SE500219C2 - Human granulocyte proteins - Google Patents
Human granulocyte proteinsInfo
- Publication number
- SE500219C2 SE500219C2 SE8403630A SE8403630A SE500219C2 SE 500219 C2 SE500219 C2 SE 500219C2 SE 8403630 A SE8403630 A SE 8403630A SE 8403630 A SE8403630 A SE 8403630A SE 500219 C2 SE500219 C2 SE 500219C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- proteins
- protein
- buffer
- antisera
- salts
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
15 20 25 30 35 40 500 2190 (enligt SDS-polyakrylamidgel-elektrofores och gelfiltrering), som var mycket instabil men som kan användas för immunisering av kaniner (1). Isolerings- och reningsmetoderna som tillämpa- des i referens (1) gav endast mycket låga utbyten av proteinet av 51 000 Dalton och ofta gick proteinet förlorat under förfa- randena. Immunisering av kaniner genom injektion av proteinet 51 000 Dalton gav ett antiserum mot L1-proteinerna men ofta också antikroppar även mot andra proteiner. Dessa antisera måste befrias från icke önskvärda antikroppar genom adsorption med normalt humant serum eller normala humana vävnadsextrakt. I publikation (1) extraherades icke fraktionerade leukocyter ge- nom frysning/tining och mekanisk homogenisering av leukocyterna utan tillsats av några enzym-inhibitorer. (20 according to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and gel filtration), which was very unstable but which can be used for immunization of rabbits (1). The isolation and purification methods used in reference (1) gave only very low yields of the 51,000 Dalton protein and often the protein was lost during the processes. Immunization of rabbits by injection of the 51,000 Dalton protein gave an antiserum to the L1 proteins but often also antibodies to other proteins. These antisera must be freed from undesirable antibodies by adsorption with normal human serum or normal human tissue extracts. In publication (1), unfractionated leukocytes were extracted by freezing / thawing and mechanical homogenization of the leukocytes without the addition of any enzyme inhibitors.
I publikation (3) beskrives endast analytiska metoder för bestämning av R:7- och R:7-proteiner; emellertid beskrives inga isolerings- eller reningsförfaranden.Publication (3) describes only analytical methods for the determination of R: 7 and R: 7 proteins; however, no insulation or purification procedures are described.
Ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla skonsamma och effektiva förfaranden för extraktion och rening av L1-proteinerna från leukocyter som möjliggör karakterisering därav och framställning av monospecifika antisera eller anti- kroppar mot dessa proteiner. Ytterligare ett syfte enligt före- liggande uppfinning är att tillhandahålla testsystem innefat- tande sådana antisera och/eller sådana renade L1-proteiner, even- tuellt märkta med en radioaktiv isotop eller med ett enzym som lämpar sig för kvantitativa tester av L1-proteiner i kroppsväts- kor eller cell- eller vävnadsextrakt.An object of the present invention is to provide gentle and efficient methods for extracting and purifying the L1 proteins from leukocytes which enable their characterization and production of monospecific antisera or antibodies to these proteins. A further object of the present invention is to provide test systems comprising such antisera and / or such purified L1 proteins, optionally labeled with a radioactive isotope or with an enzyme suitable for quantitative testing of L1 proteins in body fluid. cows or cell or tissue extracts.
Det har överraskande visat sig att L1-proteinerna kan er- hållas i ett rent och stabilt tillstånd om endast granulocyter användes såsom källa och om granulocyterna förstörs under sådana betingelser att lysosomerna inuti granulocyterna ej förstörs samtidigt.Detta kan uppnås genom tryck-homogenisering av granulo- cyterna i närvaro av en enzyminhibitor och ett medel som stabili- serar de lysosomala membranen.It has surprisingly been found that the L1 proteins can be obtained in a pure and stable state if only granulocytes are used as the source and if the granulocytes are destroyed under such conditions that the lysosomes inside the granulocytes are not destroyed simultaneously. This can be achieved by pressure homogenization of granulocytes. the cells in the presence of an enzyme inhibitor and an agent that stabilizes the lysosomal membranes.
Föreliggande uppfinning hänför sig följaktligen till rena pl 6,3- och pl 6,5-L1-proteiner och blandningar därav, förfaran- den för extraktion därav från granulocyter genom tryckhomogeni- sering av granulocyterna i närvaro av en enzym-inhibitor och ett medel som stabilíserar de lysosomala membranen och rening därav genom olika metoder, användningen av dessa proteiner för fram- ställningen av monospecifika antisera eller antikroppar, förfaran- 10 15 20 25 30 35 40 i sun 219 den för framställning av sådana monospecifika antísera eller antikroppar genom immunisering av försöksdjur med L1-proteinerna, monospecífika antísera och antikroppar i sig, användningen av sådana antísera eller antikroppar och/eller de renade L1-protei- nerna för kvalitativ och/eller kvantitativ bestämning av L1-pro- teinerna i celler, vävnader och kroppsvätskor och testsystem in- nefattande dessa rena L1-proteiner, antísera och/eller antikrop- par, eventuellt märkta med radioaktiva isotoper eller med enzymer.Accordingly, the present invention relates to pure p1,6,3 and p1,5-L1 proteins and mixtures thereof, methods for extracting them from granulocytes by pressure homogenization of the granulocytes in the presence of an enzyme inhibitor and an agent which stabilizes the lysosomal membranes and their purification by various methods, the use of these proteins for the production of monospecific antisera or antibodies, the procedure for the production of such monospecific antisera or antibodies by immunization of experimental animals with the L1 proteins, monospecific antisera and antibodies per se, the use of such antisera or antibodies and / or the purified L1 proteins for qualitative and / or quantitative determination of the L1 proteins in cells, tissues and body fluids and test systems in - including these pure L1 proteins, antisera and / or antibodies, optionally labeled with radioactive isotopes or with enzymes.
Uppfinningen hänför sig speciellt till rena pl 6,3- och pl 6,5-L1-proteiner, blandningar därav och salter därav. Salter av L1-proteinerna är speciellt icke-toxiska farmaceutiskt god- tagbara salter eller för övrigt sådana som kan användas för fäll- nings- eller reningsförloppet för L1-proteinerna. _ Sådana salter är exempelvis metallsalter, såsom alkali- metall- eller jordalkalimetallsalter, exempelvis natrium-, kalium-, magnesium- eller kalciumsalter, eller zinksalter och liknande, eller ammoniumsalter med ammoniak eller med primära, sekundära eller tertiära aminer, exempelvis salter med alifatiska, cyklo- alifatiska, cykloalifatisk-alifatiska eller aralifatiska primära, sekundära eller tertiära aminer, såsom med lägre mono-, di- eller tri-lågalkylaminer, t.ex. trietylamin, hydroxi-lågalkylaminer, exempelvis 2-hydroxietylamin, bis-(2-hydroxietyl)amin eller trís-(2-hydroxietyl)amín eller med basiska alifatiska estrar av karboxisyror, exempelvis etylendiamintetraättiksyra-1àgalkyl- estrar, exempelvis tetraetylestern och liknande.The invention relates in particular to pure p1,6,3 and p1,5-L1 proteins, mixtures thereof and salts thereof. Salts of the L1 proteins are especially non-toxic pharmaceutically acceptable salts or otherwise those which can be used for the precipitation or purification process of the L1 proteins. Such salts are, for example, metal salts, such as alkali metal or alkaline earth metal salts, for example sodium, potassium, magnesium or calcium salts, or zinc salts and the like, or ammonium salts with ammonia or with primary, secondary or tertiary amines, for example salts with aliphatic, cycloaliphatic, cycloaliphatic-aliphatic or araliphatic primary, secondary or tertiary amines, such as with lower mono-, di- or tri-lower alkylamines, e.g. triethylamine, hydroxy-lower alkylamines, for example 2-hydroxyethylamine, bis- (2-hydroxyethyl) amine or tris- (2-hydroxyethyl) amine or with basic aliphatic esters of carboxylic acids, for example ethylenediaminetetraacetic acid-1α-alkyl esters, for example tetraethyl ester and the like.
Ytterligare salter är syraadditionssalter med oorganiska syror, speciellt mineralsyror, såsom vätekloríd, svavelsyra, fosforsyra eller med organiska syror, såsom karboxi-, sulfon- eller sulfosyror, eventuellt substituerade lågalkankarboxisyror, exempelvis ättíksyra, propionsyra, glykolsyra, maleinsyra, hydr- oximaleinsyra, metylmaleinsyra, malonsyra, fumarsyra, vinsyra, citronsyra eller eventuellt substituerade aromatiska syror, I exempelvis bensoesyra, kanelsyra, mandelsyra, salicylsyra, 4-amino-salicylsyra, 2-fenoxibensoesyra, 2-acetoxibensoesyra, embonsyra, nikotinsyra, isonikotinsyra eller aminosyror, låg- alkansulfonsyror, exempelvis metansulfonsyra, etansulfonsyra, 2-hydroxietansulfonsyra, bensensulfonsyra, 4-metylbensensulfon- syra, naftalensulfonsyra eller askorbinsyra och liknande.Additional salts are acid addition salts with inorganic acids, especially mineral acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or with organic acids, such as carboxylic, sulfonic or sulphoic acids, optionally substituted lower alkanecarboxylic acids, for example acetic acid, propionic acid, glycolic acid, maleic acid, maleic acid malonic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid or optionally substituted aromatic acids, I for example benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-amino-salicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-acetoxybenzoic acid, embonic acid, nicotinic acid, isoniconicoric acid, or amino amino acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, 4-methylbenzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid or ascorbic acid and the like.
