MX2013014757A - Ensayo. - Google Patents

Ensayo.

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Anja Hemmingsen Kellett-Smith
Neil Mclennan
Ceinwen Gilbert
Majbritt Hauge Kyneb
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Abstract

La presente invención describe un dispositivo de ensayo (1) para la detección de enzima activa en una muestra. El dispositivo de ensayo (1) comprende los siguientes componentes: (a) una región de colocación (10) sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz (20) conectada operablemente a la región de colocación (10) de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación (10) pueda migrar a lo largo de la matriz (20); (c) al menos una ubicación de captura distinta (30) sobre la matriz (20), en donde cada ubicación de captura distinta (30) está distanciada de la región de colocación (10), y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta (30); (d) medios de captura (40) que están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta (30), en donde los medios de captura (40) son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de la enzima se retenga en al menos una ubicación de captura distinta (30); y (e) medios de indicación selectiva (50), o al menos un componente de los mismos, para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de enzima activa unidad a los medios de captura (40).

Description

ENSAYO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de ensayos enzimáticos.
En particular, la presente invención se refiere a ensayos de tira para actividad enzimática.
Más específicamente, la presente invención se refiere a dispositivos de ensayo y a métodos que usan los mismos y a usos de los mismos. Los dispositivos de ensayo y ensayos pueden detectar enzima activa. La enzima activa puede ser una fosfatasa, tal como una fitasa o una fosfatasa ácida, o una glicósido hidrolasa tal como una xilanasa, una ß-glucanasa o una amilasa. En un aspecto más preferido, la enzima activa es una fitasa.
La presente invención es útil para su aplicación en una variedad de aplicaciones industriales, tales como detectar enzima activa en producción de biocombustibles , composiciones detergentes y para detectar enzima activa en alimentos y piensos para animales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Determinar la presencia o ausencia de un analito, particularmente una enzima, es frecuentemente necesario en el laboratorio, y también en campos tan diversos como alimento y piensos para animales, producción de biocombustibles y REF: 245604 jabones y polvos de lavado. Comúnmente, ensayos tales como inmunoensayos se usan para este propósito.
Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISAs) pueden usarse para detectar la presencia de un anticuerpo o antígeno en una muestra. En tales métodos, un anticuerpo se une a un antígeno que está fijado a una superficie, o viceversa. Este anticuerpo es enlazado a una enzima que puede crear una señal detectable, lo cual es normalmente un cambio de color.
Otro tipo de ensayo o inmunoensayo común es el ensayo de flujo lateral. En estos ensayos la presencia de un analito se detecta en una muestra que fluye a lo largo de un soporte sólido. El analito, o un reactivo tal como un anticuerpo que se une al analito, se une después a líneas o zonas en el soporte que han sido tratadas con un antígeno o anticuerpos .
Tanto ELISAs como ensayos de flujo lateral pueden ser también ensayos de emparedado. Esto significa que la muestra hace contacto primero con un anticuerpo de captura que se une al antígeno que será detectado. El antígeno se une después a un anticuerpo adicional, el cual es probable que esté en una línea de prueba fija en el caso de ensayos de flujo lateral. El antígeno es entonces emparedado entre al menos dos anticuerpos. El segundo anticuerpo es enlazado a una señal detectable.
Muchos ensayos o inmunoensayos de los tipos descritos arriba determinan la presencia de una enzima específica .
Sin embargo, en algunas muestras las enzimas existen pero han sido inactivadas, por ejemplo por calor o inactivación química. En tales casos, los ensayos existentes aún detectan la presencia de la enzima.
Por ejemplo, US4425438 describe un ensayo que usa una columna en lugar de un sistema de flujo lateral. La muestra fluye a través de zonas de esferas que están recubiertas con un absorbente de analito. Las zonas en las cuales se presenta la unión del analito dan una medida de la cantidad del analito. Otro ensayo de columna se describe en US5073484, en donde la determinación cuantitativa de un analito en líquido tiene lugar usando zonas separadas a lo largo de la trayectoria de flujo.
Los dispositivos de flujo lateral, tales como por ejemplo aquél descrito en US5451504, comúnmente tienen diferentes zonas para el depósito de la muestra, atrapamiento o inmovilización del analito y detección del analito o complejo de analitos atrapado. Estos dispositivos no cuantifican al analito o identifican la actividad si el analito es una enzima.
El ensayo de flujo lateral descrito en US6183972 usa varias ubicaciones o bandas de captura para capturar anticuerpo anti-analito marcado y proporcionar una señal detectable. Las bandas proporcionan un patrón de señales único, el cual, cuando se combina matemáticamente para crear una curva de respuesta a dosis monótona, indica la concentración del analito en la muestra.
US5229073 describe un ensayo de flujo lateral que usa varias ubicaciones de captura para poder semi -cuantificar la cantidad de analito en una muestra.
Las moléculas grandes (por ejemplo, >3000 daltons) pueden ser detectadas usando el dispositivo de flujo lateral de US6358548. Dependiendo de la modalidad, la intensidad de color del número de líneas en sitios de captura da una indicación de la cantidad del analito.
US7425302 describe un método de flujo lateral en el que los reactivos son secados. Añadir la muestra líquida reconstituye los reactivos secos. Este método cuantifica el analito con base en la intensidad de un cambio de color. La actividad de la enzima específica G6PD se determina por la longitud de tiempo que tarda en presentarse un cambio de color, lo cual es una medida de qué tan rápido G6PD reacciona a su substrato. Sin embargo, el método de US7425302 está limitado específicamente a G6PD y ninguna enzima se retiene en un lugar de captura distinto.
WO2005/014847 describe el uso de un inmunoensayo de emparedado de flujo lateral estándar para detectar enzimas tales como fitasas, xilanasas y amilasas. La cantidad de las enzimas puede ser al menos parcialmente determinada por la intensidad del cambio de color resultante. WO2007/001895 describe un ensayo de emparedado con oro coloidal que se usa específicamente para detectar fitasa de E. coli. Este ensayo de emparedado con oro coloidal comprende un anticuerpo monoclonal primario que reconoce inmunológicamente la fitasa y un anticuerpo secundario que es conjugado a un medio de detección.
En consecuencia, algunos de los ensayos usados previamente sólo pueden proporcionar la determinación cuantitativa de una enzima en una muestra, pero no son capaces de determinar la actividad de la enzima o no identifican específicamente una enzima activa. Otros ensayos requieren análisis matemático complicado de las bandas de captura para poder determinar una concentración de analito.
Existe por lo tanto la necesidad de un ensayo que detecte sólo formas activas de una enzima. También sería adecuado que este ensayo pudiera proporcionar al menos alguna información semicuantitativa .
La presente invención busca superar algunos de los problemas de los dispositivos y métodos de la técnica anterior .
La presente invención se describirá ahora. Para facilidad de referencia hemos descrito elementos de la presente invención bajo uno o más encabezados. Se debe notar que las enseñanzas bajo cada uno de los encabezados también aplican a las enseñanzas bajo los demás encabezados. Por ejemplo, cada uno de los elementos y aspectos preferidos indicados relacionados con el dispositivo de la presente invención es igualmente un elemento o aspecto preferido relacionado con el método de la presente invención o el uso de la presente invención. Asimismo, cada uno de los elementos y aspectos preferidos indicados relacionados con el método o uso de la presente invención es igualmente un elemento o aspecto preferido relacionado con el dispositivo de la presente invención.
SUMARIO DE LA INVENCION En un amplio aspecto, la presente invención se refiere a un ensayo enzimático y a un dispositivo que detecte enzima activa en una muestra, y a métodos para determinar la presencia de enzima activa en una muestra.
En particular, la presente invención se refiere a dispositivos y ki'ts para llevar a cabo estos ensayos, específicamente ensayos de flujo lateral y dispositivos para llevar a cabo ensayos de flujo lateral e inmunoensayos .
Modalidades generales En una modalidad, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo para detectar enzima activa en una muestra .
El dispositivo comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la- región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta en la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta en la matriz está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta; (d) medios de captura están presentes en o definen cada una de las ubicaciones de captura distintas, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de enzima se detecta en por lo menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia de enzima activa en una muestra, en donde la muestra se pone sobre la región de colocación del dispositivo de ensayo de la invención y los medios de indicación selectiva del dispositivo indican si está presente enzima activa.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar niveles de enzima activa en una muestra, en donde la muestra se pone en la región de colocación del dispositivo de ensayo de la invención y los medios de indicación selectiva del dispositivo indican la cantidad de enzima activa presente de manera semicuantitativa .
En otra modalidad, la presente invención proporciona un kit que comprende o es capaz de formar el dispositivo de ensayo de la presente invención.
En otra modalidad la presente invención proporciona un método para determinar la presencia de enzima activa en una muestra, en donde el método comprende las etapas de: a) poner en contacto al menos una porción de la muestra con un medio de captura con lo cual la enzima sea capturada por el medio de captura; b) proporcionar un substrato adecuado para la enzima capturada en donde el substrato reaccione con la enzima capturada para producir un producto enzimático; c) proporcionar una especie reactiva capaz de reaccionar con el producto enzimático, en donde la especie reactiva reacciona con el producto enzimático para producir un producto insoluble; d) detectar el producto insoluble obtenido en la etapa c) , en donde la detección se correlaciona con la presencia y/o cantidad de una enzima activa en la muestra.
Algunas ventajas Una ventaja de la presente invención es que el dispositivo y métodos que usan los mismos hacen posible que un operador identifique enzima activa en una muestra.
Una ventaja adicional de la presente invención es que el dispositivo y métodos que usan los mismos hacen posible que un operador identifique de una manera simple enzima activa en una muestra y, en algunos casos, al menos de una manera semicuantitativa .
El término "semicuantitativa" según se usa en la presente significa una cantidad relativa, una cantidad aproximada o una cantidad dentro de un intervalo conocido.
De preferencia, el término "semicuantitativa" significa un estimado del nivel de enzima activa, es decir, un nivel "bajo", "aceptable" o "alto" de enzima activa. Sin embargo no excluye una determinación de unidades cuantitativas precisa. Por ejemplo, esto podría obtenerse por ubicaciones de captura más distintas en las regiones de captura o al medir u observar la intensidad de una formación de color o al medir u observar un cambio de color.
Ventajas adicionales de la presente invención se mencionan en la presente.
Aspectos generales En un aspecto, el dispositivo de ensayo comprende una región de colocación en donde puede colocarse una muestra. De preferencia la muestra es una muestra líquida. Preferiblemente la muestra es una muestra de alimento de pienso o una muestra que comprende un componente de alimento o pienso. Una matriz se coloca operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra pueda migrar de la región de colocación a lo largo de la matriz. Preferiblemente la matriz es un material tal como nitrocelulosa .
La matriz del dispositivo de ensayo de la presente solicitud comprende al menos una ubicación de captura distinta que está distanciada de la región de colocación. La muestra puede migrar a través de la ubicación de captura. De preferencia al menos dos ubicaciones de captura son usadas. Preferiblemente se usan por lo menos tres ubicaciones de captura. De preferencia se usan tres ubicaciones de captura.
En cada ubicación de captura en el dispositivo de ensayo de la presente invención, están presentes medios de captura. Los medios de captura son capaces de unirse a la enzima que será detectada por el dispositivo de ensayo. Al menos una muestra de la enzima es retenida en al menos una ubicación de captura. Los medios de captura son de preferencia anticuerpos y muy preferiblemente los medios de captura son anticuerpos que se unen a la enzima. Los anticuerpos pueden ser desarrollados contra la enzima per se o contra un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) .
Medios de indicación selectiva se usan en el dispositivo de ensayo de la presente invención para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura. De preferencia los medios de indicación selectiva comprenden una reacción de precipitación y/o proporciona un cambio mesurable en longitud de onda visible o UV que se presenta después de la formación de producto. El cambio de color puede ser causado por la reacción de un substrato con la enzima. La reacción con un substrato indica que la enzima es activa y no simplemente presente en una forma activa o desnaturalizada.
De preferencia, un cambio de color visible significa un cambio de color que puede ser observado a simple vista o por un lector mecánico y/o por un lector electrónico.
Todos o al menos algunos de los componentes de los medios de indicación selectiva están presentes en el dispositivo de ensayo. Para algunas modalidades todos los medios de indicación selectiva están presentes en y/o sobre el dispositivo de ensayo. En otras modalidades, el dispositivo de ensayo comprende al menos uno de los componentes de los medios de indicación selectiva y el dispositivo es suministrado con (por ejemplo, como un kit) con los demás componentes de los medios de indicación selectiva. Así, en uso, el usuario tiene todos los componentes necesarios de los medios de indicación selectiva para usar el dispositivo para ensayar la enzima activa.
La presente invención es adecuada toda vez que proporciona un novedoso y simple ensayo que puede usarse para detectar enzima activa. Esto es particularmente útil en las industrias de bioetanol, detergente y alimentos y piensos en donde enzimas pueden ser detectadas como presentes usando ensayos disponibles actualmente, pero son inaccesibles - por ejemplo debido a la inactivación causada por tratamiento con calor o químico. Más aún, los ensayos y métodos de la invención pueden ser útiles para determinar si enzima activa además de un aditivo para pienso o alimento es necesaria. Este método podría ser usado también para control de calidad de un producto tal como un producto alimenticio o de pienso.
Otro aspecto de la invención es que proporciona un método para determinar semicuantitativamente la cantidad de enzima activa en una muestra. De preferencia este enfoque semicuantitativo es relativo al número de regiones de captura que indican la presencia de enzima unida.
Un aspecto más de esta invención es que proporciona un método para determinar los niveles de enzima activa en un alimento o pienso, y un método para determinar si enzima adicional o un aditivo para pienso o alimento se requiere. Este método también podría usarse para el control de calidad de un producto tal como un producto de alimento o pienso.
La presente invención se puede presentar en forma de un kit. Este kit hará posible que el operador lleve a cabo el ensayo, de preferencia fuera del laboratorio. El kit puede proporcionar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo. Todos o algunos de los reactivos pueden estar en una forma seca.
De preferencia la enzima activa detectada por el ensayo o dispositivo de ensayo de la presente invención es una fosfatasa o una glicósido hidrolasa, de preferencia una fosfatasa ácida, una fitasa, una xilanasa, una amilasa o una ß-glucanasa .
En un aspecto más preferido, la enzima activa detectada por el ensayo o dispositivo de ensayo de la presente invención es una fosfatasa, de preferencia una fosfatasa ácida, muy preferiblemente una fitasa.
El término "fitasa" significa una proteína o polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de ésteres de ácido fosfórico, incluyendo fitato/ácido fítico, y liberar fosfato inorgánico. Algunas fitasas además de fitato son capaces de hidrolizar al menos algunos de los fosfatos de inositol de grados de fosforilación intermedios.
La fracción que no es polisacárido de almidón (NSP, por sus siglas en inglés) de algunos cereales tales como trigo y cebada incrementa la viscosidad en el intestino, lo cual compromete la difusión de nutrientes. Este efecto antinutricional puede reducirse por la adición de la xilanasa y/o beta-glucanasa, que fragmenta polímeros de hemicelulosa, xilano y beta-glucano respectivamente.
Las alfa-amilasas entre otros suplementos se añaden al pienso para mejorar la utilización de almidón del pienso.
Las enzimas fitasa, tales como por ejemplo la 6-fitasa BP17 derivada de Buttiauxella sp. , se añaden a pienso para animales para incrementar la disponibilidad de fosfato aumentando de esta manera el valor nutricional del producto. El procesamiento del pienso, por ejemplo bajo calor y alta presión, puede desnaturalizar la fitasa y reducir su actividad. La presente invención proporciona una prueba semicuantitativa que puede dar específicamente una indicación de los niveles postprocesamiento de actividad fitasa presentes en el pienso.
En un aspecto altamente preferido, la enzima activa detectada por la presente invención es una fitasa, más particularmente una 6-fitasa.
En un aspecto altamente preferido, la enzima activa que será detectada es BP17. BP17 es una variante enzimática de una fitasa de Butítauxella sp. La secuencia para BP17 (excluyendo péptidos de señal) es la siguiente: NDTPASGYQVE WILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPE PVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT TLNFS SP CQKHSADKSCDLGLSMPS LSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQE ALLLKLHNV YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIA IAGMLNMR TLPGQPDNTPPGGALVFER LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ En otra modalidad, la enzima activa que será detectada es BP11. BP11 es una variante enzimática de una fitasa de Butitauxella sp. . BP11 se usa en la producción de bioetanol . La secuencia para BP11 (excluyendo péptidos de señal) es la siguiente: NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISL GGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI YVWTDVDQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPI DNLNQH IPSLALMNT TLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAA GNIHSEQEWALLLKLH V YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPD KILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDN PPGGALVFER LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ En otra modalidad, la enzima activa que será detectada es BP111. BP111 es una variante enzimática de una fitasa de Buttiauxella sp. BP111 se usa en producción de bioetanol. La secuencia para BP111 (excluyendo péptidos de señal) es la siguiente: NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPYTWPE PVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILPRGSCPTPNSI YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQRYIPELAL NT ILNFSKSPWCQKHSAD PCDLALSMPS LSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQG PQVAWGNIHSEQE ALLLKLHNV YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMR TLPGQPDNTPPGGALVFER LADKSG QYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPPGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá por referencia a las siguientes figuras.
