DE69938553T2

DE69938553T2 - Verfahren zur herstellung von antikörpern gegen bierverderbende milchsäurebakterien und deren diagnostische verwendung

Info

Publication number: DE69938553T2
Application number: DE69938553T
Authority: DE
Inventors: Youichi Yaizu-shi TSUCHIYA
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2009-06-18
Anticipated expiration: 2019-07-17
Also published as: JP2002521650A; DK1100828T3; CN1309665A; US6395500B1; ES2302383T3; ATE392434T1; DE69938553D1; CA2333302A1; CN1246334C; EP1100828A1; EP1100828B1; WO2000005267A1; JP3614779B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die bierverderbende Milchsäurebakterien erkennen, die im Stande sind in Bier zu wachsen, ein Verfahren zum Nachweis der bierverderbenden Bakterien unter Verwendung der Antikörper und einen Kit zur Identifizierung von bierverderbenden Milchsäurebakterien.
Stand der Technik
Es gibt eine klarerkannte Gefahr, dass, sobald eine bestimmte Art von Milchsäurebakterium den Prozess der Bierproduktion kontaminiert hat, Trübung, schlechter Geschmack oder ähnliches, verursacht durch das Bakterium, die Qualität des erzeugten Bieres beeinträchtigen können. Zum Beispiel umfassen repräsentative bierverderbende Bakterien bestimmte Arten von Milchsäurebakterien, die zur Gattung Lactobacillus gehören, insbesondere jene, die zu Lactobacillus brevis und Lactobacillus lindneri gehören, sowie auch spezielle Arten von Milchsäurebakterium, das zur Gattung Pediococcus gehört. Es sind daher Versuche zum schnellen und hoch sensitiven Nachweis dieser bierverderbenden Milchsäurebakterien unternommen worden.
Speziell erwähnt wird ein Verfahren, in welchem das Bier, das analysiert werden soll, nachdem es mit einer Membran filtriert wurde, in einem geeigneten Medium gezüchtet wird und die gezüchteten Kolonien beobachtet werden. Da die bierverderbenden Bakterien, die im Bier bestehen, jedoch in winzigen Mengen vorhanden sind und ihr Wachstum im Medium langsam ist, gibt es Probleme mit der Sensitivität und der zeitintensiven Art ihres Nachweises unter Verwendung dieses Verfahrens.
Ein Verfahren für den Nachweis von bierverderbenden Milchsäurebakterien in Bier, welches die Antigen-Antikörperreaktion nützt, ist entwickelt worden. Zum Beispiel sind polyclonale Antikörper (Antiseren) gegen Milchsäurebakterien erzeugt worden. (Sharpe, M. E., J. Gen. Microbiol., 12, 107 (1955); Sharpe, M. E., Int. J. Syst. Bacteriol., 20, 509 (1970); Knox, M. W. et al., infect. Immun., 24, 12 (1979); Shimohashi, H. und Mutai, M., J. Gen. Microbiol., 103, 337 (1977); und japanische ungeprüfte Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer Hei 4-72570 ). Jetzt ist es durch Abgleichen verschiedener Bedingungen möglich geworden, Antiseren von einer solchen Qualität herzustellen, dass sowohl ihre Spezifität als auch ihre Sensitivität zu einem bestimmten Grad für die praktische Verwendung akzeptabel sind. Weitere Verbesserungen bleiben in den folgenden Aspekten unter anderem jedoch wünschenswert: der Antikörpertiter oder die Spezifität eines Antiserums ändert sich unweigerlich mit der Charge; Antiserum gegen eine bestimmte Art von Milchsäurebakterium wird auch positiv gegen nicht bierverderbende Bakterien; und manche Antiseren benötigen NaOH-Behandlung.
Aus diesen Gründen sind Nachweismethoden vorgeschlagen worden, die monoclonale Antikörper einsetzen ( japanische ungeprüfte Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer Hei 6-46881 und japanische ungeprüfte Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer Hei 6-105698 ). Gemäß der Beschreibung der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 6-46881 werden monoclonale Antikörper unter Verwendung des Antigens hergestellt, Lactobacillus brevis, Lactobacillus collinoides und Lactobacillus suebicus, die zur Gruppe 3 der Gattung Lactobacillus gehören und die in Medien gezüchtet werden; und diese monoclonalen Antikörper werden verwendet, um Gruppe 3 der Gattung Lactobacillus in Bier nachzuweisen.
Die Milchsäurebakterien, von denen sich herausstellen wird, dass sie in der Bierproduktion wachsen, sind jedoch nur ein Teil von jenen, die zur Gruppe 3 der Gattung Lactobacillus gehören. Das in der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 6-46881 beschriebene Verfahren hat ein Problem, dass andere, nicht bierverderbende Milchsäurebakterien auch nachgewiesen werden können, z. B. werden durch dieses Verfahren falsch positive Ergebnisse erhalten.
Gemäß der Beschreibung der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 6-105698 wird ein monoclonaler Antikörper unter Verwendung eines Antigens, Lactobacillus plantarum, hergestellt, der zur Gattung Lactobacillus gehört und in Medium gezüchtet wird; und dieser monoclonale Antikörper wird verwendet, um Lactobacillus und Lactobacillus coryniformis in Bier nachzuweisen. Dieser offenbarte Antikörper weist jedoch das gleiche Problem auf, dass er auch nicht bierverderbende Milchsäurebakterien (falsch positive) nachweist.
Aus diesem Grund wurde ein Verfahren vorgeschlagen, das nur bierverderbende Bakterien nachweist, die in Bier wachsen können (nachstehend als "bierverderbende Fähigkeit" bezeichnet. ( japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 10-104238 ). Gemäß dem Verfahren, wie es in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 10-104238 beschrieben wurde, wird mit Kaninchen ein Antiserum unter Verwendung eines Antigens, Lactobacillus brevis hergestellt, das unter anaeroben Bedingungen keine Glukoseassimilationsfähigkeit aufweist und in einem Medium gezüchtet wird; und das Antiserum wird verwendet, um den Lactobacillus brevis nachzuweisen, der die bierverderbende Fähigkeit besitzt. Von dem auf diese Weise hergestellten Antiserum wird angenommen, dass es spezifisch mit Lactobacillus brevis und Pediococcus damnosus reagiert, beide besitzen die Bierverderbende Fähigkeit.
