DE602004007112T2

DE602004007112T2 - Verfahren zum immunologischen testen der tartrat-resistenten säuren phosphatase 5b sowie dabei zu verwendender kit

Info

Publication number: DE602004007112T2
Application number: DE602004007112T
Authority: DE
Inventors: T. Nitto Boseki Co. Miura; T. Nitto Boseki Co. Ohashi; K. Nitto Boseki Co. Ltd. Biochemical Lab Sasagawa; K. Nitto Boseki Co. Ltd. Biochemical Lab Katayama
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 2003-02-25
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2024-02-21
Also published as: US20060154317A1; US7465556B2; ATE365323T1; JPWO2004077059A1; EP1598670B1; JP4483780B2; EP1598670A4; EP1598670A1; WO2004077059A1; DK1598670T3; DE602004007112D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für einen Immunoassay für die Trartrat-resistente saure Phosphataseaktivität, abstammend von Osteoclasten als Knochenresorptionsmarker und ein Kit, um darin verwendet zu werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein spezifischer Assay für die Tartrat-resistente saure Phosphataseaktivität, abstammend von Osteoclasten möglich und diese Aktivität ist als Knochenresorptionsmarker auf dem Gebiet medizinischer Behandlungen und klinischer Untersuchungen von Knochenerkrankungen sehr effektiv.
Stand der Technik
Ein großer Teil der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRACP) in Serum wird als saure Phosphatase angesehen, die von Osteoclasten abstammt und ein Assay auf TRACP wird als nützlich als Anzeiger für eine Bewertung der Funktion von Osteoclasten betrachtet. So gewinnt TRACP an Interesse als Knochenresorptionsmarker (Norio Fukunaga, Toshitaka Nakamura und Toshio Matsumoto, "Osseous Metabolism Marker", Medical Review Co., Ltd. 1995). Andererseits ist die saure Phosphatase im Serum in sechs Banden 0 bis 5 vom Ursprung durch Polyacrylamidgelelektrophorese unterteilt. Von diesen ist die saure Phosphatase, korrespondierend zur fünften Bande Tartrat-resistent und wird als Bande 5 Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRACP 5: Tartrat-resistente saure Phosphatase 5) bezeichnet. Diese saure Phosphatase wird weiter durch die Elektrophorese in 5a, mit einem höheren Gehalt an Sialinsäure, gebunden an eine Zuckerkette und 5b, fast ohne Sialinsäure gebunden an eine Zuckerkette, unterteilt. Zusätzlich ist 5a ein Enzym, abstammend von anderen Zellen als Osteoclasten und sein Blutniveau variiert nicht, während nur das Blutniveau von 5b mit der Knochenresorption variiert. Daher wird angenommen, daß 5b die Hauptsubstanz der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase, abstammend von Osteoclasten ist. Es wird auch in "Clinical Chemistry" (Clin. Chem. 47: 1497, 2001) empfohlen, daß ACP, abstammend von Osteoclasten als TRACP 5b abgekürzt werden sollte. Dementsprechend wird auch in der vorliegenden Beschreibung Phosphatase, die sich auf ACP, abstammend von Osteoclasten bezieht und als Anzeiger für die Knochenreduktion verwendet wird, in der Bezeichnung "TRACP 5b" ausgedrückt und die Tartrat-resistente saure Phosphatase, abstammend von Osteoclasten und die Tartratresistente saure Phosphatase 5b werden hier als synonym zueinander betrachtet. So werden hier alle in der Bezeichnung "TRACP 5b" in der vorliegenden Beschreibung ausgedrückt.
Konventionelle Aktivitätsassayverfahren, worin die TRACP-Aktivität als Anzeiger einer sauren Phosphatase untersucht wird, die die Aktivität von Osteoclasten anzeigen kann, sind im Hinblick auf ihre Spezifität, Empfindlichkeit, schwierige Durchführung des Assays und Assayzeit nachteilig.
Im allgemeinen wird in einem Assay für TRACP 5b durch das Aktivitätsassayverfahren die enzymatische Aktivität durch eine kolorimetrische Bestimmung eines Reaktionsprodukts (eines Alkohols oder Phenols) überprüft, erzeugt durch eine enzymatische Reaktion, wobei ein Phosphorsäureester als synthetisches Substrat in Gegenwart von Weinsäure verwendet wird. In diesem Fall inhibiert die Weinsäure die saure Phosphatase abstammend aus der Prostata und die restliche saure Phosphataseaktivität wird mit dem Substrat überprüft, um eine TRACP-Aktivität als TRACP 5b-Aktivität zu überprüfen. Neben der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase, die von Osteoclasten abstammt, ist jedoch auch diejenige, abstammend von Erythrozyten oder diejenige, abstammend von Blutplättchen in einer Probe vorhanden und eine solche saure Phosphatase wird ebenfalls überprüft. Daher ist das obige TRACP 5b-Assayverfahren im Hinblick auf seine Spezifität nachteilig.