Las figuras la y Ib presentan dos diagramas.
La figura 2 presenta un diagrama (formato 1: captura de enzima y ensayo de substrato de precipitación) .
La figura 3 presenta una serie de fotografías (etapas implicadas en el formato semiseco) .
La figura 4 presenta una fotografía (resultados de una serie de diluciones de fitasa BP17 usando el formato semiseco) .
La figura 5 presenta un diagrama (formato 2: ensayo de emparedado de anticuerpos conjugados a oro) .
La figura 6 presenta una serie de fotografías (un ejemplo de una prueba en formato seco) .
La figura 7 presenta una serie de fotografías (resultados de muestras preparadas en regulador de pH de acetato, agua MilliQ y agua de la llave) .
La figura 8 presenta una serie de fotografías (muestras en diferentes intervalos de tiempo) .
La figura 9 presenta una serie de fotografías (SDS-PAGE y Western blotting de muestras de pienso y fitasa BP17 purificada) .
La figura 10 presenta una serie de fotografías (comparación del formato de emparedado en oro y el formato de actividad enzimática en substrato de precipitación usando inhibidor específico de fitasa BP17 MIHS) .
La figura 11 presenta un diagrama y una fotografía (representación esquemática del formato de flujo continuo) .
La figura 12 presenta un diagrama (representación esquemática del formato de tira reactiva) .
La figura 13 presenta una fotografía (resultados de la prueba en formato de tira reactiva) .
La figura 14 presenta un diagrama (representación esquemática del formato de tira de absorción capilar) .
La figura 15 presenta una serie de fotografías (resultados de la prueba en formato de tira de absorción capilar) .
La figura 16 presenta una serie de fotografías (resultados de la prueba en formato de tira de absorción capilar usando diferentes agentes de bloqueo) .
La figura 17 presenta una serie de fotografías (variando la concentración de línea de prueba para modular la naturaleza semicuantitativa de la prueba. Formato de tira de absorción capilar) .
La figura 18 presenta una serie de fotografías (comparación entre NBT e INT usando el formato de tira de absorción capilar) .
La figura 19 presenta una serie de fotografías (prueba de una amplia variedad de tipos de nitrocelulosa para poder determinar el más adecuado) .
La figura 20 presenta una fotografía (prueba que reduce la concentración de agente de bloqueo de caseína en presencia de agente tensioactivo (Tween-20) ) .
La figura 21 presenta una serie de fotografías (añadiendo los reactivos de bloque directamente sobre la nitrocelulosa de prueba para probar si resultados satisfactorios podrían obtenerse) .
La figura 22 presenta una serie de fotografías (una serie de diluciones de concentraciones de fitasa BP17 probada con NC bloqueado sólo con tensioactivo con substratos tanto INT como NBT para probar la sensibilidad de este método) .
La figura 23 presenta una serie de fotografías (prueba de secado y almacenamiento de los diferentes componentes de substrato más claros juntos) .
La figura 24 presenta una serie de fotografías (una comparación entre el formato semiseco y el formato de pura solución) .
La figura 25 presenta una serie de fotografías (probar periódicamente soluciones para actividad sugiere que la solución de tetrazolio tiene buena estabilidad) .
La figura 26 presenta una fotografía de soluciones de prueba para actividad xilanasa.
La figura 27 presenta una fotografía de soluciones de prueba para actividad xilanasa.
La figura 28 presenta un diagrama esquemático para la prueba de la actividad de xilanasa activa.
La figura 29 presenta una serie de diagramas esquemáticos .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona un dispositivo para detectar enzima activa. El dispositivo puede usarse en el laboratorio y también fuera del laboratorio en diversos campos.
La presente invención proporciona un dispositivo de ensayo (1) para detectar enzima activa en una muestra. El dispositivo de ensayo (1) comprende los siguientes componentes: (a) una región de colocación (10) sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz (20) conectada operablemente a la región de colocación (10) de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación (10) pueda migrar a lo largo de la matriz (20) ; (c) al menos una ubicación de captura (30) distinta sobre la matriz (20) , en donde cada ubicación de captura (30) distinta está distanciada de la región de colocación (10) , y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura (30) distinta; (d) medios de captura (40) que están presentes en o definen cada ubicación de captura (30) distinta, en donde los medios de captura (40) son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de la enzima se retenga en al menos una ubicación de captura (30) distinta; y (e) medios de indicación selectiva (50) o al menos un componente de los mismos para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de enzima activa unidad a los medios de captura (40) .
Detectar la presencia de una enzima activa, y la cantidad de esta enzima, es de particular importancia en el campo de alimentos y piensos. La ausencia de enzima activa puede llevar pptencialmente a deficiencias de nutrientes y minerales en humanos y animales que. ingieran el alimento o pienso. La capacidad para detectar la presencia de una enzima puede no equipararse con la capacidad para detectar la presencia de enzima activa usando métodos existentes.
Como un ejemplo particular, fitato es la principal forma de almacenamiento de fósforo en cereales y legumbres. Sin embargo, los animales monogástrieos tales como cerdo, aves de corral y peces no son capaces de metabolizar o absorber fitato (o ácido fítico) y por lo tanto es excretado, llevando a contaminación con fósforo en áreas de intensa producción de ganado. Más aún, el ácido fítico también actúa como un agente antinutricional en animales monogástricos al quelar agentes metálicos tales como calcio, cobre y zinc.
A través de la acción de fitasa, el fitato es generalmente hidrolizado para dar fosfatos de inositol inferiores y fosfato inorgánico. Las fitasas son útiles como aditivos para piensos de animales en donde mejoran la disponibilidad de fósforo orgánico para el animal y reducen la contaminación con fosfato del ambiente (Wodzinski RJ, Ullah AH, Adv Appl Microbiol . 42, 263-302 (1996)). Sin embargo, si la fitasa contenida en un pienso es inactiva, esta no tendrá efecto de hidrolización de fitasa, lo cual podría llevar a malnutrición en animales. La presente invención hace posible por lo tanto que un operador tal como un cuidador de animales, granjero, veterinario, cuidador de zoológico, productor de aditivos para piensos, productor de piensos, científico o miembro del público pruebe un pienso para animal para ver si contiene enzima activa, tal como por ejemplo fitasa, y la cantidad de enzima activa, tal como fitasa.
La presente invención también podría usarse en un método para el control de calidad en la preparación de piensos o alimento, producción de biocombustibles o composiciones detergentes a las cuales una enzima, tal como una fosfatasa o una glicósido hidrolasa, de preferencia una fosfatasa ácida, una fitasa, una xilanasa, una amilasa o una ß-glucanasa, haya sido añadida.
ENSAYOS Y DISPOSITIVOS El término "dispositivo de ensayo" según se usa en la presente significa un aparato, colección de aparatos o equipo.
Un dispositivo de ensayo o aparato que comprende las características listadas en (a) a (e) arriba se muestra en las figuras la y Ib.
Con referencia a las figuras la y Ib, el dispositivo de ensayo (1) de la presente invención se muestra como dos modalidades - presentadas en la figura la (modalidad 1) y en la figura Ib (modalidad 2) .
En ambas modalidades, el dispositivo de ensayo (1) comprende una región de colocación (10) conectado operablemente a la matriz (20) . Por lo menos una ubicación de captura (30) distinta está presente en la matriz (20) . Medios de captura (40) están presentes en o definen cada ubicación de captura (30) distinta. En uso, el operador pone la muestra en la región de colocación (10) y la muestra migra a lo largo de la matriz (20) en la dirección mostrada por flechas. En la modalidad (1), medios de indicación selectiva (50) (no mostrados) , o al menos un componente de los mismos (no mostrado) , se añaden a o se constituyen en la ubicación de captura (30) . En un aspecto, los medios de indicación selectiva comprenden un reactivo (especie reactiva) que puede generar un cambio de color observable cuando la enzima activa haya reaccionado con un substrato. En ese aspecto, el reactivo puede ser suministrado en forma líquida al dispositivo en uso.
La modalidad 2 del dispositivo de ensayo (1) funciona de la misma manera que la modalidad 1. Sin embargo, en este caso el dispositivo de ensayo (1) consiste en dos mitades opuestas (2) y (3) las cuales están unidas por una sección de doblez o línea de doblez (70) . La región de colocación (10), conectada operablemente a la matriz (20) se pone en una mitad (2) del dispositivo. La ubicación o ubicaciones de captura (30) y medios de captura (40) se ponen en la matriz (20) . La misma o la mitad opuesta (3) del dispositivo comprende los medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos, y la mitad (3) opuesta comprende opcionalmente una almohadilla absorbente para absorber el exceso de muestra (60) .
Los medios de indicación selectiva (50) , o al menos un componente de los mismos, de la modalidad 2 se ponen en contacto con la matriz (20) y medios de captura (40) cuando el operador dobla la línea de doblez (70) . El operador puede tener que añadir los medios de indicación selectiva (50) o algunos componentes de los medios de indicación selectiva (50) al dispositivo en forma líquida. Como alternativa, los medios de indicación selectiva o al menos algunos componentes de los medios de indicación selectiva pueden estar presentes en forma seca en la posición (90) .
Opcionalmente preferida, la modalidad 2 comprende una ventana de observación (80) que permite que el operador vea el resultado del dispositivo de ensayo (en otras palabras, vea las ubicaciones de captura) una vez que las dos mitades (2) y (3) del dispositivo sean cerradas. La ventana de observación (80) puede hacerse de un material de plástico o puede ser una abertura abierta.
En la modalidad 2, una o cada una de las mitades (2, 3) puede hacerse de plástico o materiales de cartón, lo suficientemente rígidos como para proporcionar soporte.
Como se mencionó, el dispositivo de ensayo (1) comprende una región de colocación en donde se puede colocar una muestra. De preferencia la muestra es una muestra líquida. La matriz (20) está conectada operablemente a la región de colocación (10) de tal manera que la muestra pueda migrar de la región de colocación (10) a lo largo de la matriz (20) . De preferencia la matriz (20) es un material que permite que la muestra migre, tal como, por ejemplo, nitrocelulosa . La matriz (20) del dispositivo de ensayo (1) de la presente solicitud comprende al menos una ubicación de captura (30) distinta que está distanciada de la región de colocación (10) . La muestra puede migrar a través de la ubicación de captura (30) . De preferencia se usan tres ubicaciones de captura (30) . En cada ubicación de captura (30) en el dispositivo de ensayo (1) de la presente invención, están presentes medios de captura (40) . Los medios de captura (40) son capaces de unirse a la enzima que será detectada por el dispositivo de ensayo (1) . Al menos una muestra de la enzima es retenida en al menos una ubicación de captura (30) . Los medios de captura (40) son de preferencia anticuerpos y muy preferiblemente los medios de captura (40) son anticuerpos que se unen a la enzima. Los anticuerpos pueden ser desarrollados contra la enzima per se o contra un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) .
Medios de indicación selectiva (50) se usan en el dispositivo de ensayo (1) de la presente invención para proporcionar indicación selectiva de la presencia de una enzima activa unida a los medios de captura (40) . De preferencia los medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos están en posición (90) en la mitad opuesta del dispositivo de ensayo (1) en comparación con la matriz (20) . Preferiblemente los medios de indicación selectiva (50) comprenden una reacción de precipitación y/o proporcionan un cambio de color visible. El cambio dé color puede ser causado por la reacción de un substrato con la enzima. La reacción con un substrato indica que la enzima es activa y no simplemente presente en una forma inactiva o desnaturalizada .
En un aspecto preferido, el dispositivo es semicuantitativo - en el sentido de que la cantidad de enzima activa (cantidad de analito) es indicada por el número de ubicaciones de captura (30) del dispositivo que presenta visualmente un cambio de color y/o por la intensidad del cambio de color en las ubicaciones de captura si los medios de indicación selectiva generan un cambio de color cuando esté presente enzima activa.
El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención comprende de preferencia varias regiones que están conectadas operablemente. Las regiones incluyen de preferencia una región de colocación (10) . Más preferiblemente el dispositivo de ensayo (1) de la presente invención es un dispositivo de flujo lateral.
El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención puede comprender opcionalmente una "región indicadora" o "línea indicadora" (91) que indique si el dispositivo de ensayo ha funcionado correctamente. De preferencia la región o línea indicadora indica que el ensayo ha funcionado a través de un color o cambio de color. La región o línea indicadora opcional puede comprender anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser desarrollados contra una enzima per se o contra un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) en donde la enzima esté no relacionada con la enzima activa que será detectada. Además o como alternativa, la línea indicadora puede comprender una enzima relacionada o no relacionada que puede reaccionar con por lo menos algunos de los componentes del substrato. En una modalidad de la invención, el dispositivo y ensayo se usan para detectar enzima fitasa activa. ( En tal caso, la enzima relacionada o no relacionada en la línea indicadora puede ser una enzima que tenga actividad fosfatasa. A manera de ejemplo, la línea indicadora puede comprender una enzima relacionada o la misma enzima que la que va a ser detectada, por ejemplo, la línea indicadora puede comprender fitasa BP17 en un ensayo para detectar fitasa BP17. A manera de un ejemplo más, la línea indicadora puede comprender una enzima y un anticuerpo, en donde el anticuerpo puede ser específico para la enzima de la línea indicadora u otra enzima.
Un "ensayo" es el análisis de la composición química o concentración de una sustancia. Esto puede incluir la detección de un constituyente particular en una mezcla. El dispositivo de ensayo (1) se usa para llevar a cabo el ensayo de la invención, que es detectar enzima activa.
Los términos "inmunoensayo" y "ensayo" se usan indistintamente en esta solicitud en donde el término "ensayo" puede abarcar "inmunoensayo" . Un inmunoensayo es una forma de ensayo particular que usa la unión específica entre un antígeno y su anticuerpo para identificar una sustancia en una muestra.
El dispositivo de ensayo puede comprender preferiblemente un reactivo de bloqueo, o un reactivo de bloqueo puede añadirse al dispositivo.
El término "reactivo de bloqueo" se refiere a un agente que modula la interacción de la enzima activa que será detectada (es decir, los analitos) con los medios de captura, preferiblemente en donde los medios de captura comprenden anticuerpos. El reactivo de bloqueo permite el movimiento de la muestra a lo largo de la matriz del dispositivo de tal manera que la muestra completa no sea bloqueada por el primer medio de captura. El reactivo de bloqueo puede ser o puede comprender un tensioactivo . Ejemplos de reactivos de bloqueo adecuados o componentes de reactivos de bloqueo incluyen caseína y Dehquart CC6.
La matriz (20) puede comprender el reactivo de bloqueo. Como alternativa, el reactivo de bloqueo o un componente del mismo puede añadirse al dispositivo. El reactivo de bloqueo puede añadirse en o cerca de o incluso lejos de los componentes (30) del dispositivo de ensayo. El reactivo de bloqueo puede ser unido a la matriz (20) o aplicado sobre una almohadilla a la matriz (20) . El agente de bloqueo puede estar en una forma seca y/o una forma deshidratada .
ENZIMAS El término "enzima" según se usa en la presente se refiere a una proteína que cataliza las reacciones químicas de otras sustancias sin que a su vez sea destruida o alterada luego de la conclusión de las reacciones.
La enzima detectada por la presente invención puede ser una tipo silvestre, que es una enzima presente en la naturaleza, o una variante. Una "variante" es una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una o varias iniciaciones, supresiones, y/o sustituciones en comparación con la secuencia de origen de la cual se deriva la variante de tal enzima tipo silvestre o incluso una enzima variante, y la cual conserve una propiedad funcional y/o incremente una propiedad, por ejemplo, una actividad potenciada, de la enzima. Según se usa en la presente, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína" .
El término "enzima activa" según se usa en la presente se refiere a una enzima que conserva su función catalítica. Por ejemplo, la fitasa es capaz de catalizar la hidrólisis de ésteres de ácido fosfórico.
El término "enzima inactiva" se refiere a enzima que está presente en una muestra pero es incapaz de llevar a cabo su función catalítica. La inactivación puede ocurrir debido a la desnaturalización de la enzima, debido al tratamiento térmico o debido al tratamiento químico o tratamiento o procesamiento por otra enzima tal como proteólisis por una proteasa o desglicosilación por una glicosidasa. La inactivación también puede deberse a un inhibidor químico. En caso de que la enzima sea fitasa, tal como por ejemplo fitasa BP17, un inhibidor que puede ser usado es hexasulfato de mioinositol (MIHS) .
Ejemplos de enzimas detectadas por la presente invención incluyen fosfatasas y glicósido hidrolasas.
Las fosfatasas o monoéster fosfórico hidrolasas (EC 3.1.3) son enzimas capaces de liberar grupos fosfato a partir de su substrato. Las fosfatasas útiles incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1), fosfatasa ácida (EC3.1.3.2), 3-fitasa (EC 3.1.3.8) o 6-fitasa (EC 3.1.3.26). De preferencia la enzima detectada por el dispositivo de ensayo de la presente invención es una fitsa. Preferiblemente la enzima es 6-fitasa y muy preferiblemente la enzima es 6-fitasa (BP17) derivada de Buttiauxella sp.
