CN1225134A - 用固相法检测生物活性物质 - Google Patents

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Abstract

本发明披露一种方法,通过固相检测法测定生物活性的量,鉴定和/或定量分析生物活性物质。该方法是利用生物物质自身的活性而形成的检测方法。该方法提供了竞争性的和非竞争性的检测。

Description

用固相法检测生物活性物质
技术领域
本发明一般来说涉及检测、鉴定有生物活性的物质的性质、含量和分子活性的方法。更具体地说，本发明是关于用固相法测量酶活性、酶抑制剂、凝集素、受体和其它具有生物活性分子的技术。背景技术
配位结合测定，在已知的免疫检测中常用，它基于抗体鉴别原理，对物质进行定量(参阅Stites et al，《基础临床免疫》，第8版Appleton & lange出版社，第170-176页，综述)。然而，免疫检验有两个缺点：第一个缺点是，它需要大量抗体与相应物质结合。第二个缺点是，即使物质被鉴定有生物活性，例如酶，此方法也只能鉴定它的存在，而不能测量其活性水平。
虽然有许多检测酶活性、受体功能等方法，但应用此固相法技术不但能精确测量极少量的组份，而且可以省去物理分离步骤，还可以对大批样品进行常规检验。
例如，酶在生化反应中起关键性的作用，在有关生物学领域，如医药，食品，制药业方面测定酶活性都显得十分重要。现在通用的酶检测方法，其原理都基于酶催化底物过程中产物的形成(Loround,1981；Rossomando,1990)。尽管这些方法是许多生物研究中的主流，但是研究不仅要测量其活性的存在，还要将其量化。这一点对于那些不遵守米氏运动常数的酶，如别构酶和那些活泼的共价修饰酶尤为重要。
另外，需要定量可能存在于生物系统中的酶抑制剂含量。这一点在医药领域受到极大重视，在研究爱滋病过程中发现一些酶的抑制剂(Miller etal 1989)或抑制剂的生长控制血压(Ondetti et al 1982)或包括象青霉素这些抗生素的水解(Cullman,1990)。
急需一种能够自动检测酶的方法，特别是在制药业，在此，酶通常用做发现新药的靶物质。在探求一种新药的过程中，需要过滤掉成千上万的混合物。这一新方法的改进不仅为自动高效过滤提供方便，而且在许多其他应用上将大大降低成本。另外，对于酶来说高效自动分离对于测定受体和凝集素也是必须的。
例如，有一个简便可信的检测β-葡聚糖酶的方法，该酶对酿酒和家禽养殖中所需的大麦β-葡聚糖的水解过程中起着重要作用。对于该检测据报道有好多种，如粘度计法(Boume and Pierce,1970)，蔗糖还原法(Denalt etal,1978)，径向胶扩散法(Edney et al,1986；Martin and Bamforth 1983)和偶氮-大麦葡聚糖法(McClearly and Shameer,1987)。迄今为止，任何对成品饲料中的酶检测和定量都面临克服仪器的灵敏度和饲料自身复杂性的技术问题。若有一个改进的高度灵敏的光度计法，特别是它能使检测高水平的自动化，将十分受欢迎，微量滴定技术采用微量滴定板和微量滴定板读取器将大大方便检验工作。
在这个研究方向上有两个分支：一个是(Wirth和Wolf 1992)应用微量滴定板比色法，这一实验方法的原理与偶氮-大麦葡聚糖法一样，只是它在微量滴定板孔内读取吸收值，这个操作过程与偶氮-大麦葡聚糖法的缺点一样需要沉淀和离心步骤，其灵敏度也未达到很高水平；另一个方向是利用酶的免疫特性对酶的含量进行定量(Buhler,1991；Rafael et al1995)，这一技术的主要缺点是它不能够评估特殊酶的活性。免疫检测估计的是酶蛋白的含量，而不是酶的生物活性，所以这一检测方法只能用于抗体高度特异性的种间关系十分近的酶检测。在近期Headon(1993)的综述中，得出这样结论：迄今为止还没有报道过一个合适的检测和定量酶的方法，这可能部分原因是通常无法检测低水平的酶。
所以说，获得一个简便灵敏和有效的检测蛋白酶活性的方法将对于重组蛋白工业测试内源水解蛋白酶的活性，以及新药发现过程中过滤蛋白酶抑制剂以及诊断和常规研究有极大帮助。然而，用现在通用的方法由于有灵敏度不高(例如酪蛋白胶)，繁琐的操作步骤(例如三氯乙酸沉淀，离心和加热)，同位素辐射的危险(例如放射性标记底物)以及需要昂贵的仪器(例如荧光极化分析仪)等缺陷，所以不能满足需要而且这些方法既费时又无法自动化。发明简述
根据本发明，公开了一种应用固相法检测生物活性量和/或生物活性物质量的方法。该方法是提供应用物质自身生物活性进行检验的方法。
在本发明的实施方案中，公开了一种方法，即通过固相法检测具有生物活性物质的生物活性量。组份1结合到一个表面上，在此表面上组份1与指示剂1偶联。样品与组份1接触。样品中含有待测的未知生物活性的组份2。这些组份反应条件控制在生物活性使组份1与组份2反应将解离出组份1的范围内。反应完成后，去除样品，测出残留在表面的组份1的量。生物活性的含量与组份1的残留量之间呈反比关系。
在本发明的另一个方案中，公开了一种方法，即通过固相法检测有生物活性物质的生物活性抑制剂的量。组份1结合到一个表面上，在此表面上组份1与指示剂1偶联。样品与组份1接触。样品中不仅包含组份2，且已知其含量并有生物活性，而且还含有组份3，含量未知，且组份3是组份2的抑制剂。各种组份需在预定时间内反应，其条件控制在生物活性使组份1与组份2反应解离出组份1，组份3将干扰组份1与组份2之间的反应。反应完成后，去除样品。测出残留表面的组份1的量，此量与样品中组份3的量有正比关系。
本发明还提供一种方法，利用生物抑制性活性，通过固相法鉴定生物活性物质的特性的方法。组份1偶联指示剂1结合到一表面上，样品与组份1接触。样品中含有组份2，已知其具有一般生物活性，但不知道它的特殊活性。样品中还包含有已知量的组份3，它可能是组份2的抑制剂。此试验包括一组这样潜在的抑制剂。反应需控制在以下条件，生物活性使组份1与组份2反应解离出组份1。如果组份3对组份2特异性的话，它能够干扰组份1与组份2之间的反应。
预定时间结束后，如已知技术那样，一般需要清洗除去样品。测定残留表面的组份1的量，假如此量减少，那么说明组份3干扰了组份1与组份2之间的反应，以此鉴定组份2。假如残留表面的组份1量没有明显减少，那所选择的特殊抑制剂没有干扰反应，组份2不能被鉴定。此技术确切的标准曲线按已知的技术操作。
本发明还提供了基于组份2具有生物活性，做了组份1与组份2之间竞争性试验。
第一套试验：第一组用固相竞争性检测法，利用物质的生物活性定量有生物活性物质。
组份1的量已知，它与有生物活性的组份2结合，并结合到反应容器的表面。加入样品或者抽提物，其中含有有生物活性的组份2，其量未知。样品中还含有另一部分与指示剂1偶联的组份2，其量已知。反应条件依据生物活性，达到组份1与组份2结合为好。预定时间结束后，将样品移去。测出结合到组份1，与指示剂1偶联的组份2的含量，此量与样品中有生物活性但量未知的那部分组份2之间存在反比关系。通过已知的确切标准曲线，可对其进行定量。
在另一个检测试验中，第二组中样品含有未知量的组份1和已知量的与指示剂1偶联的组份2。结合到组份1并与指示剂1偶联的组份2的量与样品中组份1的未知量之间呈反比关系。
第二套试验：固相竞争性检测试验，即利用物质的生物活性检测有生物活性物质量的方法。在这套试验中，具有生物活性的组份2，其量已知，结合到反应容器的表面。加入的样品中含有未知量的组份2；已知量的组份1(与指示剂1偶联)。控制反应条件，依据生物活性，恰使组份1与组份2结合。反应结束后，将样品去除。测定结合到组份2上的与指示剂1偶联的组份1的量，它与样品中组份2的未知量呈反比关系。
在第二套第二组的另一试验中，样品只含有组份1，但分两部分，已知量的一部分与指示剂1偶联，另一部分组份1的量未知。反应结束后，测定结合组份2并与指示剂1偶联的组份1的量，它与样品中未知组份1的量呈反比关系。
在这些竞争性检测试验中，组份2可以是酶，组份1是酶的抑制剂。另一种选择，组份2可以是凝集素，而组份1是凝集素结合物。此外，这些试验可用受体作为组份2，而组份1是受体结合物。附图的简要说明
本发明其他优点是，结合附图使本发明清晰易懂。下面参考附图对本发明进行详细说明，本发明附图有：
图1是合成生物素(酰)化β-葡聚糖的框架图。β-葡聚糖的羟基基团被高碘酸钠(NaIO4)部分氧化为醛基(A)，随后反应液中加入乙二胺[NH2(CH2)2NH2](B)。希夫碱被四氢硼化钠(NaBH4)还原(C)，紧接着β-葡聚糖-乙二胺复合物的自由氨基基团与N-羟基琥珀酰亚氨酯生成生物素(酰)化β-葡聚糖(D)。