Als Modifikation eines solchen Verfahrens ist ein Verfahren bekannt, worin nach einer Vorbehandlung, umfassend eine Inkubation einer 5-fachen Verdünnung von Serum bei 37°C für 1 Stunde die restliche TRACP-Aktivität durch Verwendung von p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat in Gegenwart von Weinsäure untersucht wird ("Nichidai-Ishi", 49:904–911, 1990; und Clin. Chem. 33:458–462, 1987). Dieses Verfahren ermöglicht das Vermeiden des Einflusses der von Erythrozyten abstammenden sauren Phosphatase, ermöglicht jedoch nicht den Ausschluß eines Einflusses von saurer Phosphatase, abstammend von Blutplättchen. Zusätzlich haben die vorliegenden Erfinder über ein TRACP 5b-Assayverfahren als spezifischeres Aktivitätsassayverfahren ( JP-A-10-37198 ) berichtet, wobei ein Unterschied in der Empfindlichkeit gegenüber Fluor zwischen TRACP 5b und der Tartrat-resistenten sauren Phosphataseaktivität, abstammend von Erythrozyten oder Blutplättchen verwendet wird. Dieses Verfahren ermöglicht jedoch nicht den Ausschluß des Einflusses von TRACP 5a, obwohl es ein Vermeiden des Einflusses einer Tartratresistenten sauren Phosphatase, die von Erythrozyten oder Blutplättchen abstammt ermöglicht. Weiterhin ist dieses Verfahren im Hinblick auf eine Genauigkeit nachteilig, da die TRACP 5b-Aktivität bei diesem Verfahren durch Subtraktion der Aktivität, die in Gegenwart von Fluor nicht inhibiert wird, von der gesamten Tartrat-resistenten sauren Phosphataseaktivität überprüft wird. Zusätzlich wurde über ein Verfahren berichtet, worin die TRACP 5b-Aktivität unter Verwendung eines Inhibitors für TRACP 5a in Kombination mit dem oben erwähnten Verfahren unter Verwendung von Fluor ( JP-A-2001-231595 ) überprüft wird. Da die TRACP 5b-Aktivität jedoch durch Subtraktion auch bei diesem Verfahren überprüft wird, ist dieses Verfahren im Hinblick auf seine Genauigkeit wie auch das Verfahren unter Verwendung von nur Fluor nachteilig, obwohl es spezifischer ist als das letztere Verfahren.
Andererseits sind als TRACP 5b-Assayverfahren unter Verwendung von Immunoassays auch Immunoassayverfahren bekannt, die einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper verwenden (J. Clin. Endrocrinol. Metab. 71:442–451, 1990; J. Bone Miner Res. 13:683–687, 1998; Immunol. Lett. 70:143–149, 1999; J. Bone Miner Res. 14:464–469, 1999; Clin. Chem. 45:2150–2157, 1999; und Clin. Chem. 46:1751–1754, 2000). Bei diesen Verfahren wird eine Aktivität, die zu der Gesamtheit der Bande 5 korrespondiert, überprüft, so daß ein Einfluß von TRACP 5a nicht vernachlässigbar ist. Zusätzlich wurde über ein Immunassayverfahren berichtet, worin TRACP 5b spezifischer überprüft wird (japanische Patentanmeldung Kohyo Nr. 2002-510050). Es wurde berichtet, daß dieses Verfahren ein Assay-Verfahren ist, das für eine TRACP 5b-Aktivität spezifischer ist, da bei diesem Verfahren die Meßwerte durch einen Aktivitätsassay unter Verwendung des Unterschieds im optimalen pH zwischen TRACP 5a und TRACP 5b erhalten werden. Da jedoch der in diesem Verfahren verwendete Antikörper für TRACP 5b nicht spezifisch ist, genügt dieses Verfahren nicht immer im Hinblick auf seine Spezifität für TRACP 5b und es ist daher wünschenswert, dieses weiter zu verbessern um TRACP 5b als Knochenresorptionsmarker zu verwenden.
Die US-B1-6 248 544 betrifft eine Messung der Aktivität von von Osteoclasten abstammender saurer Phosphatase, die in Bande 5b lokalisiert ist, d.h. TRACP 5b. In US 6 248 544 wird die Enzymaktivität durch Verwendung von 4-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat in einem breiten Bereich von pH-Bereichen überprüft, um den besonders geeigneten pH für die TRACP 5b-spezifische Aktivität zu bestimmen.
Die US B1-6 488 027 betrifft auch TRACP 5b und ein Testkit wie auch Verfahren zum Screening auf Knochenstörungen und erwähnt 2-Chlor-4-nitrophenylphosphorsäure.
Offenbarung der Erfindung
Im Hinblick auf diese Probleme soll die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Assay auf TRACP 5b als Knochenresorptionsmarker bereitstellen, und zwar spezifisch mit hoher Empfindlichkeit und ein Kit, das in diesem Verfahren verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für einen Immunoassay für eine Tartrat-resistente saure Phosphatase 5b (TRACP 5b) in einer Probe bereit, das folgendes umfaßt:
Binden von TRACP 5b in der Probe an einen Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, Unterwerfen des TRACP 5b, gebunden an den Antikörper einer Enzymreaktion mit einer 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure repräsentiert durch die allgemeine Formel (1):
worin X Cl, F, Br oder I ist oder ein Salz davon, wobei es sich um ein Substrat für TRACP 5b handelt, und dann Überprüfen der enzymatischen Aktivität von TRACP 5b zur Durchführung des Immunassays von TRACP 5b in der Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit für einen Immunoassay von TRACP 5b bereit, der folgendes umfaßt:

i) einen festen Träger,
ii) einen Antikörper gegen TRACP 5b, und
iii) ein Substrat für TRACP 5b, wobei es sich um eine 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure handelt, repräsentiert durch die allgemeine Formel (1):
worin X Cl, F, Br oder I ist oder ein Salz davon.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Graphik, die den optimalen pH in dem Assay auf die enzymatische Aktivität von sowohl TRACP 5b als auch TRACP 5a durch Verwendung von 2-Chlor-4-nitrophenylphosphorsäure (CNPP) als Substrat für das Enzym darstellt.
2 ist eine Graphik, die durch Behandlung einer Probe (einer Standardlösung oder von Serum) mit einer Platte erhalten wird, die einen Antikörper gegen TRACP 5b immobilisiert darauf aufweist und dann durch eine Überprüfung der enzymatischen Aktivität durch ein Ratenverfahren unter Verwendung von 2-Chlor-4-nitrophenylphosphorsäure als Substrat für das Enzym.
Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Die einem Assay der vorliegenden Erfindung zu unterwerfende Probe beinhaltet menschliches Blut, Serum, Plasma und ähnliches und ist nicht besonders begrenzt, so lange es wahrscheinlich ist, daß sie TRACP 5b enthält.
In der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper an einen festen Träger gebunden. Zusätzlich kann als Antikörper entweder ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper verwendet werden, solange dies Antikörper gegen TRACP 5b sind, obwohl ein monoklonaler Antikörper im Hinblick auf seine Spezifität vorzuziehen ist. Als monoklonaler Antikörper können daher bekannte monoklonale Antikörper gegen TRACP 5b verwendet werden.