La 6-fitasa es también llamada "4-fitasa" o "fitato 6-fosfatasa" . Fitasas adicionales incluyen histidina ácido fitasas (HAP) , que es un grupo que comprende miembros encontrados entre los procariontes (por ejemplo, fitasa appA de Escherichia coli) y eucariontes (phyA y B de Aspergillus sp., fitasas HAP de levadura y plantas. Las fitasas HAP comparten un motivo de sitio activo común, RHGXRXP, en el extremo N-terminal y un motivo HD en el extremo C-terminal en sus secuencias de ADN. Esto permite un mecanismo de dos etapas en la hidrólisis de fosfomonoésteres . La phyA y phyB de A. niger y appA de E. coli son los representantes que han sido los más caracterizados.
En un aspecto preferido, la enzima es una fitasa y la actividad de enzima activa se determina por la reducción de una especie reactiva - tal como una sal tetrazolio - para producir un efecto visualmente observable, tal como un precipitado visualmente observable que puede ser coloreado. El dispositivo es semicuantitativo y la cantidad de analito es indicada por el número de ubicaciones de captura (30) del dispositivo que presenten un cambio de color debido al precipitado. La reducción con tetrazolio que produce color es en esencia una medida indirecta de la acción de la enzima fosfatasa sobre su propio substrato. A este respecto, un agente reductor o porción reactiva se genera que luego actúa en el tetrazolio para generar colorante de formazan.
En una modalidad la enzima detectada por la presente invención es una 6-fitasa de, por ejemplo, Buttiauxella s . Trichoderma reesei, E. coli, Aspergillus niger, Citrobacter braakii, Citrobacter freundii , Peniphora lycii o Penicillium funiculosum.
En una modalidad la enzima detectada por la presente invención es una 6-fitasa de, por ejemplo, Citrojbacter freundii , de preferencia C. freundii NCIMB 41247 y variantes de las mismas, por ejemplo, como se describe en WO2006/038062 (incorporada en la presente por referencia) y WO2006/038128 (incorporada en la presente por referencia), Citrojbacter braakii YH-15 como se describe en O 2004/085638, Citrobacter braakii ATCC 51113 como se describe en WO2006/037328 (incorporada en la presente por referencia) , así como variantes de las mismas, por ejemplo, como se describe en W02007/112739 (incorporada en la presente por referencia) y WO2011/117396 (incorporada en la presente por referencia) , Citrobacter amalonaticus, de preferencia Citrojbacter amalonaticus ATCC 25405 o Citrojbacter amalonaticus ATCC 25407 como se describe en WO2006037327 (incorporada en la presente por referencia), Citrojbacter gilenii, preferiblemente Citrobacter gilleniii DSM 13694 como se describe en WO2006037327 (incorporada en la presente por referencia), o Citrobacter intermedius, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sediakii , Citrobacter werkmanii , Citrobacter youngae, polipéptidos de la especie Citrobacter o variantes de los mismos .
En una modalidad, la fitasa puede ser una fitasa de Citrobacter, por ejemplo, de Citrobacter freundii, tal como las enzimas fitasas enseñadas en WO2006/038128 , cuya referencia se incorpora en la presente a manera de referencia.
En algunas modalidades, la fitasa es de preferencia fitasa de E. coli comercializada con el nombre Phyzyme XP™ por DuPont Nutrition Biosciences ApS.
Como alternativa la fitasa puede ser una fitasa de Buttiauxella, por ejemplo, una fitasa de Buttiauxella agrestis, por ejemplo, las enzimas fitasa enseñadas en WO 2006/043178, WO 2008/097619, WO09/129489, WO2008/092901 o WO10/122532, todas las cuales se incorporan en la prsente por referencia .
En una modalidad la fitasa puede ser una fitasa de Hafnia, por ejemplo de Hafnia alvei, tal como las enzimas fitasa enseñadas en US2008263688 , referencia que se incorpora en la presente por referencia.
En una modalidad la fitasa puede ser una fitasa de Aspergillus, por ejemplo, de Aspergillus orzyae.
En una modalidad, la fitasa puede ser una fitasa de Penicillium, por ejemplo de Penicillium funiculosum.
Se entenderá que según se usa en la presente 1 FTU (unidad fistasa) se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µp??? de ortofosfato inorgánico a partir de un substrato en un minuto bajo las condiciones de reacción definidas en el ensayo de fitasa ISO 2009 - un ensayo estándar para determinar la actividad fitasa y 1 FTU puede encontrarse en International Standard ISO/OIS 30024: 1-17, 2009.
Como alternativa, según se usa en la presente una unidad de fitasa (FTU) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fósforo inorgánico/minuto a partir de 0.00015 mol/L de fitato de sodio a pH 5.5 a 37 grados centígrados (Denbow, L.M. V. Ravindran, E. T. Kornegay, Z. Yi y . M. Hulet . 1995. Improving phosphorus availability insoybean meal for broilers by supplemental phytase . Poult. Sci. 74:1831-1842)".
En una modalidad, adecuadamente la enzima se clasifica usando la clasificación E.C. arriba, y la clasificación E.C. designa una enzima que tiene esa actividad cuando se prueba en el ensayo enseñado en la presente para determinar 1 FTU. .
Otro grupo de enzimas que pueden detectarse por el dispositivo y método de ensayo de la presente invención es el grupo de glicósido hidrolasas (EC 3.2.1), es decir, enzimas que hidrolizan compuestos de 0- y S-glicosilo. Una propiedad común adicional de este grupo de enzimas es que liberan por ejemplo un fragmento o producto que tiene un grupo extremo reductor (que contiene grupo aldehido). Ejemplos de este grupo incluyen xilanasas, tales como endo- 1 , 4 -ß-xilanasa (EC 3.2.1.8) y xilano endo- 1 , 3 -ß-xilosidasa (EC 3.2.1.32), de preferencia xilano 1 , 4 -beta-xilosidasa (EC 3.2.1.37); oc-amilasa (EC 3.2.1.1); ß-amilasa (EC 3.2.1.2); oligo-1,6-glucosidasa (EC 3.2.1.10); glucano 1 , 4-alfa-glucosidasa (EC 3.2.1.3); pululanasa (EC 3.2.1.41); celulasa (EC 3.2.1.4); endo-1 , 3 (4) -beta-glucanasa (EC 3.2.1.6); o glucano endo-1,3-beta-D-glucosidasa (EC 3.2.1.39).
La xilanasa es el nombre dado a una clase de enzimas que degradan el polisacárido beta- 1 , 4 -xilano en xilosa , degradando de esta manera hemicelulosa , uno de los principales componentes de las paredes de células vegetales.
La xilanasa útil en la presente invención puede ser cualquier xilanasa disponible comercialmente .
De manera adecuada, la xilanasa puede ser una endo-1 , 4 -ß-d-xilanasa (clasificada como E.C. 3.2.1.8) o una 1,4-ß-xilosidasa (clasificada como E.C. 3.2.1.37).
En una modalidad, de preferencia la xilanasa es una endoxilanasa, por ejemplo, una endo- 1 , 4 -ß-d-xilanasa . La clasificación para una 1 , 4 -ß-d-xilanasa es E.C. 3.2.1.8.
Las amilasas también pueden detectarse por el dispositivo y método de ensayo de la presente invención.
Amilasa es el nombre dado a una clase de enzimas capaces de hidrolizar almidón a oligosacáridos de cadena más corta tales como maltosa. La porción de glucosa puede ser entonces más fácilmente transferida de maltosa a un monoglicérido o monoglicérido de glicosilo que de la molécula de almidón original .
El término amilasa incluye a-amilasas (E.C. 3.2.1.1), amilasas formadoras de G4 (E.C. 3.2.1.60), ß-amilasas (E.C. 3.2.1.2) y ?-amilasas (E.C. 3.2.1.3).
En una modalidad, de preferencia la amilasa es una -amilasa. Las OC-amilasas se clasifican como (E.C. 3.2.1.1).
De preferencia, el substrato es un substrato de fosfatasa y más preferiblemente el substrato de fosfatasa es ácido 2-fosf-L-ascórbico trisódico (AsAP) .
MUESTRA El término "muestra" según se usa en la presente significa un espécimen o extracción de la sustancia o composición recolectada para análisis para determinar si está presente enzima activa.
La muestra es de preferencia un líquido. La muestra se obtiene de preferencia al colocar, disolver, licuar o triturar la sustancia o composición que se analizará en un solvente, tal como agua. De preferencia la muestra es una muestra acuosa. Agua de la llave o purificada y agua desionizada tal como una MilliQ u otra solución acuosa adecuada puede ser usada. Se contempla que para preparar la muestra cierta forma de extracción puede requerirse para permitir que la sustancia o composición sea analizada para mezclarse con, degradar y/o disolverse en el solvente. Por ejemplo, se puede usar agitación.
Se contempla que se producirá un kit en el que el operador llenará un recipiente de extracción de muestras (por ejemplo, un tubo, bolsa de plástico o lata) hasta un nivel predeterminado (marcado por una línea en el recipiente) con alimento o pienso o biocombustible o composición detergente y luego llenar el tubo hasta una segunda línea con agua tal como agua de la llave, agua purificada o desionizada. Posteriormente el recipiente de extracción es de preferencia agitado. Esto hará posible al operador tomar la muestra de una manera uniforme.
La muestra de la presente invención puede derivarse, extraerse o tomarse de un alimento o pienso, o de una composición de alimento o pienso, o de un detergente o de una composición detergente o de producción de etanol o biocombustible . Aquí, el término "alimento" se usa en un amplio sentido - y cubre alimento para humanos así como alimento para animales (es decir, un pienso) . En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano. En otro aspecto preferido, el alimento es un pienso para animales no humanos .
El alimento o pienso puede estar en forma de una suspensión, o solución, o suspensión, o como un sólido tal como un gránulo dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o el modo de administración.
Los términos "alimento" y "pienso" también puede referirse a un ingrediente de alimento. La muestra de la presente invención puede derivarse, extraerse o tomarse de un ingrediente de alimento.
Según se usa en la presente el término "ingrediente de alimento o pienso" incluye una formulación que es o puede ser añadida a alimentos o artículos alimenticios funcionales como un suplemento nutricional y/o suplemento de fibra. El término "ingrediente de alimento o pienso" según se usa aquí se refiere también a formulaciones que pueden ser usadas a bajos niveles en una amplia variedad de productos para dar efectos funcionales benéficos relevantes para el pienso o alimento particular deseado, incluyendo pero no limitado a gelificación, texturización, estabilización, emulsionamiento, suspensión, formación de película y estructuración, retención de jugosidad y sensación bucal mejorada, sin añadir viscosidad .
En una modalidad más, el "ingrediente para alimento o pienso" incluye intermedios alimenticios tales como composiciones para mejorar pan o masa antes de hornear. En el área de aplicación de repostería, las enzimas se añaden típicamente a las composiciones de masa antes del horneo, y en modalidades preferidas la desnaturalización de las enzimas durante el proceso de horneo termina más actividad enzimática. Por lo tanto, el ensayo de enzima de la presente invención debe llevarse a cabo en la masa o composición de ingrediente de masa antes del horneo. En una modalidad más, la presente invención puede usarse en composiciones de alimento lácteo que contengan componentes de cereal, de preferencia avena, centeno, arroz, trigo, salvado de trigo o derivados procesados de los mismos. De preferencia la composición de alimento lácteo es un yogurt, queso o bebida de cultivo.
El ingrediente alimenticio puede estar en forma de una solución, o suspensión, o como un sólido tal como un gránulo dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.
Los términos "alimento" y "pienso" también se pueden referir a un aditivo para alimentos. La muestra de la presente invención puede derivarse, extraerse o tomarse de un aditivo para alimento.
Según se usa en la presente, el término "aditivo para alimento o pienso" incluye formulaciones que mejoran la digestión en alimento y piensos para animales. En particular "aditivo para alimentos o piensos" se refiere a fitasas que pueden usarse para mejorar la digestión de fosfato en alimentos y piensos animales.
El aditivo para alimento puede estar en forma de una solución, o suspensión, o como un sólido tal como un gránulo dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.
La composición de pienso, y/o aditivo para piensos puede comprender uno o más materiales de pienso seleccionado del grupo que cosiste (a) cereales tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes tales como maíz o sorgo; b) subproductos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, Solubles de Grano Seco de Destilador (DDGS, por sus siglas en inglés) , (particularmente Solubles de Grano Seco de Destilador a Base de Maíz (cDDGS) , salvado de trigo, harinillas de trigo, subproductos de molienda de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, corteza de palma y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soya, girasol, cacahuate, lupino, guisantes, habas, algodón, cañóla, harina de pescado, proteína de plasma seca, harina de carne y hueso, proteína de papa, suero, copra, ajonjolí; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.
La presente invención es útil para detectar enzima activa en producción de biocombustibles , tal como producción de bioetanol .
ESTRUCTURA DEL DISPOSITIVO DE ENSAYO El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención comprende una región de colocación (10) . El término "región de colocación" se usa en la presente para referirse a una región del dispositivo de ensayo (1) sobre la cual se puede poner la muestra. De preferencia, la región de colocación (10) es una almohadilla absorbente. La región de colocación (10) está conectada operablemente a una matriz (20) . La región de colocación (10) puede ser contigua o continua con la matriz (20) . La región de colocación (10) puede ser una región integral de la matriz (20) . De preferencia, la región de colocación (10) está en un extremo de la matriz (20) . Opcionalmente está presente una almohadilla absorbente adicional para absorber el exceso de muestra (60) .
En el contexto de la presente invención, "conectado operablemente" significa unida, sujetada o en contacto con durante el funcionamiento del dispositivo.
De preferencia la matriz (20) es o comprende un material absorbente. Muy preferiblemente la matriz (20) es o comprende nitrocelulosa . Por ejemplo, la matriz (20) puede ser o puede comprender nitrocelulosa tipo MDI 90 CNPH, MDI SS12 12µ o SS12 15µ.
Cuando esté presente o se coloque en la región de muestra (10) , la muestra puede migrar a lo largo de la matriz (20) . De preferencia la migración es migración líquida tal como acción capilar. Preferiblemente la migración es en una dirección longitudinal, y más preferiblemente esto ocurre cuando el dispositivo de ensayo (1) es una tira o varilla. De preferencia la varilla o tira está contenida en un alojamiento .
Un reactivo de bloqueo puede añadirse al dispositivo de ensayo. La matriz (20) puede comprender el reactivo de bloqueo. El reactivo de bloqueo puede ser unido a la matriz (20) y el agente de bloqueo puede estar en una forma seca o deshidratada. Aquí, "unido" incluye acoplado o fijado. El reactivo de bloqueo puede estar unido directa o indirectamente a la matriz. El reactivo de bloqueo puede ser cualquier reactivo de bloqueo adecuado. Un ejemplo de un reactivo de bloqueo es caseína. El reactivo de bloqueo puede ser o puede comprender un tensioac ivo . El reactivo de bloqueo comprende de preferencia un tensioactivo . El reactivo de^ bloqueo es de preferencia un tensioactivo no iónico y/o un tensioactivo zwitteriónico . Por ejemplo, el tensioactivo puede ser Tween-20 o Dehquart CC6.
El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención comprende al menos una ubicación de captura (30) distinta en la matriz (20) . Cada ubicación de captura (30) está distanciada de la región de colocación (10) y la muestra puede migrar a través de las distintas ubicaciones de captura (30) . "Distintas" según se usa en la presente en este contexto significa separadas de otras ubicaciones de captura (30) .
El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención puede comprender varias ubicaciones de captura (30) distintas; de preferencia más de dos ubicaciones de captura (30) distintas y más preferiblemente el dispositivo comprende tres ubicaciones de captura (30) distintas.
El dispositivo de ensayo (1) puede tener dos o más regiones de ubicación de captura, cada región comprendiendo una o más ubicaciones de captura (30) discretas. Por ejemplo, cuando se tienen tres regiones de ubicaciones de captura discretas puede ser posible capturar al menos tres tipos diferentes de enzimas, tales como por ejemplo, fitasa, xilanasa y amilasa en una muestra y una medición.
En cada ubicación de captura (30) hay medios de captura (40) . Los medios de captura (40) en cada ubicación de captura (30) pueden ser diferentes o pueden ser los mismos. Los medios de captura (40) son capaces de unirse a la enzima que va a ser detectada por el dispositivo de ensayo (1) . Esto se traduce en que al menos una muestra o parte de la muestra de la enzima sea retenida en al menos una ubicación de captura (30) distinta. La unión es entre los medios de captura (40) y la enzima es de preferencia el resultado de unión anticuerpo/antígeno . Los medios de captura (40) solos pueden definir la ubicación de captura (30) .
La cantidad de medios de captura (40) en cada ubicación de captura (30) distinta del dispositivo de ensayo (1) puede ser diferente o la misma. La cantidad de medios de captura (40) en cada ubicación de captura (30) distinta puede incrementarse entre más lejos esté la ubicación de la región de colocación (10) . La cantidad de medios de captura (40) en cada ubicación de captura (30) distinta puede reducirse entre más lejos esté la ubicación de la región de colocación (10) .