图2是用ELSA检测β-葡聚糖酶过程的框架图。底物是生物素酰化的β-葡聚糖(B-βG)，它与β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)作用，通过清洗(A)将水解的底物去除。然后用过量碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合物(SA-SP)与水解的(B-βG)作用，随即洗去未反应的SA-SP(B)。SA-SP结合到水解的底物B-βG的量，用pNPP(C)与之作用来对其定量。箭头指的是被β-葡聚糖酶水解的键。
图3是生物素-葡聚糖底物被β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)水解后，未水解的β-葡聚糖用第二种酶进行定量的曲线。0.002生物素-葡聚糖的两个浓度分别稀释50倍和100倍[1∶50(■)和1∶100(□)稀释液]，而0.2生物素-葡聚糖复合物分别稀释50,000倍和100,000倍[1∶50,000(▲)和1∶100,000(Δ)稀释液]包被在微量滴定板上(如何制备作为材料与方法在例1中详细描述)。β-葡聚糖酶(100μl)按照指定浓度加入孔中并混匀，在22℃，反应保持15分钟。用PBS-T缓冲液冲洗以结束反应。然后在每个孔里加碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合物(SA-SP)，下一步洗去未结合的复合物。结合上去的碱性磷酸酶加上硝基苯磷酸在1M的二乙醇胺缓冲液中温育在22℃，反应保持30分钟，以此进行定量。其值是三次试验分析的平均值即(mean±SD)。
图4是对木聚糖蛋白酶检测的标准曲线图。生物素(BNHS)与阿拉伯木聚糖的比率是0.2，底物稀释1至10000倍。加入每一孔中的酶量，由横坐标指示。其它条件在图3和实施例1的材料方法中已经述及。其值是三次试验分析的平均值(mean±SD)。
图5是生物素-β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)的水解时间-反应曲线图。0.2生物素-葡聚糖稀释50,000倍，酶的6个浓度分别是0.032(1)、0.16(2)、0.8(3)、4(4)、20(5)和100(6)mU/孔，反应温度22℃，作用时间是0、1、3、9、27分钟。显色反应温度在22℃，时间30分钟。其它操作过程在图3和实施例1的材料方法中已经述及。β-葡聚糖酶的净活性值通过包含酶的吸收值(ODi)减去不包含酶的吸收值(ODo)获得。
图6是β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)的浓度对生物素-葡聚糖水解的影响图。图中指示检测的时间和酶浓度。其它条件在图5中述及。
图7是预先水解(Δ)的和未水解(O)的β-葡聚糖对β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)活性影响的曲线图。图中显示将两种形式不同量的β-葡聚糖加入含有生物素-β-葡聚糖的孔中，再在每孔中加的0.5mU的β-葡聚糖酶50μl，其它条件在实施例1的材料方法和图5中述及。
图8是比较偶氮-大麦葡聚糖法和ELSA法对β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)检测的标准曲线的曲线图。ELSA(■)偶氮一大麦葡聚糖(▲)，请参阅实施例1的材料与方法和图5，可详细了解两个检测。
图9是胰蛋白酶浓度的典型的剂量-反应曲线图(实施例2)。
图10A-B是剂量-反应曲线图，分别是测定卵类粘蛋白(A)浓度或抑蛋白酶醛肽(B)浓度决定的剂量-反应曲线。这一检测的操作过程与图9中的一样，只是用卵类粘蛋白和抑蛋白酶肽醛代替了未标记的胰蛋白酶作为可变的竞争剂。三次试验分析的平均值，即吸收值±SD，阳性对照其值是2.0±0.01(A)和1.95±0.002(OD)光密度单位。
图11是胰蛋白酶抑制剂(卵类粘蛋白)与其他不同的蛋白酶交叉反应图的曲线图。用于这一试验的蛋白酶有：胰蛋白酶(EC3.4.21.4)■---■,；胶原酶(EC3.4.24.3)---；组织蛋白酶D(EC3.4.23.5)●---●；弹性酶(EC 3.4.21.11)Δ---Δ；嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27)--；胃蛋白酶(EC3.4.23.1)|--|；木瓜蛋白酶(E)··C3.4.22.2)_--_；蛋白酶ⅩⅢ(EC3.4.23.18)----；蛋白酶ⅩⅩⅪ+-+；和蛋白酶Ⅳ 除了那些作为可变竞争剂取代未标记的胰蛋白酶的蛋白酶，其余鉴定过程在图9中给出。这些值是三次试验的平均值。阳性对照的吸收值±SD是1.85±0.007光密度(OD)单位。
图12是用胰蛋白酶水解生物素酰化的α-酪蛋白的曲线图。得出的值是三次反应分析的平均值SD±0.005OD单位(请参阅例3的材料与方法)。
图13是用木瓜蛋白酶水解生物素酰化的α-酪蛋白的曲线图。得出的值是三次反应分析的平均值SD±0.005OD单位。
图14是用蛋白酶Ⅳ(streptomyces caespitosus)水解生物素酰化的α-酪蛋白的曲线图。得出的值是三次反应分析的平均值SD±0.005OD单位。
图15是关于检测卵类粘蛋白(胰蛋白酶抑制剂)抑制胰蛋白酶活性的抑制性图。得出的值是三次反应分析的平均值SD±0.002OD单位。胰蛋白酶活性100％受抑制得到的最高光密度值ODmax是1.056。最高光密度值ODmax等于孔板中包括胰蛋白酶和抑制剂的所得的OD值，减去另一孔板中只含有胰蛋白酶所得的OD值。优选实施方式的详细说明
根据本发明，公开了一种应用固相法测定生物活性的量(比例和程度)和/或对有生物活性的物质进行定量或鉴定。其原理是利用物质自身的生物活性，进行自我鉴定。本方法不需要抗体。
已知的固相法检测，组份1结合到反应器皿表面，样品与反应容器中的组份1(含有指示剂分子)接触。样品中包含具有生物活性的组份2。相反的若组份2结合到反应器皿表面，样品中包含组份1也是可行的。由于具有生物活性是组份1和2之间发生相互作用。这种作用使指示剂分子发生改变。
生物活性和/或具有生物活性的物质，意思是说，任何生物分子作用另一个分子上，要么改变，要么结合到其分子(配体)上。可以作用在其中，也可作用其一部分，或派生出一个生命系统/有机体。例如象这一类分子，如酶、凝集素、受体、细胞粘和分子等就属于上面所述。
固相法检测，对竞争性和非竞争性都适用，它一般包括两种组份。其中一个具有生物活性组份(本文一般指组份2)对另一个组份(一般指组份1)起作用。由于组份2具有生物活性，结合或干扰(抑制剂)组份2。例如这两种组份可以是酶及其底物、酶及其抑制剂、凝集素和凝集素结合物质、受体和受体结合物质、以及粘着分子和细胞表面分子。
检测试验需要将其中一个物质结合到反应容器表面。一般将组份1结合上去，相反，本发明也提供将组份2结合到容器表面的试验方法。在本发明的各种实施方式中详细描述了用试验中的一个组份结合(或包被)反应容器表面的方法。一般来说，结合方法不同，结合到表面的组份所起的作用就不同。方法中包括已知的酶免疫技术(EIA)，采用“三明治”法。例如，抗体即可以作为结合到表面的物质，反过来又结合该组份。选择试验方法要使硬脂对组份的影响达到最小，对于试验的实施方式各组份的量要最合适。在这一优选的实施方式中用微量滴定板作为反应容器。
另外，检测试验中需要将一个组份进行标记，试验中所指的标记物是一个用于定量分析结果的指示剂分子。组份可以通过随机标记或只是一端标记在合适的酶切位点，结合位点或其它活性位点。
可通过直接或间接进行测量。如果是间接测量，指示剂分子可以是一个偶联的系统，象生物素-亲和素(或链霉抗生物素蛋白)。系统中的一个组份被生物素标记。偶联到亲和素上的标记物可以是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘化。不仅亲和素(或链霉抗生物素蛋白)标记的指示剂可用于检测生物素酰化的底物。其它互相结合偶联的一对也可使用。这些偶联的物质需具有这些性质：低结合常数，在反应条件下稳定，有特异性，不增加背景值，不干扰检测。其它偶联的一对组份之间的反应，可以发生在抑制剂和其具有生物活性的靶物质之间，也可在碳水化合物和凝集素之间反应。例如用甘露糖或葡萄糖代替生物素，相对应的用标记的凝集素代替亲和素，即甘露糖-凝集素或葡萄糖-凝集素，就是一个偶联对。测量这些标记的技术方法对于本专业人员都熟悉，在本发明的实施例中也有涉及。
从另一方面说，可利用直接测量被标记的组份，可用的指示剂(标记物)如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘化。