Bägge proteinerna kännetecknas genom sina isoelektriska punkter vid pH 6,3 respektive pH 6,5. Molekylvíkten för bägge 10 15 20 25 30 35 500 219 proteinerna bestämd genom gelfiltrering och densítetsgradient- ultracentrifugering är densamma och är cirka 36 500 Dalton. Ge- nom SDS-elektrofores på polyakrylamidgel visas proteinerna bestå av tre polypeptíder med ungefär identisk molekylvikt av 12 500 Dalton. Var och en av dessa polypeptidkedjor uppvisar föl- jande aminosyrasekvens med början från den N-terminala änden: Meth-Leu-Thre-Glu vilka påvisas genom Edman-standardmetoden.Both proteins are characterized by their isoelectric points at pH 6.3 and pH 6.5, respectively. The molecular weight of both proteins determined by gel filtration and density gradient ultracentrifugation is the same and is about 36,500 Daltons. By SDS electrophoresis on polyacrylamide gel, the proteins are shown to consist of three polypeptides with approximately identical molecular weights of 12,500 Daltons. Each of these polypeptide chains exhibits the following amino acid sequence beginning at the N-terminal end: Meth-Leu-Thre-Glu which are detected by the standard Edman method.
Den elektriskanetüfladdningen och tillgängligheten av antigena platser på L1-proteínerna påverkas i hög gradav frånvaron eller närvaron av kalciumjoner. Proteinerna reagerar mycket starkare såsom antigener in vítro i närvaro av kalciumjoner.The electrical addition and availability of antigenic sites on the L1 proteins are greatly affected by the absence or presence of calcium ions. The proteins react much more strongly as antigens in vitro in the presence of calcium ions.
Värmestabiliteten av L1-proteínerna är hög vid neutralt och alkaliskt pH. Kokning under 15 minuter i vattenhaltig 5 mM EDTA, pH 8,5, bevarar 90 % av proteinet. L1-proteinet ut- fälls delvis med etanol vid surt pH, exempelvis mellan cirka 4 och 5.The thermal stability of the L1 proteins is high at neutral and alkaline pH. Boiling for 15 minutes in aqueous 5 mM EDTA, pH 8.5, preserves 90% of the protein. The L1 protein is partially precipitated with ethanol at acidic pH, for example between about 4 and 5.
L1-proteínerna uppvisar en karakteristisk fördelning i människokroppen, varvid de påträffas i stora mängder i neutro- fila granulocyter, monocyter och skvamösa epitel-celler förutom normal hud. De påträffas också i många cancer-celler av den skvamösa epitel-typen och i vissa leukemi- och lymfom-celler, speciellt'sådana av typen myelogen leukemi och monocytisk lymfom.The L1 proteins show a characteristic distribution in the human body, being found in large amounts in neutrophilic granulocytes, monocytes and squamous epithelial cells in addition to normal skin. They are also found in many squamous epithelial-type cancer cells and in certain leukemia and lymphoma cells, especially those of the myelogenous leukemia and monocytic lymphoma type.
L1-proteínerna påträffas i ett övervägande antal vid skvamös cancer i urintrakten och lungorna. L1-proteínerna finns också i normala kroppsvätskor i relativt låga koncentrationer i friska individer nen iökande koncentrationer vid tillstånd med ökande grad av inflammation. I vita blodceller finns L1-proteínerna till 90 % L1-proteínerna kan användas såsom markörproteiner, speci- ellt i radioaktivt märkt form, exempelvis med 1125 eller P32, för kvalitativ och/eller kvantitativ bestämning av L1-proteín- halten i kroppsvätskor, -celler och -vävnader. .The L1 proteins are found in a predominant number in squamous cell carcinoma of the urinary tract and lungs. The L1 proteins are also found in normal body fluids in relatively low concentrations in healthy individuals n increasing concentrations in conditions with increasing degree of inflammation. In white blood cells the L1 proteins are present until 90% of the L1 proteins can be used as marker proteins, especially in radiolabeled form, for example with 1125 or P32, for qualitative and / or quantitative determination of the L1 protein content in body fluids, cells and tissues. .
L1-proteínerna är goda immunogener i djur, exempelvis i i cytosol-fraktionen. kaniner.The L1 proteins are good immunogens in animals, for example in the cytosol fraction. rabbits.
Uppfinningen avser vidare ett förfarande för framställning av de rena pl 6,3- och pI 6,5 L1-proteínerna, blandningar därav och salter därav, kännetecknad därav, att humana granulocyter sönderdelas i ett lämpligt buffertsystem, icke lösligt cellma- terial avlägsnas och ovanvätskan utsättes för 10 15 20 25 30 35 40 5 son 219 a) isoelektrisk fokusering och eluering av banden innehållande pI 6 ,3- och/eller pl 6,5-L1-proteiner med en buffert, eller b) anjonbytarkromatografi med en EDTA-innehållande buffert vid ett pH av cirka 8,5 och eluering av de önskvärda LI-proteinerna med en buffert innehållande kalciumjoner, eller c) affinitetskromatografi, eller d) preparativ agarosgel-elektrofores, eller e) katjonbytar-kromatografi, eller f) gelfiltrering, eller g) reversibel fällning med Zn++ vilken som helst kombination av stegen a) till g), befriande av eluaten från eventuella amfolyter och/eller salter, koncentre- ring av den erhållna lösningen av rena L1-proteiner om så är önskvärt, lyofilisering av den erhållna koncentrerade lösningen och om önskvärt transformation av erhållna L1-proteiner till ett salt eller transformation av erhållet salt till de fria eller proteinerna.The invention further relates to a process for the preparation of the pure pI 6.3 and pI 6.5 L1 proteins, mixtures thereof and salts thereof, characterized in that human granulocytes are decomposed in a suitable buffer system, insoluble cell material is removed and the supernatant is removed. a) isoelectric focusing and elution of the bands containing pI 6, 3- and / or p1 6,5-L1 proteins with a buffer, or b) anion exchange chromatography with an EDTA-containing buffer at a pH of about 8.5 and eluting the desired LI proteins with a buffer containing calcium ions, or c) affinity chromatography, or d) preparative agarose gel electrophoresis, or e) cation exchange chromatography, or f) gel filtration, or g ) reversible precipitation with Zn ++ any combination of steps a) to g), liberation of the eluate from any ampholytes and / or salts, concentration of the resulting solution of pure L1 proteins if desired, lyophilize of the obtained concentrated solution and, if desired, transformation of the obtained L1 proteins into a salt or transformation of the obtained salt into the free or the proteins.
Granulocyterna som användes såsom en källa för extraktíonen av L1-proteiner erhålles från färskt humant blod med vilken som helst konventionell metod, exempelvis med dextran-sedimentering och densitetsgradientcentrifugering.The granulocytes used as a source for the extraction of L1 proteins are obtained from fresh human blood by any conventional method, for example by dextran sedimentation and density gradient centrifugation.
.Buffertsystemet vari granulocyterna sprängs innehåller ett medel som förhindrar simultan sprängning av lysosomerna, såsom glycerol, dextraner och företrädesvis sackaros, i en koncentra- tion som är tillräcklig för stabilisering av det osmotíska tryc- ket före och efter sprängning av cellväggarna. Exempelvis använ- des sackaros i en koncentration av mellan 0,27 och 0,34 M.The buffer system in which the granulocytes burst contains an agent which prevents simultaneous bursting of the lysosomes, such as glycerol, dextrans and preferably sucrose, in a concentration sufficient to stabilize the osmotic pressure before and after bursting of the cell walls. For example, sucrose was used in a concentration of between 0.27 and 0.34 M.
Buffertsystemet innehåller vidare enzym-inhibitorer som förhind- rar uppslutning av L1-proteinerna, såsom diisopropylfluorofosfat (DFP), sojaböntrypsin-inhibitor, Trasilol , kvicksilverbensoat, pepstatin A och företrädesvis fenylmetylsulfonyfluorid (PMFS) och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller blandningar därav.The buffer system further contains enzyme inhibitors which prevent the digestion of the L1 proteins, such as diisopropyl fluorophosphate (DFP), soybean trypsin inhibitor, Trasilol, mercury benzoate, pepstatin A and preferably phenylmethylsulfonyfluoride (PMFS) and ethylene dihydric or ethyl acetic acid or dihydric acid.
Sprängningen av cellväggen kan genomföras på konventionellt sätt, exempelvis mekaniskt, t.ex. med en roterande blandare, en mortelstöt (Potter-Elvelyem Method), medelst ultraljud, frysning och tining eller kombinationer av dessa metoder. Enligt en före- dragen metod sprängs granulocyterna genom tryckhomogenisering.The blasting of the cell wall can be carried out in a conventional manner, for example mechanically, e.g. with a rotary mixer, a mortar (Potter-Elvelyem Method), by means of ultrasound, freezing and thawing or combinations of these methods. According to a preferred method, the granulocytes burst by pressure homogenization.
Efter sprängning av granulocyterna avlägsnas olösliga ma- terial, såsom icke sprängda celler, cellavfall och lysosomer, 10 15 20 25 30 35 40 1500 219 exempelvis genom ultracentrifugering. g L1-proteinerna erhålles i ren form från det råa granulo- cytextraktet medelst något av följande reningsförlopp. a) Isoelektrisk fokusering: Den isoelektriska fokuse- ringen genomföres företrädesvis i en granulerad gel, såsom pärlor av agaros eller polymeriserad dextran innehållande en lämplig blandning av kommersiellt tillgängliga amfolyter för tillhandahållande av en stabil pH-gradient av från cirka pH 5 till 8 under förloppet. Den isoelektriska fokuseringen genom- föres med en maximal spänning av cirka 25 V/cm under cirka 10-20 timmar vid en temperatur av cirka S till 150. En föredra- gen gel är Ultrodex® och den föredragna amfolyten är Ampholine®.After disruption of the granulocytes, insoluble materials such as non-disrupted cells, cell debris and lysosomes are removed, for example by ultracentrifugation. The L1 proteins are obtained in pure form from the crude granulocyte extract by any of the following purification procedures. a) Isoelectric focusing: The isoelectric focusing is preferably carried out in a granular gel, such as beads of agarose or polymerized dextran containing a suitable mixture of commercially available ampholytes to provide a stable pH gradient of from about pH 5 to 8 during the process. The isoelectric focusing is performed with a maximum voltage of about 25 V / cm for about 10-20 hours at a temperature of about S to 150. A preferred gel is Ultrodex® and the preferred ampholyte is Ampholine®.
Provet anbringas företrädesvis på katodsidan av gelen.The sample is preferably applied to the cathode side of the gel.