En algunas modalidades, la cantidad de medios de captura (40) en cada ubicación de captura (30) distinta del dispositivo de ensayo (1) es sustancialmente la misma.
El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención puede comprender opcionalmente una región o línea indicadora (91) que indique si el dispositivo de ensayo ha funcionado correctamente. De preferencia la región o línea indicadora indica que el ensayo ha funcionado a través de un cambio de color. La región o línea indicadora opcional puede comprender anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser desarrollados contra una enzima per se o cuando un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) , en donde la enzima no esté relacionada con la enzima activa que será detectada. Además de o como alternativa, la línea indicadora puede comprender una enzima no relacionada que pueda reaccionar con al menos algunos de los componentes del substrato.
ANTICUERPOS Los medios de captura (40) de la presente invención son de preferencia anticuerpos que se unen a la enzima activa a ser detectada por el dispositivo de ensayo (1) . Los anticuerpos pueden ser desarrollados contra la enzima per se o contra un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) .
La región o línea indicadora (91) opcional del dispositivo de ensayo (1) de la presente invención puede comprender anticuerpos.
Más preferiblemente, los medios de captura (40) son anticuerpos desarrollados contra una fitasa o un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma), tal como fitasas BP17, BP11 o BP111.
Se pueden producir anticuerpos por técnicas estándares, tal como por inmunización con la enzima de interés, como una mezcla, muestra purificada o un fragmento de la misma o usando una biblioteca de despliegue de fagos.
Para los efectos de esta invención, el término "anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye, pero no está limitado a, policlonales , monoclonales , quiméricos, de una sola cadena, fragmentos Fab, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, así como miméticos de los mismos. Estos fragmentos incluyen fragmentos de anticuerpos enteros que conservan su actividad de unión para una sustancia objetivo, fragmentos Fv, F(ab') y F(ab' )2# así como anticuerpos de cadena individual (scFv) , proteínas de fusión y otras proteínas sintéticas que comprenden el sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Más aún, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados.
Anticuerpos neutralizantes (es decir, aquellos que inhiben la actividad biológica de los polipéptidos de sustancia y los cuales se usan comúnmente en terapéuticos) no se prefieren para el dispositivo o ensayo de la presente invención .
Si se desean anticuerpos policlonales, un animal seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, etc.) es inmunizado con la enzima que será detectada (o un fragmento de polipéptido que comprenda un epítopo inmunológico de la misma) . Dependiendo de la especie anfitriona, pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica .
Suero del animal inmunizado es recolectado y tratado de acuerdo con procedimientos conocidos. Si suero que contiene anticuerpos policlonales contra la enzima a ser detectada por el dispositivo de ensayo de la presente invención, y/o secuencia de aminoácidos de esa enzima (o una secuencia que comprenda un epítopo inmunológico de la misma) contiene anticuerpos contra otros antígenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse por cromatografía de inmunoaf inidad. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales se conocen en la técnica (por ejemplo, Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl . 1973, 1:161-4) . En la sección de ejemplos, la metodología de Harboe (véase arriba) se usó para generar anticuerpos contra la enzima fitasa BP17. Sin embargo, podrían usarse otras técnicas y/u otras enzimas podrían usarse para generar anticuerpos adecuados.
Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la enzima a ser detectada por el dispositivo de ensayo (1) de la presente invención, y/o secuencia de aminoácidos de esa enzima (o una secuencia que comprenda un epítopo inmunológico de la misma) también pueden producirse fácilmente por un experto en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, la técnica de hibridoma Koehler y Milstein (1975 Nature 256:495-497), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al., (1983) Proc Nati Acad Sci 80:2026-2030) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan Rickman Liss Inc, páginas 77-96) .
Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" , el empalme de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno adecuada y actividad biológica (Morrison et al., (1984) Proc Nati Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al., (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al., (1985) Nature 314:452-454).
Como alternativa, técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (US4946779) pueden ser adaptadas para producir los anticuerpos de cadena individual específicos de sustancia.
También se pueden generar fragmentos de anticuerpo que contengan sitios de unión específicos para la sustancia. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero no están limitados a, los fragmentos F(ab' )2 que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que puedan generarse al reducir los puentes de disulfuro a los fragmentos F(ab' )2- Como alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab para permitir una rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD et al., (1989) Science 256:1275-128 1).
En algunas modalidades, de preferencia los anticuerpos son anticuerpos policlonales .
Los anticuerpos pueden ser modificados - por ejemplo, derivados - para adecuarse aún mejor al dispositivo o al ensayo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser acoplado con una o más porciones químicas que permitan la fij ción/acoplamiento específico a matrices tales como plásticos derivados.
MEDIO DE INDICACIÓN SELECTIVA El dispositivo de ensayo de la presente invención comprende un medio de indicación selectiva (50) o al menos un componente del mismo para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura (40) . El medio de indicación selectiva (50) puede comprender una reacción de precipitación.
En un aspecto, el dispositivo de ensayo comprende todos o sustancialmente todos los medios de indicación selectiva .
En otro aspecto, el dispositivo de ensayo es provisto con al menos un componente de los medios de indicación selectiva. En ese caso, el dispositivo de ensayo es provisto con los demás componentes de los medios de indicación selectiva. En un aspecto, los medios de indicación selectiva están constituidos en y/o en el dispositivo de ensayo cuando el dispositivo de ensayo está en uso. El término "constituido" incluye mezclar o poner en contacto los componentes para generar el medio de indicación selectiva .
En otro aspecto, se proporciona un kit en el que un dispositivo es provisto que puede ser usado como el dispositivo de ensayo de la presente invención y en donde el kit es provisto con los medios de indicación selectiva. En uso, todos o algunos de los componentes del medio de indicación selectiva son después añadidos al dispositivo para de esta manera formar el dispositivo de ensayo de la presente invención .
El término "proporciona/provisto" según se usa en la presente se refiere a ser capaz de suministrar la indicación por su propia cuenta o como parte de un sistema. Como alternativa, el término "proporciona/provisto" se refiere a un kit o dispositivo que contiene o comprende el componente identificado.
Los medios de indicación selectiva (50) pueden comprender o proporcionar un cambio de color visible. El cambio de color es causado preferiblemente por la reacción de un substrato de la enzima para formar una porción que reaccione con una especie reactiva. El substrato puede ser unido a la matriz (20) .
El material en el cual actúa una enzima se conoce como su "substrato" . De preferencia el substrato de la enzima es unido al dispositivo de ensayo (1) . Aquí, "unido" incluye acoplado o fijado. El substrato puede ser un unido directa o indirectamente al dispositivo. Muy preferiblemente el substrato es unido a la matriz (20) del dispositivo de ensayo (1) , o puede estar presente en la mitad opuesta (3) del dispositivo en posición (50) . El substrato está de preferencia en una forma seca.
Preferiblemente la enzima actúa en su substrato para generar una porción reactiva. La porción reactiva puede entonces actual en una especie reactiva para generar un efecto funcional, de preferencia un efecto visualmente observable tal como un cambio de color.
La porción reactiva también puede ser denominada en la presente una porción, una porción reductora, especie reductora o un agente reductor.
El substrato puede ser un substrato de fosfatasa o un compuesto con un grupo donador de fosfato. De preferencia, el substrato es un substrato de fosfatasa ácida. Para algunos aspectos, la remoción del grupo donador de fosfato produce un agente reductor o porción reactiva. De preferencia el substrato de fosfatasa es ácido 2-fosfo-L-ascórbico trisodio (AsAP) . Otros e emplos incluyen análogos, tales como sales de 2-fosfato de ascorbilo alternativas (por ejemplo, magnesio, zinc, calcio) o el derivado de 3-0-fosfato. Otros ejemplos posibles incluyen versiones esterificadas de fosfato de ascorbilo (palmitato de fosfoascorbilo) .
Cuando el medio de indicación selectiva (50) comprende un cambio de color causado por la reacción de un substrato de la enzima para formar una porción que reaccione con una especie reactiva, la especie reactiva puede ser un compuesto de tetrazolio. A este respecto, el cambio de color es causado por la formación de un colorante de formazán como resultado de la reacción enzimática.
Las sales de tetrazolio han sido usadas en la industria para eliminar sustancias que podrían alterar el cambio de color de una reacción de oxidorreducción . Por ejemplo, véase US 5,196,314. Además, el cambio de color de una sal de tetrazolio ha sido usado como un indicador de la presencia de un analito en US 5,360,595.
En la presente invención, la especie reactiva puede ser un compuesto de tetrazolio nitroazul. La especie reactiva puede ser cloruro de tetrazolio nitroazul (NBT) . La especie reactiva puede como alternativa ser un compuesto de halonitrotetrazolio . La especie reactiva puede ser de preferencia un compuesto de yodonitrotetrazolio . Preferiblemente la especie reactiva es cloruro de yodonitrotetrazolio (INT).
Al medio de indicación selectiva, y más preferiblemente a la especie reactiva, se le puede añadir una entidad capaz de reducir o prevenir la difusión del precipitado. Esto mejora la calidad del resultado, y mejora muy preferiblemente las líneas visuales del precipitado. De manera más preferible esta entidad es polietilenglicol y de manera demasiado preferible se añade a las sales de tetrazolio .
Así, en un aspecto preferido, se describe un dispositivo de ensayo de flujo lateral (1) que detecta enzima activa en una muestra. De preferencia la enzima es una fosfatasa ácida y la actividad de enzima se determina por reducción de una sal de tetrazolio para producir un precipitado de color. El dispositivo es semicuantitativo y la cantidad de analito se indica por el número de ubicaciones de captura (30) del dispositivo que presenten un cambio de color debido al precipitado.
Cuando el medio de indicación selectiva (50) comprende un substrato de fosfatasa como el descrito arriba, el substrato de fosfatasa puede hacerse reaccionar con la especie reactiva, como se describió arriba, en presencia de un potenciador de reacción. El potenciador de reacción puede ser unido a una matriz secundaria. El potenciador de reacción puede ser un compuesto de fenazina.
De preferencia el potenciador de reacción es un compuesto de metosulfato. Muy preferiblemente el potenciador de reacción es metosulfato de fenazina (PMS) .
En modalidades preferidas la enzima activa que será detectada actúa en el substrato para generar una porción reactiva o agente reductor que luego actúe en una entidad que produzca un efecto observable.
En una modalidad preferida, la enzima es fitasa, el substrato es substrato de fosfatasa o un compuesto con un grupo donador de fosfato.
En otra modalidad preferida la enzima es xilanasa, el substrato es xilano y la porción reactiva es xilosa.
En otra modalidad preferida la enzima es amilasa, el substrato es almidón y la porción reactiva es glucosa.
En una modalidad preferida la entidad es sal de tetrazolio y el efecto observable es un efecto visible, muy preferiblemente un cambio de color.
MODALIDADES PREFERIDAS Dos modalidades preferidas del dispositivo de ensayo (1) de la presente invención se muestran en la figura la y figura Ib.
De preferencia, el dispositivo de ensayo (1) es una tira o varilla. A lo largo de esta tira o varilla una muestra de líquido puede incluir longitudinalmente en la dirección mostrada por flechas en la figura 1. El cuerpo de la tira o varilla comprende la matriz (20) . Al igual que en la modalidad 1 de dispositivo (figura la) , la región de colocación (10) está de preferencia en un extremo de la tira o varilla. Las ubicaciones de captura (30) están de preferencia en el extremo opuesto de la tira o varilla a la región de colocación (10) .
El medio de indicación selectiva (50) o un componente del mismo puede añadirse al dispositivo de ensayo cuando esté en uso. Preferiblemente estos medios de indicación o al menos un componente del mismo están en forma líquida. De preferencia todos los reactivos se secan excepto el medio de indicación selectiva (50) o algún componente del medio de indicación selectiva (50) . Como alternativa, todos los reactivos pueden estar en una forma seca o deshidratada.
La modalidad preferida 2 del dispositivo de ensayo (1) se muestra en la figura Ib. En este caso el dispositivo de ensayo (1) consiste en dos mitades opuestas que son conectadas por una sección de doblez o línea de doblez (70) . La región de colocación (10), conectada operablemente a la matriz (20) se pone en una mitad (2) del dispositivo. Las ubicaciones de captura (30) y medios de captura (40) se ponen en la matriz (20) . La misma (2) o mitad opuesta (3) del dispositivo comprende el medio de indicación selectiva, o al menos un componente del mismo, y opcionalmente la mitad opuesta (3) comprende una almohadilla absorbente para absorber el exceso de muestra.
Cuando se usa la modalidad 2, el operador pone la muestra en la región de colocación (10) . El/ella permite entonces que la muestra fluya hasta al menos una posición requerida. Después, él/ella cierra el dispositivo a lo largo de la sección de doblez (70) . Esto pone al medio de indicación selectiva (50) , o al menos un componente del mismo, en contacto con la matriz (20) y medio de captura (40) . El operador puede tener que añadir el medio de indicación selectiva (50) o algunos componentes del medio de indicación selectiva (50) al dispositivo en forma líquida.
Para algunas modalidades, el medio de indicación selectiva o algunos componentes del medio de indicación selectiva pueden estar presentes en forma seca en la posición (90) . De preferencia todos los reactivos son secos. En algunas modalidades una solución de tetrazolio de ya sea INT o NBT puede añadirse por el operador a la posición (50) o (30) .
De manera opcionalmente preferible, la modalidad 2 comprende una ventana de observación (80) que permite que el operador vea el resultado del dispositivo de ensayo (en otras palabras, ver las ubicaciones de captura) una vez que las dos mitades (2) y (3) del dispositivo sean cerradas.
El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención puede comprender opcionalmente una región o línea indicadora que indique si el dispositivo de ensayo ha funcionado correctamente. De preferencia la región o línea indicadora indica que el ensayo ha funcionado a través de un cambio de color. La región o línea indicadora opcional puede comprender anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser desarrollados contra una enzima per se o contra un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) en donde la enzima no esté relacionada con la enzima activa a ser detectada. Además o como alternativa, la línea indicadora puede comprender una enzima no relacionada que pueda reaccionar con al menos algunos de los componentes del substrato.
Además de o como alternativa, la región indicadora puede comprender una fosfatasa ácida o fitasa no relacionada con la fitasa que será detectada.
En una modalidad, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo para detectar enzima activa en una muestra; en donde el dispositivo comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como colocada) en la región de colocación puede migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta en la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta; (d) medios de captura están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de la enzima sea retenida en al menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura.
De preferencia, la enzima es fitasa.
En un aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo para detectar enzima activa en una muestra; en donde el dispositivo en uso comprende: una región de colocación sobre la cual se puede poner la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) en la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) por lo menos una ubicación de captura distinta en la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta; (d) medios de captura están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de la enzima sea retenida en al menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida al medio de captura .
De preferencia, la enzima es fitasa.
En una modalidad, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo para detectar enzima activa en una muestra; en donde el dispositivo comprende: (a) una región de colocación en la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como colocada) en la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) por lo menos una ubicación de captura distinta en la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta; (d) medios de captura están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de la enzima sea retenida en al menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura; y en donde la enzima es una fitasa y en donde los medios de indicación selectiva comprenden una fosfatasa ácida.
SE ICUANTITATIVA El dispositivo de ensayo (1) de la presente invención puede proporcionar una medida al menos semicuantitativa de la cantidad de enzima activa en una muestra .
De preferencia la cantidad es en relación con el número de ubicaciones de captura (30) que indican la presencia de enzima unida. Como alternativa, la medición semicuantitativa puede hacerse usando la intensidad de un cambio de color en la ubicación o ubicaciones de captura (30) .
La intensidad de un cambio de color puede ser evaluado usando una tarjeta de puntuación o tarjeta de referencia, de preferencia en donde el operador compare la intensidad de la reacción de color en la matriz (20) con la tarjeta de puntuación. Además, o como alternativa, el usuario puede usar un dispositivo electrónico que pueda leer el cambio de color y reportar al usuario los resultados de su análisis. A manera de ejemplo, el dispositivo electrónico puede ser un teléfono móvil que puede comprender una aplicación adecuada.
La medición semicuantitativa puede determinar si la cantidad de enzima activa está por arriba o debajo de cierta cantidad o concentración, por ejemplo arriba o debajo de 300 FTU/g.
MÉTODOS Y USOS DE LA INVENCIÓN Como se describió arriba, la presente invención proporciona un método o uso (por ejemplo, usando el dispositivo de la presente invención) para determinar si hay enzima activa presente en una muestra. De preferencia este método es semicuantitativo . El método incluye usar el dispositivo de ensayo (1) descrito en la presente con una muestra, y comparar los resultados con otras muestras.
Una muestra que contenga más enzima activa causa que más ubicaciones de captura (30) indiquen la presencia de enzima activa unida.
Como alternativa o además una muestra que cause un cambio de color más fuerte (por ejemplo, más oscuro) en ubicaciones de captura contiene más enzima activa.
