SE500219C2 - Humana granulocytproteiner - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 40 500 2190 (enligt SDS-polyakrylamidgel-elektrofores och gelfiltrering), som var mycket instabil men som kan användas för immunisering av kaniner (1). Isolerings- och reningsmetoderna som tillämpa- des i referens (1) gav endast mycket låga utbyten av proteinet av 51 000 Dalton och ofta gick proteinet förlorat under förfa- randena. Immunisering av kaniner genom injektion av proteinet 51 000 Dalton gav ett antiserum mot L1-proteinerna men ofta också antikroppar även mot andra proteiner. Dessa antisera måste befrias från icke önskvärda antikroppar genom adsorption med normalt humant serum eller normala humana vävnadsextrakt. I publikation (1) extraherades icke fraktionerade leukocyter ge- nom frysning/tining och mekanisk homogenisering av leukocyterna utan tillsats av några enzym-inhibitorer.

I publikation (3) beskrives endast analytiska metoder för bestämning av R:7- och R:7-proteiner; emellertid beskrives inga isolerings- eller reningsförfaranden.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla skonsamma och effektiva förfaranden för extraktion och rening av L1-proteinerna från leukocyter som möjliggör karakterisering därav och framställning av monospecifika antisera eller anti- kroppar mot dessa proteiner. Ytterligare ett syfte enligt före- liggande uppfinning är att tillhandahålla testsystem innefat- tande sådana antisera och/eller sådana renade L1-proteiner, even- tuellt märkta med en radioaktiv isotop eller med ett enzym som lämpar sig för kvantitativa tester av L1-proteiner i kroppsväts- kor eller cell- eller vävnadsextrakt.

Det har överraskande visat sig att L1-proteinerna kan er- hållas i ett rent och stabilt tillstånd om endast granulocyter användes såsom källa och om granulocyterna förstörs under sådana betingelser att lysosomerna inuti granulocyterna ej förstörs samtidigt.Detta kan uppnås genom tryck-homogenisering av granulo- cyterna i närvaro av en enzyminhibitor och ett medel som stabili- serar de lysosomala membranen.

Föreliggande uppfinning hänför sig följaktligen till rena pl 6,3- och pl 6,5-L1-proteiner och blandningar därav, förfaran- den för extraktion därav från granulocyter genom tryckhomogeni- sering av granulocyterna i närvaro av en enzym-inhibitor och ett medel som stabilíserar de lysosomala membranen och rening därav genom olika metoder, användningen av dessa proteiner för fram- ställningen av monospecifika antisera eller antikroppar, förfaran- 10 15 20 25 30 35 40 i sun 219 den för framställning av sådana monospecifika antísera eller antikroppar genom immunisering av försöksdjur med L1-proteinerna, monospecífika antísera och antikroppar i sig, användningen av sådana antísera eller antikroppar och/eller de renade L1-protei- nerna för kvalitativ och/eller kvantitativ bestämning av L1-pro- teinerna i celler, vävnader och kroppsvätskor och testsystem in- nefattande dessa rena L1-proteiner, antísera och/eller antikrop- par, eventuellt märkta med radioaktiva isotoper eller med enzymer.

Uppfinningen hänför sig speciellt till rena pl 6,3- och pl 6,5-L1-proteiner, blandningar därav och salter därav. Salter av L1-proteinerna är speciellt icke-toxiska farmaceutiskt god- tagbara salter eller för övrigt sådana som kan användas för fäll- nings- eller reningsförloppet för L1-proteinerna. _ Sådana salter är exempelvis metallsalter, såsom alkali- metall- eller jordalkalimetallsalter, exempelvis natrium-, kalium-, magnesium- eller kalciumsalter, eller zinksalter och liknande, eller ammoniumsalter med ammoniak eller med primära, sekundära eller tertiära aminer, exempelvis salter med alifatiska, cyklo- alifatiska, cykloalifatisk-alifatiska eller aralifatiska primära, sekundära eller tertiära aminer, såsom med lägre mono-, di- eller tri-lågalkylaminer, t.ex. trietylamin, hydroxi-lågalkylaminer, exempelvis 2-hydroxietylamin, bis-(2-hydroxietyl)amin eller trís-(2-hydroxietyl)amín eller med basiska alifatiska estrar av karboxisyror, exempelvis etylendiamintetraättiksyra-1àgalkyl- estrar, exempelvis tetraetylestern och liknande.

Ytterligare salter är syraadditionssalter med oorganiska syror, speciellt mineralsyror, såsom vätekloríd, svavelsyra, fosforsyra eller med organiska syror, såsom karboxi-, sulfon- eller sulfosyror, eventuellt substituerade lågalkankarboxisyror, exempelvis ättíksyra, propionsyra, glykolsyra, maleinsyra, hydr- oximaleinsyra, metylmaleinsyra, malonsyra, fumarsyra, vinsyra, citronsyra eller eventuellt substituerade aromatiska syror, I exempelvis bensoesyra, kanelsyra, mandelsyra, salicylsyra, 4-amino-salicylsyra, 2-fenoxibensoesyra, 2-acetoxibensoesyra, embonsyra, nikotinsyra, isonikotinsyra eller aminosyror, låg- alkansulfonsyror, exempelvis metansulfonsyra, etansulfonsyra, 2-hydroxietansulfonsyra, bensensulfonsyra, 4-metylbensensulfon- syra, naftalensulfonsyra eller askorbinsyra och liknande.

