Umsatz der Leukozyten kann bei Gesundheit und Erkrankung beträchtlich variieren, was durch Untersuchungen unter Verwendung von mit isotopen markierten

₃g Granulozyten, sowie durch histologische Methoden gezeigt wurde, die das variierende Ausmaß der Leukozyten-infiltration in Gewebe zeigen. Jedoch ist keine dieser Methoden leicht für klinische Untersuchungen des

— δ-Ι Leukozytenumsatzes verfügbar. Eine alternative und leichter verfügbare Methode kann die überwachung der Freisetzung von einem oder mehreren charakteristischen Leukozytenproteinen während der Funktion und/oder Sequestration der Leukozyten sein.

Drei Veröffentlichungen zeigen den Befund, der darauf schließen läßt, daß Leukozyten eine Anzahl von Proteinen enthalten, die während verschiedener Erkrankungen in ihrer Konzentration variieren können. Einige dieser Proteine wurden als Ll, insbesondere pi 6,3 und pi 6,5 Ll (Literaturstellen 1 und 2) oder R:6 und R:7 (Literaturstelle 3) bezeichnet. Gemäß Analyse durch zweidimensionale Elektrophorese (ISO-DALT) ist das pi 6,5 Li Protein identisch mit dem R:6 Protein und das pi 6,3 Ll Protein ist identisch ist mit dem R:7 Protein. In den Veröffentlichungen 1 bis 3 wurden die Proteine bei analytischen Methoden unter Hunderten bis Tausenden von anderen Proteinen festgestellt. In der Veröffentlichung 1 wurden Versuche unternommen, die Ll Proteins zwecks Bereitstellung quantitativer Methoden und einleitender Charakterisierungen zu reinigen. Die präparative Gelfiltration, die isoelektrische Fokussierung und die Affinitätschromatographie ergaben ein Protein mit einem Molekular- gewicht von etwa 51 000 Dalton (gemäß SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Gelfiltration), das sehr instabil war, das jedoch zur Immunisierung von Kaninchen verwendet werden konnte (1). Die Isolierungs und Reinigungsmethoden, die in der Literaturstelle 1 angewendet wurden,

QQ ergaben nur eine sehr geringe Ausbeute des Proteins mit 51 000 Dalton, und häufig ging das Protein während der Verfahrensschritte verloren. Die Immunisierung von Kaninchen durch Injektion des 51 000 Dalton Proteins ergab ein Antiserum für die Ll Proteine,jedoch häufig gg auch Antikörper gegen andere Proteine. Diese Antisera mußten von unerwünschten Antikörpern befreit werden durch Adsorption mit normalem Humanserum oder Humangewebsextrakten. In der Veröffentlichung 1 wurden nicht-

-Ί-

fraktionierte Leukozyten durch Gefrieren/Auftauen und mechanisches Homogenisieren der Leukozyten ohne Zusatz von jeglichen Enzyminhibitoren extrahiert.

In der Veröffentlichung 3 sind lediglich analytische Methoden der Bestimmung der R:6 und R:7 Proteine beschrieben, jedoch keine Isolierungs- oder Reinigungsverfahren.

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von milden und wirksamen Methoden zur Extraktion und Reinigung der Ll Proteine aus Leukozyten, um deren Charakterisierung zu ermöglichen, und die Bereitstellung monospezifischer Antisera oder Antikörper gegen diese Proteine. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Testkits bzw. Testausrüstungen, die derartige Antisera und/oder derartige gereinigte Ll Proteine enthalten, gegebenenfalls markiert mit einem radioaktiven Isotop oder mit einem Enzym, das für quantitative Assays bzw. Bestimmungen von Ll Proteinen in Körperflüssigkeiten oder Zeil- oder Gewebsextrakten geeignet ist.

überraschenderweise wurde gefunden, daß die Ll Proteine in reinem und stabilem Zustand erhalten werden können, wenn nur Granulozyten als Ausgangsmaterial verwendet werden und wenn die Granulozyten unter derartigen Bedingungen zerstört werden, daß die Lysosomen in den Granulozyten nicht gleichzeitig zerstört werden. Dieses Ziel wird durch Druckhomogenisation der Granulozyten in Anwesenheit eines Enzyminhibitors und eines Mittels, das die Lysosomenmembranen stabilisiert, erreicht.

Dementsprechend betrifft die Erfindung reine pi 6,3 und pi 6,5 Ll Proteine und Gemische davon, Verfahren zu deren 3g Extraktion aus Granulozyten durch Druckhomogenisation der Granulozyten in Anwesenheit eines Enzyminhibitors und eines Mittels, das die Lysosomenmembranen stabilisiert, sowie deren Reinigung durch verschiedene Methoden, die

Verwendung dieser Proteine zur Herstellung monospezifischer Antisera oder Antikörper, Verfahren zur Herstellung dieser monospezifischen Antisera oder Antikörper durch Immunisieren von Versuchstieren mit den Ll Proteinen, die monospezifischen Antisera und Antikörper als solche, die Verwendung dieser Antisera oder Antikörper und /oder der gereinigten Ll Proteine zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Ll Proteine in Zellen , Geweben und Körperflüssigkeiten, und Testkits bzw. Testausrüstungen, die diese reinen Ll Proteine, Antisera und/ oder Antikörper, gegebenenfalls markiert durch radioaktive Isotope oder durch Enzyme, enthalten.

Die Erfindung betrifft insbesondere die reinen pi 6,3 ¹^ und pi 6,5 Ll Proteine, Gemische davon und Salze davon.

Salze der Ll Proteine sind insbesondere nicht-toxische, pharmazeutisch brauchbare Salze oder auch solche, die zur Ausfällung und/oder für Reinigungsverfahren für die Ll Proteine verwendet werden können.

Derartige Salze sind beispielsweise Metallsalze, wie Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, ζ. Β. Natrium-Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze oder Zinksalze und dgl., oder Ammoniumsalze mit Ammoniak oder primären, sekundären oder tertiären Aminen, beispielsweise Salze mit aliphatischen, cycloaliphatischen, cycloaliphatischaliphatischen oder araliphatischen primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie mit niedrig-Mono-,Di- oder Triniedrig-alkylaminen, z. B. Triethylamin, Hydroxyniedrig-alkylaminen, z. B. 2-Hydroxyethylamin, Bis-(2-hydroxyethyl)-amin oder Tris-(2-hydroxyethyl)-amin oder mit basischen aliphatischen Estern von Carbonsäuren, ζ. B. Ethylendiamintetraessigsäure-niedrig-alkylester,

z. B. dem Tetraethylester und dgl.