De preferencia el método se usa para determinar fosfatasas activas o monoéster fosfórico hidrolasas (EC 3.1.3) y glicósido hidrolasas (EC 3.2.1), incluyendo fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1), fosfatasa ácida (EC3.1.3.2), 3-fitasa (EC 3.1.3.8), 6-fitasa (EC 3.1.3.26), endo-l,4-P~ xilanasa (EC 3.2.1.8) y xilano endo- 1 , 3 -ß-xilosidasa (EC 3.2.1.32), de preferencia xilano 1 , 4 -beta-xilosidasa (EC 3.2.1.37); a-amilasa (EC 3.2.1.1), ß-amilasa (EC 3.2.1.2), oligo- 1 , 6 -glucosidasa (EC 3.2.1.10), glucano 1,4-alfa-glucosidasa (EC 3.2.1.3), pululanasa (EC 3.2.1.41), celulasa (EC 3.2.1.4), endo-1, 3 (4) -beta-glucanasa (EC 3.2.1.6), y glucano endo- 1 , 3 -beta-D-glucosidasa (EC 3.2.1.39). Muy preferiblemente se determinan los niveles de 6-fitasa activa, tal como fitasa BP17.
Un aspecto más de esta invención es que proporciona un método para determinar niveles de enzima activa en una composición de alimento o pienso o biocombustible o detergente. Este método incluye preparar una muestra de la composición de alimento o pienso o biocombustible o detergente, de preferencia una muestra acuosa. Luego esta muestra se pone en la región de colocación (10) del dispositivo de ensayo (1) de la invención, y el dispositivo de ensayo (1) se usa para determinar la cantidad de enzima activa en la muestra semicuantitativamente . La cantidad de enzima activa en varias muestras puede compararse una con otra y/o compararse con una muestra de referencia. Muy preferiblemente este método se usa para determinar niveles de fitasa activa, de preferencia niveles de fitasa BP17 activa, en un alimento o pienso.
La presente invención proporciona además un método para determinar si enzima adicional o un aditivo para pienso o alimento se requiere. Si menos que una cantidad especificada o cantidad relativa de enzima activa se detecta usando el método descrito arriba, esto indica que se debe añadir enzima adicional. Muy preferiblemente, este método se usa para determinar si fitasa adicional, de preferencia fitasa BP17 activa, debe ser añadida a un alimento o pienso.
Los métodos descritos arriba pueden usarse para control de calidad. Este método comprende usar el dispositivo de ensayo (1) de la presente invención para determinar niveles de enzima activa en una muestra y luego determinar si estas enzimas satisfacen el nivel de control de calidad de la enzima. De preferencia este método podría usarse para determinar niveles de fitasa en un pienso o un aditivo para piensos y luego determinar si el pienso o un aditivo para piensos va a ser usado.
La presente invención proporciona además un método para determinar la presencia de enzima activa en una muestra, en donde el método comprende las etapas de : a) poner en contacto por lo menos una porción de la muestra con un medio de captura con lo cual la enzima sea capturada por el medio de captura; b) proporcionar un substrato adecuado para la enzima capturada, en donde el substrato reaccione con la enzima capturada para producir un producto de enzima; c) proporcionar una especie reactiva capaz de reaccionar con el producto de enzima, en donde la especie reactiva reaccione con el producto de enzima para producir un producto insoluble; y d) detectar el producto insoluble obtenido en la etapa c) , en donde la detección se correlaciona con la presencia y/o cantidad de una enzima activa en la muestra.
De preferencia la muestra es una muestra de alimento o pienso o muestra de componente de alimento o pienso o muestra de composición de biocombustible o detergente. Preferiblemente la muestra es una muestra seca, rehidratada o acuosa. Más preferiblemente la muestra es una muestra líquida.
De preferencia la enzima activa detectada por el método es una fosfatasa o glicósido hidrolasa, muy preferiblemente una fosfatasa ácida, una fitasa, una xilanasa, una amilasa o una ß-glucanasa.
De preferencia los medios de captura usados en el método son anticuerpos que se unen a la enzima activa que será detectada por el dispositivo de ensayo (1) . Los anticuerpos pueden ser desarrollados contra la enzima per se o contra un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) .
De preferencia el substrato para la enzima capturada puede ser un substrato de fosfatasa o un compuesto con un grupo donador de fosfato. Preferiblemente, el substrato es un substrato de fosfatasa ácida y más preferiblemente el substrato de fosfatasa es ácido 2-fosfo-L-ascórbico trisodio (AsAP) .
Preferiblemente la especie reactiva usada en el método puede ser un compuesto de tetrazolio. Muy preferiblemente la especie reactiva puede ser un compuesto de tetrazolio de nitroazul. La especie reactiva puede ser cloruro de tetrazolio nitroazul (NBT) . La especie reactiva puede como alternativa ser un compuesto de halonitrotetrazolio . La especie reactiva puede ser de preferencia un compuesto de yodonitrotetrazolio . Preferiblemente la especie reactiva es cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) .
El producto insoluble es de preferencia un precipitado, muy preferiblemente un precipitado visualmente detectable u observable, de preferencia un precipitado de color .
El producto insoluble es de preferencia detectado u observado visualmente o electrónicamente. Más preferiblemente es detectable debido a un cambio de color.
KITS La presente invención puede presentarse en forma de un kit. Este kit hará posible que el operador lleve a cabo el ensayo, de preferencia fuera del laboratorio. El kit puede proporcionar uno o más o todos los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo. Estos reactivos pueden estar en una forma seca o deshidratada. Los reactivos secos pueden ser reconstituidos por la muestra en un solvente, de preferencia una muestra acuosa. Preferiblemente todos los reactivos son secos excepto el medio de indicación selectiva (50) o algún componente del medio de indicación selectiva (50). Este kit puede conocerse como "formato semiseco" . De preferencia todos los reactivos se secan excepto la especie reactiva. Muy preferiblemente todos los reactivos son secados excepto por una solución de tetrazolio ya sea de INT 0 NBT. El operador añade líquido a los reactivos secos para llevar a cabo el ensayo.
De preferencia el dispositivo de ensayo (1) es suministrado en forma de una varilla o muy preferiblemente una tira. Más preferiblemente los reactivos secos son unidos a la tira o varilla tal cual es provista. Los kits de la presente invención también pueden comprender una o más bolsas. Por ejemplo, bolsas de plástico), pipetas, jeringas, tubos o tubos de ensayo. De preferencia la tira o varilla está contenida en un alojamiento, por ejemplo un alojamiento de plástico, cartulina o cartón.
El dispositivo de ensayo de la presente invención puede ser provisto en un kit como el mostrado en la modalidad 1 de las figuras la-lb o modalidad 2 de las figuras la-lb.
Un kit de la presente invención puede comprender o ser capaz de formar el dispositivo de ensayo y todos los componentes del dispositivo de ensayo, incluyendo: (a) una región de colocación (10) sobre la cual se pueda colocar la muestra; (b) una matriz (20) conectada operablemente a la región de colocación (10) de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) en la región de colocación (10) pueda migrar a lo largo de la matriz (20) ; (c) al menos una ubicación de captura (30) distinta sobre la matriz (20) , en donde cada ubicación de captura (30) distinta está distanciada de la región de colocación (10) , y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura (30) distinta ; (d) medios de captura (40) están presentes en o definen cada ubicación de captura (30) distinta, en donde los medios de captura (40) son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de la enzima sea retenida en por lo menos una ubicación de captura (30) distinta; y (e) medios de indicación selectiva (50) o al menos un componente de los mismos, para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura.
Un kit de la presente invención puede comprender todos o sustancialmente todos los componentes del dispositivo de ensayo (a) - (d) y en donde se proporcionan medios de indicación selectiva (50) que son luego añadidos al dispositivo en uso.
Un kit de la presente invención puede comprender todos los componentes del dispositivo de ensayo (a) - (d) y al menos un componente de los medios de indicación selectiva, y en donde el kit comprende además los demás componentes de los medios de indicación selectiva (50) los cuales son después añadidos al dispositivo en uso.
Un kit de la presente invención puede comprender todos los componentes del dispositivo de ensayo (a) - (e) .
Un solvente tal como agua - u otra solución acuosa adecuada - puede ser incluido con o añadido a un kit o dispositivo de la presente invención. El mismo o cualquiera de los componentes del kit puede ser disperso, disuelto o rehidratado en un solvente tal como agua, agua purificada o agua desionizada .
Un kit de la presente invención puede ser suministrado con una tarjeta de puntuación o tarjeta de referencia. La intensidad de un cambio de color puede ser evaluada usando una tarjeta de puntuación o tarjeta de referencia, de preferencia en donde el operador compare la intensidad de la reacción de color en la matriz (20) con la tarjeta de puntuación. Una medición semicuantitativa puede llevarse a cabo usando la tarjeta de puntuación, por ejemplo si la cantidad de enzima activa esté por encima o debajo de cierta cantidad o concentración, por ejemplo por arriba o debajo de 300 FTU/g, se puede determinar usando la tarjeta de puntuación .
La tarjeta de puntuación o tarjeta de referencia puede hacerse de papel, cartulina u otros materiales físicos. Como alternativa, la tarjeta de puntuación o tarjeta de referencia puede ser vista electrónicamente, por ejemplo en un teléfono, teléfono inteligente, computadora u otro dispositivo computacional . La tarjeta de puntuación puede ser comparada con una referencia electrónica y/o la tarjeta de puntuación puede ser leída electrónicamente.
EJEMPLOS La presente invención se describirá a manera de ejemplo únicamente en los cuales se hace referencia a las siguientes figuras.
La parte 1 de la sección de ejemplos proporciona detalles sobre dispositivos y métodos de ensayo de la presente invención para determinar la presencia de fitasa activa en una muestra.
La parte 2 de la sección de ejemplos proporciona detalles sobre metodología que se puede usar para dispositivos y métodos de ensayo de la presente invención para determinar la presencia de xilanasa activa en una muestra .
Generación de anticuerpos para los dispositivos y método de ensayo de la presente invención Anticuerpos para usarse en el dispositivo y métodos de ensayo de la presente invención pueden generarse usando la metodología de Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl . 1973, 1:161-4).
En la parte 1 de la sección de ejemplos, anticuerpos contra la fitasa BP17, para usarse en el dispositivo y métodos de ensayo de la presente invención, fueron generados siguiendo la metodología de Harboe N (1973) (véase arriba) . La secuencia de BP17 (excluyendo péptidos de señal) se mostró arriba.
PARTE 1 En el trabajo que lleva a y que resulta en la presente invención se tomaron dos líneas de investigación diferentes .
Un enfoque dio como resultado un dispositivo de acuerdo con la presente invención (representado genéricamente en las figuras la-lb) y métodos que usan el mismo y kits que comprenden el mismo. Esta línea de enfoque fue llamada Formato 1. Este dispositivo etc. se describe en detalle en los ejemplos 1 etc.
Trabajamos también en un ensayo de flujo lateral de emparedado con anticuerpos conjugados a oro. Esta línea de enfoque fue llamada Formato 2. Por las razones explicadas en la presente, esta línea de enfoque no se consideró adecuada. Información con respecto al formato 2 (es decir, el ensayo de flujo lateral de emparedado con anticuerpos conjugados a oro) , tal como la figura 5 y su comentario y asociado, se han agregado por razones comparativas (véase sección de ejemplos comparativos) .
Además, en la sección de ejemplos comparativos llevamos a cabo una comparación directa del formato 1 con el formato 2 para un aspecto de los experimentos .
EJEMPLOS 1-9 Formato 1 - dispositivos y métodos de ensayo de la presente invención Ejemplo 1 El ensayo y dispositivo de la presente invención se refieren a una captura de anticuerpos con prueba de substrato de precipitación (por ejemplo, las figuras la-lb y figura 2 y figura 3) .
A este respecto, la captura de anticuerpo con prueba de substrato de precipitación fue caracterizada. Se identificó un substrato de fosfatasa ácida adecuado, con la característica principal siendo la reducción de una sal de tetrazolio para producir un precipitado de color, y mostró posteriormente funcionar en un ensayo tipo flujo lateral con una respuesta de señal dependiente de dosis.
Varios obstáculos en el desarrollo de una captura de anticuerpo con prueba de substrato de precipitación fueron notados, tal como la complejidad del substrato y que el precipitado generado migraba debido al flujo de prueba. Sin embargo, esta prueba fue más adecuada que el ensayo de emparedado de conjugado de oro (figura 5) toda vez que mide directamente la actividad de enzima en lugar de simplemente basarse en la unión de la enzima a anticuerpo.
La captura de anticuerpo con ensayo de substrato de precipitación (figura 2) se desarrolló extensamente. Se investigaron varios formatos y la prueba se refino a partir de un diseño inicialmente complejo con un substrato de varios componentes y manipulación de tiras de prueba con adición de muestras posterior a una configuración simple con etapas de usuario mínimas .
El aspecto semicuantitativo de la prueba se determina por una región de prueba de tres líneas en donde un resultado de tres líneas representa altos niveles de enzima activa (un resultado de pase) , dos líneas representan niveles intermedios (límite) y una o cero líneas indican bajos niveles de enzima (falla) .
La evolución de este ensayo se tradujo en el desarrollo de un formato muy útil - en particular lo que llamados el "formato semiseco" . La figura 3 muestra las etapas implicadas en el formato semiseco de la presente invención .
A este respecto, y como se ilustra en la figura 3, el formato semiseco requiere que el operador produzca una muestra de prueba en agua que se aplica a la tira de prueba. Un componente del complejo de substrato en solución se aplica "directo de la botella" (sin preparación requerida por el operador) directamente a la matriz de la tira de prueba (nitrocelulosa en este caso) que es cubierta con una almohadilla que contiene los demás componentes del substrato que están secos. La prueba se deja entonces desarrollar y el resultado se lee después de 20-30 minutos (figura 4). Aquí, la figura 4 presenta resultados de una serie de diluciones de 6-fitasa (llamada BP17) usando el formato semiseco de la figura 3. La 6-fitasa se deriva de Buttiauxella sp. como se describió arriba.
Un "formato seco" también se investigó en donde todos los componentes se secan en la prueba de tal manera que el operador tenga sólo que aplicar muestra (figura 6) . Aquí el operador simplemente añade la muestra y revela la prueba. Una prueba final podría ser puesta en cásete y el contrapeso ilustrado en la figura 6 no se requeriría. En el ejemplo ilustrado, un donador de fosfato ácido 2 - fosfo-L-ascórbico trisodio (AsAP) y metosulfato de fenazina potenciador de reacción, (PMS) se secan en la matriz de nitrocelulosa de prueba (NC) y una almohadilla de nylon de substrato de tetrazolio, cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) se coloca en forma segura en la parte superior. La muestra líquida se añade como es normal, y es la propia solución de muestra la que rehidrata los componentes del substrato.
Así, en la figura 6 (en particular un ejemplo de una prueba en formato seco) el operador simplemente añade la muestra y revela la prueba. En esta figura, ácido 2-fosfo-L-ascórbico trisodio = AsAP; potenciador de reacción metosulfato de fenazina = PMS; matriz de nitrocelulosa = NC y substrato de tetrazolio cloruro de yodonitrotetrazolio = INT.
Ejemplo 2 - Preparación de la muestra Solvente El método de preparación de muestra se llevó a cabo en agua. Para los efectos de continuidad se ha usado agua MilliQ. MilliQ se refiere a agua que ha sido purificada y desionizada a un alto grado por un sistema de purificación de agua.
La figura 7 muestra los resultados obtenidos cuando 1 gramo de gránulos de pienso fueron extraídos durante 30 minutos ya sea en regulador de pH de acetato 0.25 M, pH 5.0, agua MilliQ o agua de la llavr y se ejecutaron en el flujo a través de un formato por triplicado (véase también figura 11) . En cada caso la línea inferior representa la línea de prueba y la línea superior es la línea de control. Las pruebas se fotografiaron a 10 y 30 minutos después de la aplicación al substrato.
Los experimentos han demostrado que el uso de agua de la llave produce también resultados satisfactorios con el formato semiseco. El agua de la llave da una señal visual ligeramente incrementada en comparación con los otros dos solventes probados Tiempo de agitación En el ejemplo ilustrado en la figura 7, un gramo de gránulos de pienso fue extraído en 10 mLs de agua MilliQ y la extracción se dejó proceder durante 10 minutos con agitación constante. Sin embargo, experimentos adicionales han demostrado que la simple agitación de la extracción durante 5 minutos produce una extracción completa de la fitasa BP17 en la fase acuosa (figura 8) . De esta manera la preparación de la muestra de prueba es un procedimiento rápido y simple, manejable por un operador con entrenamiento mínimo.
La figura 8 muestra los resultados de toma de muestras en diferentes intervalos de tiempo. Se añadió 1 gramo de gránulos de pienso a 10 mLs de agua MilliQ y la solución resultante se muestreó en varios intervalos de tiempo de cero a 60 minutos. Después de 5 minutos la extracción parece ser suficiente para la prueba.
En un aspecto, el operador llenará un tubo de extracción de muestra o bolsa hasta un nivel predeterminado (marcado por una línea en el tubo) con gránulos de pienso y luego llenará el tubo hasta una segunda línea con agua de la llave. Las líneas serán marcadas para de esta manera optimizar la relación pienso a agua. Aunque se ha usado a lo largo una relación de 1:10, esta relación podría ser alterada para variar la concentración de enzima efectiva si se requiere .