Trotzdem müssen, um nicht-spezifische Antikörper von dem Antiserum zu entfernen, die mit Lactobacillus brevis reagieren (d. h. nicht-spezifische Antikörper, die mit nicht bierverderbenden Milchsäurebakterien reagieren), die mit Alkali behandelten Zellen von nicht bierverderbenden Lactobacillus brevis gemäß dem Verfahren, das in der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 10-104238 beschrieben wurde verwendet werden, um eine Entfernung der nicht-spezifischen Antikörper durch Adsorption zu erreichen. Außerdem besteht ein Problem, dass abhängig von dem Lactobacillus brevis, der als ein Antigen verwendet wird, das daraus resultierende Antiserum anfällig für falsche Erkennung ist. Ferner ändert sich nun, da Antiserum verwendet wird, sein Antikörpertiter und die Spezifität unvermeidlich von Charge zu Charge.
Ein repräsentatives erwähntes bierverderbendes Milchsäurebakterium ist Lactobacillus lindneri; aber die Wirkung des Antiserums gegen ein solches Bakterium ist nicht in der Veröffentlichung der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Hei 10-104238 beschrieben.
Im Hinblick auf das Vorangegangene werden verbesserte Verfahren zum Nachweis von Bakterien die Bier verderben, in der Fermentationsindustrie benötigt.
Offenbarung der Erfindung
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung Reagenzien bereitzustellen, die im Stande sind ein Milchsäurebakterium nachzuweisen, das verderbend für die Qualität des Bieres ist.
Es ist ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum spezifischen, schnellen, bequemen und reproduzierbaren Nachweis von einem bierverderbenden Milchsäurebakterium bereitzustellen, das den Prozess der Biererzeugung kontaminiert und in dem erzeugten Bier wächst und das die Qualität des Bieres vermindert.
Es ist ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum effizienten und gründlichen Nachweis von bierverderbendem Milchsäurebakterium wie zum Beispiel Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri oder Pediococcus damnosus bereitzustellen.
Die Gegenstände der Erfindung und andere können mit einem Antikörper für den Nachweis eines bierverderbenden Milchsäurebakteriums erreicht werden, der durch Züchten eines Milchsäurebakteriums mit der bierverderbenden Aktivität in Bier und durch Immunisieren eines Säugers mit dem Bier erzeugt wird.
Die Gegenstände der Erfindung können auch mit einem monoclonalen Antikörper erzielt werden, der Reaktivität gegen ein Milchsäurebakterium aufweist, das Bierverderben zeigt und das keine Reaktivität gegen ein nicht bierverderbendes Milchsäurebakterium aufweist, wobei der Antikörper durch Züchten eines Milchsäurebakterium mit der bierverderbenden Fähigkeit in Bier und durch Immunisieren eines Säugers mit dem Bier hergestellt wird.
Die Gegenstände der Erfindung können mit dem Antikörper für den Nachweis eines bierverderbenden Milchsäurebakteriums sowie mit dem monoclonalen Antikörper, wie er vorstehend beschrieben wurde, erreicht werden, wobei das Milchsäurebakterium mit bierverderbender Fähigkeit ein Milchsäurebakterium ist, das die Glucoseassimilationsfähigkeit unter anaeroben Bedingungen aufweist.
Die Gegenstände der Erfindung können auch mit dem Antikörper für den Nachweis von einem bierverderbenden Milchsäurebakterium sowie mit dem monoclonalen Antikörper, wie er vorstehend beschrieben wurde, erzielt werden, wobei das Milchsäurebakterium mit der bierverderbenden Fähigkeit ein Milchsäurebakterium ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem bierverderbenden Lactobacillus brevis, dem bierverderbenden Lactobacillus lindneri und dem bierverderbenden Pediococcus damnosus.
Die Gegenstände der Erfindung können auch durch ein Verfahren für den Nachweis von bierverderbenden Milchsäurebakterien mit bierverderbender Fähigkeit wie zum Beispiel Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri, und Pediococcus damnosus unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Antikörpers erzielt werden.
Durch das Ausführen des Verfahrens zur Herstellung einer Hybridom-Zelllinie gemäß der vorliegenden Erfindung kann die folgende Hybridom-Zelllinie erhalten werden: BLb2F37 (FERM BP-6744), BG3A5b4 (FERM BP-6745) oder PQ3H8a9 (FERM BP-6746), die den monoclonalen Antikörper produziert, der mit einem bierverderbenden Milchsäurebakterium spezifisch reagiert.
Die Gegenstände der Erfindung können auch mit einem Verfahren für den Nachweis eines bierverderbenden Milchsäurebakteriums mit einer bierverderbenden Aktivität wie zum Beispiel Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri und Pediococcus damnosus unter Verwendung einer Kombination von monoclonalen Antikörpern erreicht werden, die durch die Hybridome produziert werden.
Die Gegenstände der Erfindung können auch mit Verfahren zur Antikörpererzeugung und Hybridomen erreicht werden, die vorstehend beschrieben wurden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung und der vielen, sie begleitenden Vorteile wird leicht erreicht werden können, wenn sie durch Bezugnahme auf die folgende genaue Beschreibung besser verständlich wird und gemeinsam mit der begleitenden Abbildung in Betracht gezogen wird, wobei:
1 ein Photo ist, das die Ergebnisse zeigt, die in Beispiel 3 erhalten wurden, d. h. die rasche Identifizierung unter Verwendung dieser drei Arten von Antikörpern.
Beste Weise die Erfindung durchzuführen
Bierverderbende Milchsäurebakterien
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "ein bierverderbendes Milchsäurebakterium (oder bierverderbende Milchsäurebakterien) auf ein Bakterium, das im Stande ist in Bier zu wachsen und das aufgrund seines Wachstums darin Trübung in dem Bier verursacht.
Die Begriffe reagieren, reagieren mit, binden usw., die hierin unter Bezugnahme auf die Interaktion zwischen dem erfinderischen Antikörper und dem Milchsäurebakterium verwendet werden, beziehen sich auf die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Bakterium, d. h. eine Antikörper-Antigenreaktion. Die Bildung von solchen Komplexen oder das Fehlen solcher steht in Bezug zu analytisch relevanten Bedingungen, die in der Biererzeugung verwendet werden, wie zum Beispiel in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei 25°C (siehe die nachstehenden Beispiele).