如本文所述，保持各组份间的生物活性是各组份之间混合反应的条件。通常，当有生物活性的物质和其它组份发生反应，就会改变可用于测量的标记物的量。例如，当生物上的活性物质是酶，它将解离或酶切它的底物(结合到反应容器表面的组份1)。这些条件已经成熟，在本发明中对于每一个具有生物活性的组份都做了描述。
受体一般结合到它们的配体上，如细胞粘着分子和凝集素的竞争性试验，测量它们的量是必要的。凝集素曾定义为无免疫球蛋白特性的蛋白(糖蛋白)。它能特异的识别和可逆的结合到碳水化合物复合物的碳水化合物部分而不改变所识别糖基配体的共价键。另一个定义是凝集素是不具备免疫原性的蛋白(或糖蛋白)它聚集细胞和/或沉淀复合糖(糖缀复合物)。凝集素通常作用在寡糖或多糖的非还原性末端，可作用的范围很小C-3或C-4但C-2就是临界。(1989Pusztai，关于凝集素有一个详细的综述)，试验检测可获得的凝集素或它们结合的复合物，
样品可以是某一产品的抽提物，其中可能含有需要鉴定的具有生物活性的物质，或是鉴定其活性含量或对其组份进行定量。就本发明介绍，应用固相检测法，样品/抽提物不需要纯化而直接应用，抽提物中所谓影响因素不用去掉，洗涤。而且介绍的方法不需要对要测量的物质进行物理抽提。
反应后去除样品，通常据我们所知，在EIA技术中采用从反应容器(微量滴定板孔)冲洗掉。测定组份(结合了指示剂)的残留量。推荐使用比色检测法，它用酶标(ELISA)板读出器和相关技术。
本发明提供一种应用固相法，利用生物活性的特征，检测具有生物活性物质的生物活性量。在此方法中组份1偶联指示剂1并结合到反应容器表面。样品与结合到容器表面的接触。样品中包含组份2。组份2具有生物活性，但其含量(比率)未知，这就是试验中要测定的量。这些组份混合状态下反应，条件控制在组份1与组份2之间保持活性。在这个试验中，活性作用结果是从表面上解离下组份1或其分子的一部分，也就是说组份2水解被标记的组份1，或从表面将其移去。样品在允许反应的限定时间后去除。在反应结束后，如何测定组份1结合在表面的残留量，在本文前面有述。生物活性的量与依旧结合在表面的组份1的残留量之间有一个反比关系。也就是说，组份2的活性越大，依旧结合在表面的组份1的量就越少。
这一方法中组份2可以是酶，而组份1是酶的作用底物。酶能够对高分子和非高分子的底物中选择降解。高分子底物是那些至少具有两个酶切位点的蛋白、多肽、碳水化合物、DNA和RNA。可选的非高分子底物也可以是的肽、碳水化合物分子以及核酸序列，它们只有一个被酶作用的位置(位点)。
例如，对某一选定的蛋白酶，它的蛋白底物可以是酪蛋白、白蛋白、胶原和明胶。在另一选择的实施例中，选定的酶是β-葡聚糖酶，它的底物是葡聚糖。若酶是木聚糖酶，它的底物是阿拉伯木聚糖。如果酶是纤维素酶，它的底物是纤维素。
如上述讨论，测量与指示剂偶联的组份1残留量，可用间接标记物，如生物素-亲和素(亲和素偶联到碱性磷酸酶上)，若直接标记物，就用碱性磷酸酶，优选的比色法也可以用。对于检测来说，本文中已给出一个适合的校准曲线或标准曲线，使测量结果得以定量。
标记高分子底物(组份1)，生物素或其它标记物偶联到分子各部分。酶在多酶切位点上作用分子，很多标记物被移走，说明了酶的活性。
对于非高分子底物来说，只有一个酶切位点。组份1直接或间接地结合到表面，分子的其它部分直接或间接地被适当的指示剂标记。组份2将底物分解，在此例中，它是酶。组份2将指示剂分子释放到介质中，随后被去除，一般采用清洗。被标记分子的残留量和生物活性物质的活性是相关的。例如作为一个酶的底物，肽，通过肽的末端羧基结合到表面，无论采用直接测量法还是间接测量法，其另一末端氨基基团与指示剂1分子结合。反应结束后，可以定量测定含有标记物的未水解的底物，它的量与相对应的酶的活性成反比。
本发明同时提供一种方法，通过固相法，利用物质的生物抑制活性，检测抑制剂(一种有生物活性的物质)的生物活性。在这个试验中，组份1结合到反应容器表面，组份1与指示剂1偶联。随后在反应容器中加入含有已知含量组份2的样品，已知组份2具有生物活性。样品中同时含有未知含量的组份3，它是组份2的抑制剂。这些组份在规定时间内反应，反应条件控制在，生物活性使组份1与组份2的作用过程中把组份1解离，组份3干扰了组份1与2之间的反应。反应结束后，将样品去除。
如上所述，测定反应后依然在表面上结合的组份1的量。依然与表面偶联的组份1的量与样品中组份3的量呈正比关系。也就是说，反应中抑制剂越少，组份1与2之间的反应解离下来的标记物就越少。样品中抑制剂越多，可用于检测的标记物就越多。
如上所述，高分子或非高分子的组份1(底物)可用于检测和被标记。
在本发明的第三个实施方式中，公开了一种检测方法，利用生物活性的抑制作用通过固相法鉴定有生物活性物质。如上述前两个试验，组份1偶联指示剂1结合到表面。样品与组份1接触，样品中含有组份2，知道它有一般生物活性，但不知道它的特异性。例如，组份2是一个蛋白酶，但不能明确它是哪一种蛋白酶。样品中含已知量的组份3，它可能是组份2的抑制剂。作了一组几个试验，来检测潜在抑制剂。反应在如下条件进行，组份1与2在生物活性作用下，解离出组份1。如果组份2是特定的话，组份3干扰组份1与2之间的反应。
过了反应规定时间，将样品除去，通常用本文已知的方法清洗。测定结合在表面的组份1的残留量。如果结合在表面的组份1的量减少，则说明组份3干扰了组份1与2之间的反应，组份2就可被鉴定。若结合在表面的组份1的量没有明显减少，则说明所选择的特殊抑制剂没有干扰组份2，组份2就不能被鉴定。本文中已给出标准曲线。
本发明基于组份2具有生物活性，同时提供了组份1与2的竞争性试验。
在这一套试验中是应用固相竞争法，即利用物质的生物活性来确定具有生物活性物质的量。已知量的组份1结合到反应容器表面，组份1能与有生物活性的组份2结合。样品或抽提物既包括一部分未知量的组份2，还包括一部分已知量的组份2(已与指示剂偶联)。由于具有生物活性，反应控制在组份1与2能够结合。在规定时间之后，用本文前述方法，去除样品，测定的组份2(偶联指示剂1)与组份1结合的量。这个量与样品中具有生物活性的组份2的未知含量之间，呈反比关系。也就是说，标记物越多，组份2的未知含量就越少。本文中已给出适当的标准曲线，供定量使用。
这套试验的另外一组，样品中含有其量未知的组份1，还含有与指示剂1偶联的已知含量的组份2。与表面结合的组份1结合了组份2(已与指示剂偶联)。测定这个组份2的量，其结果与样品组份1的未知含量成反比。
在这些试验中，组份2可以是酶，而组份1是酶的抑制剂。在一个实施例中，酶选用胰蛋白酶和它的抑制剂是卵类粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。另外可用凝集素作为组份2，组份1是凝集素结合物质。这个试验还可用受体作为组份2，受体结合物质作为组份1。以及细胞粘和分子与细胞表面结合分子如CD2和细胞表面分子LFA-3也可用。
受体和它的特殊结合基团(配体)的相互作用，与酶和酶的抑制剂，凝集素和凝集素结合物质之间的作用一样。无论是配体或是受体包被在微量滴定板上，配体或受体的定量分析采用竞争型试验。在此条件下，无论是配体或是受体都会被适当的指示剂分子标记，靠它定量配体或受体。
第二套竞争性试验应用固相竞争法是利用物质的生物活性，来确定具有生物活性物质的量。在这些试验中，具有生物活性的组份2，其量已知，结合到反应容器表面。加入的样品中既含有组份2又含有组份1，其中组份2含量未知，组份1(已与指示剂1偶联)，其量已知。反应在以下条件下进行，由于有生物活性，使组份1与组份2结合。在反应完全结束后，去除样品。测定组份1(已与指示剂1偶联)结合到组份2(与表面结合的)上的量，此量与样品中组份2的未知量呈反比。
这套试验的另一组：样品中的组份1分为两部分，一部分与指示剂1偶联，它的量已知。另一部分组份1的量未知。反应完全结束后，测定组份1(与指示剂偶联)结合到组份2上的量，此量与样品中组份1的未知量呈反比。
在这些试验中组份2可以是酶，而组份1是酶的抑制剂。在一个实施例中，酶选用胰蛋白酶和它的抑制剂是卵类粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。另外可用凝集素作为组份2，组份1是凝集素结合物质。这个试验还可用受体作为组份2，受体结合物质作为组份1。也可用细胞粘着分子与细胞表面结合分子。
本发明可同时提供试剂盒做上述试验。另外试剂盒含有各个组份适合的缓冲液。如酶、底物或/和抑制剂、凝集素和凝集素结合物质、(配体)受体和受体结合物质(配体)、细胞粘着分子与细胞表面结合分子的适合的缓冲液。提供标准的反应容器，容器可事先包被符合试验用途的组份1或组份2，不局限于酶、受体、凝集素、凝集素结合物质或受体结合物质。另外，试剂盒还包括已标记好的组份和抑制剂，包括但并不局限于酶、受体、凝集素、凝集素结合物质或受体结合物质。试剂盒中还包括用于比色或其它方法的必要材料，这些材料用来测定试验过程中，留在反应容器上的标记物(指示剂)的含量。