En los experimentos presentados aquí una pasta de pienso de control (que carece de fitasa BP17) fue usada y extraída como se indicó arriba y fitasa BP17 purificada se añadió a esto para dar cantidades definidas de enzima.
Ej emplo 3 Desarrollo de la prueba de captura de anticuerpos y substrato de precipitación El substrato de precipitación Para el ensayo de ..actividad se identificó un substrato. Este substrato es un substrato de fosfatasa acido genérico que usa un donador de fosfato (ácido 2-fosfo-L-ascórbico trisodio, AsAP) un potenciador de reacción (metosulfato de fenazina, P S) y una especie reactiva (cloruro de tetrazolio nitroazul, NBT) en presencia de estos químicos y fosfatasa ácida la sal de tetrazolio soluble se reducirá dando como resultado la producción de un precipitado insoluble (el derivado formazan de la sal de tetrazolio) . En el caso de tetrazolio nitroazul esto se traduce en la formación de un precipitado azul/púrpura.
Desarrollo del formato de prueba Se han analizado varios formatos durante la fase de viabilidad del proyecto.
Formato de flujo continuo Este enfoque utiliza una metodología de "flujo continuo" . En contraste con la metodología de flujo lateral estándar una prueba de flujo continuo implica la aplicación de muestra directamente en la parte superior de una nitrocelulosa especializada (rayada con anticuerpos antifitasa BP17) y la muestra se extrae a través de la nitrocelulosa a manera de una almohadilla absorbente subyacente. Después de la aplicación de muestra el substrato se aplica de la misma manera y la prueba es luego dejada desarrollar (figura 11) .
La figura 11 es una representación esquemática del formato de flujo continuo. El formato de las figuras la- Ib es muy simple y da un resultado visual limpio. Sin embargo, para algunos aspectos, puede ser deseable tener un formato semicuantitativo todavía mejor. Así, para facilitar al operador en la interpretación de los resultados de esta manera se decidió producir formatos de prueba de varias líneas en donde el número de líneas de prueba visibles después de la conclusión de la prueba indicaría los niveles de enzima presente en la muestra.
Formato de tira reactiva Este formato adopta el enfoque de varias líneas. Inicialmente la nitrocelulosa fue rayada con seis líneas de concentraciones ascendentes, y la tira de prueba completa se sumergió (se sumergió a inmersión) en la muestra de extracto de pienso. Después de la incubación la tira fue enjuagada con agua y luego la solución de substrato se aplicó y la prueba se dejó desarrollar (figura 12) .
La figura 12 muestra una representación esquemática del formato de tira reactiva. Este formato fue muy fácil de llevar a cabo y una ventaja fue que no hubo almohadillas absorbentes presentes en la tira de prueba, lo cual significó que no se requirieron ninguna manipulación de tira de prueba después de la muestra. La prueba funcionó pero hay casos cuando un resultado semicuantitativo todavía mejor es deseado. Aquí, todas las líneas de prueba fueron visibles cuando la enzima probada - fitasa BP17 - estuvo presente, aunque a intensidades visuales dependientes de dosis. Idealmente las líneas de prueba con concentraciones de antifitasa BP17 más bajas no habrían aparecido cuando hubieran sido atacadas con bajo nivel de muestras de fitasa BP127 pero esto no fue el caso (figura 13) .
La figura 13 muestra los resultados de la prueba en formato de tira reactiva. Aquí, nitrocelulosa fue rayada con 6 líneas de prueba a 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0.125 mg/mL de antifitasa BP17 (derecha a izquierda en la fotografía) . Tiras de prueba fueron añadida directamente a los tubos de extracción de pienso (7 mL, con 0-1.0 U/mL de fitasa BP17) e incubadas durante 20 minutos con agitación. Las tiras fueron luego removidas, previamente enjuagadas en agua MilliQ y se añadió substrato a las tiras. Las pruebas se dejaron revelar durante 30 minutos y luego se fotografiaron. El resultado no parece ser semicuantitativo y parece que un alto fondo también fue observado, lo cual fue proporcional con la cantidad de fitasa BP1.7 en la muestra.
Formato de tira de absorción capilar Aquí se usó una prueba de tira similar a la tira reactiva, pero con la prueba llevada a cabo de una manera diferente. En lugar de sumergir la tira de prueba completa, aquí la muestra se dejó raigrar a lo largo de la tira de prueba por acción capilar. Una vez que se completó, el substrato se aplicó de una forma similar y el desarrollo de la línea de prueba se dejó proceder (figura 14) .
La figura 14 representa una representación esquemática del formato de tira de absorción capilar. Este formato de prueba se llevó a cabo verticalmente con la muestra en un pocilio de placa de microtitulación y una vez que la muestra había sido corrida la tira se retiró del pocilio y se puso horizontalmente para permitir la adición de substrato .
Inicialmente una prueba de varias líneas con cantidades variables de antifitasa BP17 fue empleada y se demostró que el orden en el cual la muestra encontraba las líneas era importante para el desarrollo de la prueba. Pareció que la fitasa BP17 en la muestra se uniría a la primera línea de prueba, si aún había fitasa BP17 no unida esto procedería a la segunda línea y así sucesivamente. De esta manera si la primera línea de prueba contenía un alto nivel de anticuerpos antifitasa BP17 entonces la mayoría de la muestra podría unirse a esa línea dejando muy poco restante para unirse a líneas subsecuentes. Por otro lado, si la primera línea encontraba bajos niveles contenidos de anticuerpos entonces esta línea sería rápidamente saturada y la mayoría de la fitasa BP17 continuaría hacia la siguiente línea de prueba (figura 15) . Esto permite que el nivel más bajo de anticuerpos de preferencia sea el más cercano a la región de colocación.
La figura 15 muestra los resultados de la prueba en formato de tira de absorción capilar. Aquí, nitrocelulosa fue rayada con líneas de prueba a 4, 1 y 0.25 mg/mL de antifitasa BP17. Las muestras fueron diluidas en agua a 0.2, 0.05, 0.012, 0.006 U/mL de fitasa BP17. Las muestras absorbieron capilarmente la NC al tocar el extremo a la solución y dejar que la solución viajara hacia arriba de la tira por acción capilar. Dos orientaciones de tira fueron probadas: de 4 a 0.25 mg/mL, y de 0.25 a 4 mg/mL. Después de 10 minutos las tiras fueron expuestas a solución de substrato y se les dejó desarrollar durante 30 minutos. La orientación de las concentraciones de línea de prueba tiene un . impacto significativo en la ejecución exitosa de la prueba.
Para simplificar el sistema de prueba se probaron experimentos con varias líneas a una sola concentración de antifitasa BP17. Inicialmente pareció que la vasta mayoría de la fitasa BP17 en la muestra se estaba uniendo a la primera línea de prueba. Sin embargo este problema percibido fue derivado por la adición de reactivos de bloqueo a la muestra, con la proteína de leche caseína mostrando los mejores resultados (figura 16) .· La figura 16 muestra los resultados de la prueba en formato con tira de absorción capilar usando diferentes agentes de bloqueo. Se prepararon muestras a 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 U/mL de fitasa BP17 y cero controles en extractos de pasta de control (ya sea agua o caseína) . Las tiras de prueba se pusieron en pocilios de placas de microtitulación que contenían muestras de 40 pL y la muestra se dejó absorber por acción capilar en la tira durante 10 minutos. Las tiras fueron secadas por absorción, tendidas planas y 40 pL de solución de substrato se pipetearon en la ni rocelulosa . Las tiras se dejaron revelar durante 30 minutos y luego se fotografiaron (véase ejemplo 6) .
La figura 17 muestra resultados que se refieren a variar la concentración de línea de prueba para modular la naturaleza semicuantitativa de la prueba (formato de tira de absorción capilar) . Los resultados muestran que la concentración del anticuerpo de línea de prueba tiene una influencia en la naturaleza semicuantitativa de la prueba con una concentración de 0.4-0.6 mg/mL pareciendo ser óptima para la especificación requerida y de esta manera muestra que la muestra es capaz de viajar a través del medio de captura.
En más detalle, la figura 17 muestra los resultados de variar la concentración de línea de prueba para modular la naturaleza semicuantitativa de la prueba, usando el formato de tira de absorción capilar. Nitrocelulosa fue rayada con tres líneas de prueba de la misma concentración, ya sea 0.4, 0.6, 0.8 ó 1.0 mg/mL de antifitasa BP17. Extracto de pasta de control se preparó con 1 g de pasta en 10 mL de solución de caseína 50 mg/mL incubada durante 10 minutos en el mezclador giratorio. Fitasa pura BP17 se añadió al extracto de pasta a 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 y 0.003125 U/mL. Muestras de 40 µ?. fueron pipeteadas en pocilios de una placa de microtitulación, las tiras fueron insertadas y la muestra se dejó migrar hacia arriba de la tira por acción capilar durante 10 minutos. Las tiras fueron retiradas, secadas y 40 iL de solución de substrato se pipetearon en las tiras y se dejaron revelar durante 30 minutos. La concentración del anticuerpo de línea de prueba tiene influencia en la naturaleza semicuantitativa de la prueba con una concentración de 0.4-0.6 mg/mL pareciendo ser óptima para la especificación requerida. Estos resultados demuestran que, con bloqueo adecuado, variar la concentración de línea de prueba podría usarse para modular la naturaleza semicuantitativa de la prueba.
Al igual que con el formato de tira reactiva, la ventaja del formato de tira de absorción capilar fue que ninguna almohadilla absorbente estuvo presente en la tira de prueba y de esta manera el operador no tendría que manipular la tira de prueba después de la muestra y antes de las adiciones de substrato. Sin embargo, un formato vertical podría no ser altamente deseable para algunos usos, especialmente si la tira tuviera que ser reorientada antes de la adición del substrato.
Para resolver esto, se desarrolló un formato horizontal con materiales muy similares, la única adición siendo una almohadilla de muestra absorbente corriente arriba de la porción de nitrocelulosa de la tira de prueba. Este enfoque dio un resultado de alta calidad y abrió la posibilidad de un desarrollo adicional que no hubiera sido posible con el formato 2. En algunos casos, la adición de bloqueadores puede ser necesaria. En algunos casos, la almohadilla de muestra puede tener que ser retirada antes de la adición del substrato.
Ejemplo 4 - Substratos de tetrazolio En este ejemplo, se probó un substrato de tetrazolio, cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) . Este substrato dio como resultado un precipitado rojo en la línea de prueba (en lugar de azul/púrpura con NBT) .
La figura 18 muestra una comparación entre NBT e INT con la prueba de tira de absorción capilar. Extracto de pasta de control se preparó con 1 g de pasta en 10 mL de solución de caseína 50 mg/mL incubada durante 10 minutos en el mezclador giratorio. Fitasa BP17 pura se añadió al extracto de pasta a 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 y 0.00625 U/mL. Muestras de 40 µ?. fueron pipeteadas en pocilios de la placa de microtitulación, se insertaron las tiras y la muestra se dejó migrar hacia arriba de la tira por acción capilar durante 10 minutos. La solución de INT se hizo a 4.45 mg/mL en regulador de pH de acetato, esto da la misma molaridad que la solución de NBT. Las tiras fueron retiradas, secadas y 40 ]iL de solución de substrato fue pipeteado en las tiras, incubadas durante 1 minuto. La solución de substrato fue después retirada, las tiras se secaron y se dejaron revelar durante 30 minutos.
Como se puede ver de la figura 18, los resultados demostraron que usar INT como un substrato dio resultados similares a NBT. Tanto NBT como INT fueron usados indistintamente desde este punto en adelante.
Ejemplo 5 - Tipos de ni trocelulosa Ya que el formato horizontal se consideró como un formato promisorio se llevó a cabo un experimento que probaba una amplia variedad y tipos de nitrocelulosa para poder determinar el más adecuado para este formato (figura 19) .
La figura 19 presenta los resultados de pruebas de una amplia variedad de tipos de nitrocelulosa para determinar el más adecuado. Una variedad de tipos de nitrocelulosa fueron rayados con tres líneas de prueba a 0.5 mg/mL de antifitasa BP17. Las muestras de fitasa BP17 fueron diluidas a partir de enzima purificada en extracto de pasta de pienso de control (1 g en 10 mLs de agua) para dar 0.2 y 0.04 U/mL de fitasa BP17 (más control cero de sólo pienso) . Los extractos fueron pipeteados en las almohadillas de muestra de las tiras de prueba y la muestra se dejó migrar a lo largo de la tira por acción capilar hasta la conclusión. Las almohadillas de muestra se retiraron y se aplicaron 40 µL de substrato. La prueba se dejó proceder hasta 20 minutos y luego se fotografió.
Una de las membranas de nitrocelulosa probadas, en particular MDI 90 CNPH mostró los mejores resultados (véase figura 19) y de hecho había sido la nitrocelulosa de elección según se determinó a partir de experimentos previos con formatos previos. · Esta nitrocelulosa está fácilmente disponible. Otros dos tipos de nitrocelulosa (MDI SS12 12µ y SS12 15µ) también dieron resultados satisfactorios. Todas las membranas probadas dieron una respuesta.
Ejemplo 6 - Reactivos de bloqueo Hasta este punto el reactivo de bloqueo (por ejemplo, caseína) había sido añadido a la muestra, después de la extracción. Se decidió que esto no era lo ideal toda vez que requeriría que la solución fuera suministrada con la prueba final y requeriría que el operador la añadiera al extracto de pienso. Se llevaron a cabo experimentos para resolver esto. La caseína puede ser difícil de disolver en agua. Sin embargo una solución sódica de caseína se encontró que era mejor a este respecto. Esto permitió la posibilidad de añadir caseína de sodio en cantidades definidas directamente a la extracción de pienso. Este enfoque fue funcional. Sin embargo, para algunos aspectos, este enfoque podría haber sido optimizado incluso aún más toda vez que requeriría que cantidades definidas de caseína de sodio fueran suministradas en el tubo de extracción de muestra el cual podría haber sido desplazado durante la transportación y perdido después de la apertura del tubo. Por consiguiente, se decidió probar la posibilidad de suministrar el reactivo de bloqueo dentro de la propia tira de prueba.
Se diseñaron experimentos para poner el reactivo de bloqueo seco en una almohadilla entre la almohadilla de muestra y la nitrocelulosa de prueba.
La figura 20 muestra los resultados de pruebas que reducen la concentración de agente de bloqueo caseína en presencia de tensioactivo (Tween-20) . Almohadillas de conjugado de poliéster fueron saturadas con soluciones de caseína a varias concentraciones y secadas a 37°C. Las almohadillas fueron luego puestas 'corriente arriba' de las tiras de prueba (junto con una almohadilla de muestra adicional) . Pasta de control se extrajo en agua (1 g en 10 mL) y enzima purificada fue diluida en los extractos. Las muestras se pipetearon sobre la almohadilla de muestra que luego fluyó a través de las almohadillas que contenían caseína y sobre las tiras de prueba. Almohadillas de muestra y conjugadas fueron retiradas y se aplicaron 40 L de substrato. Las pruebas se dejaron proceder a 20 minutos y luego se fotografiaron. Se observó un resultado sorprendente, ya que la presencia del tensioactivo solo fue suficiente para permitir que la prueba se desempeñara satisfactoriamente. Así, la almohadilla sin caseína mostró la misma intensidad de color que las almohadillas con caseína .
Alentados por este descubrimiento, se diseñaron experimentos para añadir los reactivos de bloqueo directamente en la nitrocelulosa de prueba para poder determinar si este enfoque también daría un resultado satisfactorio .
La figura 21 muestra los resultados obtenidos al añadir los reactivos de bloqueo directamente sobre la nitrocelulosa de prueba para probar si podrían obtenerse resultados satisfactorios.
En más detalle, la figura 21 ilustra los resultados de un experimento para añadir los reactivos de bloqueo directamente a la nitrocelulosa. Longitudes de nitrocelulosa fueron incubadas en varias soluciones de caseína/Tween durante 5 minutos y luego secadas a 55°C durante 10 minutos. Se laminó nitrocelulosa a una tarjeta de respaldo con almohadilla de muestra no tratada (y sin almohadilla conjugada) . Un conjunto de tiras de control con NC no bloqueada y almohadilla de conjugado de caseína/Tween también se construyó. Muestra de fitasa BP17 fueron diluidas a partir de enzima purificada en extracto de pasta de pienso de control (1 g en 10 mLs de agua) para dar 0.2 y 0.04 U/mL de fitasa BP17 (más control cero de sólo pienso) . Los extractos fueron pipeteados en las almohadillas de muestra de tiras de prueba y la muestra se dejó migrar a lo largo de la tira por acción capilar hasta la conclusión. Almohadillas de muestra y conjugadas fueron retiradas y se aplicaron 40 ynh de substrato. Las pruebas se dejaron proceder hasta 20 minutos y luego se fotografiaron.
De nuevo una situación en donde el tensioactivo solo en ausencia de caseína dio excelentes resultados (figura 21) .
Una serie de dilución de concentraciones de fitasa BP17 se probó con NC bloqueada sólo con tensioactivo tanto con substrato de INT como NBT para probar la sensibilidad de este método.