Bägge proteinerna kännetecknas genom sina isoelektriska punkter vid pH 6,3 respektive pH 6,5. Molekylvíkten för bägge 10 15 20 25 30 35 500 219 proteinerna bestämd genom gelfiltrering och densítetsgradient- ultracentrifugering är densamma och är cirka 36 500 Dalton. Ge- nom SDS-elektrofores på polyakrylamidgel visas proteinerna bestå av tre polypeptíder med ungefär identisk molekylvikt av 12 500 Dalton. Var och en av dessa polypeptidkedjor uppvisar föl- jande aminosyrasekvens med början från den N-terminala änden: Meth-Leu-Thre-Glu vilka påvisas genom Edman-standardmetoden.

Den elektriskanetüfladdningen och tillgängligheten av antigena platser på L1-proteínerna påverkas i hög gradav frånvaron eller närvaron av kalciumjoner. Proteinerna reagerar mycket starkare såsom antigener in vítro i närvaro av kalciumjoner.

Värmestabiliteten av L1-proteínerna är hög vid neutralt och alkaliskt pH. Kokning under 15 minuter i vattenhaltig 5 mM EDTA, pH 8,5, bevarar 90 % av proteinet. L1-proteinet ut- fälls delvis med etanol vid surt pH, exempelvis mellan cirka 4 och 5.

L1-proteínerna uppvisar en karakteristisk fördelning i människokroppen, varvid de påträffas i stora mängder i neutro- fila granulocyter, monocyter och skvamösa epitel-celler förutom normal hud. De påträffas också i många cancer-celler av den skvamösa epitel-typen och i vissa leukemi- och lymfom-celler, speciellt'sådana av typen myelogen leukemi och monocytisk lymfom.

L1-proteínerna påträffas i ett övervägande antal vid skvamös cancer i urintrakten och lungorna. L1-proteínerna finns också i normala kroppsvätskor i relativt låga koncentrationer i friska individer nen iökande koncentrationer vid tillstånd med ökande grad av inflammation. I vita blodceller finns L1-proteínerna till 90 % L1-proteínerna kan användas såsom markörproteiner, speci- ellt i radioaktivt märkt form, exempelvis med 1125 eller P32, för kvalitativ och/eller kvantitativ bestämning av L1-proteín- halten i kroppsvätskor, -celler och -vävnader. .

L1-proteínerna är goda immunogener i djur, exempelvis i i cytosol-fraktionen. kaniner.

Uppfinningen avser vidare ett förfarande för framställning av de rena pl 6,3- och pI 6,5 L1-proteínerna, blandningar därav och salter därav, kännetecknad därav, att humana granulocyter sönderdelas i ett lämpligt buffertsystem, icke lösligt cellma- terial avlägsnas och ovanvätskan utsättes för 10 15 20 25 30 35 40 5 son 219 a) isoelektrisk fokusering och eluering av banden innehållande pI 6 ,3- och/eller pl 6,5-L1-proteiner med en buffert, eller b) anjonbytarkromatografi med en EDTA-innehållande buffert vid ett pH av cirka 8,5 och eluering av de önskvärda LI-proteinerna med en buffert innehållande kalciumjoner, eller c) affinitetskromatografi, eller d) preparativ agarosgel-elektrofores, eller e) katjonbytar-kromatografi, eller f) gelfiltrering, eller g) reversibel fällning med Zn++ vilken som helst kombination av stegen a) till g), befriande av eluaten från eventuella amfolyter och/eller salter, koncentre- ring av den erhållna lösningen av rena L1-proteiner om så är önskvärt, lyofilisering av den erhållna koncentrerade lösningen och om önskvärt transformation av erhållna L1-proteiner till ett salt eller transformation av erhållet salt till de fria eller proteinerna.

Granulocyterna som användes såsom en källa för extraktíonen av L1-proteiner erhålles från färskt humant blod med vilken som helst konventionell metod, exempelvis med dextran-sedimentering och densitetsgradientcentrifugering.

.Buffertsystemet vari granulocyterna sprängs innehåller ett medel som förhindrar simultan sprängning av lysosomerna, såsom glycerol, dextraner och företrädesvis sackaros, i en koncentra- tion som är tillräcklig för stabilisering av det osmotíska tryc- ket före och efter sprängning av cellväggarna. Exempelvis använ- des sackaros i en koncentration av mellan 0,27 och 0,34 M.

Buffertsystemet innehåller vidare enzym-inhibitorer som förhind- rar uppslutning av L1-proteinerna, såsom diisopropylfluorofosfat (DFP), sojaböntrypsin-inhibitor, Trasilol , kvicksilverbensoat, pepstatin A och företrädesvis fenylmetylsulfonyfluorid (PMFS) och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller blandningar därav.

Sprängningen av cellväggen kan genomföras på konventionellt sätt, exempelvis mekaniskt, t.ex. med en roterande blandare, en mortelstöt (Potter-Elvelyem Method), medelst ultraljud, frysning och tining eller kombinationer av dessa metoder. Enligt en före- dragen metod sprängs granulocyterna genom tryckhomogenisering.

Efter sprängning av granulocyterna avlägsnas olösliga ma- terial, såsom icke sprängda celler, cellavfall och lysosomer, 10 15 20 25 30 35 40 1500 219 exempelvis genom ultracentrifugering. g L1-proteinerna erhålles i ren form från det råa granulo- cytextraktet medelst något av följande reningsförlopp. a) Isoelektrisk fokusering: Den isoelektriska fokuse- ringen genomföres företrädesvis i en granulerad gel, såsom pärlor av agaros eller polymeriserad dextran innehållande en lämplig blandning av kommersiellt tillgängliga amfolyter för tillhandahållande av en stabil pH-gradient av från cirka pH 5 till 8 under förloppet. Den isoelektriska fokuseringen genom- föres med en maximal spänning av cirka 25 V/cm under cirka 10-20 timmar vid en temperatur av cirka S till 150. En föredra- gen gel är Ultrodex® och den föredragna amfolyten är Ampholine®.