/.'eitere Salze sind Säureadditionssalze mit anorganischen Sijren, insbesondere Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoff,

Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Sulfosäuren, gegebenenfalls substituierte niedrig-Alkancarbonsäuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsaure, Methylinaleinsäure, Malonsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure oder gegebenenfalls substituierte aromatische Säuren, z. B. Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 1-Acetoxybenzoesäure, Embonsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure oder Aminosäuren, niedrig-Alkansulfonsauren, z. B. Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 4-Methylbenzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Ascorbinsäure und dgl.

Beide Proteine sind dadurch charakterisiert, daß ihre isoelektrischen Punkte beim pH-Wert 6,3 bzw. beim pH-Wert 6,5 liegen. Das Molekulargewicht beider Proteine, wie bestimmt durch Gelfiltration und Dichtegradientenültrazentrifugieren, ist gleich und beträgt etwa 36 500 Dalton. Die SDS-Elektrophorese an Polyamidgel zeigt, daß die Proteine aus drei Polypeptiden von etwa identischem Molekulargewicht von 12 500 Dalton bestehen. Jede dieser Polypeptidketten weist die folgende Aminosäuresequenz, ausgehend vom N-Terminal auf: Meth-Leu-Thre-Glu, wie durch die Standard-Edman-Verfahrensweise gezeigt. Die elektrische Gesamtladung und die Verfügbarkeit antigener Stellen an den Ll Proteinen werden stark durch die Abwesenheit oder Anwesenheit von Calciumionen beeinflußt. Die Proteine reagieren wesentlich stärker als Antigene in vitro in Anwesenheit von Calciumionen.

Die Wärmestabilität der Ll Proteine ist bei neutralem und alkalischem pH-Wert hoch. Bei 15minütigem Sieden in wässrigem 5 m-molarem EDTA vom pH-Wert 8,5 bleiben 90 % des Proteins erhalten. Die Ll Proteine werden teilweise durch Ethanol bei saurem pH-Wert, z.B. zwischen etwa 4 und 5 ausgefällt.

Die Ll Proteine haben eine charakteristische Verteilung im menschlichen Körper, sie werden in großen Mengen in neutrophilen Granulozyten, Monozyten und squamösen Epithelzellen, mit Ausnahme normaler Haut, gefunden. Sie werden auch in zahlreichen Krebszellen des squamösen Epitheltyps und in einigen Leukämie- und Lymphom-Zellen gefunden, insbesondere solchen vom myelogenen leukämischen Typ und vom monocytischen Lymphomtyp. Ll Proteine finden sich in großer Überzahl in squamösem Krebs des Harntrakts und der Lungen. Die Ll Proteine sind auch in normalen Körperflüssigkeiten in relativ niedrigen Konzentrationen bei gesunden Individuen vorhanden, jedoch in steigenden Konzentrationen bei erhöhtem Entzündungsgrad. In weißen Blutkörperchen sind die Ll Proteine bis zu 90 % in der Cytosolfraktion vorhanden.

Die L- Proteine können als Marker-Proteine, insbesondere in radioaktiv markierter Form, z. B. mit J oder P , zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung des Ll- Proteingehalts in Körperflüssigkeiten, Zellen und Geweben, verwendet werden.

Die Ll Proteine sind gute Immunogene bei Tieren, beispielsweise Kaninchen.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur

Herstellung der reinen pi 6,3 und pi 6,5 Ll Proteine, der Gemische davon und von Salzen davon, das darin besteht, Humangranulozyten in einem geeigneten Puffer-₃q systerr aufzubrechen, nicht lösliches Zellmaterial zu entfernen und die überstehende Flüssigkeit

a) einer isoelektrischen Fokussierung und Eluieren der Banken, die das pi 6,3 und/oder das pi 6,5 Ll Protein entfalten, mit einem Puffer, oder

b) einer Anionenaustauschchromatographie mit einem EDTA-enthaltenden Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8,5

und Eluieren der gewünschten Ll Proteine mit einem Calciumionen enthaltenden Puffer oder

c) der Affinitätschromatographie oder 5

d) einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese oder

e) einer Kationenaustauschchromatographie oder f) einer Gelfiltration oder

g) einer reversiblen Ausfällung mit Zn++ oder

jeglicher Kombination der Stufen a) bis g) zu unterwerfen, die Eluate von jeglichen Ampholyten und/oder Salzen zu befreien, die erhaltene Lösung der reinen Ll Proteine zu konzentrieren, falls gewünscht, die erhaltene konzentrierte Lösung zu lyophilisieren und, falls gewünscht, die erhaltenen Ll Proteine in ein Salz umzuwandeln oder das erhaltene Salz in die freien Proteine umzuwandeln.

Die als Ausgangsmaterial für die Extraktion der Ll Proteine verwendeten Granulozyten werden aus frischem menschlichem Blut nach irgendeiner der üblichen Methoden erhalten, beispielsweise durch Dextransedimentation und Dichtegradienten-Zentrifugieren,

Das Puffersystem, in dem die Granulozyten aufgebrochen werden, enthält ein Mittel, das das gleichzeitige Aufbrechen der Lysosomen verhindert, wie Glycerin, Dextrane und vorzugsweise Saccharose, in einer Konzentration, die ausreicht, um den osmotischen Druck vor und nach dem Aufbrechen der Zellwandungen zu stabilisieren. Beispiels-

weise wird Saccharose in einer Konzentration von 0,27 bis 0,34 m verwendet. Das Puffersystem enthält darüber hinaus Enzyminhibitoren, die die Digestion■der Ll Proteine verhindern, wie Diisopropylfluorphosphat (DFP), Soja-

bohnen-Trypsininhibitor, Trasilol , Quecksilberbenzoat,

Pepstatin A und vorzugsweise Phenylmethylsulfonylfluorid (PMFS), und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Gemische davon.

Das Aufbrechen der Zellwandung kann in üblicher Weise erfolgen, beispielsweise mechanisch, z. B. durch einen Rotationsmischer, einen Mörser (Potter-Elvelyem-Methode), durch Ultraschall, Gefrieren und Auftauen, oder durch Kombination dieser Methoden. Bei einer bevorzugten Methode werden die Granulozyten durch Druckhomogenisation aufgebrochen.