Vertreter der bierverderbenden Milchsäurebakterien umfassen zum Beispiel Bakterien, die als Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri oder Pediococcus damnosus klassifiziert werden (siehe Back, W. et al., Brauewelt, 31/32, 1358 (1988); aber nicht alle diese Bakterien verderben Bier.
Die Milchsäurebakterien, die in dieser Erfindung als Antigene verwendet werden, sind jene, die bierverderbende Fähigkeit aufweisen, wie zum Beispiel Milchsäurebakterien, die zur Gattung Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri oder zu Pediococcus damnosus gehören.
Diese bierverderbenden Milchsäurebakterien können durch Hinzufügen einer Probe, die aus der Umwelt stammt, zu Bier und zuvor direkt oder nachdem Milchsäurebakterien durch die Verwendung von einem Auswahlmedium für Milchsäurebakterien gezüchtet wurden, und durch Auswählen jener, die Trübung verursachen, erhalten werden.
Subkultivierung und Konservierung von bierverderbenden Milchsäurebakterien werden in folgender Weise durchgeführt: die Bakterien werden in Bier gezüchtet, bei 4°C konserviert und alle paar Monate wird eine Subkultur hergestellt; oder alternativ wird Glycerin hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 20% zu ergeben, und die Bakterien werden bei –70°C konserviert.
Die Bestimmung der Bierverderbung kann in der folgenden Weise durchgeführt werden: etwa 10⁷ Bakterien werden zu einer kleinen Flasche (334 ml) hinzugefügt, die ein im Handel erhältliches Bier – 100% Malz, pH-Wert etwa 4,4 und eine Bitterstoffeinheit von etwa 28 –; die Flasche wird verschlossen und bei 25°C für zwei Monate gelagert und dann wird eine visuelle Inspektion wird durchgeführt, um zu beurteilen, ob Trübung im Bier produziert wurde oder nicht.
Monoclonale Antikörper
Gemäß gut bekannten Verfahren wurden Mäuse mit den bierverderbenden Milchsäurebakterien immunisiert, die, wie vorstehend beschrieben, ausgewählt wurden. Anschließend wurden Hybridome erzeugt und die Hybridomclone, welche die gewünschten Antikörper erzeugten, wurden etabliert. Die Verfahren zur Erzeugung von monoclonalen Antikörpern und Hybridomen sind in Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1–3, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley und Söhne, 1998 beschrieben.
1. Erzeugung von Antigen und Immunisierung
Genau gesagt wird das bierverderbende Milchsäurebakterium, das in Bier gezüchtet wurde, geerntet. Nach dem Waschen mit physiologischer Salzlösung werden die bakteriellen Zellen in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert und verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Zusätzliche Immunisierungen werden mehrere Male zu geeigneten Intervallen durchgeführt und eine endgültige Immunisierung wird durchgeführt, wenn der Antikörpertiter im Blut steigt.
2. Zellfusion
Die Milz einer immunisierten Maus wird drei Tage nach der endgültigen Immunisierung extrahiert. Die Milzzellen werden mit Myelomazellen in der Anwesenheit von einem geeigneten Zellfusionsmittel fusioniert. Die fusionierten Zellen werden auf einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen inokuliert und die Züchtung wird in einem geeigneten Selektionsmedium, z. B. HAT-Medium, durchgeführt.
3. Durchmusterung und Clonierung
Gemäß einem Verfahren wie zum Beispiel einem ELISA wird ein Hybridom ausgewählt, das den gewünschten Antikörper erzeugen wird, und eine Durchmusterung wird durchgeführt.
Die Clonierung wird unter Verwendung eines Verfahrens wie zum Beispiel einer limitierenden Verdünnung bei dem Hybridom durchgeführt, das den gewünschten Antikörper erzeugt, und ein Hybridomclon wird etabliert.
4. Erzeugung eines monoclonalen Antikörpers in großer Menge
Nachdem der Hybridomclon, der den Antikörper erzeugt, in Medium gezüchtet wurde, werden die Zellen gewonnen und dann intraperitoneal in eine Maus inokuliert, die mit Pristan vor der Verwendung stimuliert wurde. Ascites, der den Antikörper enthält, wird vom Intraperitoneum gesammelt. Anschließend wird ein monoclonaler Antikörper aus dem Ascites unter Verwendung der Ammoniumsulfatausfällung oder einer Affinitätssäule gereinigt, z. B. Protein A- oder Protein G-Säule. Alternativ, nachdem der Hybridomclon in Medium großtechnisch gezüchtet wurde, wird der monoclonale Antikörper aus der Kultur gemäß einem Verfahren unter Verwendung der Ammoniumsulfatausfällung, einer Ionenaustauschsäule oder ähnlichem gereinigt.
Die auf diese Weise erhaltenen monoclonalen Antikörper haben die folgenden Eigenschaften: sie zeigen Reaktivität gegen Milchsäurebakterien, die bierverderbende Fähigkeit aufweisen; und zeigen keine Reaktivität gegen nicht bierverderbende Milchsäurebakterien.
5. Nachweis von bierverderbenden Milchsäurebakterien
Beispielhafte Verfahren zum Nachweis von bierverderbenden Milchsäurebakterien umfassen ELISA (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 2039 (1995), ein Verfahren, das auf der Antigen-Antikörperreaktion von Bakterien beruht, die auf Membranen gefangen sind ( japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer Hei 6-46881 ) und ähnliche.
Genau gesagt wird ein produziertes Bier mit einem Membranfilter filtriert, um die Bakterien im Bier zu fangen. Anschließend, nach dem Waschen der Membran mit einem geeigneten Puffer wie zum Beispiel Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), wird den Bakterien ermöglicht, mit den monoclonalen Antikörpern, die, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurden, zu reagieren und die Membran wird mit PBS gewaschen. Dann werden die auf der Membran verbleibenden monoclonalen Antikörper unter Verwendung eines anti-Maus-Antikörpers, der mit Peroxidase konjugiert ist, nachgewiesen, der den Nachweis von bierverderbenden Milchsäurebakterien ermöglichen wird.