在实施例1中：应用本发明介绍的方法，一个简便、灵敏的亲和素-生物素酶联吸收法(ELSA)，即利用氨基化和生物素酰化的葡聚糖作为底物(图1)，检测β-葡聚糖酶。在这个试验中，底物与β-葡聚糖酶一起温育，残留在滴定板上的β-葡聚糖-生物素，加碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合物到未反应的底物复合物(图2)中，通过酶促反应定量。由结合上去的碱性磷酸酶的活性产生的颜色反应，间接的与原滴定板孔中的酶的活性有关。应用第二个酶，不仅可以放大信号，而且以此为基础，提供了进一步简便监测β-葡聚糖酶活性的方法。
β-葡聚糖酶部分水解底物显示：从未水解的底物分离出的生物素和碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合物反应，即最终用碱性磷酸酶定量留在板上的β-葡聚糖。在试验中，结合上去的指示剂酶即碱性磷酸酶的活性，与样品中的β-葡聚糖酶的活性呈一定比例关系。ELSA是一个简便的方法，水解的β-葡聚糖片段，很容易用清洗的方法从未水解的底物中分离。它最适合于大批样品的常规检验(可达200人/日)，有很好的精确度(CV=4.0％到6.4％)，高的灵敏度(可检测如0.001mU的β-葡聚糖酶/每个试验)。一个相似类型的试验，用生物素酰化的阿拉伯木聚糖检测木聚糖酶。在实施例1中应用本发明的ELSA方法步骤检测β-葡聚糖酶和木聚糖酶，证明既简便且灵敏度高。
在实施例2中，介绍本发明的一个具体方法，它不仅对样品中的酶进行定量，而且能定量它抑制剂的浓度。这个方法涉及生物素酰化的酶抑制吸收剂法(BEISA)，它的原理是生物素标记的酶与之相对应的抑制剂特异性结合。在此试验中抑制剂被包被在塑料表面上，这里介绍的是微量滴定板孔。已知含量的生物素标记的酶和未知含量待测的酶混合，通过竞争固定化的抑制剂进行定量。酶-生物素复合物被抑制剂结合，也就可以定量的结合指示剂酶，即链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶偶联物。亲和素-磷酸酶复合物既已经被固定化，就可以与磷酸酶的一个底物发生反应，生成一个有颜色的溶液。此反应的颜色强度与样品中未知量的酶呈反比关系。酶在溶液中的精确含量，通过已知酶浓度做出的标准曲线上估计出来。
样品中抑制剂用同样的方法定量。在此过程中，要被定量的抑制剂与被固定在塑料表面的抑制剂相互竞争溶液中的生物素(酰)化酶。亲和素-磷酸酶复合物可定量的和已经偶联在固化抑制剂上的酶-生物素复合物反应，随后颜色显示。未知浓度的抑制剂可通过已知浓度的抑制剂所做的标准曲线测定，其浓度与亲和素-磷酸酶复合物生成的颜色强度呈反比。
实施例3是固相生物素酰化的酪蛋白试验，证实本发明采用固相法检测蛋白酶和蛋白酶抑制剂的正确性。将底物与固相的结合极大的简化了此试验接下去的反应步骤，象当清洗去除水解产物和未反应的试剂后，残留底物的量就可用标记的底物直接分析。若与固相上的生物素结合，它是一个相对较小分子。底物应避免硬脂(N-羟基琥珀酰亚酯)可能与较大的指示剂分子发生反应的干扰，所用的指示剂要有灵活性，即生物素要和任何指示剂发生反应，指示剂要偶联亲和素蛋白与生物素之间要具有较高的亲和性(格林，N.M.,1963)。另外，用碱性磷酸酶作为指示剂分子，比有色的分子好，因为碱性磷酸酶可明显放大信号，每个碱性磷酸酶分子可产生许多有颜色的分子。全部过程采用滴定板以及连接电脑的ELISA读出器，读取吸收值，可在相对较短的时间内十分方便地计算分析大量的样品。此外，本方法需要的试剂少，灵敏度高而且精确，在较短时间内即可完成。此方法最适合自动化的分析大量样品。
生物素酰化的酪蛋白试验方法的灵敏度，根据实施例3的条件，比放射性实验的结果低(Sevier,E.D.,1976),FTC-酪蛋白法(Twining,S.S.,1984),FITC25白蛋白法(Voss等1976)，FP方法(Bolger等1994)。但是此方法能够满足大多数蛋白酶检测基本需要，可以在很大范围内测蛋白酶活性(10-106ng胰蛋白酶/100μl/样品)。就试验结果指出，在其设计上有些灵活性，然而却是相对灵敏的。申请人已证实，检测的灵敏度可通过增加底物生物素酰化的程度，降低底物包被在滴定板孔上的量，增加水解的持续时间等方法，这些变化能使灵敏度显著提高。但有时为获得一个满意的吸收值，就要相应延长时间。解决后面的问题，可用不同的指示剂酶，象辣根过氧化物酶可高度转化或采用亲和素复合物，它含有多个指示剂分子结合的单位。在这样的条件下，检测蛋白酶不仅有可能提高灵敏度，而且可在相对较短的时间内完成。
尽管此试验中选择α-酪蛋白作为底物，若其它蛋白被证明更适合特殊检测或一组检测的话，也可采用。同时试验结果也指出，如果在试验中偶联一组不同的抑制剂，每个都可抑制不同种类的蛋白酶，那么样品中蛋白酶的种类就可以容易鉴定。另外，测定特殊蛋白酶抑制剂的浓度，该试验还要修改。
综上所述，这份报告是关于检测蛋白酶和蛋白酶抑制剂的新方法的进展情况，也就是对其灵敏、精确、简便、快速且容易适合待测试验样品的特异性作出说明。开展此试验并不昂贵，所使用的仪器大多数实验室都有，而且能自动检测。
上述讨论为通过固相法(无论是竞争性的还是非竞争性的)，不包括抗体在内的，为检测生物活性的量和/或具有生物活性物质的量和/或它的抑制剂和试剂盒的检测提供事实的基础。下面就本发明的应用方法，展示以下非局限的实施例和相应的附图。实施方式
一般方法：试验技术和一般操作技术请参阅斯泰兹等人(Stites etal.)著的《基础临床免疫学》，第8版，Appleton & Lange出版社出版，也可参阅凯米尼和查拉康比(Kemeny et Challacombe)著的《亲和素一生物素酶联合吸收法及其他固相免疫法的理论与实践》，Wiley and Sons出版社，纽约，1988年。实施例1亲和素-生物素酶联合吸收法(ELSA)检测β-葡聚糖和木聚糖的活性
材料以下材料从澳大利亚悉尼N.S.W.2102Megazyme Pty.Ltd.获得，地衣淀粉酶(内-1,3-1,4-β-葡聚糖-D-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.73)从bacillus subtilis(batch MLI82001)(细菌分类名)，外-1,3-β-葡聚糖酶(EC3.2 1.58)Trichoderma sp(EBG00703)，大麦β-葡聚糖(lotBBG30108)黑麦粉阿拉伯木聚糖(pentosan,batch MRP90801)，木聚糖酶(内-1,4-β-D木聚糖木聚糖水解酶，EC3.2.1.32)从Trichodermav/ride(batch MXY80202)和偶氮-大麦葡聚糖获得。纤维素酶(1,4-β-D-葡聚糖-D-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)从Aspergillus niger(2型)，支链淀粉酶(限制性葡聚糖酶，支链淀粉酶6-葡聚糖水解酶，EC3.2.141)从Enterobacter aerogenes,α-淀粉酶(1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶EC3.2.1.1)从豪猪胰脏(1-4A型)，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯-硬脂(BNHS),1,2-乙二二胺，对硝基苯磷酸，二乙醇胺和吐温-20(从希格玛化学试剂公司，圣路易斯，美国密苏里州)获得高碘酸钠和氢硼化物(从美国新泽西州Fairlawn的Fisher科学公司获得)，碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白(从美国加州旧金山市的Zymed实验室获得)；微量滴定板(Falcon3911,Microtest Ⅲ)(从美国加州Oxnard的Becton DickinsonLabware获得)，二甲基业砜(DMSO)(从新泽西州菲律斯堡市的J.T.BakerChemical Co.获得)，以及雀巢牌方便脱脂奶粉。RM-1是一种粗制的酶由Finnfeeds International Ltd制备的，还包括高β-葡聚糖酶，木聚糖酶和其它酶活性物质。所有的溶剂和试剂都是分析级的。制备生物素-葡聚糖偶联物这一技术的原理是基于高碘酸钠氧化多糖上的羟基产生活泼的醛基基团，反应中加入乙二胺分离出一个有氨基的多糖。希夫碱与硼氢化钠作用形成稳定结构(汪，1996)。用生物素-羟基琥珀酰亚胺酯-硬脂(BNHS)使生物素偶联到氨基基团上。简言之，1．75mg的β-葡聚糖溶于2ml蒸馏水中；2．加0.1ml,100mM的高碘酸钠，反应需避光，室温下混匀半小时；3．加1ml乙二胺处理反应混合物，混匀反应2小时；4．乙醇沉淀去掉未反应的试剂(95％的乙醇8ml加到3ml反应液中)混匀样品，0℃下离心，10000g 10分钟；5．沉淀用2ml蒸馏水溶解，制剂要清洗三遍，最后洗好的沉淀用2ml蒸馏水溶解；6．将5mg硼氢化钠加入反应液，4℃，保持4小时。清洗步骤如同上述，清洗三遍。用生物素-羟基琥珀酰亚胺酯-硬脂(BNHS,15mg或0.15mg)稀释到0.2ml二甲基亚砜(DMSO)中，可在室温反应3小时。然后如上所述，用乙醇沉淀三次。最终沉淀溶于3ml蒸馏水中，分成若干份，每一份生物素-羟基琥珀酰亚胺酯-硬脂-β-葡聚糖复合物(BNHS-β-glucan)放到聚丙烯管中，密封保存在0℃。复合物中BNHS与β-葡聚糖的比是0.2和0.002，也就是说，复合物的组份分别是15mg BNHS与75mg β-葡聚糖，0.15mg BNHS与75mg的β-葡聚糖。