Lokaliseringen av L1-proteinbanden kan genomföras genom pH-mät- ningar längs gelytan eller genom färgning av filtrerpapperavtryck, av ovanytan, exempelvis med "coomassie"-blått.The localization of the L1 protein bands can be carried out by pH measurements along the gel surface or by staining filter paper prints, of the top surface, for example with "coomassie" blue.
Banden innehållande L1-proteinerna skrapas av och elueras medelst en lämplig buffert, innehållande EDTA vid ett pH av mel- lan cirka 7,5 och cirka 9, företrädesvis vid ett pH av cirka 8,5.The bands containing the L1 proteins are scraped off and eluted by a suitable buffer, containing EDTA at a pH of between about 7.5 and about 9, preferably at a pH of about 8.5.
Eluatet befrias från amfolyterna och salterna genom dialys och/eller gelfiltrering och koncentreras gaum1ultrafiltrering och/eller lyofilisering. b) Anjonbytarkromatografi: vändes enligt detta förfarande innehåller exempelvis tertüha el- ler kvaternära aminogrupper och utgöres exempelvis av dietyl- aminoetylcellulosa, t.ex. dietylaminoetyl-Sepharose eller QAE-cellulosa (kvaternär aminoetylcellulosa). Granulocytextraktet innehållande L1-proteinerna anbringas på kolonnen i en buffert av låg jonstyrka innehållande EDTA och med ett pH av cirka 8,5.The eluate is freed from the ampholytes and salts by dialysis and / or gel filtration and concentrated by ultrafiltration and / or lyophilization. b) Anion exchange chromatography: used according to this procedure contains, for example, tertiary or quaternary amino groups and consists, for example, of diethylaminoethylcellulose, e.g. diethylaminoethyl-Sepharose or QAE-cellulose (quaternary aminoethylcellulose). The granulocyte extract containing the L1 proteins is applied to the column in a low ionic strength buffer containing EDTA and having a pH of about 8.5.
L1-proteinerna elueras specifikt medelst en kalciumjon-innehål- lande buffert, exempelvis en buffert innehållande 30 mM barbital Anjonbytarmaterialen som an- och 5 mM kalciumklorid. c) Affinitetskromatografi: En tredje metod för rening av L1-proteinet är baserat på affinitetskromatografi. Denna kan genomföras på reglerade porösa glaspärlor uppvisande stor yta, exempelvis cirka 50 m2/g. Glaspärlorna placeras i en kolonn och det råa granulocytextraktet anbringas i en lämplig buffert av låg molaritet innehållande kalciumjoner vid neutralt eller svagt surt pH, exempelvis cirka pH 6-7. L1-proteinerna elueras med en alkalisk buffert av cirka pH 7,5-8,5 innehållande cirka 50 mM 10 15 20 ZS 30 35 40 EDTA och polyetylenglykol eller litiumbromid.The L1 proteins are specifically eluted by means of a calcium ion-containing buffer, for example a buffer containing 30 mM barbital Anion exchange materials as an and 5 mM calcium chloride. c) Affinity chromatography: A third method for purifying the L1 protein is based on affinity chromatography. This can be done on regulated porous glass beads having a large surface area, for example about 50 m2 / g. The glass beads are placed in a column and the crude granulocyte extract is applied to a suitable low molarity buffer containing calcium ions at neutral or slightly acidic pH, for example about pH 6-7. The L1 proteins are eluted with an alkaline buffer of about pH 7.5-8.5 containing about 50 mM 10 15 20 ZS 30 35 40 EDTA and polyethylene glycol or lithium bromide.
Enligt en annan affinitetskromatografi-metod användes en anti-L]-antikropp-kolonn. L1-proteinerna adsorberas till anti- kropparna under det att övriga proteiner tvättas ut med en buf- fert. Därefter elueras L1-proteinerna med en saltlösning, såsom en vattenhaltig buffert av cirka pH 3,5, innehållande ett salt, såsom natriumklorid eller natriumjodid. d) Preparativ agarosgel-elektrofores: Planbädd-agaros- geler av lämpliga dimensioner användes innehållande 75 mM barbital/2,5 mM EDTA;buffert, pH 8,5. Elektrofores genomföres vid 4 V/cm under 10-18 timmar. L1-proteinbanden lokaliseras ge- nom färgning av filterpapperavtryck av gelovanytan. L1-protein- banden påträffas i xz-globulin-området och elueras genom frys- ning/tiníng och centrifugering av de relevanta remsorna av agarosgelen. e) Katjonbytarkromatografi: genomföres på katjonbytarhartser, såsom sulfoprmpyl-substituerad cellulosa eller polymeriserad dextran. Det råa granulocytextrak- tet anbringas på kolonnen efter blandning med en buffert av låg jonstyrka innehållande kalciumjoner och med ett pH av cirka 6.According to another affinity chromatography method, an anti-L] antibody column was used. The L1 proteins are adsorbed to the antibodies while the other proteins are washed out with a buffer. Thereafter, the L1 proteins are eluted with a saline solution, such as an aqueous buffer of about pH 3.5, containing a salt, such as sodium chloride or sodium iodide. d) Preparative agarose gel electrophoresis: Flatbed agarose gels of suitable dimensions were used containing 75 mM barbital / 2.5 mM EDTA, buffer, pH 8.5. Electrophoresis is performed at 4 V / cm for 10-18 hours. The L1 protein bands are located by staining the filter paper imprint of the gelovan surface. The L1 protein bands are found in the xz-globulin region and are eluted by freezing / thawing and centrifuging the relevant strips of the agarose gel. e) Cation exchange chromatography: performed on cation exchange resins, such as sulfopropyl-substituted cellulose or polymerized dextran. The crude granulocyte extract is applied to the column after mixing with a low ionic strength buffer containing calcium ions and having a pH of about 6.
Icke-adsorberade proteiner tvättas bort med utgångsbufferten och L1-proteinerna elueras med en buffert innehållande EDTA och Katjonbytarkromatografi ökande koncentrationer av natriumjoner. f) Gelfiltrering: För gelfiltreringen användes Sephadefß G75 till G200 agarosgeler (Sepharose-geler), såsom Ultra gel eller polyakrylamidgelpärlor, såsom Bio-Gel P-60.Non-adsorbed proteins are washed away with the starting buffer and the L1 proteins are eluted with a buffer containing EDTA and cation exchange chromatography increasing concentrations of sodium ions. f) Gel filtration: For the gel filtration, Sephadefß G75 to G200 agarose gels (Sepharose gels), such as Ultra gel or polyacrylamide gel beads, such as Bio-Gel P-60, were used.
Kolonnen utgöres företrädesvis av en lång sådan. Kolonnlängden bör vara cirka 50 gånger diametern. Det råa granulocytextraktet anbringas som sådant och L1-proteinerna kromatograferas. För packning av kolonnen och bearbetning användes en buffert som företrädesvis innehåller 0,1 M natriumcitrat, 2,5 mM EDTA-K2 och 0,25 mM timerosal, pH 8,5. L1-proteinerna påträffas i en fraktion motsvarande en molekylvikt av 35 000 till 40 000 Dalton. g) Reversibel utfällníng med Zn++ Li-proteinerna utfälles kvantitativt ur vattenhaltiga lösningar med neutralt eller alka- liskt pH genom behandling med Zn++-joner, speciellt i form av vattenlösliga zinksalter, såsom zinkacetat eller zinkklorid.The column is preferably a long one. The column length should be about 50 times the diameter. The crude granulocyte extract is applied as such and the L1 proteins are chromatographed. For packing the column and processing, a buffer containing preferably 0.1 M sodium citrate, 2.5 mM EDTA-K2 and 0.25 mM thimerosal, pH 8.5 was used. The L1 proteins are found in a fraction corresponding to a molecular weight of 35,000 to 40,000 Daltons. g) Reversible precipitation with the Zn ++ Li proteins is quantitatively precipitated from aqueous solutions with neutral or alkaline pH by treatment with Zn ++ ions, especially in the form of water-soluble zinc salts, such as zinc acetate or zinc chloride.
Exempelvis kan en vattenhaltig lösning innehållande L1-protei- nerna behandlas vid pH cirka 8,5 med en vattenhaltig lösning av cirka 10 mM till 100 mM zinkacetat. Det utfällda L1-zinksaltet 10 15 20 25 30 35 40 500 219 tillvaratages, tvättas om nödvändigt med den vattenhaltiga buf- fertlösningen, behandlas med en komplexbíldníngssyra, exempelvis en cirka 100 mM vattenhaltig dikaliumetylendiamintetraättiksyra- lösning av pH 8,5 och för utvinnande av de fria L1-proteinerna filtreras lösningen genom en jonbytarkolonn, exempelvis Pharmacia PD-10, och lyofiliseras.For example, an aqueous solution containing the L1 proteins can be treated at pH about 8.5 with an aqueous solution of about 10 mM to 100 mM zinc acetate. The precipitated L1-zinc salt is recovered, washed if necessary with the aqueous buffer solution, treated with a complexing acid, for example an approximately 100 mM aqueous dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid solution of pH 8.5 and to recover the the free L1 proteins, the solution is filtered through an ion exchange column, for example Pharmacia PD-10, and lyophilized.
Salterna av L1-proteinet bildas genom konventionella meto- der, exempelvis genom behandling med de relevanta jonerna, exempelvis en bas, en syra eller ett salt innehållande de önsk- värda jonerna eller genom jonbytarbehandling. Ett mycket olösligt mangansalt kan exempelvis beredas genom tillsats av Mn++-joner, exempelvis i form av en cirka 10-mM till 100-mM vattenhaltig lös- ning av mangan-acetat eller något annat vattenlösligt mangan- salt, till en vattenhaltig lösning av L1-proteinerna.The salts of the L1 protein are formed by conventional methods, for example by treatment with the relevant ions, for example a base, an acid or a salt containing the desired ions or by ion exchange treatment. A highly insoluble manganese salt can be prepared, for example, by adding Mn ++ ions, for example in the form of an approximately 10-mM to 100-mM aqueous solution of manganese acetate or some other water-soluble manganese salt, to an aqueous solution of L1- the proteins.