Provet anbringas företrädesvis på katodsidan av gelen.

Lokaliseringen av L1-proteinbanden kan genomföras genom pH-mät- ningar längs gelytan eller genom färgning av filtrerpapperavtryck, av ovanytan, exempelvis med "coomassie"-blått.

Banden innehållande L1-proteinerna skrapas av och elueras medelst en lämplig buffert, innehållande EDTA vid ett pH av mel- lan cirka 7,5 och cirka 9, företrädesvis vid ett pH av cirka 8,5.

Eluatet befrias från amfolyterna och salterna genom dialys och/eller gelfiltrering och koncentreras gaum1ultrafiltrering och/eller lyofilisering. b) Anjonbytarkromatografi: vändes enligt detta förfarande innehåller exempelvis tertüha el- ler kvaternära aminogrupper och utgöres exempelvis av dietyl- aminoetylcellulosa, t.ex. dietylaminoetyl-Sepharose eller QAE-cellulosa (kvaternär aminoetylcellulosa). Granulocytextraktet innehållande L1-proteinerna anbringas på kolonnen i en buffert av låg jonstyrka innehållande EDTA och med ett pH av cirka 8,5.

L1-proteinerna elueras specifikt medelst en kalciumjon-innehål- lande buffert, exempelvis en buffert innehållande 30 mM barbital Anjonbytarmaterialen som an- och 5 mM kalciumklorid. c) Affinitetskromatografi: En tredje metod för rening av L1-proteinet är baserat på affinitetskromatografi. Denna kan genomföras på reglerade porösa glaspärlor uppvisande stor yta, exempelvis cirka 50 m2/g. Glaspärlorna placeras i en kolonn och det råa granulocytextraktet anbringas i en lämplig buffert av låg molaritet innehållande kalciumjoner vid neutralt eller svagt surt pH, exempelvis cirka pH 6-7. L1-proteinerna elueras med en alkalisk buffert av cirka pH 7,5-8,5 innehållande cirka 50 mM 10 15 20 ZS 30 35 40 EDTA och polyetylenglykol eller litiumbromid.

Enligt en annan affinitetskromatografi-metod användes en anti-L]-antikropp-kolonn. L1-proteinerna adsorberas till anti- kropparna under det att övriga proteiner tvättas ut med en buf- fert. Därefter elueras L1-proteinerna med en saltlösning, såsom en vattenhaltig buffert av cirka pH 3,5, innehållande ett salt, såsom natriumklorid eller natriumjodid. d) Preparativ agarosgel-elektrofores: Planbädd-agaros- geler av lämpliga dimensioner användes innehållande 75 mM barbital/2,5 mM EDTA;buffert, pH 8,5. Elektrofores genomföres vid 4 V/cm under 10-18 timmar. L1-proteinbanden lokaliseras ge- nom färgning av filterpapperavtryck av gelovanytan. L1-protein- banden påträffas i xz-globulin-området och elueras genom frys- ning/tiníng och centrifugering av de relevanta remsorna av agarosgelen. e) Katjonbytarkromatografi: genomföres på katjonbytarhartser, såsom sulfoprmpyl-substituerad cellulosa eller polymeriserad dextran. Det råa granulocytextrak- tet anbringas på kolonnen efter blandning med en buffert av låg jonstyrka innehållande kalciumjoner och med ett pH av cirka 6.

Icke-adsorberade proteiner tvättas bort med utgångsbufferten och L1-proteinerna elueras med en buffert innehållande EDTA och Katjonbytarkromatografi ökande koncentrationer av natriumjoner. f) Gelfiltrering: För gelfiltreringen användes Sephadefß G75 till G200 agarosgeler (Sepharose-geler), såsom Ultra gel eller polyakrylamidgelpärlor, såsom Bio-Gel P-60.

Kolonnen utgöres företrädesvis av en lång sådan. Kolonnlängden bör vara cirka 50 gånger diametern. Det råa granulocytextraktet anbringas som sådant och L1-proteinerna kromatograferas. För packning av kolonnen och bearbetning användes en buffert som företrädesvis innehåller 0,1 M natriumcitrat, 2,5 mM EDTA-K2 och 0,25 mM timerosal, pH 8,5. L1-proteinerna påträffas i en fraktion motsvarande en molekylvikt av 35 000 till 40 000 Dalton. g) Reversibel utfällníng med Zn++ Li-proteinerna utfälles kvantitativt ur vattenhaltiga lösningar med neutralt eller alka- liskt pH genom behandling med Zn++-joner, speciellt i form av vattenlösliga zinksalter, såsom zinkacetat eller zinkklorid.

Exempelvis kan en vattenhaltig lösning innehållande L1-protei- nerna behandlas vid pH cirka 8,5 med en vattenhaltig lösning av cirka 10 mM till 100 mM zinkacetat. Det utfällda L1-zinksaltet 10 15 20 25 30 35 40 500 219 tillvaratages, tvättas om nödvändigt med den vattenhaltiga buf- fertlösningen, behandlas med en komplexbíldníngssyra, exempelvis en cirka 100 mM vattenhaltig dikaliumetylendiamintetraättiksyra- lösning av pH 8,5 och för utvinnande av de fria L1-proteinerna filtreras lösningen genom en jonbytarkolonn, exempelvis Pharmacia PD-10, och lyofiliseras.