Nach dem Aufbrechen der Granulozyten werden unlösliche Materialien, wie nicht gebrochene Zellen, Zelltrümmer und L/sosomen entfernt, beispielsweise durch Ultrazentr ifugieren.

Die LL Proteine werden in reiner Form aus dem rohen Granu „ozytenextrakt nach einem beliebigen der folgenden Reini'iungsverfahren erhalten.

a) Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung wird vorzugsweise in einem granulierten Gel, wie Agarose- oder polymerisiorte Dextranperlen, durchgeführt, das ein geeignetes Gemisch von handelsüblichen Ampholyten enthält, um einen stabilen pH-Gradienten von etwa pH 5 bis 8 wäl- rend des Verfahrens zu ergeben. Die isoelektrische Fokussierungsmethode wird mit einer maximalen Spannurg von etwa 25 V/cm während etwa 10 bis 20 h bei eirer Temperatur von etwa 5 bis 15° durchgeführt. Ein

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bevorzugtes Gel ist Ultrodex , und der bevorzugte Am f. holyt ist Ampholine

Die Probe wird vorzugsweise an der Kathodenseite des Gels aufgebracht. Die Lokalisierung der Ll Proteinbanden kann durch pH-Wert-Messungen längs der Gel-

Oberfläche oder durch fleckenbildende Filterpapierabdrücke der Topoberfläche, beispielsweise mit Koomassie-Blau, erfolgen.

Die die Ll Proteine enthaltenden Banden werden abgekratzt und mit einem geeigneten Puffer, der EDTA enthält, bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,5, eluiert.

Das Eluat wird von den Ampholyten und den Salzen durch Dialyse und/oder Gelfiltration befreit und durch Ultrafiltration und/oder Lyophilisieren konzentriert.

b) Anionenaustauschchromatographie

Die Anionenaustauschermaterialien, die bei dieser Methode verwendet werden, enthalten beispiele tertiäre oder quaternäre Aminogruppen und sind beispielse Diethylaminoethylcellulose, ζ. B. Diethylaminoethyl-Sepharose , oder QAE-Cellulose (quaternäre Aminoethylcellulose). Der Granulozytenextrakt, der die Ll Proteine enthält, wird auf die Säule in einem Puffer mit geringer Ionenstärke, der EDTA enthält, und mit einem pH-Wert von etwa 8,5 aufgetragen. Die Ll Proteine werden spezifisch durch Calciumionen enthaltenden Puffer, beispielsweise einen Puffer, der 30 m-molares Barbital und 5 m-molares Calciumchlorid enthält , eluiert.

^c^ Affinitätschromatographie

Eine dritte Methode zur Reinigung des Ll Proteins bsiert auf der Affinitätschromatographie. Diese kann an Glasperlen mit gesteuerten Poren, mit einer großen Oberfläche, z. B. von etwa 50 m²/g durchgeführt werden. Die Glasperlen werden in eine Säule eingesetzt und der rohe Granulozytenextrakt wird in einem geeigneten Puffer mit niedriger Molarität, der Calcium-

ionen enthält, bei neutralem oder leicht sauren pH-Wert, z. B. von etwa pH-Wert 6 bis 7, aufgetragen. Die Ll Proteine werden mit einem alkalischen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,5 bis 8,5, der etwa 50 m-molares EDTA und Polyethylenglykol oder Lithiumbromid enthält, eluiert.

Eine andere affinitätschromatographische Methode verwendet die anti-Ll Antikörpersäule. Die Ll Proteine werden an den Antikörpern adsorbiert, wohingegen andere Proteine mit einem Puffer durchgewaschen werden. Anschließend werden die Ll Proteine mit einer Salzlösung, wie mit einem wässrigen Puffer vom pH-Wert etwa 3,5, der ein Salz enthält, wie Natriumchlorid oder Natriumjodid, eluiert.

d ) Präparative Agarosege!-Elektrophorese

Flachbett-Agarosegels mit geeigneten Abmessungen,die 75 m-molaren Barbital-/2,5 m-molaren EDTA-Puffer vom pH-Wert 8,5 enthalten, werden verwendet. Die Elektrophorese erfolgt bei 4 V/cm während 10 - 18 h. Die Ll Pr )teinbanden werden durch Fleckenbildung auf Filterpaoierabdrücken der Geltopoberfläche lokalisiert. Die Ll Proteinbanden werden in dem «₂-Globulingebiet gebunden und werden durch Gefrieren/Auftauen und Zentrifugieren der relevanten Streifen des AgarosegeLs eluiert.

e) Ka"ionenaustauschChromatographie

Die Kationenaustauschchromatographie wird an Kationenaustauscherharzen, wie Sulfonylpropyl-substituierte-Cellulose oder polymerisiertes Dextran durchgeführt. Der rohe Granulo?,ytenextrakt wird auf die Säule nach dem Vermischen mit einem Puffer mit niedriger Ionenstärke, der Calciumionen enthält, und mit einem pH-Wert von etwa 6 aufgetragen. Nicht adsorbierte

Proteine werden mit dem Ausgangspuffer weggewaschen, und die Ll Proteine werden mit einem Puffer, der EDTA und steigende Konzentrationen an Natriumionen enthält, eluiert.

f) Gelfiltration

Für die Gelfiltration werden Sephadex G75 bis G200-Agarosegels (Sepharosegels), wie Ultragel , oder

Polyacrylamidgel-Perlen, wie Bio-Gel P-60 verwendet. Die Säule ist vorzugsweise eine lange Säule. Die Länge der Säule sollte etwa das 50fache des Durchmessers betragen. Der rohe Granulozytenextrakt wird als solcher aufgetragen, und die Ll Proteine werden chromatographiert. Zum Füllen der Kolonne und zur Verarbeitung wird ein Puffer verwendet, der vorzugsweise 0,1 m Natriumeitrat, 2,5 m-molares EDTA-K- und 0,25 m-molares Thimerosal enthält, pH 8,5. Die Ll Proteine finden sich in einer Fraktion, die einem Molekulargewicht von 35 000 bis 40 000 Dalton entspricht.

g) Reversible Ausfällung mit Zn

Die Ll Proteine werden quantitativ aus wässrigen Lösungen mit neutralem oder alkalischem pH-Wert durch Behandeln mit Zn -Ionen, insbesondere in der Form von wasserlöslichen Zinksalzen, wie Zinkacetat oder Zinkchlorid, ausgefällt. Beispielsweise kann eine wässrige Lösung, die die Ll-Proteine enthält, bei einem pH-Wert von etwa 8,5 mit einer etwa 10 m-molaren bis 100 m-molaren wässrigen Lösung von Zinkacetat behandelt werden. Das ausgefällte Ll-Zinksalz wird gesammelt, falls notwendig mit der wässrigen Pufferlösung gewaschen, mit einer komplexbildenden Säure behandelt, beispielsweise einer etwa 100 m-molaren wässrigen Diakalium-ethylendiamintetraessigsäurelösung vom pH-Wert 8,5, und zur Gewinnung der freien

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LJ Proteine wird die Lösung durch eine Ionenaustauschersäule, beispielsweise Pharmacia PD-IO, filtriert und lyophilisiert.