Ferner, wenn die in dieser Erfindung erhaltenen Antikörper direkt markiert werden (z. B. mit Enzymen, fluoreszierenden Farbstoffen oder Radioisotopen), wird der direkte Nachweis von bierverderbenden Milchsäurebakterien möglich, ohne dass sekundäre Antikörper benötigt werden; und die Nachweissensitivität kann auch verstärkt werden.
6. Schnelles Identifizierungsverfahren und schneller Identifizierungskit
Das Verfahren gemäß dieser Erfindung, das hohe Spezifität hat und eine schnelle Identifizierung ermöglicht, wird mindestens mit den folgenden Komponenten bereitgestellt: (1) einem Zentrifugationsröhrchen, ausgestattet mit einem Filter zum Fangen von Bakterien; (2) den drei Arten von monoclonalen Antikörpern gegen bierverderbende Milchsäurebakterien, wie sie gemäß der Erfindung erhalten werden; (3) sekundären Antikörper oder Antikörper-ähnlichen Substanzen gegen die vorher erwähnten monoclonalen Antikörper, wobei beide mit Enzymen markiert wurden; und (4) einem Substrat, das mit einem markierenden Enzymen der sekundären Antikörper oder der Antikörper-ähnlichen Substanzen reagiert und sie färbt. Die Milchsäurebakterien, die als positive Kontrollen verwendet werden, können darüber hinaus vorzugsweise enthalten sein.
Das rasche Identifikationsverfahren, das Verfahren zum Nachweis und der rasche Identifikationskit gemäß der Erfindung werden nachstehend genau erklärt werden.
Der rasche Identifikationskit für bierverderbende Milchsäurebakterien gemäß der Erfindung beruht auf dem Fangen der Bakterien durch die Verwendung eines Zentrifugationsröhrchen, das mit einem Filter ausgestattet ist, und der Entfernung der nicht umgesetzten Antikörper in Kombination mit einem Enzym-Immunassay; er beurteilt die Vorhersage von bierverderbender Fähigkeit betreffend ein Testbakterium durch die Stärke seines Farbtons. In dem vorliegenden Verfahren werden eine bakterielle Suspension und Enzym-markierte Antikörper (z. B. monoclonale Antikörper und Enzym-markierte sekundäre Antikörper oder monoclonale Antikörper die direkt mit Enzymen markiert sind) zu dem Zentrifugationsröhrchen mit einem Filter hinzugefügt und einer Zentrifugation unterzogen. Wenn der Antikörper mit dem Testbakterium reagiert, bleibt er gemeinsam mit dem markierenden Enzym auf dem Filter; wohingegen wenn der Antikörper nicht reagiert, das markierende Enzym gemeinsam mit dem Filtrat unter dem Filter entfernt wird. Wenn daher eine Enzym-Substratlösung hinzugefügt wird, findet die Färbung nur dort statt, wo der Antikörper mit dem Testbakterium reagiert. Das ermöglicht es, dass die Vorhersage der bierverderbenden Aktivität des Testbakteriums mit Leichtigkeit gemacht wird. Außerdem ist die Spezifität hoch, da das wesentliche Prinzip das gleiche ist wie die der direkt fluoreszierenden Antikörpertechnik.
Es ist notwendig, dass der Filter zur Verwendung in dem Zentrifugationsröhrchen mit einem Filter einen Porendurchmesser aufweist, der ausreichend groß ist, um die Milchsäurebakterien, die der Gegenstand der Messung sind, zu fangen, und der die Entfernung von nicht umgesetzten Antikörpern ermöglicht. Das kann leicht durch einen Fachmann ausgewählt werden. Zum Beispiel kann ein Filter eingesetzt werden, der einen Porendurchmesser in der Größenordnung von 0,2–0,45 μm aufweist und von einem solchen Material ist, das die Adsorption des Proteins minimiert, z. B. kann Polyvinylidenfluorid (PVDF) eingesetzt werden; vorzugsweise wird er nach dem Blockieren mit Casein, Rinderserumalbumin oder ähnlichem verwendet.
Das Testbakterium wird in physiologischer Salzlösung oder einem Puffer suspendiert, der für die Antigen-Antikörperreaktion geeignet ist; und dann werden die monoclonalen Antikörper und die Enzym-markierten sekundären Antikörper oder die monoclonalen Antikörper, die direkt mit Enzymen markiert sind, hinzugefügt.
Nachdem ihnen erlaubt wurde, mit dem Testbakterium zu reagieren, werden die nicht umgesetzten monoclonalen und Enzym-markierten sekundären Antikörper oder die nicht umgesetzten monoclonalen Antikörper, die direkt mit Enzymen markiert sind, durch Zentrifugation entfernt.
Darüber hinaus wird zu den Antikörpern eine Waschlösung einer solchen Art und Konzentration hinzugefügt, welche die Reaktion nicht hemmt, z. B., 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), der 0,05% Tween 20 enthält. Danach wird das Waschen und Entfernen der Waschlösung durch Zentrifugation durchgeführt. Gemäß dieser Erfindung ist es möglich, durch den Einsatz des Zentrifugationsröhrchen mit einem Filter (oder einer Filtereinheit) Waschen und Entfernen der Waschlösung gleichzeitig durchzuführen, und es ist auch möglich geworden, die Waschung vollständig mit großer Effizienz ohne dem Risiko durchzuführen, dass die Testbakterien weggewaschen werden.
Es wird bevorzugt, dass das Färbesubstrat eine maximale Absorptionswellenlänge in einer sichtbaren Region aufweist, hoch sensitiv ist und leicht zu unterscheiden ist und über die Zeit eine hohe Stabilität aufweist. Um solche Erfordernisse zu erfüllen, werden färbende Substrate des Peroxidasetyps bevorzugt. Zum Beispiel können Tetramethylbendizin (TMBZ) und Orthophenylendiamin (OPD) verwendet werden.
Der Kit gemäß dieser Erfindung soll verwendet werden, um bierverderbende Milchsäurebakterien zu identifizieren. Ein spezifisches Beispiel einer Serie von Manipulationen gemäß dieser Ausführungsform wird im Folgenden illustriert:

1. Eine physiologische Salzlösung, 100 μl, und eine bierverderbende Milchsäure-Bakteriensuspension, – suspendiert in physiologischer Salzlösung, sterilisiert durch Hitzebehandlung und seine Absorption bei 660 nm auf 0,3 – eingestellt, 100 μl, die als eine positive Kontrolle verwendet werden, werden jeweils auf eine Agglutinationsschale gegeben.