Salterna av L1-proteinet bildas genom konventionella meto- der, exempelvis genom behandling med de relevanta jonerna, exempelvis en bas, en syra eller ett salt innehållande de önsk- värda jonerna eller genom jonbytarbehandling. Ett mycket olösligt mangansalt kan exempelvis beredas genom tillsats av Mn++-joner, exempelvis i form av en cirka 10-mM till 100-mM vattenhaltig lös- ning av mangan-acetat eller något annat vattenlösligt mangan- salt, till en vattenhaltig lösning av L1-proteinerna.

Uppfinníngen hänför sig också till monospecifika antisera mot L1-proteinet och antikroppen innehållande immunoglobulinerna, speciellt sådana som bildats genom kaniner.

Monospecifika antisera framställes med konventionella meto- der, exempelvis genom veckovis injektion av de rena L1-proteiner- na med komplett Freund's adjuvans, exempelvis_subkutant eller intramuskulärt, i doser av cirka 100 pg per kanin per vecka under cirka 8-16 veckor. Därefter tillvaratages serum från djuren, exempelvis genom vensektion, och levras. I stället för kaniner kan också andra icke-humana varmblodiga djur, speciellt dägg- djur användas, t.ex. får, getter, råttor, möss, hästar och lik- nande.

Den monospecifika antikropp-innehållande globulinfraktíonen kan isoleras från serum med konventionella metoder, exempelvis genom jonbytarkromatografi.

För framställningen av dessa monospecifika anti-L1-anti- kroppar drives antiserum innehållande den monospecifika anti- kroppen eller globulin-fraktionen därav genom en kolonn där de renade L1-proteinerna har konjugerats till ett lämpligt material, såsom agaros eller cellulosa-gel. Efter borttvättning av icke- adsorberade proteiner elueras anti-L1-antikropp-molekylerna med en buffert med ett pH av cirka 3,5 innehållande natriumklorid eller natriumjodid.

De relevanta fraktionerna justeras till ett pH av cirka 7, díalyseras och koncentreras.

Anti-L1-antikropparna, antingen renade eller i rå form, 10 15 20 25 30 35 40 9 500 219' såsom i form av antiserum eller globulinfraktioner därav, använ- des för de kvalitativa eller kvantitativa metoderna för detekte- ring av L1-proteiner i celler, vävnader eller kroppsvätskor.

Sådana metoder innefattar fällning i geler, nefelometri, radio- immuno-assay, enzym-immuno-assay, immunofluorescens och immuno- peroxidas-cytohistokemiska metoder på konventionellt sätt.

Uppfinningen avser vidare testsystem innefattande dairena monospecifika anti-L1-antikroppen eller anti-L1-antikropp-globu- lin-fraktionen eller anti-L1-antikropp-innehållande antiserum.

Sådana testsystem är av konventionell typ och är avsedda för enkel radio-immuno-diffusion, latex-agglutinatíon, f1äcktest_ radio-immuno-assay, enzym-immuno-assay, immuno-fluorescenstezt eller enzym-immuno-histokemiskt test.

Sådana system kan förutom anti-L1-antikroppar i ren eller rå form, torkade eller solubiliserade i en lämplig buffert, innehålla i förväg framställda geler, latex, polystyren, formalin- stabiliserade animala röda blodceller eller liknande partiklar, enzymer, såsom rädisperoxidas, alkalisk fosfatas, enzymsubstrat, fluorescens- .eller.enzymkonjugerade antikroppar och material som lämpar sig för separation av antikroppbundna L1-molekyler från fria fl-molekyler, såsom avdödade stammar av Staphylococcus aureus tillhörande stammarna som bildar Staphylococcus protein A, träkol (som adsorberar det fria L1-proteinet men ej antikropp- proteinkomplexet) eller en andra antikropp, såsom get- eller antikanin-immunoglobulin eller L1-proteiner märkta med radio- aktiva ísotoper, såsom 1125 eller med enzymer, såsom med rädis- peroxidas eller alkalisk fosfatas. Systemet kan också innehålla bärare, varpå monospecifika anti-L1-antikroppar är fixerade vid en yta, exempelvis den inre ytan av provrör, ytan av glas- eller plastpärlor, stycken av filtrerpapper, cellulosaacetatmembran eller liknande material, samt buffertar för sådana metoder.