Die Salze des Ll Proteins werden nach üblichen Methoden erhalten, z. B. durch Behandeln mit den relevanten Ionen, z. B. einer Base, einer Saure oder einem Salz, die bzw. das die gewünschten Ionen enthält, oder durch Ionenaustauscherbehandlung. Ein sehr unlösliches Manqansalz kann beispielsweise hergestellt werden durch Zusatz von Mn -Ionen, beispielsweise in der Form von einer etwa 10 m-molaren bis 100 mmolaren wässrigen Lösung von Manganacetat oder einem anderen wasserlöslichen Mangansalz zu einer wässrigen Lösung der Ll Proteine.

Die Erfindung betrifft auch die monospezifischen Antisera gegen das Ll Protein und die Antikörper enthaltenden Immunglobuline, insbesondere solche, wie sie durch Kaninchen erzeugt werden.

Monospezifische Antisera werden durch übliche Methoden erzeugt, z. B. durch wöchentliche Injektion der reinen Ll Proteine mit vollständigem Freund's Adjuvans

z. B. subkutan oder intramuskulär, in Dosierungen von etwa 100 ug pro Kaninchen pro Woche während etwa 8 bis 16 Wochen. Das Serum wird dann aus den Tieren z. B. durch Venensektion und Gerinnung gewonnen. Anstelle von Kaninchen können auch andere nicht-menschliehe warmblütige Tiere, insbesondere Säuger, z. B. Schafe, Ziegen, Ratten, Mäuse, Pferde und dgl. verwendet werden.

Die monospezifische Antikörper enthaltende Globulinfraktion kann aus dem Serum durch übliche Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie.

Zur Erzeugung der monospezifischen anti-Ll Antikörper wird das monospezifische Antikörper enthaltende Antiserum oder die Globulinfraktion davon durch eine Säule geführt, in der die gereinigten Ll Proteine an ein geeignetes Material, wie Agarose- oder Cellulosegel, konjugiert wurden. Nach dem Wegwaschen der nichtadsorbierten Proteine werden die anti-Ll Antikörpermoleküle durch einen Puffer mit einem pH-Wert von 3,5, der Natriumchlorid oder Natriumjodid enthält, eiuiert.

Die relevanten Fraktionen werden auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt, dialysiert und konzentriert.

Die anti-Ll Antikörper weiden entweder gereinigt oder in roher Form, wie in der Form der Antiserum- oder Globulinfraktionen davon, für qualitative oder quantitative Methoden zur Bestimmung von Ll Proteinen in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten verwendet. Derartige Methoden umfassen die Ausfällung in Gele, die Nephelometrie, Radioimmunassay, Enzymimmunassay, Immunfluoreszenz und Immunperoxidase-zytohistochemische Techniken in üblicher Weise.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus Testkits bzw. Testausrüstungen, die den reinen monospezifischen anti-Ll Antikörper oder die anti-Ll Antikörper-GlobulLnfraktion oder das den anti-Ll Antikörper enthaltende Antiserum umfassen; Derartige Testkits sind vom üblichen Typ und zielen ab auf Einzel-Radioimmundiffusion, Latexagglutination, Spottest, Radioimmunassays, Enzymimmunassays, Immunfluoreszenz- und Enzymimmunhistochemische-Tests.

Derartige Kits können zusätzlich zu anti-Ll Antikörpern in reiner oder roher Form,getrocknet oder lyophilisiert in einem geeigneten Puffer, vorgefertigte Gele, Latex, Polystyrol, mit Formalin stabilisierte tierische rote Blutkörperchen oder ähnliche Teilchen, Enzyme, wie

Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Enzymsubstrate, Fluoreszenz- oder Enzym-konjugierte-Antikörper und Materialien, die zur Abtrennung von Antikörper-gebundenen Ll Molekülen von freien Ll Molekülen geeignet sind, wie abgetötete Stämme von Staphylococcus aureus, die zu den Stämmen gehören, die Staphylococcus-Protein A erzeugen, Aktivkohle (die das freie Ll Protein, jedoch nicht den Antikörper-Protein-Komplex adsorbiert), oder einen zweiten Antikörper, wie Ziegen- oder Anti-Kaninchen-Immunglobulin oder Ll-Proteine, markiert mit

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radiaktiven Isotopen, wie J oder mit Enzymen, wie Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase, enthalten. Der Kit kann auch Träger enthalten, auf denen monospezifische anti-Ll Antikörper an einer Oberfläche fixiert sind, z. B. die innere Oberfläche von Teströhrchen, die Oberfläche von Glas- oder Kunststoffkügelchen, Stücke von Filterpapier, Celluloseazetatmembranen oder ahnliche Materialien, sowie Puffer für derartige Methoden.