2. Eine Platinschlaufe des Testbakteriums wird in der physiologischen Salzlösung suspendiert: seine Konzentration wird eingestellt, um fast die gleiche Menge wie die der bierverderbenden Milchsäurebakteriensuspension aufzuweisen.
3. Jeweils 25 μl der jeweiligen Bakteriensuspension wird zu drei Filtereinheiten hinzugefügt: drei Filtereinheiten werden für ein Bakterium verwendet und als Nummern I–III bezeichnet.
4. Eine Antikörperlösung, 50 μl, wird zu den jeweiligen Filtereinheiten hinzugefügt: die Antikörperlösung wird durch Verdünnen mit PBS erhalten, ein monoclonaler Antikörper und ein enzymmarkierter sekundärer Antikörper, ein monoclonaler Antikörper, der direkt mit einem Enzym markiert ist, oder ähnliches, um eine geeignete Konzentration zu ergeben; und zu I wird eine Lösung von BLb2F37 zur Verwendung als der monoclonale Antikörper hinzugefügt, zu II wird ein Lösung von BG3A5b4 zur Verwendung hinzugefügt und zu III wird ein Lösung von PQ3H8a9 zur Verwendung hinzugefügt.
5. Nach dem Schütteln wird den Filtereinheiten gestattet, bei Raumtemperatur für 15 Minuten zu stehen.
6. Die Einheiten werden bei 2000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert.
7. Zu den Einheiten werden 350 μl an Waschlösung hinzugefügt.
8. Die Einheiten werden bei 2000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert.
9. Zu den Einheiten werden 50 μl einer Substratlösung hinzugefügt.
10. Nach dem Schütteln wird den Filtereinheiten erlaubt, bei Raumtemperatur für 5 Minuten zu stehen.
11. Zu den Einheiten werden 50 μl einer Abschrecklösung hinzugefügt.
12. Nach dem Schütteln wird zuerst sichergestellt, dass die Filtereinheiten, zu welchen die positive Kontrolle hinzugefügt worden ist, ausreichende Färbung zeigt.
13. Als Nächstes wird die Art der Färbung mit Hinblick auf die drei Filtereinheiten, zu welchen das Testbakterium hinzugefügt worden ist, mit der folgenden Tabelle verglichen und eine Beurteilung wird dann durchgeführt.

Bewertungstabelle

("+": starke Färbung, "–": keine Färbung oder schwache Färbung)

Antikörper-Lösung	Bewertungsergebnis
I	II	III
–	–	–	nicht bierverderbendes Bakterium
+	–	–	bierverderbender L. brevis oder P. damnosus
–	+	–	bierverderbender L. lindneri
–	–	+	bierverderbender P. damnosus
+	–	+	bierverderbender L. brevis oder P. damnosus

Wenn irgendeinem bierverderbenden Milchsäurebakterium erlaubt wird, jeweils mit den drei monoclonalen Antikörpern zu reagieren, reagiert es mit einem oder zwei monoclonalen Antikörpern und gleichzeitig reagiert es nicht mit mindestens einem monoclonalen Antikörper. Andererseits reagiert ein nicht bierverderbendes Bakterium mit keinem der drei monoclonalen Antikörper. Das vorliegende Beurteilungsverfahren nützt das Vorangegangene: siehe den Abschnitt von Prüfungen für Antikörperspezifität in den Beispielen. Mit anderen Worten entwickelt jedes bierverderbende Bakterium, wenn die Konzentration der ursprünglich bereitgestellten bakteriellen Lösung nicht zu niedrig oder zu hoch ist, eine markant starke Farbe in mindestens einer oder zwei Filtereinheiten, wie verglichen mit der (den) verbleibenden Einheit(en), wenn es der Suspension ermöglicht wird, mit äquivalenten Mengen der drei Antikörper zu reagieren; wohingegen im Falle von nicht bierverderbenden Bakterien keiner der drei Farbe entwickelt oder eine schwache Färbung von ähnlichen Größenordungen in allen Dreien auftritt. Demgemäß braucht die Quantität eines Testbakteriums in diesem Verfahren nicht genau zu sein; und darüber hinaus, wenn das Bakterium dahingehend beurteilt worden ist, dass es bierverderbende Fähigkeit aufweist, ist die Identifikation der Art des Bakteriums, basierend auf der Filtereinheit, auf welcher sich Farbe entwickelt hat, auch möglich. Außerdem ist es möglich, da die Suspension von bierverderbenden Bakterien gleichzeitig vorbereitet wird und im Vergleich als die positive Kontrolle verwendet wird, zu bestimmen, ob die Antikörper inaktiviert worden sind, sowie auch zu bestimmen, ob das Manipulationsverfahren Fehler aufweist. Zur gleichen Zeit werden genauere Bewertungen ermöglicht.
Es passiert manchmal, dass bestimmte bierverderbende Bakterien ihre Reaktivität gegen Antikörper vermindern, wenn ihre Subkultur in Medium zu oft wiederholt wird, nachdem sie aus Bier isoliert worden sind. In solchen Fällen werden die Bakterien zum Beispiel zuerst in etwa 0,1% NaOH-Lösung suspendiert und es wird ihnen ermöglicht, bei Raumtemperatur für 10 Minuten zu stehen. Dann werden sie zu den Filtereinheiten hinzugefügt nachdem die NaOH-Lösung durch Zentrifugation entfernt wurde, sollen die Antikörperlösungen hinzugefügt werden. Auf diese Weise kann ausreichende Färbung erreicht werden.