缓冲液和包被孔板含有0.3％(W/V)脱脂乳的磷酸盐缓冲液[PBS,NaCl4.39,Na2HPO4,8.19NaH2PO42.45(g/l)；pH7.2]含有0.3％(W/V)脱脂乳的用于稀释碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合物。用于清洗滴定板的缓冲液是PBS(pH7.2)含有0.05％(V/V)吐温-20,(PBS-T)。磷酸钠缓冲液(20mM,pH6.5)用于稀释所有的酶制剂，除了木聚糖酶用25mM的乙酸盐缓冲液(pH4.7)稀释外。碱性磷酸酶底物溶液在1M的二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中含有1mg/ml对硝基苯甲酸。
用0.01M的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释生物素-葡聚糖复合物，用0.1ml/孔的量直接包被微量滴定板。然后，在室温下放1小时，再在4℃下过夜。通常，0.2生物素-葡聚糖复合物(BNHS-β-glucan)的储存液稀释50,000倍，而0.002稀释100倍。微量滴定板用PBS-T清洗3遍，去掉液体，放在密封器皿中，在0℃下可存放数月。
测试过程β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)用磷酸钠缓冲液(20mM,pH6.5)稀释到所需浓度。取100μl酶加到已被生物素-葡聚糖包被的滴定板孔中，将板封一个不易蒸发的盖，混匀，在适当的温度下(通常22-24℃)，温育一段时间(1-30分钟)，倾空板使停止反应，然后用pH7.2的PBS-T将孔清洗3遍。空白对照含有温育缓冲液，不含酶。碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白(100μg)已用pH7.2的PBS稀释1000倍，加到每一孔中，室温下温育30分钟。滴定板用pH7.2的PBS-T清洗6遍。在室温空气中，凉10到20分钟。然后把碱性磷酸酶底物溶液每个孔加100μl，室温下温育30分钟。或者直至每孔的光密度吸收值从1.5-2.0不再因酶产生而变化为止。用微量滴定板读出器，在450nm处读取数据(Bio-Rad Laboratories Ltd.,Mississauga,ON,Canada,Model450)。
其它操作流程制备阿拉伯木聚糖底物与β-葡聚糖一样，只是底物是阿拉伯木聚糖而不是β-葡聚糖。BNHS与阿拉伯木聚糖的比是0.2的底物储存液在包被滴定板之前稀释10,000倍。应用偶氮-大麦葡聚糖法检测β-葡聚糖酶是根据麦克科利尔和珊米尔(McCleary and Shameer,1987)的方法。用三种不同的酶浓度来研究试验的精确度，酶浓度分别是0.076、2.1和160mU/孔，每个浓度加100μl到孔里，其中含有已稀释50000倍的0.2生物素β-葡聚糖。混匀，22℃下，温育15分钟。其它操作流程上文已述。试验在同一个滴定板上重复8次，全部试验要重复6次。在研究β-葡聚糖对酶活性的影响，在磷酸钠缓冲液(20mM,pH6.5)中的β-葡聚糖浓度是(5.12mg/ml)，取出等体积0.2U/mL的β-葡聚糖酶与之混匀，在40℃，水解60分钟。将酶溶液进行沸水浴15分钟。对照样品包括β-葡聚糖，但未与酶进行温育反应，也就不用煮。每孔加50μl水解与未水解的的β-葡聚糖溶液，孔中已含有稀释了50000倍的0.2生物素-葡聚糖。溶液与50ul(0.5mU)的β-葡聚糖酶温育，在22℃下，保持15分钟，其他条件如上所述。结果与讨论
β-葡聚糖的水解图3显示用不同浓度的β-葡聚糖酶水解不同的生物素-葡聚糖，用碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合物检测未水解底物，获得的光密度值不同，吸收值提供了一个未水解的底物的量。被水解的底物的净含量可通过减去每个试验的无酶对照的吸收值来估算。标记葡聚糖，生物素/葡聚糖=0.2(w/w)，它比0.002比例的复合物吸收值变化大，得到一个较陡的标准曲线。在比较0.2和0.002生物素酰化产生的程度，表明底物稀释越高，灵敏度越高。这些结果说明，提高灵敏度和降低背景值，可通过提高底物的生物素/葡聚糖的比率，加大包被平板的底物溶液的稀释度。但这也是有限度的，底物过分的生物素酰化，有可能降低它与酶接触的能力。相似的，在本试验中，虽然加大底物的稀释度可提高灵敏度，但也相应的要增加颜色反应所需的时间。显然要找一个折衷的方法，就是适当的生物素与底物的结合水平、底物浓度以保证试验中灵敏度、背景值以及颜色反应所需时间都能满足要求。0.2生物素-葡聚糖底物稀释100,000能够在1到100mU/孔范围内检测β-葡聚糖的活性。这些数据表明检测方法能够检出很低的酶活性值。
当底物是生物素-阿拉伯木聚糖复合物，用β-葡聚糖酶和木聚糖酶与其温育，得一相似曲线，在这个试验中，当把β-葡聚糖酶加入温育混合物中，它没有任何活性(图4)。
不同酶浓度的时间-反应
在这个研究中，生物素-葡聚糖复合物用不同浓度的β-葡聚糖酶水解(从0.032到100mU/孔)反应时间从1到27分钟(图5)。在此试验和接下去的试验中，净吸收值由酶的活性而定。(OD0-OD1 450nm)。结果证实，浓度相对高的酶100mU/孔)其反应在1分钟之内完成，而浓度相对低的酶(0.032mU/孔)反应速度慢，一直持续超过27分钟。所得结果在图6显示，证明在较短时间内(1-3分钟)，酶反应速度随酶量的增加接近直线上升。但随着温育时间的延长，曲线就不在随浓度的增加而呈直线了。这些结果指出样品中β-葡聚糖酶的含量，如果选择适当的试验条件是可以估测出来的。试验的优点除了灵敏度高外是它的高效率，即一个人一天内可做200个这样的试验。它的缺点是，仅给出相对的酶活性单位，而不是精确值。此操作可在试验中加一个已知活性的酶进行校订，就象偶氮-大麦葡聚糖法(McCleany and Shameer,1987)相似的方法，以校订或标准曲线就可得到精确值。
外源β-葡聚糖对检测结果的影响已很清楚，β-葡聚糖酶和其它碳水化合物水解酶一样，与它们的底物键合(Headon,1993；Yu et al.,1995)当样品中外源底物浓度高时就会干扰试验。最近的研究证实，水解底物的存在并不影响结果，而是降低了酶的活性，从吸收值上就能看出。当板孔里的β-葡聚糖的量超过1μg/孔(图7)，相当于含有酶的抽提物中有10μg/mL的β-葡聚糖。大麦中含有高浓度的β-葡聚糖(5％)，如果抽提用最小量的缓冲液(假设1∶10w/v)，那么每毫升就有5μgβ-葡聚糖5μg/mL，在此条件下，抽提物中的β-葡聚糖对β-葡聚糖酶活性的影响相当小。即使外源β-葡聚糖对β-葡聚糖酶有抑制作用，它的影响可通过事先酶促水解而减轻。类似情况请看图7。下面讨论在β-葡聚糖酶检测中内源底物对检测结果的影响。如果在这些试验中，若稀释酶抽提物会产生较低检测值的可能性很大。因为它降低了灵敏度，近来的研究很少采用。
从此项研究的数据显示，对试验进行修订可用于对抽提物中β-葡聚糖酶的含量进行定量。在此条件下，竞争性的ELSA法适用于两种形式的底物：抽提物中的未知含量和参照量(生物素酰化的β-葡聚糖)与滴定板孔表面结合。这样的检测类似于ELISA广泛应用于检测分析低分子量的物质(Kemeny and Challacombe,1988)。