La figura 22 muestra los resultados de una serie de dilución de concentraciones de fitasa BP17 probadas con NC bloqueada sólo con tensioactivo con substratos tanto de INT como de NBBT para probar la sensibilidad de este método.
Nitrocelulosa rayada fue incubada en soluciones de Tween-20 al 0.25% durante 5 minutos y luego secadas a 55°C durante 10 minutos. Muestras de fitasa BP17 fueron diluidas a partir de enzima purificada en extracto de pasta de pienso de control (1 g en 10 mLs de agua) para dar una serie de dilución de 0.4-0.001 U/mL de fitasa BP17 (más control cero de sólo pienso) .
En más detalle, la figura 22 muestra los resultados de este experimento. Nitrocelulosa rayada fue incubada en soluciones de Tween-20 al 0.25% durante 5 minutos y luego secada a 55 °C durante 10 minutos. Muestras de fitasa BP17 fueron diluidas a partir de enzima pura en extracto de pasta de pienso de control (1 g en 10 mLs de agua) para dar una serie de diluciones de 0.4-0.0015 U/mL de fitasa BP17 (más control cero de sólo pienso) . Los extractos fueron pipeteados en las almohadillas de muestra de tiras de prueba y la muestra se dejó migrar a lo largo de la tira por acción capilar hasta la conclusión. Las almohadillas de muestra y conjugadas fueron retiradas y se aplicaron 40 ]ih de substrato (a base de NBT o INT) . Las pruebas se dejaron proceder hasta 20 minutos y luego se fotografiaron. Los resultados muestran que ambos substratos actuaron similarmente y la sensibilidad general y naturaleza semicuantitativa del método parecieron excelentes .
El atractivo de un método para bloquear directamente nitrocelulosa con tensioactivo es que elimina la necesidad de incluir una 'almohadilla de bloqueo' secundaria en la tira de prueba y de esta manera elimina un nivel de complejidad con respecto al montaje de la prueba. Además, la inclusión del reactivo de bloqueo en la propia prueba niega la necesidad de que el operador haga nada que no sea añadir pienso y agua a un tubo vacío para la preparación de la muestra.
La tira de prueba producida es un diseño muy simple que comprende nitrocelulosa de prueba rayada con tres líneas de anticuerpos antifitasa BP17, todos a la misma concentración y bloqueados, después del rayado, con solución de Tween-20 al 0.1% en agua unida a una almohadilla de muestra no tratada de control .
Ejemplo 7 - Experimentos de suministro de substrato En todos los ejemplos detallados arriba la solución de substrato se añadió al mezclar los tres componentes juntos (AsAP, PMS y tetrazolio, INT o NBT) inmediatamente antes de usar. Para simplificar esto para el operador, se llevaron a cabo experimentos para intentar secar estos componentes en el formato de prueba final. Esto significaría que el operador no sería responsable de la composición del substrato y obviaría la necesidad de suministrar componentes de prueba líquidos .
Se llevaron a cabo experimentos iniciales en donde varios componentes de substrato fueron mezclados juntos y usados para saturar almohadillas absorbentes seguidos por secado y almacenamiento a 37°C y los resultados se muestran en la figura 23.
La figura 23 muestra los resultados obtenidos cuando se prueba el secado y almacenamiento de los diferentes componentes de substrato mezclados juntos. Cuadrados de 1 cm de absorbente fueron sumergidos en varias combinaciones de los substratos (premezclados) durante 5 minutos. Las almohadillas fueron secadas y puestas en una incubadora a 37°C. Treinta minutos después se consideró que las almohadillas estaban secas y esto se consideró como 'Tiempo = 0'. Las almohadillas fueron monitoreadas a intervalos de tiempo regulares, viendo específicamente cambios de color en tono púrpura (NBT) o en tono rojo (INT) . Tiempo cero y nocturno son mostrados .
En este experimento, cuadrados de 1 cm de absorbente fueron sumergidos en varias combinaciones de los substratos (premezclados) . Las almohadillas fueron secadas y puestas en una incubadora a 37°C. Luego de 30 minutos las almohadillas se consideró que estaban secas y esto se consideró como 'tiempo = 0'. Las almohadillas fueron monitoreadas a intervalos de tiempo regulares, buscando específicamente cambios de color hacia púrpura (NBT) o hacia rojo (INT) . Tiempo cero y nocturno se muestran en la figura 23. Después del nocturno parece que las combinaciones más útiles son: NBT o INT por su propia cuenta; AsAP + PMS; PMS; AsAP + - INT parece moderadamente estable y más estable que AsAP + NBT.
A partir de este experimento fue claro que mezclar la solución de tetrazolio, tanto INT o NBT con cualquiera de los demás componentes de la prueba se tradujo en precipitación eventual de tetrazolio con el tiempo.
Se demostró también que el mezclado y secado del AsAP y PMS parecieron estables con el tiempo. Experimentos para utilizar todos estos componentes secos han sido llevados a cabo, al igual que experimentos en los que algunos de los componentes de substrato están secos mientras que otros se usan en solución. Parece posible que todos los componentes del ensayo podrían ser provistos en forma seca. Potencialmente el uso de una muestra acuosa podría rehidratar los componentes secos.
Así, en la figura 6 (un ejemplo de una prueba en formato seco) el usuario (operador) simplemente añade la muestra y revela la prueba. En esta figura, ácido 2-fosfo-L-ascórbico trisodio = AsAP; potenciador de reacción metosulfato de fenazina = PMS; matriz e nitrocelulosa = NC; y substrato de tetrazolio cloruro de yodonitrotetrazolio = INT.
Ejemplo 8 - El formato seco Se llevaron a cabo experimentos para secar todos los componentes de prueba en la prueba de tal manera que el operador simplemente tuviera que añadir un extracto a la prueba y luego leer el resultado, sin ninguna adición o manipulación adicional. Aquí, almohadillas, con todos los componentes secados, serían incorporadas en varias partes del sistema de prueba. Como se demostró previamente todos los tres componentes no pueden ser premezclados y secados en una sola almohadilla, y por lo tanto un sistema de prueba en donde varios componentes pueden separarse, o al menos utilizar combinaciones que sean estables, debe determinarse como también sus diferentes ubicaciones dentro de la prueba. Un ejemplo de cómo se contempla esta prueba puede observarse en la figura 6. Así, la figura 6 presenta un diagrama de una prueba de formato seco.
En la prueba de formato seco de la figura 6 el operador simplemente añade la muestra y revela la prueba. Una prueba final podría ser puesta en cásete y el contrapeso único ilustrado en la figura 6 no se requeriría. En el ejemplo ilustrado se seca PMS/AsAP en la nitrocelulosa de prueba y una almohadilla de nylon de INT se pone en forma segura en la parte superior. La muestra se añade como siempre, y es la propia solución de muestra la que rehidrata los componentes del substrato.
Ejemplo 9 - El formato semiseco Como una alternativa al formato semiseco (arriba) , experimentos en donde algunos de los componentes fueron suministrados en una forma seca y otros permanecen en solución han sido llevados a cabo. Esto ha producido un sistema de prueba conocido como el formato semiseco.
En el formato semiseco la muestra se corre junto con la tira horizontal como arriba, y una vez completa la solución de tetrazolio se pipetea directamente en la nitrocelulosa de la prueba. Esto es luego cubierto con una almohadilla de nitrocelulosa que contiene AsAP/PMS seco y la prueba se deja revelar. Esto se ilustra en la figura 3 (etapas implicadas en el formato semiseco) .
Este formato tiene varias ventajas. El operador no tiene que preparar los reactivos de substrato antes de la prueba, y aunque el formato requiere que la solución de tetrazolio sea provista es simplemente un caso de añadirla 'directo de la botella'. Una ventaja observada con este formato es que el requisito de la remoción de la almohadilla absorbente es eliminado. Parece que la presencia de la almohadilla de AsAP/PMS fija el precipitado en su lugar e incluso en presencia de la almohadilla de muestra el precipitado resultante no migra .
Una comparación entre el formato semiseco y el formato previo (solución completa) se muestra en la figura 24.
La figura 24 muestra una comparación entre el formato semiseco y el formato de solución completa. Muestras de fitasa BP17 fueron diluidas a partir de enzima purificada en extracto de pasta de pienso de control (1 g en 10 raLs de agua) para dar una serie de dilución de 0.4-0.0015 U/mL de fitasa BP17 (más control cero de sólo pienso) . Los extractos fueron pipeteados en las almohadillas de muestra de tiras de prueba y la muestra se dejó migrar a lo largo de la tira por acción capilar hasta la conclusión. Para el formato de solución completa las almohadillas de muestra se retiraron y se aplicaron 40 ]ih de substrato completo. Para el formato semiseco se añadieron 20 \ih de solución INT a la nitrocelulosa de prueba y se puso una almohadilla de PMS/AsAP en la parte superior. Las pruebas se dejaron proceder hasta 20 minutos y luego se fotografiaron.
Los resultados del experimento de la figura 24 muestran que la sensibilidad del método semiseco es aceptable con respecto a las especificaciones de prueba.
Para que este formato semiseco sea aceptable es importante que la solución de tetrazolio permanezca estable durante la vida útil propuesta de la prueba final. Los experimentos han sido iniciados para resolver esto. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 25.
En el experimento de la figura 25, muestras de fitasa BP17 fueron diluidas a partir de enzima purificada en extracto de pasta de pienso de control (1 g en mLs de agua) para dar 0.2 y 0.4 µ/mL de BP17. Se preparó INT a 40 mg/mL en 50% de metanol, en regulador de pH de acetato 0.125 M calentado a 60°C hasta disolver. Esta solución de abastecimiento se diluyó a 10 mg/mL en regulador de pH de acetato de 0.25M. Alícuotas fueron almacenadas congeladas a -20°C, a temperatura ambiente y a 55°C. Se pipetearon 40 pL de cada uno de estos extractos en las almohadillas de muestra de tiras de prueba y la muestra se dejó migrar a lo largo de la tira por acción capilar hasta la conclusión. Las pruebas se llevaron a cabo por triplicado. Se pipetearon 20 yL de solución INT en la NC de prueba y una tira de PMS/AsAP NC se puso en la parte superior. La prueba se dejó proceder hasta 20 minutos y se fotografió. Una prueba de 'tiempo = cero' se llevó a cabo inmediatamente con la solución de INT recién preparada para dar una señal de línea de base. Después de 14 días las muestras congeladas, RT y 55 °C fueron visualmente comparadas para dar una comparación continua de la estabilidad de las soluciones de INT. Después de 14 días no se observó deterioro de la solución de INT a temperatura ambiente o 55°C. Con las pruebas a -20°C las señal fue menor que con las demás temperaturas lo que se cree que se debe a cierta precipitación de INT durante almacenamiento y descongelación .
Ya que después de 2 semanas a todas las temperaturas no se notó una diferencia en actividad, esto sugiere que la solución de tetrazolio tiene buena estabilidad con el tiempo (figura 25) .
E emplo 10 - Kit La figura 29 ilustra el uso de un dispositivo/kit/ensayo de la invención.
En el panel 1 de la figura 29 una bolsa de recolección se llena con muestra hasta la primera línea indicada, luego la bolsa se llena con agua hasta la segunda línea indicada.
En el panel 2 la bolsa se sella y se agita hasta que la muestra sea degradada.
En el panel 3 el alojamiento (de acuerdo con la modalidad 1, ilustrado en las figuras la-lb) es abierto como un libro.
En el panel 4 una pipeta se llena con una parte del extracto de muestra de la bolsa, y esto se aplica a la región de colocación en el alojamiento.
En el panel 5 el usuario espera hasta que el líquido haya migrado a la parte superior de la tira. Esto se puede indicar por un cambio de color.
En el panel 6 uno o más componentes del medio de indicación selectiva se añaden al dispositivo.
En el panel 7 el alojamiento se cierra y se sella. En el panel 8 el alojamiento se tiende en una superficie plana para revelar.
En el panel 9, uno, dos y tres resultados de línea son mostrados.
EJEMPLO COMPARATIVO Formato 2 - emparedado con anticuerpos conjugados a oro El emparedado con anticuerpos conjugados a oro ilustrado en la figura 5 discriminó entre muestras de pienso que contenían actividad fitasa BP17 de alto y bajo nivel. La potencia de la señal generada en esta prueba podría ser atenuada por la inclusión de anticuerpos antifitasa BP17 libres, cuyas concentraciones mostraron ser capaces de desplazar la respuesta lineal de la prueba al intervalo de actividad de fitasa BP17 deseado.
Sin embargo, con esta metodología, los sueros de conejo antifitasa BP17 policlonal empleados reaccionan con enzima tanto nativa como desnaturalizada.
Además, con el trabajo del ensayo de emparedado de oro hubo la sospecha de que la muestra inactiva realmente estaba siendo agotada de enzima y que el procedimiento de inactivación había destruido la enzima en lugar de una inactivación simple.
Para resolver esto, SDS-PAGE y Western blotting de las muestras se llevaron a cabo y esto demostró que esta teoría era correcta y que las muestras inactivas de hecho eran agotadas de la enzima (figura 9) .
La figura 9 se refiere a SDS-PAGE y Western blotting de muestras de pienso y fitasa BP17 purificada. Los resultados demostraron que los gránulos de la ' prueba 5 ' tuvieron muy poca f itasa BP17 detectable en comparación con el pasta , y que la f itasa BP17 inactiva no tenía banda de f itasa BP17 discernible ( aunque una f rot is general de material se observó en el Western blot ) . Fitasa BP17 purif icada y f itasa BP17 activa ( líneas 9 y 10) dieron una banda fuerte en la tinción con proteína pero una multitud de bandas en el Western blot, probablemente debido a niveles de fondo de multímeros de fitasa BP17 y productos de degradación, ninguno de los cuales se encontró con la muestra inactivada con calor (línea 8) .
En ligeramente más detalle, la figura 9 muestra los resultados de SDS-PAGE y Western blotting de muestras de pienso y fitasa BP17 purificada. Muestras de fitasa BP17 activa e inactiva fueron concentradas 30 veces usando microconcentradores . Se usaron los gránulos y pasta de la "prueba 5" ya que esto había mostrado tener alto nivel de fitasa BP17 en la pasta y cantidades insignificantes en los gránulos procesados . Los gránulos de pienso y pasta fueron extraídos en agua Mil l iQ durante 10 minutos y las extracciones resultantes se ej ecutaron en SDS - PAGE . Las proteínas fueron transf eridas a una membrana de nitrocelulosa y teñidas para proteína total con Ponceau S (panel i zquierdo) . Se sondearon por absorción con anticuerpo primario antisuero antif itasa BP17 , seguidos por anticuerpo secundario anticonej o de cabra biotini lado y se visual i zaron con conj ugado de estreptavidina- Qdot 625 ( Invitrogen) . Los resultados demostraron que los gránulos de la prueba 5 tuvieron muy poca fitasa BP17 detectable en comparación con la pasta, y que la fitasa BP17 inactiva no tenía banda de fitasa BP17 discernible (aunque una frotis general de material se observó en el Western blot) . Fitasa BP17 purificada y fitasa BP17 activa dieron una banda fuerte en la tinción de proteína pero una multitud de bandas en el Western blot, probablemente debido a niveles de fondo de los multímeros de fitasa BP17 y productos de degradación, ninguno de los cuales se encontró con la muestra inactiva.
Este descubrimiento puso en duda la validez del ensayo de oro para determinar los niveles de enzima activa en una muestra dada. Aunque parece probable que fitasa BP17 inactivada experimentalmente y pienso con baja actividad de fitasa BP17 postprocesamiento serían mecánicamente comparables (es decir, la fitasa BP17 siendo destruida en ambos casos) , el ensayo a base de oro no sería capaz de detectar una situación en donde la inactivación de fitasa BP17 hubiera ocurrido por medio de desnaturalización en lugar de destrucción.
Para probar esto el inhibidor de fitasa BP17 específico hexasulfato de mioinositol (MIHS) se usó para inhibir la actividad de fitasa BP17 sin destruir la enzima. Aquí el ensayo de oro aún fue capaz de detectar la presencia de la enzima inhibida mientras que el ensayo de actividad mostró una señal ampliamente reducida (figura 10) .
La figura 10 muestra una comparación del formato de emparedado con oro (formato 2) y el formato de actividad enzimática en substrato de precipitación (formato 1 - es decir, el ensayo de la presente invención) usando el inhibidor específico de fitasa BP17 MIHS .
Los resultados para la prueba de emparedado con oro se presentan en la figura 10 - en la parte superior. Aquí, fitasa BP17 purificada se preparó en 75 mM de reglador de pH de glicina-HCl, pH 2.5 a varias concentraciones con o sin 2.5 mM de MIHS y se dejó incubar durante 20 minutos antes de la prueba. Las pruebas de oro se ejecutaron contra muestras de 100 uL.