Als in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper gegen TRACP 5b unter Verwendung von TRACP 5b, gereinigt aus menschlichen Osteoclasten als Immunogen hergestellt werden. Der monoklonale Antikörper wird beispielsweise durch ein Hybridom erzeugt, erhalten durch Immunisierung eines Tiers mit gereinigter menschlicher TRACP 5b als Immunogen und Fusion von Zellen, die anti-menschliche TRACP 5b-Antikörper erzeugen können, die durch das Tier erzeugt werden, mit Myelomzellen.
Das oben erwähnte Hybridom kann durch das folgende Verfahren erhalten werden. Das heißt, menschliche TRACP 5b wird mit einem wohl bekannten Adjuvans wie zum Beispiel Freund's komplettem oder inkomplettem Adjuvans mit Aluminiumhydroxid-Adjuvans, Pertussis-Adjuvans oder ähnlichem vermischt, um eine Adjuvansflüssigkeit für die Sensibilisierung herzustellen und diese Flüssigkeit wird einem Tier verabreicht (zum Beispiel einer Maus oder einer Ratte) und zwar subkutan in die Abdominalhöhle oder intravenös in den Schwanz in etlichen Teilen in Intervallen von 1 bis 3 Wochen, um das Tier zu immunisieren. Obwohl die verwendete Antigenmenge für die Sensibilisierung in der Regel in einem Bereich von 1 µg bis 100 mg gewählt wird, wird ungefähr 50 µg allgemein bevorzugt. Obwohl die Zahl immunisierender Operationen allgemein 2 bis 7 beträgt, sind verschiedene Verfahren bekannt. Darauffolgend werden die Antikörper erzeugenden Zellen, die von der Milz oder ähnlichem abstammen mit Zellen in einem Teströhrchen fusioniert, die eine proliferierende Fähigkeit aufweisen, wie zum Beispiel Myelomzellen oder ähnlichen. Die Antikörper-erzeugenden Zellen können aus der Milz oder ähnlichem einer Maus, einer Nacktmaus, einer Ratte oder ähnlichem erhalten werden.
Als Fusionsverfahren kann die Fusion durch Verwendung von Poly(ethylenglykol) (PEG) durch das Verfahren von Köhler und Milstein (Nature, 256, 495, 1975), das bereits per se wohl bekannt ist, durchgeführt werden. Die Fusion kann auch unter Verwendung von Sendai-Virus oder durch das Elektrofusionsverfahren durchgeführt werden.
Als Verfahren zur Selektion eines Hybridoms, das einen Antikörper erzeugen kann, der menschliche TRACP 5b erkennen kann, und zwar aus den fusionierten Zellen, kann die Selektion wie folgt durchgeführt werden. D.h., das Hybridom wird aus Kolonien gewählt, die von Zellen gebildet werden, die in HAT-Medium und HT-Medium in limitierender Verdünnung der fusionierten Zellen überleben können. Wenn ein Antikörper gegen menschliche TRACP 5b in dem Überstand des Kulturmediums für irgendeine der Kolonien enthalten ist, die von den fusionierten Zellen gebildet wird, die in einer Platte mit 96 Vertiefungen oder ähnliches ausgesät wurden, kann ein Klon, der einen monoklonalen Antikörper gegen menschliches TRACP 5b erzeugen kann, durch ein ELISA-Verfahren selektiert werden, worin der Überstand auf eine Assayplatte mit darauf immobilisierter menschlicher TRACP 5b plaziert wird und nach der Reaktion wird ein sekundärer markierter Antikörper wie zum Beispiel Antimaus-Immunoglobulin-HRP-markierter Antikörper mit dem oben erwähnten Antikörper umgesetzt. Als Markierungssubstanz für den markierten Antikörper können Enzyme verwendet werden (z.B. alkalische Phosphatase), fluoreszierende Substanzen, radioaktive Substanzen und ähnliches neben dem HRP. Ein Screening der spezifischen Antikörper gegen menschliche TRACP 5b kann auch durch Durchführung von ELISA unter Verwendung einer Assay-Platte mit nur BSA gebunden als Blockierungsmittel, simultan zu den oben erwähnten ELISA als Kontrolle durchgeführt werden. Das heißt ein Klon kann selektiert werden, der auf der Platte mit menschlicher TRACP 5b darauf immobilisiert positiv ist und in dem ELISA unter Verwendung von nur BSA negativ ist.
Als so selektiertes Hybridom, das dazu in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper gegen TRACP 5b zu erzeugen, können beispielhaft die Hybridome TrK27, TrK49 und TrK62 genannt werden. Die Hybridome TrK27, TrK49 und TrK62 wurden wie folgt bei dem Patented Organism Deposition Center (IPOD), Industrial Technology General Research Institute (Independent Administrative Corporation), Chuo-dairoku, Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Perfecture, Japan 305-8566 hinterlegt: Hybridoma TrK27 wurde als Empfangsnummer IPOD FERMBP-7889 am 14. Februar 2002 hinterlegt, das Hybridom TrK49 mit der Empfangsnummer IPOD FERN BP-8249 am 27. November 2002 und das Hybridom TrK62 mit der Empfangsnummer IPOD FERMBP-7890 am 14. Februar 2002.
Jedes der Hybridome wird auf einem Medium kultiviert, das üblicherweise für die Zellkultur verwendet wird, wie zum Beispiel α-NEM, RPMI1640, ASF, S-Klon oder ähnliche und der monoklonale Antikörper kann von dem Überstand des Kulturmediums gewonnen werden. Ebenso ist das Folgende möglich: nachdem ein Tier, von dem das Hybridom abstammte, wie zum Beispiel eine Maus, zunächst mit Pristin behandelt wird, wird das Hybridom intraperitoneal in das Tier injiziert, um eine Anhäufung von Ascites auszulösen und der monoklonale Antikörper wird aus dem Ascites gewonnen. Als Verfahren um den monoklonalen Antikörper aus dem Überstand oder Ascites zu gewinnen, kann ein konventionelles Verfahren verwendet werden. Dies sind beispielhaft Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder ähnlichem, Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A, Protein G oder ähnlichem.