I det ovanstående och i det följande användes följande för- kortningar: PMSF fenylmetylsulfonylfluorid PAGE : polyakrylamidge1-elektrofores SDS : natriumdodecylsulfat IEF isoelektrisk fokusering SRID enkelradioimmunodiffusion NHS normalt humant serum ACD syra-citrat-dextros 10 15 20 25 30 35 40 10 500 2191 DFP diisopropylfluorofosfat EDTA etylendiamintetraättiksyra EDTA-K2: dikaliumsalt av EDTA DEAE dietylaminoetyl RIA radio-immuno-assay PBS fosfatbuffrad saltlösning PASA protein A-innehållande Staph. aureus Exempel 1: Isolering av granulocyter a) En blandning bestående av 435 ml färskt humant blod, 65 ml av en vattenhaltig lösning innehållande 2,2 % trinatrium- citratdihydrat, 0,8 % vattenfri citronsyra och 2,45 % dextros, 250 ml högmolekylär dextran (Dextraven@l150) och 23 ml av en lösning innehållande 2,5 mM citronsyra, 45 mM trinatriumcitrat, 180 mM glUkos OCh 15 mM natriumklorid tillåtes avsätta sig under 1 timme vid 4°C. Ovanvätskeskiktet tillvaratages och centrifu- geras vid 200 x g under 20 minuter vid 4°C. Sedimentet behand- las med 50 ml av iskallt destillerat vatten, varigenom de röda blodcellerna lyseras. Efter 30 sekunder återställes isotonicitet genom tillsats av 16,5 ml iskyld 0,6 M natriumklorid. Kvarvarande leukocyter tvättas två gånger med isotonisk saltlösning. Granulo- cyterna separeras från de mononukleära cellerna genom centrifu- gering på Lymphopreflg)[densitetsgradientcentrifugeringsmaterial bestående av 9,6 % (vikt/volym) natrium-metrizoatlösning innehål- lande 5,6 % (vikt/volym) av en erytrocytaggregerande polysackarid (Ficoll)] följt av centrifugering vid 800 x g under 20 minuter vid ZOOC. Detta förfarande ger ett utbyte av cirka 5 x 108 celler, varav cirka 95 % är granulocyter. b) Granulocytextraktion Cellerna som erhållits som beskrivits under a) åter- uppslammas i 0,27 M sackaros innehållande 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-K2 och 0,25 mM timerosal under tillsats av trisbuffert till pH 8,5. Därefter homogeniseras cellerna enligt French och Holm (4) genom exponering för 28 kp/cmz tryckluft under två perioder av 2 minuter under det att de tillåtes tränga ut ur tryckkamma- ren med en hastighet av en droppe per sekund. Under detta förfa- rande hålles cellbehållarna i våt is. Cirka 90 % sprängs och efter centrifugering vid 100 000 x g under 1 timme påträffades cirka 90 % av totalt L1-protein i det klara ovan- vätskefluidet. Sistnämnda betecknas det råa granulocytextraktet. av cellerna Den totala proteinhalten är cirka 3 mg/ml, varav 30 % är Lqnotenær. 10 15 20 25 30 35 40 “» 500 219 c) Preparativ isoelektrisk fokusering (IEF) För preparativ IEF användes en gelplatta med måtten 110 mm x 240 mm x 5 mm bestående av Ultrade (Dextran G75, raffinerad) innehållande 2 % (vikt/volym)Ampho1inÅÉ)pH 5-8 (en blandning av syntetiska amfolyter med buffringskapaciteter vid de isoelektriska punkterna därför). Proverna [B ml av ovan- vätskan enligt b)] blandades med en lika stor volym av Ultrade gel och anbringades 5 cm från katoden pâ gelplattorna. Separation genomföres under 18 timmar med maximalt 25 V cm' , 15 mA och 10 W.

Proteinbanden lokaliseradasbåde genom "coomassie"-blått-färgning av filtrerpapper8VIïyCk av gelplattan och gaum1pH-mätningar av gelovanytan. L1-proteinerna i området för pH 6,3 och 6,5 eluerades med en lika stor volym av en vattenhaltig lösning inne- hållande 0,1 M natriumacetat, 2,5 mM EDTA-K2 och 0,25 mM timero- sal, pH 8,5, genom centrifugering vid 2000 x g under 20 minuter genom 0,45 Pm Millipore -filter. Amfolyterna avlägsnades genom dialys mot elueringsbufferten över natten. De kvarvarande pr0teín- och buffertinnehållande lösningarna koncentrerades genom ultra- filtrering på Minocon -celler (semípermeabelt membran). Utbytet av dessa förlopp är cirka 20 % av L1-proteinet anbringat på gelen för preparativ IBF. 2,5 ml av denna lösning anbringades på en Pharmacia PD-10 kolonn (Sephade G25 M) ekvilibrerad med destil- lerat vatten och L1-proteinerna eluerades med 3,5 ml destillerat vatten och lyofiliserades vilket gav 1 mg rent L1-protein pl 6,3 och 6,5.

L1-proteinet med pl 6,3 och pl 6,5 kan också renas separat med detta förfarande vilket ger cirka 0,67 mg av L1-proteinet med pl 6,5 och cirka 0,33 mg av L1-proteinet pl 6,3.

Exempel 2: ~ a) Förfarandet utnyttjar den dramatiska ändringen i den isoelektriska punkten av L1-proteinet när detta tillåtes taga upp kalciumjoner (2). Proteinet i råa granulocytextrakt binds till en anjonbytare, exempelvis dietylamonioetyl-typen, vid alkaliskt pH och med en buffert innehållande etylendiamintetra- ättiksyra i tillräckliga mängder för bindning av kalciumjoner.

L1-proteinerna kan därefter elueras specifikt genom tillsats av kalciumklorid till bufferten för att en slutkoncentration av cirka 5-10 mM per liter skall garanteras.

Råa granulocytextrakt beredes såsom beskrivits i exempel 1. Deras totala proteinhalt är cirka 2-5 g per liter, 10 15 20 25 30 35 40 500 219 'Z varav cirka 60 procent är L1-protein.

DEAE-Sephacel (från Pharmacia, Sverige) ekvilibrerades med 60 mM barbitalfbuffert (7,7 g dietylbarbitursyra och 10,5 g av natriumsaltet därav i 1 liter vatten) innehållande 1 g/l EDTA-K2, pH 8,5 och förpackades på en kromatografikolonn med dimensionen 1,5 cm x 5 cm, dvs en volym av cirka 9 ml.