试验的精确度在ELSA检测中的平均值±SD是根据三个酶浓度(160、2.1和0.076mU/mL)的8个重复试验得出的分析结果。所得的吸收值分别是：0.33±0.016(CV=6.4％)和1.25±0.06(CV=4.9％)和1.92±+0.078(CV=4.0％)。当平均CV=12.9％时吸收值的变化比(平均CV=5.1％)时大很多。不同的温育和颜色反应时间或其它变化的条件导致两个变化的不同。可通过对照适当的参考曲线和更严格的反应条件来减轻它们的不同。
偶氮-大麦-葡聚糖法与ELSA法在检测β-葡聚糖酶活性时，二者之间的关系研究的目的是比较两个检测方法的灵敏度，展示本文的方法与另一个间接的而又十分流行的方法，即偶氮-大麦-葡聚糖法。(McCleary andShameer,1987)。在这个比较中，酶浓度采用对数标度作图，以此可在很大范围内对两个方法进行比较。据图8所示，当酶浓度相对高时，偶氮-染色过程得到一个陡直的曲线，而ELSA法得到一个平稳渐进的曲线。ELSA的检测范围从0.001到1mU/检测，而偶氮-大麦-葡聚糖法的检测范围从10到100mU/检测，灵敏度相差10至100,000倍。偶氮-蓝染色法被认为比其它标准更简便，但也有局限。它需要离心分离水解底物和未水解的底物进行沉淀，这些步骤在ELSA法的试验预备中是采用的。由于一些常数改变，如染色的多糖片段溶解性，沉淀剂的离子强度，沉淀和离心的温度等条件的变化，所以偶氮-染色法必需进行标准校定。这些数据说明，用ELSA法检测β-葡聚糖酶活性，做起来更简单比相应的偶氮-大麦-葡聚糖法更灵敏。
用其它酶水解生物素酰化-β-葡聚糖试验结果示于表1，对照不同酶制剂对生物素酰化-β-葡聚糖的水解程度。在这些检测中，根据酶的生产者提供的检测值，将酶活性稀释到一般状态。虽然对照结果只是近似而并不精确，但证实了那些酶可以水解β-葡聚糖，如地衣淀粉酶(做对照的酶)，纤维素酶(McClear and Glennie-Holmme,1985)也能够水解生物素酰化-β-葡聚糖。RM-1是一个未纯化的粗酶制剂具有较高的β-葡聚糖酶活性，亦能水解生物素酰化-β-葡聚糖。其它酶，如内-1,3-β-葡聚糖酶(Wood andBhat,1988)水解β-葡聚糖的活性较低或没有水解底物的能力，支链淀粉酶、β-木聚糖酶和α-淀粉酶虽没有水解底物的能力，但相对于地衣淀粉酶也产生了一个较低的值。影响α-淀粉酶活性的因素，可能与淀粉污染了β-葡聚糖制剂或在酶制剂中残存了β-葡聚糖酶活性等因素有关。纤维素酶水解底物的能力说明改变底物(用纤维素而不是β-葡聚糖)为检测提供基础。实施例2对酶及其抑制剂进行定量
此实施例提供了定量样品中的酶，同时也可对其抑制剂的浓度进行定量的方法。此试验推荐“生物素酰化的酶抑制吸收剂法”(BEISA)，它的原理是：生物素标记的酶能特异性的与之相对应的抑制剂结合。
方法：NHS-生物素溶液(200μl二甲基亚砜中加5.5mg NHS-生物素)和胰蛋白酶溶液(1000μlPBS加15mg)混合，室温反应3小时并轻柔的震荡。用minicon-15浓缩器(Amicon公司产品)，4℃条件下，去除未偶联的生物素。最终体积为1000μl。
所有化学试剂从希格玛化学试剂公司(密苏里州圣路易斯市)或Fisher科学公司(加拿大Winnipeg市)购得。胰蛋白酶(EC3.4.21.4)及其抑制剂、从蛋清中提取的卵类粘蛋白以及抑蛋白酶醛肽用作该试验证实BEISA的模型。
96孔微量滴定板(Falcon 3911)用胰蛋白酶抑制剂(卵类粘蛋白4μg/100μl/孔)包被，37℃条件下过夜。板用PBS-T{[PBS,NaCl9.00,Na2HPO4,1.15 NaH2PO4 0.23(g/l)；]加0.05％(V/V)吐温-20]}清洗一次。再在每个孔内加200μl5％的脱脂乳，接着37℃温育2小时。滴定板用PBST冲洗两次。除第一排孔内加100μl的PBS外，其余每孔加50μl。在第二排孔内加50μl浓度为400μg/ml的未标记的胰蛋白酶，其浓度依次稀释两倍连续往后加，直到第11排孔(包括第11)。除第一排孔外，其余各孔加50μl生物素酰化的胰蛋白酶，(用PBS稀释3000倍，接近2μg/100μl/孔)，然后37℃下温育1小时。最后每孔体积是100μl。空白对照的那排孔(第一排)中无胰蛋白酶，它作为阴性对照。而第12排孔虽然有生物素酰化的胰蛋白酶，但没有未标记的胰蛋白酶，它作为阳性对照。滴定板用PBST清洗3次。然后在每个板孔中加100μl链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(用50mM(pH9.5)的碳酸氢盐缓冲液稀释1000倍)，滴定板在室温温育30分钟。随后滴定板用PBST清洗5次。然后每孔加对硝基苯磷酸底物(100μl/孔)，[对硝基苯磷酸底物在10％的乙二醇胺缓冲液(pH9.8)中的浓度是1mg/ml]。之后滴定板在空气温度下，温育30分钟。最后滴定板在450nm下用微量滴定板读出器读取吸收值(加拿大Bio-Rad实验室，450型)。得到的是三次分析的平均值。阳性对照的吸收值±SD是1.9±0.02光密度(OD)单位。
胰蛋白酶可检测的浓度范围从0.1到1.0μg/ml示于图9，而抑制剂(卵类粘蛋白)可检测的浓度范围从1到10μg/ml示于图10-A，抑制剂(抑蛋白酶醛肽)可检测的浓度范围从0.03到1μg/ml示于图10-B。此试验可通过降低卵类粘蛋白包被到微量滴定板孔上的量来提高灵敏度。在此条件下需要较长时间的温育，以获得酶的颜色反应。使用亲和素偶联多个单位的碱性磷酸酶来修改颜色反应试验，可适当缩短颜色反应时间。
BEISA的特异性是，特殊的酶需要选择特异性的抑制剂来包被微量滴定板。在本试验中，胰蛋白酶抑制剂(卵类粘蛋白)没有和其它蛋白酶交叉反应(见图11)。这些结果显示BEISA可特异的检测并定量存在于其它蛋白酶内的胰蛋白酶。另外其它抑制剂如结合弹性蛋白酶的弹性蛋白酶抑制剂，不能干扰标记的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂的结合。其它蛋白象牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA),α-酪氨酸都不干扰检测。
BEISA是可用于定量胰蛋白酶及其抑制剂的新方法。本方法具有灵敏、特效、简便的优点，适合流水作业和自动化。样品的混合物不需清除，因为所有影响颜色反应的混合物都在清洗步骤中弃除了。此操作过程可用于任何有合适抑制剂的酶。已知有8000种抑制剂与2000种酶反应。(Zollner,1993)。
尽管本试验采取把抑制剂包被到微量滴定板的表面和标记偶联生物素的酶的操作过程，相反，也可采用将酶包被在滴定板表面，标记偶联生物素的抑制剂的方法。实施例3  相法用生物素酰化酪蛋白检测蛋白酶和蛋白酶抑制剂
材料α-酪蛋白，生物素酰胺己酰酸酯，(正)羟基琥珀酰亚胺酯，(NHS-生物素)，吐温-20，对硝基苯磷二钠(pNPP)，用于本试验的蛋白酶有：胰蛋白酶(EC3.4.21.4)、木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.3)、胶原酶(EC3.4.24.3)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)、组织蛋白酶D(EC3.4.23.5)、弹性酶(EC3.4.21.11)蛋白酶Ⅳ(Streptomyces caespitosus)蛋白酶ⅩⅩⅪ(Bacillus licheniformis)、蛋白酶ⅩⅢ(Aspergillus saitoi)(EC3.4.23.18)和卵类粘蛋白(Sigma化学试剂公司产品)，二甲基亚砜(DMSO)(J.T.Baker化学试剂公司产品)和微量滴定板(Falcon 3911)购自Beeton Dickion and CO.，柠檬酸(0.1M)-磷酸(0.2M)缓冲液(Stoll et al.,1990)用于木瓜蛋白酶(pH6.2)，蛋白酶ⅩⅢ(pH2.8)，织蛋白酶D(pH3.0)弹性酶(pH6.5)，磷酸(0.2M)缓冲液(Stoll et al.,1990)用于胰蛋白酶(pH7.5)，蛋白酶Ⅳ(pH7.5)，蛋白酶ⅩⅩⅪ(pH7.5)，嗜热菌蛋白酶(pH7.5)，胶原酶(pH7.1)，10mM盐酸用于胃蛋白酶(pH 2.0)。
制备生物素酰化酪蛋白12mg的α-酪蛋白溶丁1ml，(0.1M,pH7.2)的磷酸盐缓冲液中[PBS,NaCl 9.00；Na2HPO4；1.15 NaH2PO40.23(g/l)；]可以和3.6mg NHS-生物素(溶于150μlDMSO中)反应2小时，室温上轻柔摇振。