Als in der vorliegenden Erfindung verwendeter monoklonaler Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper, der nicht nur mit TRACP 5b sondern auch mit TRACP 5a reaktiv ist, verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung kann ein polyklonaler Antikörper verwendet werden. Der polyklonale Antikörper kann beispielsweise unter Verwendung von TRACP 5b, gereinigt aus menschlichen Osteoclasten als Immunogen, Immunisierung eines Tiers wie einer Ratte oder einer Maus mit diesem TRACP 5b und Herstellung eines Antiserums von dem Tier erhalten werden.
In der vorliegenden Erfindung wird der Immunoassay für TRACP 5b in einer Probe durch Binden von TRACP 5b in der Probe an den oben erwähnten Antikörper, Unterwerfen des gebundenen TRACP 5b einer enzymatischen Reaktion mit einer 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure der allgemeinen Formel (1) oder einem Salz davon als Substrat für das Enzym und dann Überprüfung der enzymatischen Aktivität durchgeführt.
Als in der vorliegenden Erfindung zu verwendende 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure können beispielhaft 2-Chlor-4-nitrophenylphosphorsäure, 2-Fluor-4-nitrophenylphosphorsäure und 2-Brom-4-nitrophenylphosphorsäure genannt werden. Als das Salz der 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure können beispielhaft das Ammoniumsalz, Imidazoliumsalz, Cyclohexylammoniumsalz, Kaliumsalz, Natriumsalz und Tris(hydroxyammonium)salz genannt werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete oben genannte Substrat hat einen niedrigeren Km-Wert für TRACP 5b und einen höheren Km-Wert für TRACP 5a als p-Nitrophenylphosphorsäure (PNPP) und ist daher im Hinblick auf Empfindlichkeit und Spezifität sehr vorteilhaft, wenn es für einen Assay auf TRACP 5b verwendet wird.
In der vorliegenden Erfindung ist, wenn TRACP 5b in einer Probe einer enzymatischen Reaktion mit der 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure oder ihrem Salz unterworfen wird, einem Substrat für TRACP 5b, der pH der Reaktion vorzugsweise höher als 6,3 und nicht höher als 6,8, noch bevorzugter liegt er bei 6,35 bis 6,75, insbesondere bei 6,38 bis 6,70. Wenn der pH zu niedrig ist, wird vermutlich eine Enzymreaktion von TRACP 5a auftreten, was zu einem sehr niedrigen Verhältnis einer TRACP 5b Reaktivität gegenüber der TRACP 5a-Reaktivität führt. Daher kann dies dazu führen, daß die Spezifität für TRACP 5b unzureichend wird. Wenn der pH zu hoch liegt, tritt die enzymatische Reaktion von TRACP 5b selbst nicht einfach auf, so daß die Messungsempfindlichkeit zu einer Erniedrigung neigt.
In der vorliegenden Erfindung kann spezifisch TRACP 5b wie folgt überprüft werden, indem zum Beispiel ein Endpunktverfahren angewandt wird. Zunächst wird eine einem Assay zu unterwerfende Probe einem Antikörper zugefügt, der an einem festen Träger adsorbiert ist um das TRACP 5b in der Probe und den Antikörper einer Antigen-Antikörper-Reaktion zu unterwerfen und TRACP 5b an den Antikörper zu binden. Dann wird der feste Träger mit einer Waschlösung gewaschen, um Komponenten zu entfernen, die in der Probe enthalten sind und die nicht an den Antikörper gebunden sind. Danach wurde die 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure oder ihr Salz dem Reaktionssystem als Substrat für das Enzym zugefügt, um das Substrat mit TRACP 5b, gebunden an den Antikörper umzusetzen, vorzugsweise bei einem pH von mehr als 6,3 und nicht mehr als 6,8. Nachdem die enzymatische Reaktion mit einer reaktionsbeendigenden Lösung beendet wird, wird das 2-Halogen-4-nitrophenol, das durch die Reaktion erzeugt wird, einer Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 390 bis 450 nm, vorzugsweise 400 bis 430 nm unterworfen. Da der Wert der Absorption die enzymatische Aktivität von TRACP 5b reflektiert, kann das TRACP 5b in der Probe auf der Basis des Absorptionswertes überprüft werden.
In der vorliegenden Erfindung kann auch ein Ratenassay durchgeführt werden, als Assay für die enzymatisch Aktivität, anders als ein konventionelles Verfahren unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphorsäure, da das 2-Halogen-4-nitrophenol eine Farbe bei dem pH der Reaktion entwickelt. Wenn der Ratenassay durchgeführt wird, kann das TRACP 5b in einer Probe durch Messung der Aktivität von TRACP 5b mit dem Substrat als durchschnittliche Absorptionsveränderung pro definierte Zeit (in der Regel 1 Minute) überprüft werden. Im Ergebnis reduziert sich die Meßzeit, was wünschenswert ist.
In der vorliegenden Erfindung wird, wie aus dem oben beschriebenen Assay-Verfahren deutlich wird, der Antikörper nach einer Bindung an einen festen Träger verwendet. Der feste Träger ist nicht besonders begrenzt, obwohl ein fester Träger, der in einem Festphasenimmunassayverfahren, wie zum Beispiel einem ELISA verwendet wird, üblicherweise verwendet wird. Ein Material für feste Träger beinhaltet beispielsweise Polystyrole, Polypropylene, Polycarbonate, Polyethylene, Nylons und Methylacrylate. Als Form für den festen Träger werden beispielhaft eine Plattenform und eine Kugelform genannt.
Zur Herstellung der Antikörpers, der an einen festen Träger adsorbiert ist, wird der Antikörper gegen TRACP 5b direkt oder indirekt an den festen Träger durch Verwendung einer physikalischen Bindung, chemischen Bindung oder eine Affinität angebunden. Die Menge des verwendeten Antikörpers für die Sensibilisierung liegt häufig im Bereich von 1 ng bis 100 mg/ml.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch Verwendung eines Kits für einen Immunassay auf TRACP 5b durchgeführt werden, der i) einen festen Träger, ii) einen Antikörper gegen TRACP 5b und iii) ein Substrat, wobei es sich um 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure der allgemeinen Formel (1) oder ein Salz davon handelt, umfaßt.