Uppfinníngen hänför sig också till monospecifika antisera mot L1-proteinet och antikroppen innehållande immunoglobulinerna, speciellt sådana som bildats genom kaniner.The invention also relates to monospecific antisera to the L1 protein and the antibody containing the immunoglobulins, especially those formed by rabbits.
Monospecifika antisera framställes med konventionella meto- der, exempelvis genom veckovis injektion av de rena L1-proteiner- na med komplett Freund's adjuvans, exempelvis_subkutant eller intramuskulärt, i doser av cirka 100 pg per kanin per vecka under cirka 8-16 veckor. Därefter tillvaratages serum från djuren, exempelvis genom vensektion, och levras. I stället för kaniner kan också andra icke-humana varmblodiga djur, speciellt dägg- djur användas, t.ex. får, getter, råttor, möss, hästar och lik- nande.Monospecific antisera are prepared by conventional methods, for example by weekly injection of the pure L1 proteins with complete Freund's adjuvant, for example subcutaneously or intramuscularly, at doses of about 100 pg per rabbit per week for about 8-16 weeks. Serum is then collected from the animals, for example by venous section, and clotted. Instead of rabbits, other non-human warm-blooded animals, especially mammals, can also be used, e.g. sheep, goats, rats, mice, horses and the like.
Den monospecifika antikropp-innehållande globulinfraktíonen kan isoleras från serum med konventionella metoder, exempelvis genom jonbytarkromatografi.The monospecific antibody-containing globulin fraction can be isolated from serum by conventional methods, for example by ion exchange chromatography.
För framställningen av dessa monospecifika anti-L1-anti- kroppar drives antiserum innehållande den monospecifika anti- kroppen eller globulin-fraktionen därav genom en kolonn där de renade L1-proteinerna har konjugerats till ett lämpligt material, såsom agaros eller cellulosa-gel. Efter borttvättning av icke- adsorberade proteiner elueras anti-L1-antikropp-molekylerna med en buffert med ett pH av cirka 3,5 innehållande natriumklorid eller natriumjodid.For the preparation of these monospecific anti-L1 antibodies, antiserum containing the monospecific antibody or globulin fraction thereof is driven through a column where the purified L1 proteins have been conjugated to a suitable material, such as agarose or cellulose gel. After washing off non-adsorbed proteins, the anti-L1 antibody molecules are eluted with a buffer having a pH of about 3.5 containing sodium chloride or sodium iodide.
De relevanta fraktionerna justeras till ett pH av cirka 7, díalyseras och koncentreras.The relevant fractions are adjusted to a pH of about 7, dialyzed and concentrated.
Anti-L1-antikropparna, antingen renade eller i rå form, 10 15 20 25 30 35 40 9 500 219' såsom i form av antiserum eller globulinfraktioner därav, använ- des för de kvalitativa eller kvantitativa metoderna för detekte- ring av L1-proteiner i celler, vävnader eller kroppsvätskor.The anti-L1 antibodies, either purified or in crude form, such as in the form of antiserum or globulin fractions thereof, were used for the qualitative or quantitative methods for detecting L1 proteins. in cells, tissues or body fluids.
Sådana metoder innefattar fällning i geler, nefelometri, radio- immuno-assay, enzym-immuno-assay, immunofluorescens och immuno- peroxidas-cytohistokemiska metoder på konventionellt sätt.Such methods include gel precipitation, nephelometry, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, immunofluorescence, and immunoperoperidase cytohistochemical methods in a conventional manner.
Uppfinningen avser vidare testsystem innefattande dairena monospecifika anti-L1-antikroppen eller anti-L1-antikropp-globu- lin-fraktionen eller anti-L1-antikropp-innehållande antiserum.The invention further relates to test systems comprising those monospecific anti-L1 antibody or anti-L1 antibody-globulin fraction or anti-L1 antibody-containing antiserum.
Sådana testsystem är av konventionell typ och är avsedda för enkel radio-immuno-diffusion, latex-agglutinatíon, f1äcktest_ radio-immuno-assay, enzym-immuno-assay, immuno-fluorescenstezt eller enzym-immuno-histokemiskt test.Such test systems are of the conventional type and are intended for simple radioimmuno-diffusion, latex agglutination, spot test-radioimmunoassay, enzyme-immuno-assay, immunofluorescence test or enzyme-immunohistochemical test.
Sådana system kan förutom anti-L1-antikroppar i ren eller rå form, torkade eller solubiliserade i en lämplig buffert, innehålla i förväg framställda geler, latex, polystyren, formalin- stabiliserade animala röda blodceller eller liknande partiklar, enzymer, såsom rädisperoxidas, alkalisk fosfatas, enzymsubstrat, fluorescens- .eller.enzymkonjugerade antikroppar och material som lämpar sig för separation av antikroppbundna L1-molekyler från fria fl-molekyler, såsom avdödade stammar av Staphylococcus aureus tillhörande stammarna som bildar Staphylococcus protein A, träkol (som adsorberar det fria L1-proteinet men ej antikropp- proteinkomplexet) eller en andra antikropp, såsom get- eller antikanin-immunoglobulin eller L1-proteiner märkta med radio- aktiva ísotoper, såsom 1125 eller med enzymer, såsom med rädis- peroxidas eller alkalisk fosfatas. Systemet kan också innehålla bärare, varpå monospecifika anti-L1-antikroppar är fixerade vid en yta, exempelvis den inre ytan av provrör, ytan av glas- eller plastpärlor, stycken av filtrerpapper, cellulosaacetatmembran eller liknande material, samt buffertar för sådana metoder.Such systems may contain, in addition to pure or crude anti-L1 antibodies, dried or solubilized in a suitable buffer, pre-prepared gels, latex, polystyrene, formalin-stabilized animal red blood cells or similar particles, enzymes such as radish peroxidase, alkaline phosphatase , enzyme substrates, fluorescence or enzyme-conjugated antibodies and materials suitable for the separation of antibody-bound L1 molecules from free fl molecules, such as killed strains of Staphylococcus aureus belonging to the strains forming Staphylococcus protein A, charcoal free as the protein but not the antibody-protein complex) or a second antibody such as goat or anti-rabbit immunoglobulin or L1 proteins labeled with radioactive isotopes such as 1125 or with enzymes such as radix peroxidase or alkaline phosphatase. The system may also contain carriers to which monospecific anti-L1 antibodies are attached to a surface, for example the inner surface of test tubes, the surface of glass or plastic beads, pieces of filter paper, cellulose acetate membranes or similar materials, and buffers for such methods.
I det ovanstående och i det följande användes följande för- kortningar: PMSF fenylmetylsulfonylfluorid PAGE : polyakrylamidge1-elektrofores SDS : natriumdodecylsulfat IEF isoelektrisk fokusering SRID enkelradioimmunodiffusion NHS normalt humant serum ACD syra-citrat-dextros 10 15 20 25 30 35 40 10 500 2191 DFP diisopropylfluorofosfat EDTA etylendiamintetraättiksyra EDTA-K2: dikaliumsalt av EDTA DEAE dietylaminoetyl RIA radio-immuno-assay PBS fosfatbuffrad saltlösning PASA protein A-innehållande Staph. aureus Exempel 1: Isolering av granulocyter a) En blandning bestående av 435 ml färskt humant blod, 65 ml av en vattenhaltig lösning innehållande 2,2 % trinatrium- citratdihydrat, 0,8 % vattenfri citronsyra och 2,45 % dextros, 250 ml högmolekylär dextran (Dextraven@l150) och 23 ml av en lösning innehållande 2,5 mM citronsyra, 45 mM trinatriumcitrat, 180 mM glUkos OCh 15 mM natriumklorid tillåtes avsätta sig under 1 timme vid 4°C. Ovanvätskeskiktet tillvaratages och centrifu- geras vid 200 x g under 20 minuter vid 4°C. Sedimentet behand- las med 50 ml av iskallt destillerat vatten, varigenom de röda blodcellerna lyseras. Efter 30 sekunder återställes isotonicitet genom tillsats av 16,5 ml iskyld 0,6 M natriumklorid. Kvarvarande leukocyter tvättas två gånger med isotonisk saltlösning. Granulo- cyterna separeras från de mononukleära cellerna genom centrifu- gering på Lymphopreflg)[densitetsgradientcentrifugeringsmaterial bestående av 9,6 % (vikt/volym) natrium-metrizoatlösning innehål- lande 5,6 % (vikt/volym) av en erytrocytaggregerande polysackarid (Ficoll)] följt av centrifugering vid 800 x g under 20 minuter vid ZOOC. Detta förfarande ger ett utbyte av cirka 5 x 108 celler, varav cirka 95 % är granulocyter. b) Granulocytextraktion Cellerna som erhållits som beskrivits under a) åter- uppslammas i 0,27 M sackaros innehållande 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-K2 och 0,25 mM timerosal under tillsats av trisbuffert till pH 8,5. Därefter homogeniseras cellerna enligt French och Holm (4) genom exponering för 28 kp/cmz tryckluft under två perioder av 2 minuter under det att de tillåtes tränga ut ur tryckkamma- ren med en hastighet av en droppe per sekund. Under detta förfa- rande hålles cellbehållarna i våt is. Cirka 90 % sprängs och efter centrifugering vid 100 000 x g under 1 timme påträffades cirka 90 % av totalt L1-protein i det klara ovan- vätskefluidet. Sistnämnda betecknas det råa granulocytextraktet. av cellerna Den totala proteinhalten är cirka 3 mg/ml, varav 30 % är Lqnotenær. 