Vorstehend und nachfolgend werden folgende Abkürzungen verwendet:

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese

SDS Natriumdodecylsulfat

ISF isolektrisches Fokussieren

SRID Einzel - Radioimmundiffusion

NHS normales Humanserum

ACD Säure-Citrat-Dextrose

DFP Diisopropylfluorphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EDTA-K₂ Dikaliumsalz von EDTA

DEAE Diethylaminoethyl

RIA Radioimrnunassay

PSS mit Phosphat gepufferte Salzlösung

PASA Protein A enthaltender Staph. aureus

-19-Beispiel 1; Isolierung von Granulozyten

a) Ein Gemisch aus 435 ml frischem menschlichem Blut, 65 ml einer wässrigen Lösung, die 2,2 % TrinatrLumcitratdihydrat enthält, 0,8 % wasserfreier Zitronensäure und 2,45 % Dextrose, 250 ml Dextran mit hohem Molekulargewicht (Dextraven -150) und 23 ml einer Lösang, die

2.5 mM Zitronensäure, 45 mM Trinatriumcitrat, 80 mM Glucose und 15 mM Natriumchlorid enthält, läßt man 1 h bei 4°C sedimentieren.Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und bei 200 χ g während 20 min bei 4 ⁰C zentrifugiert. Das Sediment wird mit 50 ml eisgekühltem destilliertem Wasser behandelt, wodurch die roten Blutkörperchen aufgelöst werden. Nach 30 s wird die Isotonie durch Zusatz von 16,5 ml eiskaltem 0,6 m Natriumchlorid wieder hergestellt. Die verbleibenden Leukozyten werden zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Die Granulozyten werden von den nononuklearen Zellen durch Zentrifugieren an Lymphoprep / Material für das Zentrifugieren mit Dichtegradienten, bestehend aus 9,6 % (Gew./VoI) Natriummetrizoat-Lösung, enthaltend

5.6 % (Gew./Vol.) eines Erythrozyten-aggregierenden Polysaccharids (Ficoll)_7, gefolgt vom Zentrifugieren bei 800 χ g während 20 min bei 20 ⁰C abgetrennt. Diese

Verfahrensweise ergibt eine Ausbeute von etwa 5x10 Zellen, wobei etwa 95 % Granulozyten sind.

b) Granulozytenextraktion

Die wie unter a) erhaltenen Zellen werden erneut in 0,27 m Saccharose, enthaltend 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-K₂ und 0,25 mM Thimerosal, versetzt mit Trispuffer auf den pH-Wert 8,5,suspendiert. Anschließend werden die Zellen nach French und Holm (4) durch Anlegen von 27,4.10⁵Pa (28 kg/cm²) Druckluft während zwei Perioden von 2 min, wobei sie aus der Druckkammer in einer Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde

entweichen können, homogenisiert. Während dieser Verfahrensweise wurden die Zellbehälter in Naßeis gehalten. Etwa 90 % der Zellen werden aufgebrochen, und nach dem Zentrifugieren bei 100000 χ g während 1 h fanden sich etwa 90 % des gesamten Ll Proteins in der klaren überstehenden Flüssigkeit. Letztere wird als roher Granulozytenextrakt bezeichnet. Der gesamte Proteingehalt beträgt etwa 3 mg/ml, wobei 30 % davon Ll Proteine sind.

10c) Präparative isoelektrische Fokussierung (IEF)

Für die präparative IEF werden 110 χ 240 χ 5 mm GeI-

platten verwendet, die aus Ultradex (Dextran G75, verfeinert), enthaltend 2 % (Gew./Vol.) Ampholine ^R, pH 5-8 (ein Gemisch von synthetischen Ampholyten mit Pufferkapazitäten an ihren isoelektrischen Punkten)bestehen. Die Proben / 5 ml der überstehenden Flüssigkeit gemäß b) werden mit einem gleichen Volumen von Ultradex -Gel vermischt und 5 cm von der Kathode entfernt auf die GeI-platten aufgetragen. Die Trennung erfolgt während 18 h mit maximal 25 V cm , 15 mA und 10 W. Die Proteinbanden werden sowohl durch Koomassie-Blau-Fleckenbildung auf einem Filterpapierabdruck der Gelplatte, als auch durch pH-Wertmessungen der Geltopoberfläche, lokalisiert. Die Ll Proteine in dem pH 6,3 und 6,5 Abschnitt werden mit einem gleichen Volumen einer wässrigen Lösung, die 0,1 M Natriumacetat, 2,5 mM EDTA-K₂ und 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5, enthält, durch Zentrifugieren bei 2000 χ g während 20 min durch 0,45 um Millipore ^R Filter eluiert. Die Ampholyte werden durch Dialyse gegen den Elutionspuffer über Nacht entfernt. Das verbleibende Protein und die Puffer enthaltenden Lösungen werden durch

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Ultrafiltration an Minicon Zellen (semipermeable Membran) konzentriert. Die Ausbeute dieser Verfahren beträgt etwa 20 % des Ll Proteins, das auf das präparative IEF-GeI aufgetragen wurde. 2,5 ml dieser Lösung

R R

werden auf eine Pharmacia PD-10 Säule (Sephadex G25 M), equilibriert mit destilliertem Wasser, aufgetragen, und die Ll Proteine werden mit 3,5 ml destilliertem Wasser

eluiert und lyophilisiert, unter Bildung yon I mg reinem Ll Protein pi 6,3 und 6,5.

Das pi 6,3 und das pi 6,5 Ll Protein können auch getrennt nach dieser Methode gereinigt werden, unter Bildung von etwa 0,67 mg des pi 6,5 und etwa 0,33 mg des pi 6,3 Ll-Proteins.

Beispiel 2

Die Methode nutzt die starke Änderung des isoelektrischen Punktes des Ll Proteins aus, wenn es Calciumionen aufnehmen kann (2). Das Protein bindet in rohen Granulocytenextrakten an einen Anionenaustauscher, beispielsweise des Diethylaminoethyltyps, bei alkalischem pH-Wert und mit einer Ethylendiamintetraessigsäure, in ausreichenden Mengen zur Bindung von Calciumionen, enthaltenden Puffer. Die Ll Proteine können anschließend spezifisch durch Zusatz von Calciumchlorid zu dem Puffer eluiert werden, um eine Endkonzentration von etwa 5-10 mM pro Liter sicherzustellen.

Die rohen Granulozytenextrakte werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Ihr gesamter Proteingehalt liegt bei etwa 2-5 g pro Liter, wovon etwa 60 % Ll Protein ist.

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DEAE-Sephacel (Pharmacia, Schweden) wird mit 60 mmolarem Barbitalpuffer (7,7 g Diethylbarbitursäure und 10,5 g des Natriumsalzes davon in 1 1 Wasser), enthaltend IgI EDTA-K₂, pH 8,5, equilibriert und in eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 1,5 χ 5 cm, d. h. einem Volumen von etwa 9ml , gefüllt.

Die Probe, etwa 10 ml roher Granulozytenextrakt, verdünnt mit 30 ml EDTA-K- Barbitalpuffer vom pH-Wert 8,5 wird

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mit einer Schlauchpumpe, die eine Strömungsgeschwindigkeit von etwa 2 ml/min ergibt, aufgetragen. Nicht adsorbierte Proteine werden mit 100 ml Barbitalpuffer ausgewaschen. Vor dem Eluieren der Ll Proteine wird die Säule ebenfalls mit 30 ml Barbitalpuffer ohne EDTA-K-gewaschen. Die Ll Proteine werden anschließend mit 60 mmolarem Barbitalpuffer, der 5 mM CaCl₂ enthält, pH 8,5, eluiert.