In diesem Kit ist es, im Hinblick auf i), den festen Träger und ii), den Antikörper gegen TRACP 5b möglich den festen Träger und eine Lösung des Antikörpers separat herzustellen und den Antikörper auf den festen Träger zum Zeitpunkt des Assays von TRACP 5b zu adsorbieren. Alternativ kann der Kit nach vorheriger Adsorption des Antikörpers an den festen Träger bereitgestellt werden. Der Kit umfaßt vorzugsweise eine Waschlösung zum Zweck der Entfernung von Komponenten, die nicht an den festen Träger adsorbiert sind, nach der Bindung von TRACP 5b in einer Probe an den Antikörper. Beispielsweise kann Tris-Puffer, enthaltend ein Tensid als Waschlösung verwendet werden.
Wenn dieser Kit in einem Endpunktverfahren verwendet wird, umfaßt der Kit vorzugsweise eine Enzym-Reaktions-beendigende Lösung. Als Enzym-Reaktions-beendigende Lösung können beispielsweise wäßrige Alkalilösungen wie beispielsweise Lösungen von Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid und ähnlichen verwendet werden.
Weiterhin kann der Kit der vorliegenden Erfindung außerdem ein Verdünnungsmittel für die Probe, falls nötig, umfassen. Beispielsweise kann eine Pufferlösung wie Tris-Puffer als Verdünnungsmittel für die Probe verwendet werden. Falls nötig kann ein Chelatbildner (z.B. EDTA·2Na) und ein anorganisches Salz (z.B. Natriumchlorid) der Pufferlösung zugefügt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im weiteren Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Referenzbeispiele und Arbeitsbeispiele illustriert, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.
Referenzbeispiel 1
Präparation eines monoklonalen Antikörpers gegen TRACP 5b
(1) Reinigung von saurer Phosphatase-TRACP 5b, abstammend von Osteoclasten
Nachdem eine informierte Zustimmung erhalten wurde, wurden 130 g des Caputs von einem menschlichen Schenkelknochen, ausgeschnitten in einer chirurgischen Operation in flüssigem Stickstoff eingefroren, mit einem Hammer zerkleinert und dann in 200 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, 0,3M KCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA·2Na, 0,1 % Triton X-100, 0,02 % NaN₃, 1 Einheit/ml Aprotinin, pH 7,5) suspendiert, die einen Protease-Inhibitor enthielt, gefolgt von einer Homogenisierung in einem Ultraschallhomogenisator. Das Homogenat wurde über Nacht bei 4°C gerührt und bei 10 000 Upm für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gegen 10 mM Tris-Puffer (pH 8,2) dialysiert. Darauffolgend wurde die dialysierte Lösung auf eine CM-Sepharose-Säule (ϕ40 mm × 40 cm) [Sigma Chemical Co.] aufgebracht und das adsorbierte Protein wurde mit demselben Tris-Puffer wie oben, enthaltend NaCl eluiert, während die NaCl-Konzentration mit einem linearen Konzentrationsgradienten (0–5M NaCl) anstieg. Die Tartrat-resistente saure Phosphataseaktivität wurde mit einem Substrat 2,6-Dichlor-4-acetylphenylphosphorsäure [hergestellt von Nitto Boseki Co., Ltd.] überprüft und Fraktionen, die ein hohes Niveau der Aktivität enthielten, wurden gesammelt. Die so erhaltene Lösung wurde konzentriert und gegen 20 mM Tris-Puffer (pH 7,2), enthaltend 0,7 M NaCl dialysiert und die dialysierte Lösung wurde auf einer Superdex-200-Säule (ϕ16 mm × 60 cm) [Amersham Pharmacia Biotech AB] aufgebracht. Auf dieselbe Weise wie oben wurde die Tartrat-resistente saure Phosphataseaktivität in den durch Flution erhaltenen Fraktionen überprüft und die Fraktionen, die die Aktivität enthielten, wurden gesammelt. Die so erhaltene Lösung wurde zweifach mit 20 mM Trispuffer (pH 7,2) verdünnt und auf eine HiTrap-Heparin-HP-Säule (5 ml) [Amersham Pharmacia Biotech AB] aufgebracht und das adsorbierte Protein wurde mit demselben 20 mM Tris-Puffer (pH 7,4) wie oben, enthaltend NaCl, eluiert, während die NaCl-Konzentration mit einem linearen Konzentrationsgradienten (0,35-1M NaCl) anstieg. Fraktionen, die eine hohe Tartrat-resistente saure Phosphataktivität enthielten, wurden zusammengefaßt und dann konzentriert, um 0,4 mg gereinigter saurer Phosphatase, abstammend von Osteoclasten, zu erhalten. Die Menge an Protein wurde durch A₂₈₀ bestätigt. Im Hinblick auf die Reinheit wurde eine SDS-PAGE [TIFCO] durchgeführt, gefolgt von einer Silberfärbung. Im Ergebnis wurde die Reinheit durch Auftreten einer einzelnen Bande bei einem Molekulargewicht von ungefähr 35.000 bestätigt. Das zu der einzelnen Bande korrespondierende Enzym wurde als gereinigtes TRACP 5b angesehen und wurde als immunisierendes Antigen verwendet.
(2) Immunisierung
Die gereinigte Tartrat-resistente saure Phosphatase, abstammend von menschlichen Osteoclasten (TRACP 5b) wurde auf eine Konzentration von 250 µg/ml mit 50 mM Citratpuffer (pH 5,5) verdünnt und 25 µg (100 µl) der Verdünnung wurden vollständig mit 100 µl Freund's kompletten Adjuvans [Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] vermischt, bis eine Emulgation bewirkt wurde. Die so hergestellte Suspension wurde intraperitoneal an eine weibliche Balb/c Maus im Alter von 6 Wochen [Nippon Clear Co., Ltd.] unter Anästhesie mit Diethylether verabreicht. Nach 2 Wochen wurde dieselbe Menge wie oben an TRACP 5b (25 µg/ml) mit Freund's inkompletten Adjuvans [Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] vermischt. Durch genau dasselbe Verfahren wie im Fall von Freund's kompletten Adjuvans wurde eine Emulgation bewirkt, um eine Suspension zu erhalten und die Maus wurde mit der Suspension sensibilisiert. Zwei Wochen nach dieser Prozedur wurde dieselbe Prozedur wie oben durchgeführt. Für die vierte Immunisierung, d.h. die endgültige Immunisierung, wurde eine Verdünnung von TRACP 5b (25 µg/ml) mit 50 mM Citratpuffer (pH 5,5) hergestellt und dann an die Maus durch Injektion in die Schwanzvene verabreicht.