Provet, cirka 10 ml av rått granulocytextrakt spätt med 30 ml EDTA-K2-barbitalbuffert, pH 8,5, anbringades med en peri- staltisk pump, vilket gav en flödeshastighet av cirka 2 ml/min.

Icke-adsorberade proteiner tvättades ut medelst 100 ml barbital- buffert. Före eluering av L1-proteinerna tvättades kolonnen ock- så med 30 ml barbitalbuffert utan EDTA-K2. L1-proteinerna elue- rades därefter med 60 mM barbitalbuffert innehållande 5 mM CaCl2, pH 8,5.

Pig. 1 visar den totala protein- och L1-protein-eluerings- profilen för sådan jonbyteskromatografi och fig. 2 visar protein- bandmönstren när rått leukocytextrakt och renat L1-protein utsät- tes för analytisk agarosgel-elektrofores. Det framgår att det renade L1-proteinet ger två större band som beskrivits tidigare motsvarande pI 6,3 och pl 6,5. 1 Mängden L1-protein som eluerades med kalciuminnehållande buffert är nära 50 % av den som anbringades i provet och påträf- fades i en total volym av cirka 20 ml. Denna lösning kan bekvämt koncentreras genom ultrafiltrering med användningav Millipore CX-10-membran. Detta leder till en del proteínförlust beroende på om EDTA tillsättes eller ej för hindrande av att L1-protein binds till membranen. Till och med utan tillsats av EDTA kan ett totalt utbyte av cirka 35 % uppnås.

Såsom framgår-av fig. 1 elueras en del L1-protein med 60 mM barbitalbuffert innehållande 5 mM CaCl2 och 125 mM NaCl, pH 8,5, men detta protein ger band som huvudsakligen är anodiska och kato- diska av de övervägande L1-banden och kan representera delvis I denaturerat eller komplexbundet L1-protein förutom olika proteiner.

Metoder i stor skala Ovan beskrivna metod kan med framgång uppförstoras för hantering av 50 ml råa granulocytextrakt. Detta uppnås genom an- vändning av en kolonn innehållande cirka S0 ml DEAE-Sephace (cirka 2,5 cm x 10 cm) och proportionella ökningar av volymen av samma buffertsubstanser som angivits ovan. b) Det faktum att en reversibel utfällning av L1-proteinerna 10 15 20 ZS 30 35 f” san kan uppnås genom tillsats av 10 mM Zn++ kan utnyttjas. Till 10 ml rått leukocytextrakt sättes 90 ml barbitalbuffert, 75 mM, pH 8,5, och 10 ml av en 100 mM Zn-acetatlösning i vatten.fä1ÜÜflg'V en tvättas flera gånger, exempelvis fem gånger, med 75 mM barbi- talbuffert, pH 8,5, med 10 mM Zn-acetat. Slutligen tvättas fäll- ningen med 75 mM barbitalbuffert, pH 8,5, och löses genom dropp- vis tillsats av en lösning av 100 mM EDTA-K2 i vatten, pH juste- ras till 8,5 genom 5 M natriumhydroxid. Denna proteinlösning an- bringas på en Pharmacia PD-10-kolonn ekvilibrerad med destille- rat vatten och L1-proteinerna elueras med 3,5 ml destillerat vatten och lyofiliseras, vilket ger cirka 10-20 mg av rena 210 z L1-proteiner.

Exempel 3. Framställning av antiserum mot renat L1 __ En lösning innehållande cirka 1 mg/ml av L1-protein av pl 6,3 och pI 6,5 (erhållet enligt exempel 1 eller 2) i 0,1 M natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,25 mM timerosal, pH 8,5, homogeni- serades med Freund's komplett adjuvans. En volym av denna bland- ning innehållande cirka 100 pg L1-proteiner injicerades på flera subkutana ställen i kaniner en gång per vecka under 6 veckor.

Kaninerna tappades[fi.blod genom venpunktur. Blodet fick koagulera vid rumstemperatur över natten. Serum tillvaratogs och testades med avseende på L1-antiserum-aktivitet.

Normalt kan sådant antiserum användas i en spädning av 1:32 för en enda radio-immuno-fällning och en spädning av 1:2000 för radio-immuno-assay.

Exempel 4: Testsystem för radio-immuno-assay Testsystemet innehåller (för 100 tester): 1 ampull av 2 ml lyofiliserat anti-L1-serum erhållet enligt exempel 3 1 flaska av 100 ml RIA-buffert: 50 mM natriumklorid, 0,2 % bovinserumalbumin, 0,2 % natriumazíd, justerat till pH 7,4; 1 gummitäckt ampull av 5 ml vattenhaltig lösning av radioaktivt -jodïzs-märkta L1-proteiner justerade så att de ger S00 cpm/ml (enligt Bolton-Hunter-märkningsmetoden); 1 flaska av 100 ml av en vattenhaltig suspension av formalin-be- handlad Staphylococcus aureus (PASA = protein A-innehållande Staph. aureus av Cowan I-stam) i fosfatbuffertsaltlösning; 1 flaska av 2 ml av RIA-buffertlösning innehållande 500 ng L1-protein (referenslösning). 10 15 20 25 30 35 40 500 219 '4 Pörfarande för kvantisering av L1-proteiner enligt RIA En serie av standards framställdes genom tvåfaldig späd- ning av den tillhandahållna L1-referenslösningen ned till 7,8 ng/ml med RIA-buffert. I en serie av provrör pipetterades 25 pl av patientplasma spädd 1:30 i RIA-buffert eller standard- referenslösning. Därtill sattes 20 pl av anti-L1-serum och bland- ningarna inkuberades vid 37°C under 30 minuter. Därefter till- sattes 50 pl av lösningen med radioaktivt märkt L1-protein, vilket följdes av inkubering vid 37°C under 1 timme. Till varje rör sattes därefter 1 ml av uppslammad Staph. aureus-suspension och centrifugerades vid 2000 x g under 10 minuter. Ovanvätskan sögs av och radioaktiviteten i sedimentet uppmättes. Den pro- centuella mängden av radioaktiviteten i förhållande till initi- ellt tillsatt radioaktivitet avsattes för L1-referensstandard- spädningarna så att referenskurvan kunde ritas upp. Värdena från patienproven kan avläsas från denna kurva.