Nachdem die Erfindung nun im Allgemeinen beschrieben wurde, kann durch Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele, die hierin nur zum Zweck der Veranschaulichung bereitgestellt werden und, falls nicht anders angegeben, nicht einschränkend gedacht sind, ein tieferes Verständnis erlangt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
(Erzeugung von monoclonalen Antikörpern, die für bierverderbende Milchsäurebakterien spezifisch sind)
(1) Erzeugung von Antigenen
Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri und Pediococcus damnosus, welche die bierverderbenden Milchsäurebakterien darstellen, die aus Bier isoliert wurden, wurden als Antigene verwendet. Diese Stämme wurden gemäß dem Klassifikationssystem identifiziert, wie es in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology beschrieben wird. Wie im Klassifikationssystem aufgezeigt, weist der verwendete Lactobacillus brevis unter anaeroben Bedingungen die Glucose-Assimilationsfähigkeit auf. Diese Stämme, die bei 4°C konserviert worden sind, wurden in frischem Bier inokuliert und bei 25°C gezüchtet, bis die Biere trüb wurden, und die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Dann wurden Teile der bakteriellen Lösungen in frischen Bieren subkultiviert und die frischen bakteriellen Zellen wurden zu jeder Immunisationszeit verwendet.
Nachdem die durch Zentrifugation geernteten Zellen mit physiologischer Salzlösung gewaschen wurden, wurden sie in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert und ihre Absorption bei 660 nm auf 0,5 zur Immunisierung eingestellt.
(2) Immunisierung von Mäusen
Weibliche BALB/C Mäuse (8 Wochen alt) wurden von Japan SLC gekauft. Sie wurden nach vorläufigem Füttern für 10 Tage immunisiert.
Für die Immunisierung wurden drei Arten von Bakteriensuspensionen, die wie vorstehend erzeugt wurden, intraperitoneal in die jeweiligen Mäuse inokuliert. Das Intervall der Injektionen war auf einmal pro Woche festgelegt und die Mengen an injizierter Suspension waren, vom Beginn an, 0,1, 0,5, 1,0, 1,0, und 1,0-sechsmal insgesamt: im Ganzen wurden 4,6 ml injiziert.
(3) Zellfusion
Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzen der Mäuse entfernt und die Milzzellen wurden in RPMI1640-Medium ohne fötales Rinderserum (FKS) Nissui Pharmaceutical Co. Ltd. gemäß Monoclonal Antibody Experimental Manual; Toyama, S; Yasuto, T., Hrsg.; Kodansha aufgetrennt. Als nächstes wurden die Zellen einer Zellfusion mit Myelomazellen (SP2/0; Ag14, Dainippon Pharmaceuticals Co. Ltd.) in der Anwesenheit von Polyethylenglycol (zur Verwendung in der Zellfusion, erhältlich von Boehringer Mannheim AG) unterzogen. Anschließend wurde das Hybridom in einem RPMI1640-Medium suspendiert, das 15% FKS und HAT (H-0262, erhältlich von Sigma Inc.) enthielt. Die Suspension wurde in einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Nr. 167008, erhältlich von Nunc Inc.) ausplattiert, bei 37°C in einem CO₂-Inkubator gezüchtet, und danach wurde das Medium in geeigneten Intervallen ausgetauscht. Sobald das Hybridom gezüchtet war, wurde der Antikörpertiter des Überstands durch ELISA, wie nachstehend beschrieben, gemessen und es wurde nach Antikörper-positiven Zellen durchmustert.
(4) Durchmusterung auf Antikörper
Zu jeder Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Nr. 168055, erhältlich von Nunc Inc.) wurden jeweils 50 μl einer 2,5% Glutaraldehydlösung hinzugefügt. Die Lösung wurde verworfen, nachdem ihr ermöglicht wurde, bei Raumtemperatur für 3 Stunden zu stehen.
Die Erzeugungen von bierverderbenden Milchsäurebakterien der drei Arten, die in Bier subkultiviert wurden, und eine Erzeugung des Lactobacillus casei AHU1057-Stammes (Kontrolle), der ein nicht bierverderbendes Milchsäurebakterium war, das in MRS-Medium subkultiviert wurde, wurden jeweils erzeugt, sodass ihre Absorption bei 660 nm 0,3 sein konnte: AHU: Laborstory of Culture Collection of Microorganisms, Faculty of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japan. Die jeweiligen Erzeugungen wurden zu jeder Vertiefung in 50 μl-Anteilen hinzugefügt. Nach der Zentrifugation bei 2.000 UpM für 5 Minuten wurde den Vertiefungen ermöglicht, bei 4°C bis zum nächsten Tag zu stehen. Dann wurde der Überstand entfernt und 100 μl an PBS, das 1% Gelatine enthielt, wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Nachdem ihnen erlaubt wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu stehen, wurde der Überstand verworfen und eine Testplatte, die mit Bakterien beschichtet wurde, wurde erzeugt.
50 μl des Kulturüberstands aus der Zellfusion, wie vorstehend erzeugt, wurden zu jeder Vertiefung der Testplatte hinzugefügt. Ferner wurden zu jeder Vertiefung 25 μl eines im Handel erhältlichen Peroxidase-konjugierten anti-Maus-IgG + M-Antikörpers (Wako Pure Chemicals) hinzugefügt, der mit PBS 250-fach verdünnt war, das 0,1% Gelatine enthielt. Nachdem ihm gestattet wurde, dass er bei Raumtemperatur für eine Stunde steht, wurde der Überstand verworfen. Dann wurde jede Vertiefung zweimal mit 100 μl eines Trispuffers gewaschen (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0), der 0,05% Tween 20 enthielt. Anschließend wurden 50 μl einer Substratlösung (0,25 M Natriumcitratpuffer (pH-Wert 4,2), der 1 mg/ml o-Phenylendiamin-Dihydrochloride enthielt) zu jeder der Vertiefungen hinzugefügt. Nachdem gestattet wurde, dass sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten stand, wurden 50 μl einer Abschrecklösung (10 mM NaN₃) zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. "A492–A630" (Werte, die durch Subtraktion der Absorption bei 630 nm von der bei 492 nm erhalten wurden) wurden gemessen. Wenn die Vertiefung, die mit einem bierverderbenden Milchsäurebakterium beschichtet war, eine höhere Absorption hatte als die Vertiefung, die mit Lactobacillus casei (der Kontrolle) beschichtet war, wurde bestimmt, dass sie positiv war.