(3) Etablieren des Hybridoms
Drei Tage nach der endgültigen Immunisierung wurde die Milz chirurgisch aus der Maus entfernt, die mit TRACP 5b sensibilisiert worden war, und zwar unter Anästhesie mit Diethylether und wurde aseptisch dispergiert um Splenozyten herzustellen. Die Fusion wurde gemäß dem Verfahren von Köhler und Nilstein (Nature, 256, 495, 1975) durchgeführt. Die Splenozyten wurden mit Myelomzellen P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) unter Verwendung von Poly(ethylenglykol) (PEG4000) [Merck & Co., Inc.] fusioniert. Als Fusionsverhältnis lag die Zahl der Splenozyten bei 8 × 10⁷, währen die Zahl der Myelomzellen P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) bei 2 × 10⁷ lag. Das heißt das Fusionsverhältnis der Splenozyten zu den Myelomzellen betrug 4:1. Die fusionierten Zellen wurden in 10 % FCS [INVITROGEN] α-NEM [IRVINE] HAT [Cosmo Bio Co., Ltd.] Medium dispergiert, in Mikrotiterkulturplatten mit 96 Vertiefungen [Sumitomo Bakelite Co., Ltd.] ausgesät und dann unter Bedingungen von 37°C und 5 % CO₂ kultiviert.
(4) Screening
Nach ungefähr 2 Wochen wurde das Wachstum von Kolonien bestätigt und ein Screening wurde durchgeführt. Ein Verfahren zum Durchführen des Screenings wird unten beschrieben. Zur Erzeugung einer Platte für das Screening wurde im obigen Punkt (1) gereinigtes TRACP 5b in 50 mM Citratpuffer gelöst und auf eine Platte mit 96 Vertiefungen [Nunc] in einer Menge von 0,5 µg/100 µl/Vertiefung aufgebracht. Man ließ die Platte bei 4°C zwei Nächte stehen und sie wurde dann dreimal mit Tris-Puffer, enthaltend 0,05 % Tween 20, gewaschen. In jede Vertiefung wurden 200 µl einer 1,5%igen BSA-Lösung gegeben, um eine nicht-spezifische Reaktion zu inhibieren und man ließ die Platte über Nacht bei 4°C stehen. Nachdem die so vervollständigte Platte dreimal mit Tris-Puffer, enthaltend 0,05 % Tween 20 gewaschen worden war, wurden 100 µl des Kulturüberstands in jeder Vertiefung umgesetzt und die Platte wurde weiter gewaschen. Dann wurde ein HRP-markierter Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper [Zymed Laborstories, Inc.], ein sekundärer Antikörper zugefügt, um die Reaktion durchzuführen. Nach dem Waschen wurden 100 µl einer 3 mg/ml farberzeugenden Lösung o-Phenylendiamin (OPD) [Nacalai Tesque Inc.], einem farberzeugenden Substrat für HRP, in Zitronensäure jeder Vertiefung zugefügt, um eine Anfärbung für eine definierte Zeitspanne auszulösen. Dann wurden 100 µl 1N Schwefelsäure jeder Vertiefung als Beendigungslösung zugefügt und die Absorption wurde durch Messung der Wellenlänge bei 492 nm gemessen. Klone, die sich in dem obigen Verfahren als positiv erwiesen, wurden einem wiederholten Klonieren durch das limitierende Verdünnungsverfahren unterworfen und die so erhaltenen Überstände wurden wiederum überprüft.
(5) Bestätigung eines Antikörpers
Die Reaktion des Klons TrK27 mit gereinigtem TRACP 5b wurde durch ELISA bestätigt und der Klon TrK27 wurde als Klon selektiert, der einen mit TRACP 5b reaktiven Antikörper erzeugen kann. Dieses Hybridom TrK27 wurde als Empfangsnummer IPOD FERMBP-7889 am 14. Februar 2002 bei dem Patented Organism Deposition Center (IPOD), Industrial Technology General Research Institute (Independent Administrative Corporation), Chuo-dairoku, Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 305-8566 hinterlegt.
Ein durch dieses Hybridom erzeugter Antikörper wurde durch Verwendung eines monoklonalen Antikörper-Typisierungskits [Amersham Pharmacia Biotech AB] überprüft, um herauszufinden, daß die Klasse IgG1 war und daß die leicht Kette κ war. Die Spezifität diese Antikörpers wurde wie folgt untersucht. Ein ELISA wurde unter Verwendung von jeweils TRACP 5b, TRACP 5a, abstammend von menschlichem Serum und eluiert mit einer HiTrap-Heparin HP-Säule, ACP, abstammend von der Prostata, ACP, abstammend von Blutplättchen (einer Blutplättchen-Extraktlösung) und ACP, abstammend von Erythrozyten (eine Erythrozyten-Extraktlösung) durchgeführt. Als Ergebnis reagierte der Antikörper mit TRACP 5b und TRACP 5a jedoch nicht mit den anderen Isoformen.