10 15 20 25 30 35 40 “» 500 219 c) Preparativ isoelektrisk fokusering (IEF) För preparativ IEF användes en gelplatta med måtten 110 mm x 240 mm x 5 mm bestående av Ultrade (Dextran G75, raffinerad) innehållande 2 % (vikt/volym)Ampho1inÅÉ)pH 5-8 (en blandning av syntetiska amfolyter med buffringskapaciteter vid de isoelektriska punkterna därför). Proverna [B ml av ovan- vätskan enligt b)] blandades med en lika stor volym av Ultrade gel och anbringades 5 cm från katoden pâ gelplattorna. Separation genomföres under 18 timmar med maximalt 25 V cm' , 15 mA och 10 W.In the above and below, the following abbreviations are used: PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride PAGE: polyacrylamide1 electrophoresis SDS: sodium dodecyl sulfate IEF isoelectric focusing SRID single radioimmunodiffusion NHS normal human serum ACD acid citrate dextrose 10 15 21 25 25 Dophylate 40 15 20 25 30 35 35 40 EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EDTA-K2: dipotassium salt of EDTA DEAE diethylaminoethyl RIA radioimmunoassay PBS phosphate buffered saline PASA protein A-containing Staph. aureus Example 1: Isolation of granulocytes a) A mixture consisting of 435 ml of fresh human blood, 65 ml of an aqueous solution containing 2.2% trisodium citrate dihydrate, 0.8% anhydrous citric acid and 2.45% dextrose, 250 ml high molecular weight dextran (Dextraven® 150) and 23 ml of a solution containing 2.5 mM citric acid, 45 mM trisodium citrate, 180 mM glucose and 15 mM sodium chloride are allowed to settle for 1 hour at 4 ° C. The supernatant layer is collected and centrifuged at 200 x g for 20 minutes at 4 ° C. The sediment is treated with 50 ml of ice-cold distilled water, whereby the red blood cells are lysed. After 30 seconds, isotonicity is restored by the addition of 16.5 ml of ice-cooled 0.6 M sodium chloride. Remaining leukocytes are washed twice with isotonic saline. The granulocytes are separated from the mononuclear cells by centrifugation on Lymphopre fl g) [density gradient centrifugation material consisting of 9.6% (w / v) sodium metrizoate solution containing 5.6% (w / v) of an erythrocyte aggregating polysaccharide ] followed by centrifugation at 800 xg for 20 minutes at ZOOC. This method gives a yield of about 5 x 108 cells, of which about 95% are granulocytes. b) Granulocyte extraction The cells obtained as described in a) are resuspended in 0.27 M sucrose containing 10 mM PMSF, 2.5 mM EDTA-K 2 and 0.25 mM thimerosal with the addition of Tris buffer to pH 8.5. Thereafter, the cells of French and Holm (4) are homogenized by exposure to 28 kp / cm 2 compressed air for two periods of 2 minutes while allowing them to be expelled from the pressure chamber at a rate of one drop per second. During this procedure, the cell containers are kept in wet ice. About 90% exploded and after centrifugation at 100,000 x g for 1 hour, about 90% of the total L1 protein was found in the clear supernatant fluid. The latter is called the crude granulocyte extract. of the cells The total protein content is about 3 mg / ml, of which 30% is Lqnotenær. 10 15 20 25 30 35 40 “» 500 219 c) Preparative isoelectric focusing (IEF) For preparative IEF, a gel plate measuring 110 mm x 240 mm x 5 mm consisting of Ultrade (Dextran G75, refined) containing 2% (w / w) was used. volume) Ampho1inÅÉ) pH 5-8 (a mixture of synthetic ampholytes with buffering capacities at the isoelectric points therefore). The samples [B ml of the supernatant according to b)] were mixed with an equal volume of Ultrade gel and applied 5 cm from the cathode to the gel plates. Separation is performed for 18 hours with a maximum of 25 V cm ', 15 mA and 10 W.
Proteinbanden lokaliseradasbåde genom "coomassie"-blått-färgning av filtrerpapper8VIïyCk av gelplattan och gaum1pH-mätningar av gelovanytan. L1-proteinerna i området för pH 6,3 och 6,5 eluerades med en lika stor volym av en vattenhaltig lösning inne- hållande 0,1 M natriumacetat, 2,5 mM EDTA-K2 och 0,25 mM timero- sal, pH 8,5, genom centrifugering vid 2000 x g under 20 minuter genom 0,45 Pm Millipore -filter. Amfolyterna avlägsnades genom dialys mot elueringsbufferten över natten. De kvarvarande pr0teín- och buffertinnehållande lösningarna koncentrerades genom ultra- filtrering på Minocon -celler (semípermeabelt membran). Utbytet av dessa förlopp är cirka 20 % av L1-proteinet anbringat på gelen för preparativ IBF. 2,5 ml av denna lösning anbringades på en Pharmacia PD-10 kolonn (Sephade G25 M) ekvilibrerad med destil- lerat vatten och L1-proteinerna eluerades med 3,5 ml destillerat vatten och lyofiliserades vilket gav 1 mg rent L1-protein pl 6,3 och 6,5.The protein bands were located both by "coomassie" blue staining of filter paper 8VIïyCk of the gel plate and gaum1pH measurements of the gel surface. The L1 proteins in the range of pH 6.3 and 6.5 were eluted with an equal volume of an aqueous solution containing 0.1 M sodium acetate, 2.5 mM EDTA-K 2 and 0.25 mM timerol, pH 8.5, by centrifugation at 2000 xg for 20 minutes through a 0.45 Pm Millipore filter. The ampholytes were removed by dialysis against the elution buffer overnight. The remaining protein- and buffer-containing solutions were concentrated by ultrafiltration on Minocon cells (semipermeable membrane). The yield of these processes is about 20% of the L1 protein applied to the gel for preparative IBF. 2.5 ml of this solution was applied to a Pharmacia PD-10 column (Sephade G25 M) equilibrated with distilled water and the L1 proteins were eluted with 3.5 ml of distilled water and lyophilized to give 1 mg of pure L1 protein p6 , 3 and 6.5.
L1-proteinet med pl 6,3 och pl 6,5 kan också renas separat med detta förfarande vilket ger cirka 0,67 mg av L1-proteinet med pl 6,5 och cirka 0,33 mg av L1-proteinet pl 6,3.The L1 protein with p1 6.3 and p1 6.5 can also be purified separately by this procedure to give about 0.67 mg of the L1 protein with p1 6.5 and about 0.33 mg of the L1 protein p1 6.3 .
Exempel 2: ~ a) Förfarandet utnyttjar den dramatiska ändringen i den isoelektriska punkten av L1-proteinet när detta tillåtes taga upp kalciumjoner (2). Proteinet i råa granulocytextrakt binds till en anjonbytare, exempelvis dietylamonioetyl-typen, vid alkaliskt pH och med en buffert innehållande etylendiamintetra- ättiksyra i tillräckliga mängder för bindning av kalciumjoner.Example 2: ~ a) The process takes advantage of the dramatic change in the isoelectric point of the L1 protein when it is allowed to take up calcium ions (2). The protein in crude granulocyte extracts binds to an anion exchanger, for example the diethylaminoethyl type, at alkaline pH and with a buffer containing ethylenediaminetetraacetic acid in sufficient amounts to bind calcium ions.
L1-proteinerna kan därefter elueras specifikt genom tillsats av kalciumklorid till bufferten för att en slutkoncentration av cirka 5-10 mM per liter skall garanteras.The L1 proteins can then be eluted specifically by adding calcium chloride to the buffer to ensure a final concentration of about 5-10 mM per liter.
Råa granulocytextrakt beredes såsom beskrivits i exempel 1. Deras totala proteinhalt är cirka 2-5 g per liter, 10 15 20 25 30 35 40 500 219 'Z varav cirka 60 procent är L1-protein.Crude granulocyte extracts are prepared as described in Example 1. Their total protein content is about 2-5 g per liter, of which about 60 percent is L1 protein.
DEAE-Sephacel (från Pharmacia, Sverige) ekvilibrerades med 60 mM barbitalfbuffert (7,7 g dietylbarbitursyra och 10,5 g av natriumsaltet därav i 1 liter vatten) innehållande 1 g/l EDTA-K2, pH 8,5 och förpackades på en kromatografikolonn med dimensionen 1,5 cm x 5 cm, dvs en volym av cirka 9 ml.DEAE-Sephacel (from Pharmacia, Sweden) was equilibrated with 60 mM barbital buffer (7.7 g diethyl barbituric acid and 10.5 g of its sodium salt in 1 liter of water) containing 1 g / l EDTA-K 2, pH 8.5 and packaged on a chromatography column with the dimension 1.5 cm x 5 cm, ie a volume of about 9 ml.
Provet, cirka 10 ml av rått granulocytextrakt spätt med 30 ml EDTA-K2-barbitalbuffert, pH 8,5, anbringades med en peri- staltisk pump, vilket gav en flödeshastighet av cirka 2 ml/min.The sample, about 10 ml of crude granulocyte extract diluted with 30 ml of EDTA-K2 barbital buffer, pH 8.5, was applied with a peristaltic pump, giving a flow rate of about 2 ml / min.
Icke-adsorberade proteiner tvättades ut medelst 100 ml barbital- buffert. Före eluering av L1-proteinerna tvättades kolonnen ock- så med 30 ml barbitalbuffert utan EDTA-K2. L1-proteinerna elue- rades därefter med 60 mM barbitalbuffert innehållande 5 mM CaCl2, pH 8,5.Non-adsorbed proteins were washed out with 100 ml of barbital buffer. Before eluting the L1 proteins, the column was also washed with 30 ml of barbital buffer without EDTA-K2. The L1 proteins were then eluted with 60 mM barbital buffer containing 5 mM CaCl 2, pH 8.5.
Pig. 1 visar den totala protein- och L1-protein-eluerings- profilen för sådan jonbyteskromatografi och fig. 2 visar protein- bandmönstren när rått leukocytextrakt och renat L1-protein utsät- tes för analytisk agarosgel-elektrofores. Det framgår att det renade L1-proteinet ger två större band som beskrivits tidigare motsvarande pI 6,3 och pl 6,5. 1 Mängden L1-protein som eluerades med kalciuminnehållande buffert är nära 50 % av den som anbringades i provet och påträf- fades i en total volym av cirka 20 ml. Denna lösning kan bekvämt koncentreras genom ultrafiltrering med användningav Millipore CX-10-membran. Detta leder till en del proteínförlust beroende på om EDTA tillsättes eller ej för hindrande av att L1-protein binds till membranen. Till och med utan tillsats av EDTA kan ett totalt utbyte av cirka 35 % uppnås.Pig. Figure 1 shows the overall protein and L1 protein elution profile for such ion exchange chromatography and Figure 2 shows the protein band patterns when crude leukocyte extract and purified L1 protein are subjected to analytical agarose gel electrophoresis. It can be seen that the purified L1 protein yields two larger bands as previously described corresponding to pI 6.3 and pI 6.5. The amount of L1 protein eluted with calcium-containing buffer is close to 50% of that applied to the sample and found in a total volume of about 20 ml. This solution can be conveniently concentrated by ultrafiltration using Millipore CX-10 membranes. This leads to some protein loss depending on whether EDTA is added or not to prevent L1 protein from binding to the membranes. Even without the addition of EDTA, a total yield of about 35% can be achieved.