Die Fig. 1 zeigt das Gesamtprotein- und Ll Protein-Elutionsprofil einer derartigen Ionenaustauschchromatographie, und in der Fig. 2 ist das Proteinbanden-Muster dargestellt, wenn roher Leukozytenextrakt und gereinigtes Ll Protein der analytischen Agarosegel-Elektrophorese unterworfen wird. Es ist ersichtlich, daß das gereinigte Ll Protein zwei Hauptbanden, wie vorstehend beschrieben, entsprechend pi 6,3 und pi 6,5 ergibt.

Die ir.it dem Calcium enthaltenden Puffer eluierte Menge an Ll Protein liegt nahe bei 50 % der in der Probe aufgetragenen und wird in einem Gesamtvolumen von etwa 20 ml gefunden. Diese Lösung kann zweckmäßig durch Ultrafiltration unter Verwendung von Millipore CX-10 Membranen konzentriert werden. Dies führt zu einem gewissen Proteinverlust, in Abhängigkeit davon, ob EDTA zugesetzt wird oder nicht, um die Bindung von Ll Protein an die Membranen zu verhindern. Selbst ohne Zusatz von EDTA kann eine Gesamtausbeute von etwa 35 % erzielt werden.

Wie in der Fig. 1 gezeigt, wird ein Teil des Ll Proteins mit 60 m-molarem Barbitalpuffer, der 5 mM CaCl₇ und 125 mM NaCl enthält, pH 8,5, eluiert, jedoch ergibt dieses Protein Banden, die hauptsächlich anodal und kathodal von den Haupt-Ll-Banden liegen und teilweise denaturiertes oder komplexes Ll Protein zusätzlich zu verschiedenen Proteinen darstellen dürften.

-23-Methoden in großem Maßstab

Die vorstehend beschriebene Methode kann erfolgreich im Maßstab vergrößert werden, um 50 ml rohe Granulozytenextrakte zu handhaben. Dies wird erzielt unter Verwendung einer Säule, die etwa 50 ml DEAE-Sephacel (etwa 2,5 χ 10 cm) enthält und proportionale Steigerung der wie vorstehend angegebenen Puffervolumina.

b) Hier wird ausgenützt, daß eine reversible Ausfällung der Ll Proteine durch Zusatz von 10 mM zn erzielt werden kann. Zu 10 ml rohem Leukozytenextrakt werden 90 ml Barbitalpuf fer, 75 mil, pH 8,5, und 10 ml einer 100 mM Zn-Acetatlösung in Wasser gefügt. Die Ausfällung wird mehrfach, beispielsweise fünfmal, mit 75 m-molarem Barbitalpuffer, pH 8,5, mit 10 m-molarem Zn-Acetat gewaschen. Schließlich wird die Ausfällung mit 75 m-molarem Barbitalpuffer, pH 8,5, gewaschen und durch tropfenweise Zugabe einer Lösung von 100 m-molarem EDTA-K₂ in Wasser, pH-Wert durch 5 mM Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt, gelöst. Diese Proteinlösung wird auf eine Pharmacia PD-10-Säule aufgetragen, die mit destilliertem Wasser equilibriert ist, und die Ll Proteine werden mit 3,5 ml destilliertem Wasser eluiert und lyophilisiert, unter Bildung von etwa 10 bis 20 mg reinen Ll Proteinen.

Beispiel 3: Herstellung von Antiserum für gereinigtes Ll

Eine Lösung, die etwa 1 mg/ml gereinigtes pi 6,3 und pi 6,5 Ll Protein (erhalten gemäß Beispiel 1 oder 2) in 0,1 μ Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5, enthält, wird mit vollständigem Freund's Adjuvans homogenisiert. Ein Volumenteil dieses Gemischs, der etwa 100 \xq Ll Proteine enthält, wird Kaninchen subkutan an verschiedenen Stellen einmal pro Woche während 6 Wochen injiziert« Die Kaninchen werden

-24-

durch Venenpunktur ausgeblutet. Man läßt das Blut bei Raumtemperatur über Nacht gerinnen. Das Serum wird gewonnen und auf die Ll-Antiserum-Aktivität getestet.

Normalerweise kann ein solches Antiserum in einer Verdünnung von 1:32 für eine einzelne radiale Immunpräzipitation und in einer Verdünnung von 1:2000 für den Radioimmunassay verwendet werden.

Beispiel 4: Testkit für den Radioimmunassay

Der Testkit enthält (für 100 Tests):

1 Ampulle

2 ml lyophilisiertes anti-Ll Serum, erhalten gemäß Beispiel 3

1 Flasche

100 ml RIA-Puffer: 50 mM Natriumchlorid, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Natriumazid, eingestellt auf den pH-Wert 7,4

1 mit Kautschuk überzogene Ampulle

5 ml wässrige Lösung von mit radioaktivem Jod markierten Ll Proteinen, eingestellt unter Bildung von 500 cpm/ml (markiert nach der Bolton-Hunter-Methode)

1 Flasche

100 ml einer wässrigen Suspension von mit Formalin behandeltem Staphylococcus aureus (PASA = Protein A enthaltender Staph aureus des Cowan I-Stammes) in mit Phosphat gepufferter Salzlösung.

1 Flasche 2 ml einer RIA-Pufferlösung,

enthaltend 50 ng Ll Protein (Bezugslösung)

Verfahrensweise zur quantitativen Bestimmung von Ll Proteinen durch RIA

Eine Reihe von Standards wird durch Zweifachverdünnung der gelieferten Ll Bezugslösung auf 7,8ng/ml mit RIA-Puffer bereitet. In eine Reihe von Testrohren werden 25 μΐ Patientenplasma, verdünnt auf 1:30 in RIA-Puffer oder Standardbezugslösung, pipettiert. Hierzu werden 20 Ul anti-Ll Serum gefügt, und die Gemische werden 30 min bei 37 ⁰C inkubiert. Anschließen werden 50 Ul der Lösung mit dem radioaktiv markierten Ll Protein zugesetzt, worauf 1 h bei 37 ⁰C inkubiert wird. In jedes Röhrchen wird dann 1 ml suspendierte Staph. aureus Suspension gefügt, und es wird 10 min bei 2000 χ g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment gemessen. Der Prozentsatz der Radioaktivität, bezogen auf die ursprünglich zugesetzte Radioaktivität, für die Ll Bezugsstandardverdünnungen so aufgetragen, daß eine Bezugskurve gezeichnet werden kann. Die Werte der Patientenproben können von dieser Kurve abgelesen werden.