(6) Herstellung und Reinigung eines monoklonalen Antikörpers
Einer Balb/c weiblichen Maus im Alter von 10 Wochen [Nippon Clear Co., Ltd.] wurden zwei Wochen nach einer Verabreichung von 0,5 ml Pristan [Aldrich Chemical Co.] intraperitoneal 1 × 10⁷ Zellen des erhaltenen Hybridoms TrK27 verabreicht. Nach ungefähr 2 Wochen wurde in der Abdominalhöhle der Maus angehäufter Ascites chirurgisch unter Anästhesie mit Diethylether gesammelt. Als Ergebnis der Bestätigung durch Verwendung von Ascites, schrittweise als Probe verdünnt und durch das ELISA-Verfahren, angewandt für das Screening, wurde festgestellt, daß der Ascites eine hohe Konzentration an monoklonalem Antikörper enthielt. Der Ascites wurde mit 40 % Ammoniumsulfat behandelt und gegen PBS dialysiert und dann wurde der monoklonale Antikörper durch Verwendung einer Protein G-Säule [Amersham Pharmacia Biotech AB] gereinigt und durch SDS-PAGE bestätigt. Im Ergebnis wurde eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von ungefähr 150 000 bestätigt, wenn sich der Antikörper in einem nicht-reduziertem Zustand befand und zwei Banden bei Molekulargewichten von ungefähr 50 000 und 25 000, wenn der Antikörper mit Mercaptoethanol reduziert worden war. Die Menge des gereinigten Antikörpers betrug ungefähr 15 mg pro Maus, war also ausreichend für eine industrielle Verwertung.
(7) Erzeugung einer Platte mit einem darauf immobilisierten Anti-TRACP 5b-Antikörper
Der im obigen Punkt (6) erhaltene Antikörper wurde in PBS gelöst und die resultierende Lösung wurde auf eine Platte mit 96 Vertiefungen [Nunc] in einer Menge von 1 µg/200 µl/Vertiefung aufgebracht. Man ließ die Platte bei 4°C zwei Nächte stehen und sie wurde dann dreimal mit Tris-Puffer, enthaltend 0,05 % Tween 20 gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden 200 µl einer 1,5%igen BSA-Lösung zugefügt, um eine nicht-spezifische Reaktion zu inhibieren und man ließ die Platte über Nacht bei 4°C stehen, um eine Platte zu vervollständigen, die darauf immobilisiert einen Anti-TRACP 5b-Antikörper aufwies.
Referenzbeispiel 2
Vergleich zwischen dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Substrat und einem anderen Substrat durch eine Km-Messung
Um den Unterschied zwischen TRACP 5b und TRACP 5a in ihrer Reaktivität mit 2-Chlor-4-nitrophenylphosphorsäure (CNPP) zu untersuchen, wurde der Km für beide gemessen. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß der Km 1,5 mM (pH 6,4) für TRACP 5b und 3,5 mM (pH 5,6) für TRACP 5a betrug. Der Km-Wert für TRACP 5b liegt bei weniger als der Hälfte von demjenigen für TRACP 5a, was anzeigt, daß das Substrat CNPP für einen Assay auf TRACP 5b geeigneter ist als für einen auf TRACP 5a.
Anderseits liegen gemäß Clin. Chem., 47(1), 74–80 die Km-Werte bei der Reaktion von jeweils TRACP 5b und TRACP 5a mit p-Nitrophenylphosphorsäure (PNPP) bei 7,0 mM (pH 5,8) bzw. 1,9 mM (pH 5,2). Das heißt, für einen Assay auf TRACP 5b ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete CNPP vorteilhafter als PNPP im Hinblick auf Affinität und Spezifität.
Beispiel 1
Assay auf TRACP 5b oder 5a bei verschiedenen pH-Werten
Der pH einer Pufferlösung, enthaltend das Substrat CNPP wurde von 5,6 bis 6,8 variiert und die Aktivität von TRACP 5b und TRACP 5a für dieses Substrat wurde überprüft. Die Puffersubstratlösung hatte die folgende Zusammensetzung: CNPP 5 mM, Mes 0,1 M und Natriumtartrat 40 mM. Der pH wurde auf Werte, variierend von 5,6 bis 6,8 in Stufen von 0,2 eingestellt. Die als Proben verwendeten TRACP 5b und TRACP 5a wurden hergestellt indem menschliches Serum durch Verwendung einer Heparinsäule getrennt und eine Fraktion konzentriert wurde, die zu einem Peak korrespondierte, der auf jeweils TRACP 5a bzw. TRACP 5b zurückzuführen war. Als TRACP 5a wurde eine Probe verwendet, die eine solche Konzentration hatte, daß ihre Absorption bei pH 5,6 0,8 betrug (Optimum für TRACP 5a). Als TRACP 5b wurde eine Probe verwendet, die eine solche Konzentration aufwies, daß ihre Absorption bei pH 6,4 0,8 betrug (Optimum für TRACP 5b). Als Assayverfahren wurde eine Platte mit einem darauf immobilisierten Anti-TRACP 5b-Antikörper Trk27 verwendet und 100 µl jeder Probe wurden jeder Vertiefung zugefügt und es wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde unter Schütteln gerührt. Dann wurde die Reaktionslösung verworfen und jede Vertiefung wurde dreimal mit 200 µl Tris-Puffer, enthaltend 0,05 % Tween 20 gewaschen. Darauffolgend wurden 100 µl der Substratpufferlösung jeder Vertiefung zugefügt und es wurde 30 Sekunden geschüttelt, gefolgt von einer Inkubation in einem Inkubator bei 37°C für 1 Stunde. Dann wurden 50 µl 0,2M NaOH jeder Vertiefung zugefügt, um die enzymatische Reaktion zu beenden und die Absorption der Reaktionslösung wurde mit einer Mikrotiterplattenablesevorrichtung gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Unter solchen Bedingungen lag der optimale pH für TRACP 5b bei ungefähr 6,4 und derjenige für TRACP 5a bei 5,6.