Såsom framgår-av fig. 1 elueras en del L1-protein med 60 mM barbitalbuffert innehållande 5 mM CaCl2 och 125 mM NaCl, pH 8,5, men detta protein ger band som huvudsakligen är anodiska och kato- diska av de övervägande L1-banden och kan representera delvis I denaturerat eller komplexbundet L1-protein förutom olika proteiner.As shown in Figure 1, some L1 protein is eluted with 60 mM barbital buffer containing 5 mM CaCl 2 and 125 mM NaCl, pH 8.5, but this protein yields bands that are predominantly anodic and cathodic of the predominant L1 bands. and may represent partially I denatured or complexed L1 protein in addition to various proteins.
Metoder i stor skala Ovan beskrivna metod kan med framgång uppförstoras för hantering av 50 ml råa granulocytextrakt. Detta uppnås genom an- vändning av en kolonn innehållande cirka S0 ml DEAE-Sephace (cirka 2,5 cm x 10 cm) och proportionella ökningar av volymen av samma buffertsubstanser som angivits ovan. b) Det faktum att en reversibel utfällning av L1-proteinerna 10 15 20 ZS 30 35 f” san kan uppnås genom tillsats av 10 mM Zn++ kan utnyttjas. Till 10 ml rått leukocytextrakt sättes 90 ml barbitalbuffert, 75 mM, pH 8,5, och 10 ml av en 100 mM Zn-acetatlösning i vatten.fä1ÜÜflg'V en tvättas flera gånger, exempelvis fem gånger, med 75 mM barbi- talbuffert, pH 8,5, med 10 mM Zn-acetat. Slutligen tvättas fäll- ningen med 75 mM barbitalbuffert, pH 8,5, och löses genom dropp- vis tillsats av en lösning av 100 mM EDTA-K2 i vatten, pH juste- ras till 8,5 genom 5 M natriumhydroxid. Denna proteinlösning an- bringas på en Pharmacia PD-10-kolonn ekvilibrerad med destille- rat vatten och L1-proteinerna elueras med 3,5 ml destillerat vatten och lyofiliseras, vilket ger cirka 10-20 mg av rena 210 z L1-proteiner.Large scale methods The method described above can be successfully augmented for handling 50 ml of raw granulocyte extract. This is achieved by using a column containing about S0 ml DEAE-Sephace (about 2.5 cm x 10 cm) and proportional increases in the volume of the same buffer substances as indicated above. b) The fact that a reversible precipitation of the L1 proteins can be achieved by the addition of 10 mM Zn ++ can be used. To 10 ml of crude leukocyte extract are added 90 ml of barbital buffer, 75 mM, pH 8.5, and 10 ml of a 100 mM Zn acetate solution in water. The mixture is washed several times, for example five times, with 75 mM barbital buffer. pH 8.5, with 10 mM Zn acetate. Finally, the precipitate is washed with 75 mM barbital buffer, pH 8.5, and dissolved by dropwise addition of a solution of 100 mM EDTA-K2 in water, the pH is adjusted to 8.5 by 5 M sodium hydroxide. This protein solution is applied to a Pharmacia PD-10 column equilibrated with distilled water and the L1 proteins are eluted with 3.5 ml of distilled water and lyophilized to give about 10-20 mg of pure 210 z L1 proteins.
Exempel 3. Framställning av antiserum mot renat L1 __ En lösning innehållande cirka 1 mg/ml av L1-protein av pl 6,3 och pI 6,5 (erhållet enligt exempel 1 eller 2) i 0,1 M natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,25 mM timerosal, pH 8,5, homogeni- serades med Freund's komplett adjuvans. En volym av denna bland- ning innehållande cirka 100 pg L1-proteiner injicerades på flera subkutana ställen i kaniner en gång per vecka under 6 veckor.Example 3. Preparation of antiserum to purified L1 A solution containing about 1 mg / ml of L1 protein of pI 6.3 and pI 6.5 (obtained according to Example 1 or 2) in 0.1 M sodium acetate, 2.5 mM EDTA, 0.25 mM thimerosal, pH 8.5, was homogenized with Freund's complete adjuvant. A volume of this mixture containing approximately 100 pg of L1 proteins was injected at several subcutaneous sites in rabbits once a week for 6 weeks.
Kaninerna tappades[fi.blod genom venpunktur. Blodet fick koagulera vid rumstemperatur över natten. Serum tillvaratogs och testades med avseende på L1-antiserum-aktivitet.The rabbits were bled [fi. Blood by venipuncture. The blood was allowed to coagulate at room temperature overnight. Serum was recovered and tested for L1 antiserum activity.
Normalt kan sådant antiserum användas i en spädning av 1:32 för en enda radio-immuno-fällning och en spädning av 1:2000 för radio-immuno-assay.Normally, such antiserum can be used in a 1:32 dilution for a single radioimmunoprecipitate and a 1: 2000 dilution for radioimmunoassay.
Exempel 4: Testsystem för radio-immuno-assay Testsystemet innehåller (för 100 tester): 1 ampull av 2 ml lyofiliserat anti-L1-serum erhållet enligt exempel 3 1 flaska av 100 ml RIA-buffert: 50 mM natriumklorid, 0,2 % bovinserumalbumin, 0,2 % natriumazíd, justerat till pH 7,4; 1 gummitäckt ampull av 5 ml vattenhaltig lösning av radioaktivt -jodïzs-märkta L1-proteiner justerade så att de ger S00 cpm/ml (enligt Bolton-Hunter-märkningsmetoden); 1 flaska av 100 ml av en vattenhaltig suspension av formalin-be- handlad Staphylococcus aureus (PASA = protein A-innehållande Staph. aureus av Cowan I-stam) i fosfatbuffertsaltlösning; 1 flaska av 2 ml av RIA-buffertlösning innehållande 500 ng L1-protein (referenslösning). 10 15 20 25 30 35 40 500 219 '4 Pörfarande för kvantisering av L1-proteiner enligt RIA En serie av standards framställdes genom tvåfaldig späd- ning av den tillhandahållna L1-referenslösningen ned till 7,8 ng/ml med RIA-buffert. I en serie av provrör pipetterades 25 pl av patientplasma spädd 1:30 i RIA-buffert eller standard- referenslösning. Därtill sattes 20 pl av anti-L1-serum och bland- ningarna inkuberades vid 37°C under 30 minuter. Därefter till- sattes 50 pl av lösningen med radioaktivt märkt L1-protein, vilket följdes av inkubering vid 37°C under 1 timme. Till varje rör sattes därefter 1 ml av uppslammad Staph. aureus-suspension och centrifugerades vid 2000 x g under 10 minuter. Ovanvätskan sögs av och radioaktiviteten i sedimentet uppmättes. Den pro- centuella mängden av radioaktiviteten i förhållande till initi- ellt tillsatt radioaktivitet avsattes för L1-referensstandard- spädningarna så att referenskurvan kunde ritas upp. Värdena från patienproven kan avläsas från denna kurva.Example 4: Radioimmunoassay Test System The test system contains (for 100 tests): 1 ampoule of 2 ml lyophilized anti-L1 serum obtained according to Example 3 1 bottle of 100 ml RIA buffer: 50 mM sodium chloride, 0.2% bovine serum albumin, 0.2% sodium azide, adjusted to pH 7.4; 1 rubber-filled ampoule of 5 ml aqueous solution of radioactive iodine-labeled L1 proteins adjusted to give S00 cpm / ml (according to the Bolton-Hunter labeling method); 1 bottle of 100 ml of an aqueous suspension of formalin-treated Staphylococcus aureus (PASA = protein A-containing Staph. Aureus of Cowan I strain) in phosphate buffered saline; 1 bottle of 2 ml RIA buffer solution containing 500 ng L1 protein (reference solution). 10 15 20 25 30 35 40 500 219 '4 Method for quantification of L1 proteins according to RIA A series of standards was prepared by doubling the dilution of the provided L1 reference solution down to 7.8 ng / ml with RIA buffer. In a series of test tubes, 25 μl of patient plasma diluted 1:30 in RIA buffer or standard reference solution was pipetted. To this was added 20 μl of anti-L1 serum and the mixtures were incubated at 37 ° C for 30 minutes. Then 50 μl of the solution with radiolabeled L1 protein was added, which was followed by incubation at 37 ° C for 1 hour. To each tube was then added 1 ml of suspended Staph. aureus suspension and centrifuged at 2000 x g for 10 minutes. The supernatant was sucked off and the radioactivity in the sediment was measured. The percentage of the radioactivity in relation to the initially added radioactivity was set aside for the L1 reference standard dilutions so that the reference curve could be plotted. The values from the patient samples can be read from this curve.