用生物素酰化酪蛋白检测蛋白酶活性的过程微量滴定板，除了第1排的8个，均用生物素酰化酪蛋白(在PBS里0.13μg/孔/100μl)包被，37℃下温育2小时。滴定板用0.1M的PBST[PBS加0.05％(V/V)吐温-20]清洗3次。不同浓度的酶溶液100μl(见图12-14)用适当的缓冲液稀释(见表2)把它们加到同一个板的3个孔里，在湿润的空气中，37℃下温育30分钟。滴定板用PBST清洗3次以结束反应。然后加链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶溶液(碳酸氢盐缓冲液pH9.5稀释1000倍)100μl/孔，除第1排8个孔不加外(空白对照)，其余都加。滴定板室温温育30分钟。空白对照只有PBS，不加酶，也未包被生物素酰化酪蛋白。倾空滴定板，用PBST清洗6次，以结束反应。加pNPP底物孔，[在10％的二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中pNPP的浓度是1mg/ml。然后室温温育20分钟，最后滴定板在450nm下用微量滴定板读出器(Bio-Rad实验室，450型，加拿大)读取吸收值。当最大吸收值在2.0光密度(OD)单位左右时，灵敏度最好。
用生物素酰化酪蛋白检测抑制剂的含量在本检测中除了每个孔的蛋白酶(胰蛋白酶)浓度一样(3.36μg/100μl/孔)外，其它步骤与蛋白酶活性检验的基本相似，而抑制剂(卵类粘蛋白)的浓度是变化的(见图15)。在所有过程中，滴定板要盖上以防止蒸发。结果
生物素酰化酪蛋白结合到微量滴定板表面，被不同浓度的胰蛋白酶(见图12)、木瓜蛋白酶(见图13)、蛋白酶Ⅳ(见图14)水解。不同酶浓度为：胰蛋白酶从10至106ng/100μl/样品；木瓜蛋白酶从0.5至4ng/100μl/样品；蛋白酶Ⅳ从1至1000ng/100μl/样品。检测的灵敏度由酶的含量决定，分别是：胰蛋白酶30ng/100μl、木瓜蛋白酶700ng/100μl、蛋白酶Ⅳ200ng/100μl最大吸收值的10％的量决定。如果把温育蛋白酶的时间采用24小时，而不是0.5小时的话，灵敏度可增加10倍。如果把结合到孔表面的标记的酪蛋白减少，也可大大改进灵敏度。不过这些条件的改变将使生物素-碱性磷酸酶复合物产生颜色反应的比率减低。
表2证实了生物素酰化酪蛋白可作为所有蛋白酶的底物。这些酶和包括有活性的丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸及金属离子在内，可归为4组(IUBMB,1992)，表1示出每个酶进行反应所需的最适pH值。
通过研究卵类粘蛋白-胰蛋白酶的抑制剂也证实可用生物素酰化酪蛋白法，定量样品中的胰蛋白酶抑制剂其抑制性曲线的斜度是陡直的(见图15)。
贯穿本专利申请，引用包括美国专利在内的各种出版物，在下文有全部引用资料的列表。在此特意披露这些参考过的出版物和专利，是此申请完整性不可分割的一部分，也是为了详细描述与本发明相关的技术背景。
本发明采用例证说明的描述方法，为了更易理解，描述中尽量采用通俗的文字来解释专业术语。
显然，本发明的许多修正与变化都是根据上述前人的经验。在所附的权利要求范围内进行实际应用本发明要比详细的说明更易理解。
表1不同酶之间的相对活性1
        酶           来源 比较与地衣淀粉酶的相对活性(平均值±SD,n=12)
纯酶：
地衣淀粉酶(内1,3-1,4葡聚糖酶    Magzyme Bacillussubtilis(E.C.3 2.1.73)            100±4
  内-β-木聚糖酶 Magzyme Trichodermaviride(E.C.3.2.1.32)           2.1±0.1
外-1,3-β-D葡聚糖酶 Magzyme Trichodermasp.(E.C.3.2.1.58)           6.2±0.3
部分纯化的酶：
纤维素酶(1,4,-β-D-糖原水解酶       (E.C.3.2.1.4)            101±7
支链淀粉酶(限制性葡聚糖酶      (E.C.3.2.1.41)           1.8±0.1
 α-淀粉酶      (E.C.3.2.1.1)           4.3±0.2
粗制酶：
RM-12       (Finnfeeds)            108±4
1、其检测过程描述见图3。所有酶的浓度根据生产者提供的活性值都稀释到5U酶活性/mL。所有酶根据图5以及材料和方法中的操作规程进行检测。所有滴定板孔中的底物是0.2生物素-葡聚糖(稀释50,000)倍。水解时间15分钟，显色反应时间30分钟，22℃，对每个酶进行检验。平均CV小于5％。
2、RM-1含有900U/g的β-葡聚糖酶(pH5.0)和其它酶的混合物。
表2不同种蛋白酶水解生物素酰化α-酪蛋白所得光谱
蛋白酶1 pH测定值-2 蛋白酶水解生物素酰化α-酪蛋白 灵敏度3(ng/100μl/样品)
丝氨酸蛋白酶：
胰蛋白酶(EC3.4.21.4) 7.5 是 30
弹性蛋白酶(EC3.4.21.11) 6.5 是 4.4
半胱氨酸蛋白酶
木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2) 6.2 是 700
天门冬氨酸蛋白酶：
蛋白酶ⅩⅢ(EC3.4.23.18  2.8 是 222
胃蛋白酶(EC3.4.23.1  2.0 是 641
     组织蛋白酶D(EC3.4.23.5) 3.0 是 160
甲硫氨酸蛋白酶：
嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27) 7.5 是？4 25
胶原酶(EC3.4.24.3) 7.1 -
不能鉴定的蛋白酶：
蛋白酶Ⅳ  7.5 是 200
蛋白酶ⅩⅩⅪ  7.5 是 5500
1．参阅(IUBMB,1992)有酶分类的进一步描述。
2．每一个蛋白酶的检测都是在最适pH(Sigma,1997)。
3．灵敏度由需要水解10％的生物素酰化α-酪蛋白所需酶的量决定。
4．只有当胶原酶超过50000ng/100μl/样品才能水解生物素酰化α-酪蛋白(在检测甲硫氨酸蛋白酶时，介质中不能有锌)。                               参考文献1-贝尔利、纳瓦来内，1981，应用改进溶解性纤维素酶的产量，诱导、
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代理人附注：为便于查阅文献，以下特附上外文的参考文献题录及出版物出处。
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Claims (55)

1．一种利用生物自身活性检测具有生物活性物质的生物活性量的固相检测法，包括以下步骤：
a．一组份1结合到表面，其中该组份1与一指示剂1偶联；
b．一样品中包含组份2，其生物活性未知，与已偶联的组份1接触，混合物反应条件是：保持组份1与组份2之间生物活性反应，使组份1解离；
c．在确定的反应时间后，去掉样品；以及
d．测定仍然旧结合的组份1的量，其中生物活性与残留的组份1的量之间是反比关系。
2．根据权利要求1所述的方法，其中该组份2是酶，该组份1是该酶的底物。
3．根据权利要求2所述的方法，其中该酶是一种能够降解底物的酶，该底物是选自由聚合物底物和非聚合物组成的类组。
4．根据权利要求3所述的方法，其中聚合物底物是选自由蛋白、多肽、碳水化合物、DNA、RNA组成的类组。
5．根据权利要求4所述的方法，其中蛋白是选自酪蛋白、白蛋白、胶原蛋白和明胶使之成为一种用于选出蛋白酶的底物。
6．根据权利要求2所述的方法，其中酶是β-葡聚糖酶，底物是葡聚糖。
7．根据权利要求2所述的方法，其中酶是蛋白酶，底物是酪蛋白。
8．根据权利要求2所述的方法，其中酶是木聚糖酶，底物是阿拉伯木聚糖酶。
9．根据权利要求2所述的方法，其中酶是纤维素酶，底物是纤维素。
10．根据权利要求1所述的方法，其中所述的测定步骤包括，加入一个与该指示剂1结合的有标记的指示剂2，测量结合上去的有标记的指示剂2的量。
11．根据权利要求10所述的方法，其中指示剂1是生物素。
12．根据权利要求11所述的方法，其中指示剂2是亲和素或链霉抗生物素蛋白。
13．根据权利要求10所述的方法，其中该标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘。
14．根据权利要求1所述的方法，其中该样品是一个抽提物。
15．根据权利要求1所述的方法，其中所述的测定步骤包括测量尚存留指示剂1的量的步骤。
16．根据权利要求15所述的方法，其中所述的指示剂1是选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘所组成的类组。