Beispiel 2
Vergleich zwischen der vorliegenden Erfindung und einem Verfahren unter Verwendung von PNPP (einem konventionellen Substrat)
Absorptionswerte aufgrund einer Reaktion einer Pufferlösung, enthaltend ein Substrat CNPP mit jeweils TRACP 5a und TRACP 5b bei pHs 6,2, 6,4, 6,6 und 6,8 wurden mit den Ergebnissen verglichen, die in einem Vergleichsbeispiel unter Verwendung einer Pufferlösung (pH 6,1) erhalten wurden, die als Substrat PNPP enthielt, das als für einen Assay auf TRACP 5b geeignet angesehen wird. Gemäß dem in der japanischen Patentanmeldung Kohyo Nr. 2002-510050 offenbarten Verfahren ist die Zusammensetzung dieser PNPP-Substratpufferlösung wie folgt: PNPP 8 mM, Natriumacetat 0,1M, Natriumtartrat 40 mM, pH 6,1. Als TRACP 5b-Probe wurde dieselbe Probe wie in Beispiel 1 verwendet. Als TRACP 5a-Probe wurde eine Probe verwendet, die so hergestellt wurde, daß in dem Vergleichsbeispiel (PNPP wurde bei einem pH von 6,1 verwendet) ein Wert für TRACP 5a ein Zehntel von demjenigen von TRACP 5b sein würde, gemäß den in der japanischen Patentanmeldung Kohyo Nr. 2002-510050 offenbarten Daten. Dasselbe Assay-Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt und die Absorption wurde als Anzeiger einer enzymatischen Aktivität verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Wie aus den Ergebnissen deutlich wird, liegen die 5b/5a-Verhältnis bei pH 6,4 und 6,6 im Fall von CNPP bei 17 bzw. 18, was anzeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren für einen Assay auf TRACP 5b geeigneter ist als das konventionelle Verfahren (das Vergleichsbeispiel). Tabelle 1

Probe Beispiel 2 (CNPP) Vergleichsbeispiel (PNPP)

pH 6,2 pH 6,4 pH 6,6 pH 6,9

TRACP 5a 0,062 0,047 0,038 0,025 0,098

TRACP 5b 0,802 0,811 0,674 0,401 0,981

TRACP 5b/5a 13 17 18 16 10
Beispiel 3
Assayverfahren für die TRACP 5b-Aktivität durch ein Ratenverfahren
Zu jeder Vertiefung einer Platte mit darauf immobilisiertem Anti-TRACP 5b-Antikörper TrK27 wurden 100 µl einer Probe (Standardlösung oder Serum) aufgebracht und es wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde unter Schütteln gerührt. Dann wurde die Reaktionslösung verworfen und jede Vertiefung wurde dreimal mit 200 µl Trispuffer, enthaltend 0,05 % Tween 20 gewaschen. Darauffolgend wurden 100 µl einer Pufferlösung, enthaltend ein Substrat (CNPP) jeder Vertiefung zugefügt und es wurde für 30 Sekunden geschüttelt, worauffolgend die Absorption bei 405 nm mit einer Mikrotiterplattenablesevorrichtung gemessen wurde. Darauffolgend wurde die Platte in einem Inkubator 60 Minuten auf 37°C erwärmt. Während der Inkubation wurde die Absorption bei 405 nm in Intervallen von 10 Minuten gemessen. Andererseits wurde das folgende Verfahren als Vergleichsverfahren gewählt (End-Punktverfahren): 60 Minuten nach Beginn der Inkubation wurden 50 µl 0,2N NaOH jeder Vertiefung als Reaktions-beendigende Lösung zugefügt und die Absorption bei 405 nm wurde auf ähnliche Weise gemessen. 2 zeigt den Reaktionszeitverlauf, überprüft über eine Zeitspanne von 60 Minuten. Das TRACP 5b-Aktivitätsniveau wird durch die folgende Gleichung berechnet:
U/L = ΔOD/min der Probe/ΔOD/min der Standardlösung × Aktivitätswert der Standardlösung, worin ΔOD/min eine Absorptionsveränderung pro Minute bei einer Meßwellenlänge von 405 nm ist.
Ein Ratenverfahren wurde durch Messung einer Absorptionsveränderung pro Minute während einer Zeitspanne zwischen 10 und 20 Minuten nach Beginn der Inkubation durchgeführt und durch Berechnung der Aktivität durch die obige Gleichung. Im Ergebnis lagen die TRACP 5b-Aktivitätsniveaus der Serumproben 1 und 2 bei 4,1 U/l und 9,1 U/l. Diese Niveaus waren im wesentlichen dieselben wie 4,2 U/l und 9,3 U/l, die die Niveaus waren, die nach Zugabe der reaktionsbeendigenden Lösung nach 60 Minuten der Reaktion beim Endpunktverfahren gemessen wurden. Daher konnte bewiesen werden, daß es die vorliegende Erfindung ermöglicht die TRACP 5b-Aktivität in ungefähr 20 Minuten durch das Ratenverfahren ohne Verwendung einer Beendigungslösung zu untersuchen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben im Detail erklärt, ermöglicht es das Immunoassayverfahren der vorliegenden Erfindung TRACP 5b in einer Probe spezifisch mit hoher Empfindlichkeit und fast keinem Einfluß von TRACP 5a in der Probe zu untersuchen. Daher kann TRACP 5b genauer als vorher untersucht werden.

Claims

Verfahren für einen Immunassay einer Tartrat-resistenten sauren Phosphatase 5b (TRACP 5b) in einer Probe, das folgendes umfasst: Binden von TRACP 5b in der Probe an einen Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, Unterwerfen des TRACP 5b, gebunden an den Antikörper einer Enzymreaktion mit einer 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure repräsentiert durch die allgemeine Formel (1):
worin X Cl, F, Br oder I ist oder ein Salz davon, wobei es sich um ein Substrat für TRACP 5b handelt, und dann Überprüfen der enzymatischen Aktivität von TRACP 5b zur Durchführung des Immunassays von TRACP 5b in der Probe.
Immunassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei zum Zeitpunkt der enzymatischen Reaktion der pH höher als 6,3 und nicht höher als 6,8 ist.
Immunassayverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei zum Zeitpunkt der enzymatischen Reaktion der pH bei 6,35 bis 6,75 liegt.
Immunassayverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Assay der enzymatischen Aktivität durch ein Ratenverfahren durchgeführt wird.
Kit für einen Immunassay von TRACP 5b, das folgendes umfasst: i) einen festen Träger, ii) einen Antikörper gegen TRACP 5b, und iii) ein Substrat für TRACP 5b, wobei es sich um eine 2-Halogen-4-nitrophenylphosphorsäure handelt, repräsentiert durch die allgemeine Formel (1):
worin X Cl, F, Br oder I ist oder ein Salz davon.