Beispiel 5: Testkit für die nephelometrische Bestimmung von Ll Proteinen in Lösung

Der Testkit enthält:

1 Ampulle 1,5 ml anti-Ll Antikörperlösung

in pH 7,5 Puffer (Natriumacetatpuffer, enthaltend '> mM Calciumchlorid) mit einem Titer

von etwa 1:32 beim Test durch

Doppelimmundiffusion in Agarosegel.

1 Flasche 20 ml verdünnter Puffer wie

vorstehend

1 Ampulle 0,5 ml einer Lösung von Ll

Protein in einer Konzentration von 400 pg/ml

Anti-Ll Serum wird mit Verdünnungspuffer auf 1:15 verdünnt. 6 Standards Ll Protein (1:1 bis 1:64) werden durch Zweifachverdünnung der Standard Ll Lösung bereitet. Anschließend werden 250 μΐ Antikörperverdünnung und 10 ul der Probe oder verdünnter Ll Standard in Nephelometer-Cuvetten gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte wird von dem Nephelometer abgelesen.

Beispiel 6: Testkit für einzelne Radialimmundiffusionsanalysen für Ll Protein in Lösung

Der Testkit enthält:

1 oder mehr vorbereitete Agarosegels mit

einem Gehalt von 2 % gleichmäßig verteilter anti-Ll Antikörperlösung mit einem Titer von etwa

1:32 beim Test durch Doppeldiffusion in Gel, und 0,1 M Natriumacetat, 5 inM Calciumchlorid, 0,25 mM Thimerosal, pH 8,5.

1 Ampulle

0,1 ml Ll Proteinlösung mit einer Konzentration von 300 ug/ml

Das Agarosegel wird in einer geschlossenen Kammer zur 5 Verhinderung der Austrocknung des Gels bereitgestellt. Das Gel hat 18 vorbereitete Vertiefungen zum Auftrag von 10 μΐ der Standardlösungen und der zu untersuchenden Proben.

10 Beispiel 7: Testkits für den Latex-Agglutinationsassay für eine halbquantitative Bestimmung von Ll Protein

Der Testkit enthält:

a) 1 2 ml-Flasche

einer Suspension von Latexteilchen von 50 pm Durchmesser, an die gereinigtes Ll Protein fixiert wurden.

b) 1 2 ml-Flasche

c) 1 0,5 ml-Flasche

einer Pufferlösung von anti-Ll Antikörper, die mit den vorstehend erwähnten Latexteilchen agglutinieren, mit einem Titer von 1:3 bis 1:4.

einer Pufferlösung des Ll Proteins in einer Konzentration von 50 ug/ml

30 1 Tropfen von a), b) und der zu untersuchenden Patientenprobe werden auf einem schwarzen Objektträger vermischt und 5 min auf die Agglutination beobachtet. Ein Nichtauftreten der Agglutination bedeutet eine Ll Konzentration von über 1000 ng/ml. In den positiven Kontroll-

35 lösungen werden a), b) und c) vermischt, und es sollte keine Agglutination auftreten.

-28-Beispiel 8: Testkits für den Spot-Test

Der Testkit enthält:

10 Stück Celluloseacetat, 5 χ 50mm , mit zwei Flecken mit einem Durchmesser von 4 mm von getrocknetem spezifischem anti-Ll Antikörper, im Abstand von 10 und 30 ml von einem Ende,

a) I Flasche 2 ml einer Pufferlösung, ent

haltend spezifische anti-Ll Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase,

b) 1 Flasche 10 ml einer wässrigen

Trispuffer/isotonische Salzlösung-pH 7,4-Lösung, enthaltend 1 mg/ml Diaminobenzidin (DAB)

c) 1 Flasche 1 ml einer wässrigen Puffer-

lösung von Ll Protein in einer

Konzentration von 50 ug/ml.

Zum Test wird 1 Tropfen der Probelösung auf den ersten Fleck aufgetragen und 1 Tropfen der Lösung c) auf den zweiten Fleck. Nach 10 min wird der Teststreifen mit Trispuffer-Salzlösung während 5 min gewaschen. Anschließend wird 1 Tropfen der Lösung a) auf jeden Fleck aufgetragen, 10 min bei Raumtemperatur belassen, und der Streifen wird erneut 5 min in Trispuffer-Salzlösung gewaschen. Zu 1 ml Lösung b) werden 5 μΐ 30 % Wasserstoffperoxid gefügt. Ein Tropfen dieses Gemischs wird auf jeden Fleck aufgetragen. Eine nach 3 min auftretende ausgeprägte Braunfärbung zeigt die Anwesenheit von Ll Proteinen in der Probe an.

Durch Serienverdünnung der Probe kann der Test halbquantitativ gestaltet werden.

Beispiel 9: Testkits für Ll Proteine durch Enzymimmunassay

Die Testkits enthalten:
5

1 Mikroliter-Falle mit 5 χ 10 Vertiefungen aus Kunststoffmaterial, wobei die Innenoberfläche des Bodens und des unteren Teils der Vertiefungen mit spezifischen anti-Ll Antikörpern überzogen sind. 10

a) 1 Flasche 2 ml einer Pufferlösung, die

spezifische anti-Ll Antikörper, konjugiert mit Meerrettich.-Peroxidase enthalten. 15

b) 1 Flasche 10 ml einer wässrigen Tris-

puffer/isotonische SalzlösungpH 7,4-Lösung, enthaltend 1 mg/ml Diaminobenzidin (DAB) 20

c) 1 Flasche 1 ml einer wässrigen Puffer

lösung von Ll Protein in einer Konzentration von 50 ug/ml

Testverfahren: 50 μΐ der Testprobenlösung oder der Lösung c) werden in die Vertiefungen gefügt und bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Anschließend werden die Vertiefungen mit Trispuffer/Salzlösung mit einem Gehalt von 0,5 % Rinderserumalbumin gewaschen. In jede Vertiefung werden 50 μΐ Lösung a) gefügt, und es wird 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden wie vorstehend gewaschen. Zu 1 ml der Lösung b) werden 5 ul 30 % Wasserstoffperoxid gefügt und 50 μΐ dieses Gemischs werden in jede Vertiefung gefügt,-Die Schale wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, und die Farbintensität in jeder Vertiefung wird photometrisch bestimmt.