Exempel S: Testsystem för nefelometrisk bestämning av L1-proteiner i lösning Testsystemet innehåller: 1 ampull av 1,5 ml anti-L1-antikropplösning i buffert av pH 7,É (natriumacetatbuffert innehållande 5 mM kalcium- klorid) med en titer av cirka 1:32 testat medelst dubbel- immunodiffusion i agarosgel; 1 flaska av 20 ml spädningsbuffert enligt ovan; 1 ampull av 0,5 ml av en lösning av L1-protein i en koncentra- tion av 400 pg/ml Anti-L1-serum späddes 1:15 med spädningsbuffert. Sex stan- dard av L1-protein (1:1 till 1:64) framställdes genom tvåfaldig spädning av standard-L1-lösningen. Därefter blandades 250 pl av antikroppspädning och 10 pl prov eller spädd L1-standard i nefe- lometerkyvetter och inkuberades under 10 minuter vid rumstempera- tur. Den optiska densiteten avlästes på nefelometern.Example S: Test system for nephelometric determination of L1 proteins in solution The test system contains: 1 ampoule of 1.5 ml anti-L1 antibody solution in buffer of pH 7, É (sodium acetate buffer containing 5 mM calcium chloride) with a titer of about 1 : 32 tested by double immunodiffusion in agarose gel; 1 bottle of 20 ml dilution buffer as above; 1 ampoule of 0.5 ml of a solution of L1 protein at a concentration of 400 pg / ml Anti-L1 serum was diluted 1:15 with dilution buffer. Six standards of L1 protein (1: 1 to 1:64) were prepared by double dilution of the standard L1 solution. Then, 250 μl of antibody dilution and 10 μl of sample or diluted L1 standard were mixed in nephelometer cuvettes and incubated for 10 minutes at room temperature. The optical density was read on the nephelometer.
Exempel 6: Testsystem för enkel radio-immuno-diffusions- analys av L1-proteiner i lösning Testsystemet innehåller: 1 eller flera i förväg framställda agarosgeler innehållande 2 % av homogent fördelad anti-L1-antikropplösning med en titer av cirka 1:32 vid testning medelst dubbeldiffusion i gel och 0,1 M natriumacetat, 5 mM kalciumklorid, 0,25 mM timerosal, pH 8,5; 10 15 20 25 30 35 40 15 500 219 1 ampull 0,1 ml L1-proteinlösning med en koncentration av 300 pg/ml. 'A __4 Agarosgelen tillhandahölls i en sluten kammare för för- hindrande av uttorkning av gelen. Gelen uppvisade 18 i förväg framställda brunnar för påförande av 10 Pl av standardlösningar och proverna som skulle testas.Example 6: Test system for simple radioimmuno-diffusion analysis of L1 proteins in solution The test system contains: 1 or more pre-prepared agarose gels containing 2% of homogeneously distributed anti-L1 antibody solution with a titer of about 1:32 when tested by double diffusion in gel and 0.1 M sodium acetate, 5 mM calcium chloride, 0.25 mM thimerosal, pH 8.5; 10 15 20 25 30 35 40 15 500 219 1 ampoule 0.1 ml L1 protein solution with a concentration of 300 pg / ml. 'A __4 The agarose gel was provided in a closed chamber to prevent drying of the gel. The gel showed 18 pre-prepared wells for application of 10 μl of standard solutions and the samples to be tested.
Testsystem för latex-agglutination-assay för en semikvantitativ bestämning av L1-protein Exempel 7: Testsystemet innehåller: a) 1 flaska och 2 ml av en suspension av latexpartiklar av 50 Pm diameter vartill renat L1-protein har fixerats; b) 1 flaska och 2 ml av en buffertlösning av anti-L1-antikropp som agglutinerar med ovannämnda latexpartiklar, med en titer av 1:3 till 1:4; c) 1 flaska och 0,5 ml av en buffertlösning av L1-proteinet i en koncentration av 50 pg/ml.Test system for latex agglutination assay for a semi-quantitative determination of L1 protein Example 7: The test system contains: a) 1 bottle and 2 ml of a suspension of latex particles of 50 Pm diameter to which purified L1 protein has been fixed; b) 1 vial and 2 ml of an anti-L1 antibody buffer solution agglutinating with the above latex particles, having a titer of 1: 3 to 1: 4; c) 1 bottle and 0.5 ml of a buffer solution of the L1 protein at a concentration of 50 pg / ml.
En droppe av a), b) och patientprovet som skall testas blandas på en svart skiva och observerades med avseende på agglutination i 5 minuter. Avsaknad av agglutination betyder en L1-koncentration av över 1000 ng/ml. I de positiva kontrollös- ningarna blandas a), b) och c) och ingen agglutination bör ut- vecklas. 4 Exempel 8: Testsystem för fläck-testet Testsystemet innehåller: 10 bitar av cellulosaacetat med måtten 5 mm x 50 mm med 2 fläckar med en diameter av 4 mm av torkad specifik anti-L1-antikropp lokaliserade 10 mm och 30 mm från ena änden; 0 a) 1 flaska av 2 ml av en buffertlösning-innehållande specifik anti-L1-antikroppar konjugerade med rädisperoxidas; _ b) 1 flaska av 10 ml av en vattenhaltig lösning av trisbuffert/ isotonisk saltlösning, pH 7,4, innehållande 1 mg/ml diaminobensidin (DAB); c) 1 flaska av 1 ml av en vattenhaltig buffertlösning av L1-protein i en koncentration av S0 pg/ml För testning anbringas en droppe av provlösningen på den första fläcken och en droppe av lösning c) på den andra fläcken.A drop of a), b) and the patient sample to be tested are mixed on a black disc and observed for agglutination for 5 minutes. Lack of agglutination means an L1 concentration of over 1000 ng / ml. In the positive control solutions, a), b) and c) are mixed and no agglutination should be developed. Example 8: Spot test test system The test system contains: 10 pieces of cellulose acetate measuring 5 mm x 50 mm with 2 spots with a diameter of 4 mm of dried specific anti-L1 antibody located 10 mm and 30 mm from one end; A) 1 vial of 2 ml of a buffer solution containing specific anti-L1 antibodies conjugated to radish peroxidase; b) 1 bottle of 10 ml of an aqueous solution of Tris buffer / isotonic saline, pH 7.4, containing 1 mg / ml diaminobenzidine (DAB); c) 1 bottle of 1 ml of an aqueous buffer solution of L1 protein at a concentration of SO pg / ml For testing, apply one drop of the sample solution to the first spot and one drop of solution c) to the second spot.
Efter 10 minuter tvättades testremsan i trisbuffert/saltlösning under 5 minuter. Därefter anbringas en droppe av lösning a) på varje fläck och lämnas under 10 minuter vid rumstemperatur och 10 15 20 25 30 35 40 500 219 *Ö remsan tvättas åter under 5 minuter i trisbuffert/ saltlösning.After 10 minutes, the test strip was washed in Tris buffer / saline for 5 minutes. Then a drop of solution a) is applied to each stain and left for 10 minutes at room temperature and the strip is washed again for 5 minutes in Tris buffer / saline.
Till 1 ml av lösning b) sättes 5 pl av 30-procentig väteperoxid.To 1 ml of solution b) is added 5 μl of 30% hydrogen peroxide.
En droppe av denna blandning anbrhups på\mrje fläck. En distinkt brun färgning uppträder efter 3 minuter vilket indikerar närva- ron av L1-proteiner i provet.A drop of this mixture is applied to each spot. A distinct brown staining occurs after 3 minutes, indicating the presence of L1 proteins in the sample.
Genom seriespädning av provet kan testet göras semi- kvantitativt.By serial dilution of the sample, the test can be performed semi-quantitatively.
Exempel 9: Testsystem för L1-proteiner genom enzym-immuno-assay Testsystemen innehåller: 1 mikrotiter-bricka med 5 x 10 brunnar framställda av plast- material, varvid den inre ytan av botten och det lägre partiet av brunnarna är belagd med specifika anti-L1-anti- kroppar; a) 1 flaska med Z ml av en buffertlösning innehållande speci- fika anti-L1-antikroppar konjugerade med rädisperoxidas; b) 1 flaska med 10 ml av en vattenhaltig lösning av trisbuf- fert/isotonisk saltlösning, pH 7,4, innehållande 1 mg/ml av diaminobensidin (DAB); c) 1 flaskaflßd 1 ml av en vattenhaltig buffertlösning av L1-prptein i en koncentration av S0 pg/ml.Example 9: Test system for L1 proteins by enzyme-immuno-assay The test systems contain: 1 microtiter tray with 5 x 10 wells made of plastic material, the inner surface of the bottom and the lower part of the wells being coated with specific anti- L1 antibodies; a) 1 vial of 2 ml of a buffer solution containing specific anti-L1 antibodies conjugated to radish peroxidase; b) 1 bottle with 10 ml of an aqueous solution of Tris buffer / isotonic saline, pH 7.4, containing 1 mg / ml of diaminobenzidine (DAB); c) 1 bottle fl ßd 1 ml of an aqueous buffer solution of L1-protein at a concentration of SO pg / ml.
Testförfarande: S0 pl av denna provlösníng eller av lös- ning c) sättes till brunnarna och inkuberas vid rumstemperatur under 1 timme. Brunnarna tvättades därefter med trísbuffert/salt- lösning innehållande 0,5 % bovinserumalbumin. Till varje brunn sattes 50 pl av lösning a) och inkuberades.under 1 timme vid rumstemperatur. Brunnarna tvättades enligt ovan. Till 1 ml av lösning b) sattes 5 pl av 30-procentig väteperoxid och S0 pl av denna blandning sattes till varje brunn. Brickan inkuberades under 30 minuter vid rumstemperatur och färgintensiteten bestäm- des för varje brunn fotometriskt.Test procedure: SO μl of this sample solution or of solution c) is added to the wells and incubated at room temperature for 1 hour. The wells were then washed with Tris buffer / saline containing 0.5% bovine serum albumin. To each well was added 50 μl of solution a) and incubated for 1 hour at room temperature. The wells were washed as above. To 1 ml of solution b) was added 5 μl of 30% hydrogen peroxide and SO μl of this mixture was added to each well. The tray was incubated for 30 minutes at room temperature and the color intensity was determined for each well photometrically.
Förklaringar till figurerna Pig. 1: Kromatografisk profil av 9 ml rått leukocytextrakt på en DEAE-Sephacel -kolonn, 1,5 cm x S cm. Den totala protein- halten bestämdes genom UV-ljusabsorbans vid 280 nm och L1-kon- centrationen genom en enkel radio-immunodíffusion.Explanations of the figures Pig. 1: Chromatographic profile of 9 ml crude leukocyte extract on a DEAE-Sephacel column, 1.5 cm x 5 cm. The total protein content was determined by UV light absorbance at 280 nm and the L1 concentration by a simple radioimmunodiffusion.