A manera de comparación, las pruebas de substrato de precipitación también se presentan en la figura 10 - en la parte inferior. Las pruebas de substrato de precipitación se ejecutaron contra muestras de 40 uL a varias concentraciones. Se aplicó a las tiras de prueba 40 ]iL de MIHS 2.5 mM en regulador de pH de glicina 75 mM (o control de sólo regulador de pH) y se incubó durante 15 minutos. La solución se retiró después y la solución de substrato (AsAP, PMS, cloruro de tetrazolio nitroazul (NBT) en 2% de Tween-20) fue añadida. Esto se incubó durante 1 minuto, se retiró y las tiras se dejaron revelar. La prueba se fotografió después de 20 minutos. Los resultados sugieren que la prueba con oro detecta la fitasa BP17 si es inhibida o no mientras, que la prueba de substrato de precipitación claramente detecta sólo la enzima activa.
De la figura 10, que es una comparación del formato de emparedado de oro y el formato de actividad de enzima con substrato de precipitación usando inhibidor específico de fitasa BP17 MIHS (el cual inhibe la actividad de fitasa BP17 sin destruir la enzima) se puede ver que el ensayo cori oro (parte superior) aún fue capaz de detectar la presencia de la enzima inhibida mientras que el ensayo de actividad (abajo) mostró una señal ampliamente reducida.
Así, el formato de emparedado con anticuerpos conjugados a oro (figura 5) sólo detecta la presencia de enzima y no su actividad. La inactivación funcional de fitasa BP17 con un inhibidor específico aún dio un resultado positivo con esta forma del ensayo.
Estos resultados demostraron claramente la necesidad de un ensayo en donde la actividad de una enzima tal como fitasa BP17 pueda ser medida directamente, en lugar de basarse en la suposición, de que la enzima fuera activa simplemente porque aún estaba presente. El dispositivo de ensayo de la presente invención cumple esa necesidad.
WO2005/014847 y WO2007/001895 describen un ensayo que se basa en el mismo principio que la prueba de oro. Supuestamente, los ensayos sólo detectan fitasa activa con la medición de pienso tratado con calor con el kit de ELISA descrito. Esto podría no ser correcto toda vez que la fitasa es destruida y removida junto con la matriz de pienso en la preparación de la muestra. El kit puede por lo tanto en realidad no ser capaz de discriminar entre fitasa activa que está presente y fitasa no activa que esté presente.
PARTE 2 En estos experimentos, proporcionamos detalles sobre la metodología de detección para detectar xilanasa activa en una muestra usando el dispositivo y métodos de la presente invención.
Ejemplo i La metodología usada en este ejemplo es un sistema de detección a base de una metodología de azúcar reductora . A este respecto, adaptamos la metodología descrita en Chong et al "Determination of reducing sugars in the nanomole range with tetrazolium blue" (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115) . En esa metodología (que es un ensayo en placa) , un azúcar reductor (tal como xilosa) se detecta por calentamiento (95°C durante 3 minutos o 55 °C durante 1 hora) de la muestra de azúcar con cloruro azul de tetrazolio y tartrato de sodio potasio en NaOH.
En nuestra metodología para detectar xilanasa activa en una muestra usando el dispositivo y métodos de la presente invención, detectamos la producción del azúcar reductor (por ejemplo, xilosa) mediante la actividad enzimática de xilanasa en su substrato de xilano por incubación a temperatura ambiente al sustituir cloruro azul de tetrazolio con cloruro de tetrazolio nitroazul. El cloruro de tetrazolio nitroazul es de la misma familia de substratos que la usada en la metodología de fitasa descrita en la parte 1 (arriba) .
Los datos se presentan en la figura 26. A este respecto : Hilera superior (de la figura 26) , de izquierda a derecha : Xilosa pura (5 ih de solución al 1%) seguida por diluciones dobles (0.5-0.0001% de xilosa) y un control cero en el lado derecho lejano.
Hilera inferior (de la figura 26) , de izquierda a derecha : Ensayos de xilanasa que contenían 5 uL de xilanasa 10 U/mL en el primer pocilio, seguidos por diluciones dobles de la enzima (5-0.001 U/mL de xilanasa) y un control cero en el lado derecho extremo. Cada pocilio también contenía 5 µL de xilano al 1% (substrato) en regulador de pH de acetato (0.25 M, pH 4.5) . Después de que la xilanasa y xilano fueron mezclados juntos en cada pocilio la placa se incubó durante 60 minutos a 37°C para permitir que la enzima reaccionara con su substrato.
En nuestra metodología, 200 µL de solución de revelado' se añadieron a cada pocilio y la placa se puso a 55 °C durante 1 hora y después se fotografió. La solución de revelado contiene 1 mg/mL de azul de tetrazolio, tartrato de sodio potasio 0.5 M y NaOH 0.05 M.
Nuestra metodología con azúcar reductor detecta 5 µ?,. de xilosa al 0.031% (hilera superior, pocilio 6 desde el lado izquierdo) y aproximadamente 5 µ??? de 0.1 U/mL de xilanasa en el ensayo de enzima (hilera inferior, pocilio 7 del lado izquierdo) .
Ejemplo ii La metodología usada en este ejemplo es también un sistema de detección a base de una metodología de azúcar reductor. La metodología usada en este ejemplo es la misma que aquella para el ejemplo i hilera superior arriba (xilosa 1-0.0001%) - excepto que azul tetrazolio fue sustituido con tetrazolio nitroazul y la reacción se dejó revelar a temperatura ambiente durante 60 minutos. Los datos se presentan en la figura 27.
Ejemplo iii La metodología descrita en el ejemplo i o ejemplo ii puede usarse en un dispositivo o método de ensayo de acuerdo con la presente invención para detectar xilanasa activa en una muestra. A este respecto, la metodología de detección de xilanasa se incorpora en una prueba rápida similar a la descrita en la parte 1 (arriba) .
Así, de una manera similar a la prueba de fitasa mencionada arriba, la xilanasa de un extracto de pienso complejo se captura sobre un anticuerpo desdarrollado contra una xilanasa deseada o adecuada. En la metodología, la enzima xilanasa es expuesta al substrato xilano y la xilosa resultante producida es detectada por, por ejemplo, el ensayo de azúcar reductor de tetrazolio. La figura 28 presenta un esquema de esta metodología.
Todas las publicaciones mencionadas en la descripción anterior se incorporan en la presente por referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema descritos de la presente invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica sin alejarse del alcance y espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención ha sido descrita en relación con modalidades, preferidas específicas, se debe entender que la invención reclamada no debe ser limitada indebidamente a estas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que sean obvias para los expertos en bioquímica o campos relacionados intentan estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (86)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un dispositivo de ensayo para la detección de enzima activa en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta en la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta en la matriz está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta ; (d) medios de captura están presentes en o definen cada una de las ubicaciones de captura distintas, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la enzima de tal manera que al menos una porción de la muestra de enzima se detecta en por lo menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar indicación selectiva de la presencia de enzima activa unida a los medios de captura.
2. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región de colocación es una almohadilla absorbente.
3. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la región de colocación está en un extremo de la matriz.
4. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende múltiples ubicaciones de captura distintas.
5. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende más de dos ubicaciones de captura distintas.
6. El dispositivo de ensayo de conformidad ,con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende tres ubicaciones de captura distintas.
7. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque la cantidad de medios de captura en cada ubicación de captura distinta es diferente o la misma.
8. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cantidad de medios de captura en cada ubicación de captura distinta aumenta o disminuye entre más lejos está la ubicación de la región de colocación.
9. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende un reactivo de bloqueo.
10. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el reactivo de bloqueo se une directamente al dispositivo.
11. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque el reactivo de bloqueo es o comprende tensioactivo.
12. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el reactivo de bloqueo es un agente tensioactivo.
13. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque el reactivo de bloqueo es Tween.
14. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la matriz es un material absorbente.
15. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la matriz es o comprende nitrocelulosa .
16. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el medio de indicación selectiva comprende una reacción de precipitación.
17. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el medio de indicación selectiva comprende o proporciona un cambio de color visible.
18. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el cambio de color es causado por la reacción de un sustrato de la enzima para formar un resto que reacciona con una especie reactiva.
19. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el sustrato se une a la matriz.
20. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el sustrato es un sustrato de fosfatasa que usa/tiene un donante de fosfato.
21. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sustrato de fosfatasa es ácido 2 - fosfo-L-ascórbico trisódico (AsAP) .
22. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque la especie reactiva es un compuesto de tetrazolio.
23. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la especie reactiva es un compuesto de tetrazolio nitroazul.
24. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la especie reactiva es cloruro de tetrazolio nitroazul (NBT) .
25. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la especie reactiva es un compuesto de halonitrotetrazolio .
26. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la especie reactiva es un compuesto de yodonitrotetrazolio .
27. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la especie reactiva es cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) .
28. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, caracterizado porque el sustrato de fosfatasa se hace reaccionar con la especie reactiva en presencia de un potenciador de reacción.
29. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el potenciador de reacción se une a una matriz secundaria.
30. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el potenciador de reacción es un compuesto de fenazina.
31. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque el potenciador de reacción es un compuesto de metosulfato .
32. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque el potenciador de reacción es metosulfato de fenazina (PMS) .
33. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, caracterizado porque los medios de captura son los mismos.
34. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizado porque los medios de captura son anticuerpos.
35. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque los anticuerpos son anticuerpos producidos contra la enzima o un componente de la misma (por ejemplo, un fragmento de la misma y/o un epítopo de la misma) .
36. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizado porque los anticuerpos son anticuerpos policlonales o monoclonales .
37. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque la muestra es una muestra acuosa.
' 38. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, caracterizado porque la muestra se deriva de un pienso o aditivo para piensos .
39. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, caracterizado porque la muestra es una extracción de un pienso o aditivo para piensos.
40. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, caracterizado porque la muestra es una extracción de un gránulo de pienso.
41. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, caracterizado porque la enzima es una fosfatasa ácida.
42. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, caracterizado porque la enzima es una fitasa.
43. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la fitasa es una 6-fitasa, tal como fitasa BP17.
44. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, caracterizado porque la enzima es una xilanasa.
45. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44, caracterizado porque la migración es en una dirección longitudinal.
46. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 45, caracterizado porque las ubicaciones de captura son perpendiculares al flujo migratorio de la muestra.
47. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, caracterizado porque es una tira o una varilla.
48. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 47, caracterizado porque comprende una cubierta.
49. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la cubierta está formada por un pliegue en el dispositivo que define dos secciones .
50. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque algunos o todos los componentes del dispositivo (a) a (e) están presentes en una sección, y en donde algunos o todos los componentes del dispositivo (a) a (e) están presentes en la otra sección.
51. El dispositivo de ensayo de conformidad con la reivindicación 49 o 50, caracterizado porque el medio de indicación selectiva (e) , o al menos un componente del mismo, está presente en una sección, y en donde algunos o todos los componentes del dispositivo (a) a (d) están presentes en la misma u otra sección.
52. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, caracterizado porque el medio de indicación selectiva (e) , o al menos un componente del mismo, está presente en una sección, y en donde los componentes del dispositivo (a) a (d) están presentes en la misma u otra sección.
53. El dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 52, caracterizado porque el medio de indicación selectiva (e) , o al menos un componente del mismo, está presente en o sobre la cubierta.
54. Un dispositivo de ensayo caracterizado porque es para evaluar al menos semicuantitativamente el nivel de fitasa activa en un pienso o aditivo para piensos.
55. Un dispositivo de ensayo caracterizado porque es para evaluar al menos semicuantitativamente el nivel de xilanasa activa en un pienso o aditivo para piensos.
56. Un método para determinar la presencia de enzima activa en una muestra, caracterizado porque la muestra se pone sobre la región de colocación del dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55 y los medios de indicación selectiva del dispositivo indican si está presente enzima activa.
57. Un método para determinar niveles de enzima activa en una muestra, caracterizado porque la muestra se pone en la región de colocación del dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55 y los medios de indicación selectiva del dispositivo indican semicuantitativamente la cantidad de enzima activa presente.
58. El método de conformidad con la reivindicación 56 ó 57, caracterizado porque la muestra se obtiene de un alimento o pienso.
59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 58, caracterizado porque la enzima activa a ser detectada es fitasa.
60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 58, caracterizado porque la enzima activa a ser detectada es xilanasa.
61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 60, caracterizado porque se usa para determinar si enzima adicional tiene que ser añadida a un alimento o pienso.
62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 61, caracterizado porque se usa para determinar si fitasa adicional tiene que ser añadida a un alimento o pienso.
63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 62, caracterizado porque se usa como una forma de control de calidad.
64. Un kit caracterizado porque comprende o es capaz de formar el dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55.
65. El kit de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque comprende reactivos secos que se reconstituyen mediante la adición de una muestra líquida o acuosa .
66. El kit de conformidad con la reivindicación 64 ó 65, caracterizado porque además comprende al menos un reactivo líquido que será añadido por un operador.
67. El kit de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el reactivo líquido es una solución de tetrazolio .
68. Un método para determinar la presencia de enzima activa en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas de: a) poner en contacto al menos una porción de la muestra con un medio de captura con lo cual la enzima sea capturada por el medio de captura; b) proporcionar un substrato adecuado para la enzima capturada en donde el substrato reaccione con la enzima capturada para producir un producto enzimático; c) proporcionar una especie reactiva capaz de reaccionar con el producto enzimático, en donde la especie reactiva reacciona con el producto enzimático para producir un producto insoluble; y d) detectar el producto insoluble obtenido en la etapa c) , en donde la detección se correlaciona con la presencia y/o cantidad de una enzima activa en la muestra.
69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la enzima es una enzima como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67.
70. El método de conformidad con la reivindicación 68 o 69, caracterizado porque la muestra es una muestra como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67.
71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 70, caracterizado porque el medio de captura es un medio de captura como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67.
72. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 71, caracterizado porque la especie reactiva es una especie reactiva como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67.
73. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 72, caracterizado porque usa el dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67.
74. Un dispositivo de ensayo o un método que usa el mismo o el uso de los mismos, en donde el dispositivo de ensayo es para la detección de fitasa activa en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta sobre la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta ; (d) medios de captura que están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la fitasa de tal manera que al menos una porción de la muestra de la fitasa se retenga en al menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de fitasa activa unida a los medios de captura .
75. Un dispositivo de ensayo o un método que usa el mismo o el uso de los mismos, en donde el dispositivo de ensayo es para la detección de fitasa activa en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra ,- (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta sobre la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta ; (d) medios de captura que están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la fitasa de tal manera que al menos una porción de la muestra de la fitasa se retenga en al menos una ubicación de captura distinta, en donde el medio de captura comprende un anticuerpo; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de fitasa activa unida a los medios de captura.
76. Un dispositivo de ensayo o un método que usa el mismo o el uso de los mismos, en donde el dispositivo de ensayo es para la detección de fitasa activa en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta sobre la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta; (d) medios de captura que están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la fitasa de tal manera que al menos una porción de la muestra de la fitasa se retenga en al menos una ubicación de captura distinta, en donde el medio de captura comprende un anticuerpo que se puede unir a BP17; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de fitasa activa unida a los medios de captura .
77. Un dispositivo de ensayo o un método que usa el mismo o el uso de los mismos, en donde el dispositivo de ensayo es para la detección de xilanasa activa en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta sobre la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta ; (d) medios de captura que están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la xilanasa de tal manera que al menos una porción de la muestra de la xilanasa se retenga en al menos una ubicación de captura distinta; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de xilanasa activa unida a los medios de captura.
78. Un dispositivo de ensayo o un método que usa el mismo o el uso de los mismos, en donde el dispositivo de ensayo es para la detección de xilanasa activa en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) una región de colocación sobre la cual se puede colocar la muestra; (b) una matriz conectada operablemente a la región de colocación de tal manera que la muestra cuando esté presente (tal como puesta) sobre la región de colocación pueda migrar a lo largo de la matriz; (c) al menos una ubicación de captura distinta sobre la matriz, en donde cada ubicación de captura distinta está distanciada de la región de colocación, y en donde la muestra puede migrar a través de la ubicación de captura distinta ; (d) medios de captura que están presentes en o definen cada ubicación de captura distinta, en donde los medios de captura son capaces de unirse a la xilanasa de tal manera que al menos una porción de la muestra de la xilanasa se retenga en al menos una ubicación de captura distinta, en donde el medio de captura comprende un anticuerpo; y (e) medios de indicación selectiva o al menos un componente de los mismos para proporcionar la indicación selectiva de la presencia de xilanasa activa unida a los medios de captura.
79. El dispositivo de ensayo o un método que usa el mismo o el uso del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los medios de indicación selectiva están constituidos sobre y/o en el dispositivo de ensayo cuando el dispositivo de ensayo está en uso .
80. Un kit que comprende o es capaz de formar el dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio de indicación selectiva se añade al kit.
81. Un kit que comprende o es capaz de formar el dispositivo de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos un componente del medio de indicación selectiva se añade al kit.
82. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se suministra con una tarjeta de puntuación o tarjeta de referencia .
83. Un dispositivo de ensayo, caracterizado porque es sustancialmente como el descrito en la presente y con referencia a las figuras.
84. Un método caracterizado porque es sustancialmente como el descrito en la presente y con referencia a las figuras.
85. Un uso sustancialmente como el descrito en la presente y con referencia a las figuras.
86. Un kit caracterizado porque es sustancialmente como el descrito en la presente y con referencia a las figuras .
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