(5) Clonierung
Die Clonierung wurde, gemäß der limitierenden Verdünnung, auf den Hybridomen durchgeführt, die Positivität gezeigt haben. Auf diese Weise wurden aus den Hybridomen, die Lactobacillus brevis als das Antigen verwendet hatten, vier Hybridome, die monoclonale Antikörper produzierten, erhalten. Unter ihnen war ein Stamm, der als "BLb2F37" bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry am 8. Juli 1998 (Zugangsnummer FERM P-16884) hinterlegt worden war. Der Stamm wurde ferner zur "internationalen Hinterlegung" beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1–3, Higahshi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), einer internationalen Hinterlegungsbehörde, am 4. Juni 1999 gemacht (Internationale Zugangsnummer FERM BP-6744). Auch die zwei monoclonalen antikörperproduzierenden Hybridome wurden aus den Hybridomen erhalten, welche Lactobacillus lindneri als Antigen nutzten. Unter ihnen wurde ein Stamm als "BG3A5b4" bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry am 8. Juli 1998 (Zugangsnummer FERM P-16885) hinterlegt. Der Stamm wurde ferner am 4. Juni 1999 zur "internationalen Hinterlegung" beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1–3, Higahshi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), einer internationalen Hinterlegungsbehörde, gemacht (Internationale Zugangsnummer FERM BP-6745). Außerdem wurden zwei monoclonale antikörperproduzierende Hybridome aus den Hybridomen erhalten, welche Pediococcus damnosus als das Antigen enthielten. Unter ihnen wurde ein Stamm als "PQ3H8a9" bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry am 8. Juli 1998 (Zugangsnummer FERM P-16886) hinterlegt. Der Stamm wurde ferner am 4. Juni 1999 zur "internationalen Hinterlegung" beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1–3, Higahshi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), einer internationalen Hinterlegungsbehörde, gemacht (Internationale Zugangsnummer FERM BP-6746).
(6) Erzeugung von monoclonalen Antikörpern
Die Hybridome sind gezüchtet worden, bis ungefähr 80% der Gesamtzellen verkümmert waren und schwarz aussahen, und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt. Zu diesen wurde langsam gesättigtes Ammoniumsulfat bei 4°C in Mengen hinzugefügt, die äquivalent zum Kulturüberstand waren. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände verworfen. Danach wurden die Ausfällungen wieder in PBS aufgelöst, die aufgelösten Lösungen wurden gegen PBS bei 4°C über Nacht dialysiert, um monoclonale Antikörper zu erzeugen.
(7) Test für Antikörperspezifität
Die Spezifität der monoclonalen Antikörper, die vorstehend erhalten wurden (Antikörper BLb2F37, BG3A5b4 und PQ3H8a9) wurde gegen die folgenden Stämme untersucht, die bei Bierbrauereien und Forschungslaboren isoliert wurden: 44 Stämme, die bierverderbende Wirkung zeigten, und 18 Stämme, die keine bierverderbende Wirkung zeigten, beide gehören zu Lactobacillus brevis; sieben Stämme zeigen Bierverderben und gehören zu Lactobacillus lindneri; drei Stämme zeigen Bierverderben und ein Stamm zeigt kein Bierverderben, beide gehören zu Pediococcus damnosus; und 47 Stämme von anderen Milchsäurebakterien zeigen kein Bierverderben, einschließlich Lactobacillus casei, Lactobacillus parvus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefir, Pediococcus pentosaceus, und Pediococcus dextrinicus.
Die jeweiligen Stämme wurden gezüchtet und die Zellen wurden geerntet; sie wurden verwendet, um die Reaktivität gegen jeden Stamm zu überprüfen, ähnlich wie bei dem Verfahren, beschrieben in (4). Die bierverderbenden Stämme werden hier in Bier gezüchtet und die nicht bierverderbenden Stämme werden in MRS-Medium gezüchtet. Als Kontrolle wurde der Stamm von Lactobacillus casei AHU1057 verwendet, der kein Bierverderben zeigte. Die Absorption im Falle von AHU1057 wurde als ein Leerwert angesehen und jene, die einen Wert von 0,08 oder mehr zeigten, wurden als "reaktiv" bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Wie aus Tabelle 1 offensichtlich ist, zeigte der BLb2F37-Antikörper Reaktivität gegen alle bierverderbenden Lactobacillus brevis und die Mehrheit von Pediococcus damnosus, aber zeigte keine Reaktivität gegen nicht bierverderbende Lactobacillus brevis und andere nicht bierverderbende Milchsäurebakterien, einschließlich Pediococcus damnosus. Der BG3A5b4-Antikörper zeigte Reaktivität gegen alle bierverderbenden Lactobacillus lindneri, aber zeigte keine Reaktivität gegen die nicht bierverderbenden Bakterien. Der PQ3H8a9-Antikörper zeigte Reaktivität gegen alle bierverderbenden Pediococcus damnosus und eine Mehrheit der bierverderbenden Lactobacillus brevis, zeigte aber keine Reaktivität gegen die nicht bierverderbenden Milchsäurebakterien außer dem einen Stamm des nicht bierverderbenden Pediococcus damnosus.
Aus den Ergebnissen ist klar geworden, dass die vorstehend beschriebenen Antikörper verwendet werden können, um bierverderbende Milchsäurebakterien spezifisch nachzuweisen, und zwar ohne mit nicht bierverderbenden Milchsäurebakterien zu reagieren. Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass, wenn die drei Arten von Antikörpern zur Verwendung kombiniert werden, alle bierverderbenden Milchsäurebakterien spezifisch nachgewiesen werden können.
Beispiel 2
[Klassifizierungstest der erhaltenen monoclonalen Antikörper]
Ein im Handel erhältlicher Kit (Maus Monoclonal Antibody Isotyping Kit, erhältlich von Amersham Inc.) wurde verwendet, um die Arten von Klasse und Unterklasse und L-Kette in Bezug auf die drei Antikörper zu untersuchen, die in Beispiel 1 erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Antikörper Klasse, Unterklasse L-Kette (Art)

BLb2F37 IgG2b λ

BG3A5b4 IgG2 K

PQ3H8a9 IgG2b K
Beispiel 3
[Schnelles Identifizierungsverfahren und schneller Identifizierungskit]
Die drei Arten von monoclonalen Antikörpern zur Verwendung, die die bierverderbende Milchsäurebakterien erkannten, wurden durch das Verfahren, wie es vorstehend erklärt ist, erhalten.