Exempel S: Testsystem för nefelometrisk bestämning av L1-proteiner i lösning Testsystemet innehåller: 1 ampull av 1,5 ml anti-L1-antikropplösning i buffert av pH 7,É (natriumacetatbuffert innehållande 5 mM kalcium- klorid) med en titer av cirka 1:32 testat medelst dubbel- immunodiffusion i agarosgel; 1 flaska av 20 ml spädningsbuffert enligt ovan; 1 ampull av 0,5 ml av en lösning av L1-protein i en koncentra- tion av 400 pg/ml Anti-L1-serum späddes 1:15 med spädningsbuffert. Sex stan- dard av L1-protein (1:1 till 1:64) framställdes genom tvåfaldig spädning av standard-L1-lösningen. Därefter blandades 250 pl av antikroppspädning och 10 pl prov eller spädd L1-standard i nefe- lometerkyvetter och inkuberades under 10 minuter vid rumstempera- tur. Den optiska densiteten avlästes på nefelometern.

Exempel 6: Testsystem för enkel radio-immuno-diffusions- analys av L1-proteiner i lösning Testsystemet innehåller: 1 eller flera i förväg framställda agarosgeler innehållande 2 % av homogent fördelad anti-L1-antikropplösning med en titer av cirka 1:32 vid testning medelst dubbeldiffusion i gel och 0,1 M natriumacetat, 5 mM kalciumklorid, 0,25 mM timerosal, pH 8,5; 10 15 20 25 30 35 40 15 500 219 1 ampull 0,1 ml L1-proteinlösning med en koncentration av 300 pg/ml. 'A __4 Agarosgelen tillhandahölls i en sluten kammare för för- hindrande av uttorkning av gelen. Gelen uppvisade 18 i förväg framställda brunnar för påförande av 10 Pl av standardlösningar och proverna som skulle testas.

Testsystem för latex-agglutination-assay för en semikvantitativ bestämning av L1-protein Exempel 7: Testsystemet innehåller: a) 1 flaska och 2 ml av en suspension av latexpartiklar av 50 Pm diameter vartill renat L1-protein har fixerats; b) 1 flaska och 2 ml av en buffertlösning av anti-L1-antikropp som agglutinerar med ovannämnda latexpartiklar, med en titer av 1:3 till 1:4; c) 1 flaska och 0,5 ml av en buffertlösning av L1-proteinet i en koncentration av 50 pg/ml.

En droppe av a), b) och patientprovet som skall testas blandas på en svart skiva och observerades med avseende på agglutination i 5 minuter. Avsaknad av agglutination betyder en L1-koncentration av över 1000 ng/ml. I de positiva kontrollös- ningarna blandas a), b) och c) och ingen agglutination bör ut- vecklas. 4 Exempel 8: Testsystem för fläck-testet Testsystemet innehåller: 10 bitar av cellulosaacetat med måtten 5 mm x 50 mm med 2 fläckar med en diameter av 4 mm av torkad specifik anti-L1-antikropp lokaliserade 10 mm och 30 mm från ena änden; 0 a) 1 flaska av 2 ml av en buffertlösning-innehållande specifik anti-L1-antikroppar konjugerade med rädisperoxidas; _ b) 1 flaska av 10 ml av en vattenhaltig lösning av trisbuffert/ isotonisk saltlösning, pH 7,4, innehållande 1 mg/ml diaminobensidin (DAB); c) 1 flaska av 1 ml av en vattenhaltig buffertlösning av L1-protein i en koncentration av S0 pg/ml För testning anbringas en droppe av provlösningen på den första fläcken och en droppe av lösning c) på den andra fläcken.

Efter 10 minuter tvättades testremsan i trisbuffert/saltlösning under 5 minuter. Därefter anbringas en droppe av lösning a) på varje fläck och lämnas under 10 minuter vid rumstemperatur och 10 15 20 25 30 35 40 500 219 *Ö remsan tvättas åter under 5 minuter i trisbuffert/ saltlösning.

Till 1 ml av lösning b) sättes 5 pl av 30-procentig väteperoxid.

En droppe av denna blandning anbrhups på\mrje fläck. En distinkt brun färgning uppträder efter 3 minuter vilket indikerar närva- ron av L1-proteiner i provet.

Genom seriespädning av provet kan testet göras semi- kvantitativt.

Exempel 9: Testsystem för L1-proteiner genom enzym-immuno-assay Testsystemen innehåller: 1 mikrotiter-bricka med 5 x 10 brunnar framställda av plast- material, varvid den inre ytan av botten och det lägre partiet av brunnarna är belagd med specifika anti-L1-anti- kroppar; a) 1 flaska med Z ml av en buffertlösning innehållande speci- fika anti-L1-antikroppar konjugerade med rädisperoxidas; b) 1 flaska med 10 ml av en vattenhaltig lösning av trisbuf- fert/isotonisk saltlösning, pH 7,4, innehållande 1 mg/ml av diaminobensidin (DAB); c) 1 flaskaflßd 1 ml av en vattenhaltig buffertlösning av L1-prptein i en koncentration av S0 pg/ml.