17．一种利用生物抑制活性通过固相检测法检测具有生物活性物质的生物活性抑制剂含量的方法，包括下列步骤：
a．一组份1结合到表面，其中该组份1与一指示剂1偶联；
b．一样品中含有已知含量的组份2，其生物活性也已知，样品中还有未知含量的组份3，它是组份2的抑制剂，该样品与组份1接触，此混合物是在这样条件下进行反应：该组份1和组份2之间的生物活性解离该组份1，同时，该组份3干扰该组份1和组份2之间的反应；
c．去除样品；以及
d．测定尚存留结合的组份1的量，其与样品中组份3的量是正比关系。
18．一种利用生物抑制活性通过固相检测法鉴定具有生物活性物质的方法，包括下列步骤：
a．一组份1结合到表面，其中该组份1与指示剂1偶联；
b．一样品中含有组份2，已知其具有一般生物活性但不知其特性，样品中还有已知含量的组份3，它可能是组份2的抑制剂，样品与组份1接触，此混合物是在这样条件下进行反应：该组份1和组份2之间的生物活性反应解离该组份1，同时该组份3干扰组份1和2之间的反应；
c．在预先确定时间后，去除样品；以及
d．测定尚存留结合的组份1的量，如果其量减少，则该组份3干扰了组份1和2之间的反应，从而鉴定出该组份2。
19．一种利用物质的生物活性通过固相竞争性试验检测生物活性物质定量的方法，包括下列步骤：
a．已定量的组份1结合着有生物活性的组份2，再结合到表面；
b．一样品含有两部分具有生物活性的组份2，一部分的量未知，另一部分与指示剂1偶联，其量已知，该样品与组份1接触，此混合物反应条件是，因为有生物活性，组份1与组份2结合；
c．去除样品；以及
d．测定偶联到指示剂1并结合到组份1上的组份2的量，这个量与样品中有生物活性的组份2的未知含量之间存在着反比关系。
20．根据权利要求19所述的方法，其中该组份2是酶，该组份1是该酶的抑制剂。
21．根据权利要求19所述的方法，其中组份2是凝集素，组份1是可结合到凝集素上。
22．根据权利要求19所述的方法，其中组份2是受体，组份1可与受体结合的物质。
23．根据权利要求20所述的方法，其中酶是胰蛋白酶，抑制剂是卵类粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。
24．根据权利要求19所述的方法，其中所述的测定步骤包括加入与指示剂结合的带有标记的指示剂2，并测量结合上去的带有标记指示剂2的量的步骤。
25．根据权利要求24所述的方法，其中指示剂1是生物素。
26．根据权利要求25所述的方法，其中指示剂2是亲和素或链霉抗生物素蛋白。
27．根据权利要求24所述的方法，其中该标记物是选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘组成的类组。
28．根据权利要求19所述的方法，其中测定步骤包括测量尚存留的指示剂1的量。
29．根据权利要求28所述的方法，其中所述指示剂1是选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘组成的类组。
30．根据权利要求19所述的方法，其中样品是一个加入已知含量且偶联到指示剂1上的组份2的抽提物。
31．一种利用物质的生物活性通过固相竞争性试验检测结合在生物活性物质的定量的方法，包括下列步骤：
a．已知量的组份1，它能和有生物活性的组份2结合，结合到表面；
b．样品中含有组份1，其量未知，还含有组份2，其量已知，且与指示剂1偶联，样品与有组份1接触，此组份2与组份1结合混合物反应条件：因有生物活性组份1与2结合；
c．去除样品，以及
d．测定与指示剂偶联且结合到组份1上去的组份2的量，此量与样品中组份1的未知量之间存在反比关系。
32．根据权利要求31所述的方法，其中组份2是酶，组份1是酶的抑制剂。
33．根据权利要求31所述的方法，其中组份2是凝集素，组份1是可与凝集素结合的物质。
34．根据权利要求31所述的方法，其中组份2是受体，组份1是可与受体结合的物质。
35．一种利用物质的生物活性通过固相竞争性试验检测生物活性的物质的定量的方法，包括下列步骤：
a．把有生物活性的组份2，其量已知，结合到表面；
b．样品中含有组份2，其量未知，还含有组份1，其量已知且与指示剂1偶联，与表面的组份2结合，混合物反应条件：因有生物活性，组份1与2结合；
c．去除样品；以及
d．测定与指示剂1偶联并与结合在表面的组份2结合的组份1的量，此量与样品中组份2的未知量呈反比关系。
36．根据权利要求35所述的方法，其中组份2是酶，组份1是酶的抑制剂。
37．根据权利要求35所述的方法，其中组份2是凝集素，组份1是可与凝集素结合的物质。
38．根据权利要求35所述的方法，其中组份2是受体，组份1是可与受体结合的物质。
39．根据权利要求36所述的方法，其中酶是胰蛋白酶，抑制剂卵类粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。
40．根据权利要求35所述的方法，其中测定步骤包括：加入带有标记的指示剂2与指示剂1结合，测量结合上去的带标记的指示剂2的量。
41．根据权利要求40所述的方法，其中指示剂1是生物素。
42．根据权利要求41所述的方法，其中指示剂2是亲和素或链霉抗生物素蛋白。
43．根据权利要求40所述的方法，其中标记物是选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘组成的类组。
44．根据权利要求35所述的方法，其中测定步骤包括尚存留的指示剂1的量。
45．根据权利要求44所述的方法，其中指示剂1是选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、颜色染料、荧光分子、发光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘组成的类组。
46．根据权利要求35所述的方法，其中样品是抽提物，加入有已知量且与指示剂1偶联的组份2。
47．一种利用物质的生物活性通过固相竞争性试验检测结合到有生物活性物质上的其它物质的定量的方法，包括下列步骤：
a．把已知量的有生物活性的组份2，与组份1结合，再将此混合物结合到表面；
b．样品含有两部分：组份1，与指示剂1偶联的那部分，其量已知；另一部分其量未知，样品接触表面，并与组份2结合，混合物反应条件：因为有生物活性，组份1与2结合；
c．去除样品；以及
d．测定结合到已结合的组份2的指示剂1相偶联的组份1的量，其中偶联到一指示剂的已结合组份1的量与样品中未知量的组份1呈反比关系。
48．根据权利要求47所述的方法，其中组份2是酶，组份1是酶的抑制剂。
49．根据权利要求47所述的方法，其中组份2是凝集素，组份1是可与凝集素结合的物质。
50．根据权利要求47所述的方法，其中组份2是受体，组份1是可与受体结合的物质。
51．一套用于实施权利要求1方法的试剂盒，它包括已偶联指示剂1的组份1，已知量的有生物活性的组份2，合适的缓冲液以及试剂，以组成反应混合物，在这样条件下使组份1与组份2之间的生物活性解离出组份1，反应容器事先以指示剂1标记的组份1包被，以及测定组份1的量所用的检测材料，而该组份1的量留存在反应容器中以指示剂1为标记。
52．一套用于实施权利要求17方法的试剂盒，它包括已偶联指示剂1的组份1，已知量的有生物活性的组份2，组份3是组份2的抑制剂用于对照，合适的缓冲液以及试剂，以组成反应混合物，在这样条件下使组份1与组份2之间的生物活性解离出组份1，反应容器事先以组份1包被的反应容器，该组份1标记有指示剂1，以及测定组份1的量所用的检测材料，而该组份1的量留存在反应容器中是以指示剂1为标记的。
53．一套用于实施权利要求18方法的试剂盒，它包括已偶联指示剂1的组份1，一组合适的抑制剂的组份3，合适的缓冲液以及试剂，以生成反应混合物，反应容器事先被指示剂1标记的组份1包被，以及测定组份1的量所用的检测材料，而该组份1的量留存在反应容器中是以指示剂1为标记的。
54．一套用于实施权利要求19或31方法的试剂盒，它包括组份1，已知量的与指示剂1偶联的组份2，合适的缓冲液以及试剂，以组成反应混合物，在这样条件下使组份1结合到有生物活性的组份2上不能被解离，反应容器事先以组份1包被，以及测定组份2的量所用的检测材料其留存在反应容器中是以指示剂1为标记的。
55．一套用于实施权利要求35或47方法的试剂盒，它包括已偶联指示剂1的组份1，已知量的组份2，合适的缓冲液以及试剂，以组成反应混合物，在这样条件下使组份1结合到有生物活性的组份2上不能被解离，反应容器事先以组份2包被，以及测定组份1的量所用的检测材料，而该组份1的量留存在反应容器中是以指示剂1为标记的。
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