-30-Legenden zu den Figuren

Fig. 1: Chromatographisches Profil von 9 ml rohem

TO

Leukozytenextrakt an einer DEAE-Sephacel Säule, 1,5 χ 5 cm. Der Gesamtproteingehalt

wurde durch UV-Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt, und die Ll Konzentration durch Einzel - Radialimmundiffusion.

Fig. 2: Die Proteinbandenmuster des rohen Granulo-

zytenextrakts A, der 5 m-molaren CaCl₂-Fraktion B und der 125 m-molaren NaCl-Fraktion C bei der Agarosegel-Elektrophorese in Barbitalpuffer, 75 m-molar, mit 2,5 niM EDTA-K₂, pH 8,5.

Die Fraktion B enthält die beiden reinen Ll Proteine pi 6,3 und pi 6,5

Literaturangaben

(1) Magne K. Fagerhol, Inge Dale und Terje Andersson,Scand.J. Haematol. (1980) 24, 393-398

(2) M. K. Fagerhol, I. Dale, T. Andersson, Bull, europ. Physiopath. resp. 1980, 16 (suppl) 273 281.

(3) Karen E. Willard, Anne Karine Thorsrud, Eimar Munthe und Egil Jellum, Clin. Chem., Vol. 28, Nr. 4,1067-1073 (1982)

(4) French, P. C. und Holm, R. Α., (1947) Thromb. Diath. Haemorrh. 32, 432-440

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Claims

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmarih ^ / ο r λ ο C. Dipl.-lng. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTA NWALTE ZUGELASSENE VERTRETEF? BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PAIENI OfFICf; 4-14499/FAG/+ CIBA-GEIGY AG, CH-4002 Basel Humanproteine, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Testkits 15 Patentansprüche

1. Reine pi 6,3 und pi 6,5 Ll-Proteine, Gemische davon und Salze davon.

2. Reines pi 6,3 Ll-Protein und Salze davon gemäß Anspruch 1.

3. Reines pi 6,5 Ll-Protein und Salze davon gemäß

Anspruch 1.

4. Verwendung der Ll-Proteine gemäß Anspruch 1,2 oder 3 als gQ Marker-Proteine oder als Immunogene in Tieren.

5. Verfahren zur Herstellung der reinen pi 6,3 und

pi 6,5 Ll-Proteine, Gemische davon und Salze davon, dadurch gekennzeichnet, daß man Humangranulozyten gg in einem geeigneten Puffersystem aufbricht, nichtlösliches Zellmaterial entfernt und die überstehende Flüssigkeit

a) einem isoelektrischen Fokussieren und Eluieren der das pi 6,3 und/oder das pi 6,5 Ll-Protein enthaltenden Banden mit einem Puffer, oder

b) einer Anionenaustauschchromatographie mit einem EDTA-enthaltenden Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und Eluieren der gewünschten Ll-Proteine mit einem Calciumionen enthaltenden Puffer, oder

c) einer Affinitätschromatographie, oder

d) einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese, oder

e) einer Kationenaustauschchromatographie, oder

f) einer Gelfiltration oder

g) einer reversiblen Ausfällung mit Zn , oder 20

jeglicher Kombination der Stufen a) bis g) unterwirft, die Eluate von jeglichen Ampholyten und/oder Salzen befreit, die erhaltene Lösung der reinen Ll-Proteine konzentriert, falls gewünscht, die erhaltene konzentrierte Lösung lyophilisiert und, falls gewünscht, die erhaltenen Ll-Proteine in ein Salz umwandelt oder das erhaltene Salze in die freien Proteine umwandelt.

6. Monospezifische anti-Ll Antisera und monospezifische anti-Ll Antikörper, erzeugt durch die reinen Ll-Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Monospezifische anti-Ll Antisera und Antikörper gemäß Anspruch 6, erhalten aus Kaninchen.

8. Verfahren zur Herstellung von anti-Ll Antisera und anti-Ll Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß

Tiere mit reinen Ll-Proteinen des Anspruchs 1 behandelt werden und die Antisera oder Antikörper durch übliche Methoden erhalten werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die monospezifischen Antisera erzeugt werden durch wöchentliche Injektion der reinen Ll-Proteine mit vollständigem Freund's Adjuvans, z. B. subkutan oder intramuskulär, in Dosierungen von etwa 100 ug pro Kaninchen pro Woche während etwa 8 bis 16 Wochen, und Gewinnen des Serums aus den Tieren durch Venensektion und Gerinnung.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß warmblütige Tiere, jedoch keine Menschen verwendet werden.

11. Verfahren nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß Schafe, Ziegen, Ratten, Mäuse, Pferde und dgl. verwendet werden.

12. Verfahren nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß Kaninchen als Tiere verwendet werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die monospezifische Antikörper enthaltenden Globulinfraktionen von den Ll Antisera isoliert und als ein Ausgangsmaterial zum Isolieren der anti-Ll Antikörper verwendet werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13,

dadurch gekennzeichnet, daß das monospezifischen Antikörper enthaltende Antiserum oder die Globulinfraktion davon durch eine Säule geführt wird, in gg der die gereinigten Ll Proteine an ein geeignetes Material konjugiert wurden und die anti-Ll Antikörper, nach dem Wegwaschen der nicht adsorbierten Proteine durch einen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 3,5,

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der Natriumchlorid oder Natriumjodid enthält, eluiert werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-Ll Antisera- oder anti-Ll Antikörperlösungen dialysiert und konzentriert werden.

16. Verwendung der anti-Ll Antisera und anti-Ll Anti-

körper zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Ll Proteinen in Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten.

17. Testkit, enthaltend die monospezifischen anti-Ll Antikörper, anti-Ll Antikörper-Globulinfraktionen oder anti-Ll Antisera gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 , 6 und 7.

18. Reines pi 6,3 und pi 6,5 Ll Protein, Gemische davon und Salze davon, erhältlich nach dem Verfahren von Anspruch 5.

19. Monospezifisches anti-Ll Antiserum oder monospezifischer anti-Ll Antikörper, erhältlich nach dem Verfahren von Anspruch 8.