Testförfarande: S0 pl av denna provlösníng eller av lös- ning c) sättes till brunnarna och inkuberas vid rumstemperatur under 1 timme. Brunnarna tvättades därefter med trísbuffert/salt- lösning innehållande 0,5 % bovinserumalbumin. Till varje brunn sattes 50 pl av lösning a) och inkuberades.under 1 timme vid rumstemperatur. Brunnarna tvättades enligt ovan. Till 1 ml av lösning b) sattes 5 pl av 30-procentig väteperoxid och S0 pl av denna blandning sattes till varje brunn. Brickan inkuberades under 30 minuter vid rumstemperatur och färgintensiteten bestäm- des för varje brunn fotometriskt.

Förklaringar till figurerna Pig. 1: Kromatografisk profil av 9 ml rått leukocytextrakt på en DEAE-Sephacel -kolonn, 1,5 cm x S cm. Den totala protein- halten bestämdes genom UV-ljusabsorbans vid 280 nm och L1-kon- centrationen genom en enkel radio-immunodíffusion.

Fig. 2: Proteinband-mönster av rått granulocytextrakt (A), s mm caciz-frakz-.ionefi-(B) och 1zs mn Naci-fraktionen (c) vid agarosgel-elektrofores i barbitalbuffert, 75 mM, med 2,5 mM EDTA-K2, pH 8,5. Fraktion B innehåller de två rena L1-proteiner- na pl 6,3 och pI 6,5. 17 ' 500 219 Litteraturreferenser: (1) (2) (3) Magne K. Fagerhol, Inge.Dale och Terje Andersson, Scand. J. Haemancu. (1980) 24,' 393-398.

Dale, T. Andersson, Bull. 1980, 16 (suppl) 273 281.

M.K. Fagerhol, I.

Physiopath. resp. europ.

Karen E. Wíllard, Anne Karíne Thorsrud, Eimar Munthe och Egil Jellum, Clin. Chem., vol. 28, nr 4, 1067-1073 (1982).

French. P.C. (1947) Thromb. Díath. 32, och Holm, R.A., Haemorrh. 432-440.

Claims (9)

10 15 20 25 30 35 40 500 219 i' .ß Patentkrav

1. Rena pI 6,§- och pI 6,5-L1-proteiner, k ä n n e- t e c k n a d e därav, att de uppvisar en molekylvikt av 36500 Dalton och består av tre polypeptidunderenheter; samt bland- ningar och salter därav.

2. Protein enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det utgöres av pI 6,3-L1-proteinet eller salter därav.

3. Protein enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det utgöres av pI 6,5-L1-proteinet eller salter därav.

4. Förfarande för framställning av rena pI 6,3- och pI 6,5-L1-proteiner, blandningar eller salter därav enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att humana granulocyter sprängs i ett lämpligt buffertsystem, som innehåller ett medel, som förhindrar en samtidig sprängning av lysosomer, i en koncentra- tion, som är tillräcklig för stabilisering av osmotiskt tryck före och efter cellväggsprängningen, icke lösligt cellmaterial avlägsnas och ovanvätskan utsättes för a) isoelektrisk fokusering och eluering av banden in- nehållande pI 6,3- och/eller pI 6,5-L1-proteiner med en buf- fert, eller -- b) anjonbytarkromatografi med en EDTA-innehållande buffert vid ett pH av cirka 8,5 och eluering av de önskvärda Ll-proteinerna med en buffert innehållande kalciumjoner, eller c) affinitetskromatografi, eller d) preparativ agarosgel-elektrofores, eller e) katjonbytarkromatografi, eller f) gelfiltrering, eller g) reversibel utfällning med Zn**, eller vilken som helst kombination av stegen a) till g), eluaten befrias från eventuella amfolyter och/eller salter, erhållen lösning av rena L1-proteiner koncentreras, vilka L1-proteiner uppvisar en molekylvikt av 36500 Dalton, bestämd medelst gelfiltrering eller densitetsgradientultracentrifugering; om så är önskvärt lyofiliseras erhållen koncentrerad lösning, och om så är önskvärt transformeras erhållna L1-proteiner till ett salt, eller erhållet salt transformeras till de fria proteiner- Da. 15 W 500 219'

5. Användning av L1-proteinerna enligt krav 1 såsom markör-proteiner eller såsom_immunogen i djur. A

6. Monospeqifika anti-L1-antisera och monospecifika anti- L1-antikroppar k ä n n e t e c k n a d e därav, att de är framställda med rena Ll-proteiner enligt något av kraven 1-3.

7. Förfarande för framställning av anti-L1-antisera och anti-L1-antikroppar enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att djur behandlas med rena L1-proteiner enligt krav 1 och att antisera eller antikroppar erhålles med konventionellav metoder.

8. Användning av anti-Ll-antisera och anti-L1-antikroppar enligt krav 6 för kvalitativ eller kvantitativ bestämning av L1-proteiner i celler, vävnader eller kroppsvätskor.

9. Testsystem, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar monospecifika anti-L1-antikroppar, anti-L1-anti- kroppglobulinfraktioner eller anti-L1-antisera enligt krav 6{