(1) Erzeugung von einem Zentrifugenröhrchen, ausgestattet mit einem Filter (Blockierung schon durchgeführt)
Zu einem Zentrifugenröhrchen mit einem Filter (SUPREC^TM-01, erhältlich von Takara Shuzo Co. Ltd.) wurden 100 μl von 1% Casein (in PBS) hinzugefügt. Nachdem gestattet wurde, dass es für 1 Stunde bei Raumtemperatur stand, wurde es bei 2000 UpM für 5 Minuten unter Verwendung einer Zentrifuge des Ausschwingtyps zentrifugiert, die einen Radius von 16,5 cm aufwies. Als nächstes wurde eine Waschlösung (10 mM Tris-HCl/pH-Wert 8,0/0,05% Tween 20), 200 μl hinzugefügt und die Zentrifugation wurde bei 2000 UpM für 10 Minuten durchgeführt. Das resultierte in einem Zentrifugationsröhrchen mit einem Filter (Blockierung schon durchgeführt), der bei 4°C gelagert wurde.
(2) Antikörperlösungen
Antikörper BLb2F37 (für Antikörperlösung I) Antikörper BG3A5b4 (für Antikörperlösung II) bzw. Antikörper PQ3H8a9 (für Antikörperlösung III) wurden verdünnt, um Hintergründe von ähnlicher Höhe zu ergeben. Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG + IgM (H + L) (erhältlich von Wako Pure Chemicals Co. Ltd.) wurde 50-fach verdünnt. Fünf Volumenteile des Vorherigen, 5 Volumenteile des Letzteren, 7 Volumenteile von 1% Casein (in PBS) und 33 Volumensteile von PBS wurden gemischt und in kleine Portionen geteilt, um bei –20°C eingefroren zu werden. Die jeweiligen Lösungen wurden als Antikörperlösungen I–III bezeichnet.
50 Mikroliter von jeder dieser Lösungen wurde pro Zentrifugationsröhrchen mit einem Filter verwendet.
(3) Waschlösung
350 Mikroliter von 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), enthaltend 0,05% Tween 20, wurde pro Filtereinheit verwendet.
(4) Färbungs- und Abschrecklösungen
Ein Färbekit für Peroxidase (OPD) (erhältlich von Sumitomo Bakelite Co. Ltd.) wurde verwendet. 50 Mikroliter eines Farbfixierungmittels (eine Tablette), aufgelöst in 5 ml einer Substratlösung, wurde pro Zentrifugationsröhrchen mit einem Filter verwendet. Die gleichen Mengen von Abschrecklösungen wurden verwendet. (5) Eine Plantinschlaufe der bierverderbenden Bakterien, die nach der Züchtung in Bier in NBB-Schrägkulturen gehalten wurden, oder eine Schlaufe der nicht bierverderbenden Bakterien, die in NBB-Schrägkulturen gehalten wurden, wurden in 100 μl physiologischer Salzlösung suspendiert und je 25 μl wurden zu den drei Filtereinheiten hinzugefügt, um jeweils eine Reaktion mit den Antikörperlösungen I–III zu ermöglichen. Waschen und Färben wurde durchgeführt. Infolgedessen wurde im Falle von nicht bierverderbenden Bakterien eine fast gleiche, schwache Färbung mit allen drei Filtereinheiten beobachtet; in Fällen der bierverderbenden Bakterien wurde eine erheblich stärkere Färbung bei einer oder zwei der Filtereinheiten im Vergleich zu der (den) verbleibenden Filtereinheit(en) beobachtet. Siehe 1.
Die erhaltenen Ergebnisse deuteten darauf hin, dass, wenn das vorlegende Verfahren eingesetzt wurde, die Mengen an Testbakterien nicht genau sein müssen, und dass, wenn das Bakterium als ein bierverderbendes Bakterium bewertet wird, die Identifikation seiner Art basierend darauf möglich wird, auf welchem Röhrchen (Antikörper) sich Farbe entwickelt.
Ferner, wenn ein solches schnelles Identifikationverfahren auf alle in der Tabelle 1 aufgelisteten Bakterien angewandt wurde, wurden Ergebnisse erhalten, welche den in Tabelle 1 gezeigten Antikörperreaktivitäten nicht widersprachen, obwohl das in den Figuren nicht gezeigt wird.
Noch weiter ist klar gezeigt worden, dass gemäß dem vorliegenden schnellen Identifikationsverfahren angemessene Beurteilungen der bakteriellen Mengen auf dem Niveau einer Platinschlaufe möglich sind.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung hat breite Anwendbarkeit. Die Antikörper dieser Erfindung zeigen Reaktivität gegen bierverderbende Milchsäurebakterien, zeigen aber keine Reaktivität gegen nicht bierverderbende Milchsäurebakterien; daher sind sie für den raschen, bequemen und hoch genauen Nachweis der bierverderbenden Milchsäurebakterien nützlich. Zusätzlich, da diese Antikörper der Erfindung monoclonale Antikörper sind und daher reproduzierbar hergestellt werden können, sind sie als Reagenzien für den Nachweis von bierverderbenden Bakterien nützlich. Ferner ist es durch Kombination der Antikörper der Erfindung möglich, Milchsäurebakterien aus allen möglichen Arten nachzuweisen, die als problematisch angesehen werden. Darüber hinaus setzen das schnelle Identifikationsverfahren und ein Kit gemäß der Erfindung ein im Handel erhältliches Zentrifugationsröhrchen ein, das mit einem Filter ausgestattet ist, und nützen den Vorteil der Spezifität der drei Antikörper des Erfindungsprozesses. Das ermöglicht bequeme und genaue Beurteilungen der bierverderbenden Fähigkeit in Bezug auf die Milchsäurebakterien, die aus herkömmlicher Züchtung mit Medien hervorgegangen sind.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, umfassend: (a) das Züchten eines Milchsäurebakteriums, das in Bier in der Lage ist, das Bier zu verderben, (b) das Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugetiers mit dem gezüchteten Milchsäurebakterium, und (c) das Isolieren des Antikörpers aus dem Säugetier.
Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzelllinie, umfassend: (a) das Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugetiers, das eine Milz hat, mit einem Milchsäurebakterium, das in Bier in der Lage ist, das Bier zu verderben, und (b) das Fusionieren von Milzzellen des Säugetiers mit Myelomzellen.