Fig. 2: Proteinband-mönster av rått granulocytextrakt (A), s mm caciz-frakz-.ionefi-(B) och 1zs mn Naci-fraktionen (c) vid agarosgel-elektrofores i barbitalbuffert, 75 mM, med 2,5 mM EDTA-K2, pH 8,5. Fraktion B innehåller de två rena L1-proteiner- na pl 6,3 och pI 6,5. 17 ' 500 219 Litteraturreferenser: (1) (2) (3) Magne K. Fagerhol, Inge.Dale och Terje Andersson, Scand. J. Haemancu. (1980) 24,' 393-398.Fig. 2: Protein band pattern of crude granulocyte extract (A), s mm caciz-fraction-.ionefi- (B) and 1zs mn Naci-fraction (c) by agarose gel electrophoresis in barbital buffer, 75 mM, with 2.5 mM EDTA-K2, pH 8.5. Fraction B contains the two pure L1 proteins pI 6.3 and pI 6.5. 17 '500 219 Literature references: (1) (2) (3) Magne K. Fagerhol, Inge.Dale and Terje Andersson, Scand. J. Haemancu. (1980) 24, '393-398.
Dale, T. Andersson, Bull. 1980, 16 (suppl) 273 281.Dale, T. Andersson, Bull. 1980, 16 (suppl) 273 281.
M.K. Fagerhol, I.M.K. Fagerhol, I.
Physiopath. resp. europ.Physiopath. resp. europ.
Karen E. Wíllard, Anne Karíne Thorsrud, Eimar Munthe och Egil Jellum, Clin. Chem., vol. 28, nr 4, 1067-1073 (1982).Karen E. Wíllard, Anne Karíne Thorsrud, Eimar Munthe and Egil Jellum, Clin. Chem., Vol. 28, No. 4, 1067-1073 (1982).
French. P.C. (1947) Thromb. Díath. 32, och Holm, R.A., Haemorrh. 432-440.French. P.C. (1947) Thromb. Diath. 32, and Holm, R.A., Haemorrh. 432-440.
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB838318754A GB8318754D0 (en) | 1983-07-11 | 1983-07-11 | Human proteins anti-sera test kits |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8403630D0 SE8403630D0 (en) | 1984-07-09 |
SE8403630L SE8403630L (en) | 1985-01-12 |
SE500219C2 true SE500219C2 (en) | 1994-05-09 |
Family
ID=10545560
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8403630A SE500219C2 (en) | 1983-07-11 | 1984-07-09 | Human granulocyte proteins |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4833074A (en) |
JP (2) | JPH0784479B2 (en) |
BE (1) | BE900119A (en) |
CH (1) | CH661048A5 (en) |
DE (1) | DE3425186C2 (en) |
DK (1) | DK169439B1 (en) |
FR (1) | FR2550205B1 (en) |
GB (2) | GB8318754D0 (en) |
IT (1) | IT1177889B (en) |
NL (1) | NL192456C (en) |
SE (1) | SE500219C2 (en) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0263072B1 (en) * | 1986-10-03 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel lymphokine related peptides |
JPH023698A (en) * | 1988-06-20 | 1990-01-09 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Monoclonal antibody against human lymphotoxin, hybridoma capable of producing the same antibody, method for purifying and measuring human lymphotoxin using the same antibody and measuring reagent |
US5211937A (en) * | 1990-07-30 | 1993-05-18 | Glycomed Incorporated | Method of determining a site of inflammation utilizing elam-1 ligands |
US5776348A (en) * | 1995-02-07 | 1998-07-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Mineral precipitation system and method for inhibiting mineral precipitate formation |
EP0937259B1 (en) | 1996-11-01 | 2004-10-06 | Magne K. Fagerhol | Process for the extraction of proteins |
ZA981370B (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-07 | Cerberus Developments Bv | Method and apparatus for continuous flow isoelectric focusing for purifying biological substances |
JP3614779B2 (en) * | 1998-07-22 | 2005-01-26 | サッポロホールディングス株式会社 | Antibody for detection of beer harmful lactic acid bacteria and its diagnostic use |
GB0229747D0 (en) * | 2002-12-20 | 2003-01-29 | Axis Shield Asa | Assay |
ATE411038T1 (en) | 2003-03-28 | 2008-10-15 | Univ Laval | S100 PROTEIN AS AN ACTIVATOR OF NEUTROPHIL CELLS TO REDUCE NEUTROPENIA IN CANCER TREATMENT |
US7659087B2 (en) * | 2004-07-23 | 2010-02-09 | Aspenbio Pharma, Inc. | Methods and devices for diagnosis of appendicitis |
ES2359822T3 (en) * | 2004-07-23 | 2011-05-27 | Aspenbio Pharma, Inc. | PROCEDURE AND DEVICES FOR THE APPENDICITIS DIAGNOSIS. |
WO2010062663A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Schering Corporation | Inflammatory bowel disease biomarkers and related methods of treatment |
CN103025757A (en) * | 2010-04-29 | 2013-04-03 | 巴克斯特国际有限公司 | Purification method for divalent cation binding proteins on anion exchange resin |
CA2998349A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Amgen Inc. | Prediction of clinical response to il23-antagonists using il23 pathway biomarkers |
KR20180096633A (en) | 2015-12-22 | 2018-08-29 | 암젠 인크 | CCL20 as a predictor of clinical response to IL23-antagonists |
CA3062435A1 (en) | 2017-05-09 | 2018-11-15 | Immundiagnostik Ag | Method for determination of members of the s100 family of calcium binding proteins by immunoturbidimetry |
-
1983
- 1983-07-11 GB GB838318754A patent/GB8318754D0/en active Pending
-
1984
- 1984-07-04 CH CH3229/84A patent/CH661048A5/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-06 GB GB08417338A patent/GB2143239B/en not_active Expired
- 1984-07-09 BE BE0/213302A patent/BE900119A/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-09 DE DE3425186A patent/DE3425186C2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-09 FR FR848410864A patent/FR2550205B1/en not_active Expired
- 1984-07-09 SE SE8403630A patent/SE500219C2/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-10 IT IT48540/84A patent/IT1177889B/en active
- 1984-07-10 DK DK338484A patent/DK169439B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-10 JP JP59141568A patent/JPH0784479B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-10 NL NL8402182A patent/NL192456C/en not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-11-02 US US07/117,429 patent/US4833074A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-21 JP JP6318730A patent/JP2558442B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2143239A (en) | 1985-02-06 |
NL8402182A (en) | 1985-02-01 |
GB2143239B (en) | 1987-11-11 |
NL192456B (en) | 1997-04-01 |
FR2550205A1 (en) | 1985-02-08 |
IT8448540A0 (en) | 1984-07-10 |
JPS6051113A (en) | 1985-03-22 |
JPH07278194A (en) | 1995-10-24 |
DK169439B1 (en) | 1994-10-31 |
DE3425186C2 (en) | 1995-04-20 |
JP2558442B2 (en) | 1996-11-27 |
SE8403630D0 (en) | 1984-07-09 |
US4833074A (en) | 1989-05-23 |
FR2550205B1 (en) | 1989-12-08 |
IT1177889B (en) | 1987-08-26 |
GB8417338D0 (en) | 1984-08-08 |
CH661048A5 (en) | 1987-06-30 |
GB8318754D0 (en) | 1983-08-10 |
NL192456C (en) | 1997-08-04 |
BE900119A (en) | 1985-01-09 |
DK338484D0 (en) | 1984-07-10 |
SE8403630L (en) | 1985-01-12 |
DK338484A (en) | 1985-01-12 |
DE3425186A1 (en) | 1985-01-24 |
JPH0784479B2 (en) | 1995-09-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Peterson et al. | Differentiation of glomerular, tubular, and normal proteinuria: determinations of urinary excretion of β 2-microglobulin, albumin, and total protein | |
US4468457A (en) | Method for producing a CSAp tryptic peptide and anti-CSAp antibodies | |
Lin et al. | Characterization of four human pregnancy-associated plasma proteins | |
zum Büschenfelde et al. | LM-Ag and LSP--two different target antigens involved in the immunopathogenesis of chronic active hepatitis? | |
Peterson | Demonstration in serum of two physiological forms of the human retinol binding protein | |
SE500219C2 (en) | Human granulocyte proteins | |
US4514506A (en) | Method for the identification and purification of human lung tumor-associated antigens (hLTAA) and clinical detection and determination of these antigens | |
Manni et al. | The eighth component of human complement (C8): isolation, characterization, and hemolytic efficiency | |
US4626355A (en) | Method of determining alcohol consumption | |
US4191533A (en) | Pregnancy-specific β1 -glycoprotein and process for isolating it | |
IE47092B1 (en) | New glycoprotein and process for isolating it | |
US4302385A (en) | Placenta-specific tissue protein PP10 | |
US4500451A (en) | New protein PP13 extracted from human placental tissues and use thereof | |
US4223002A (en) | Isolation of alpha1 -fetoprotein | |
US4592863A (en) | Protein PP20, a process for obtaining it, and its use | |
US4325866A (en) | Protein, PP11, a process for its preparation and its use | |
Myerowitz et al. | Isolation and characterization of mouse serum alpha 1-antitrypsins | |
Calvert et al. | Properties of two pig low density lipoproteins prepared by zonal ultracentrifugation | |
US3979507A (en) | Diagnostic system for organ abnormalities | |
US4195073A (en) | Radioimmunoassay of alpha 1 fetoprotein | |
Hanna et al. | Detection, separation and characterization of organ specific antigens of human thrombocytes | |
Veltri et al. | A human tumour-associated membrane antigen from squamous-cell carcinoma of the lung | |
SU1363564A1 (en) | Method of producing echinococcus diagnostic antigen for immune deficiency analysis | |
JP2752684B2 (en) | Hemolytic protein from the fruit body of Oyster mushroom | |
WIKLUND et al. | Further immunochemical studies of tissue polypeptide antigen (TPA) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |