CN104155442A - 增强的内毒素检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的改进方法和试剂盒。其中，检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的方法包括在导致样本中蛋白质降解的条件下使样本与活性酸性蛋白酶接触，进一步使样本与变形细胞溶解物接触，以及确定在变形细胞溶解物中是否发生了凝胶化反应；检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的试剂盒包含酸性蛋白酶。该试剂盒还包含一种或多种变形细胞溶解物和/或一种或多种脂多糖结合多肽。所述检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的改进方法和试剂盒增加了内毒素检测的精度。

Description

增强的内毒素检测
本申请是申请日为2009年8月11日，发明名称为“增强的内毒素检测”的中国专利申请号200980132249.5的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年8月18日提交的美国专利申请12/193,169号的优先权，该申请内容的全文以引用的方式并入本文。
背景技术
内毒素，也被称为脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，并且是在革兰氏阴性菌败血症期间发生的许多毒性效应(即便不是全部)的原因。LPS是由与被称为脂质A的保守的葡萄糖胺类磷脂共价结合的可变多糖结构域构成的糖脂的混合物。LPS直接刺激宿主单核细胞和巨噬细胞分泌许多种炎性细胞因子，这些炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子-I(TNF-I)、白介素-1(IL-1)和白介素-8(IL-8)。由宿主巨噬细胞过度释放的这些细胞因子促使在革兰氏阴性菌败血症发作之后出现器官衰竭和死亡。LPS表现的促炎生物活性通常存在于脂质A部分。
发明内容
本文提供检测样本中的革兰氏阴性菌或脂多糖的方法。例如，提供检测样本中的革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，该方法包括在非活性酸性蛋白酶存在下使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触，以及确定该一种或多种脂多糖结合多肽是否与样本结合。结合则表明样本中含有革兰氏阴性菌或脂多糖。本文还提供检测样本中的革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，该方法包括在导致样本中蛋白质降解的条件下使样本与活性酸性蛋白酶接触，在非活性酸性蛋白酶存在下使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触，以及确定该一种或多种脂多糖结合多肽是否与样本结合。
提供检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，该方法包括在导致样本中蛋白质降解的条件下使样本与活性酸性蛋白酶接触，进一步使样本与变形细胞溶解物接触，以及确定在变形细胞溶解物中是否发生了凝胶化反应。
提供用于检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的试剂盒。该试剂盒包含酸性蛋白酶。该试剂盒还包含一种或多种变形细胞溶解物和/或一种或多种脂多糖结合多肽。
下面的附图和说明书中阐明了一方面或多方面的细节。从说明书、附图和权利要求书中将显而易见其它特征、目的和优点。
附图说明
图1A-1D显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物(BioDtech,Inc.,Birmingham,AL)处理肽X。图1A是PPC抑制试验图，显示在内毒素检测中克服肽X的抑制作用所需的肽稀释程度。图1B显示在用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理前和处理后肽X样本中的1EU/ml PPC的回收。图1C显示肽X样本中的确定内毒素污染物的回收。图1D是PAGE凝胶图像，显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理的肽X降解。
图2A-2C显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理Sushi3肽。图2A是PPC抑制试验图，显示在内毒素检测中克服Sushi3肽的抑制作用所需的肽稀释程度。图2B显示Sushi3肽样本中的确定内毒素污染物的回收。图2C是PAGE凝胶图像，显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理的Sushi3肽降解。
图3A-3B显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理血红蛋白。图3A显示牛红细胞的血红蛋白样本中的内源性内毒素污染物的回收。图3B是PAGE凝胶图像，显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理的血红蛋白降解。凝胶在非还原条件下移动产生三个不同的血红蛋白群。标明了每个血红蛋白群和EndoPrepTM蛋白酶的位置。
图4A-4B显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理BSA。图4A是显示BSA样本中确定的内毒素污染物回收的图。图4B是PAGE凝胶图像，显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理的BSA降解。标明了BSA和EndoPrepTM蛋白酶的位置。
图5A-5B显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理IgG。图5A是来自血浆的兔IgG样本中确定的内毒素污染物回收的图。图5B是PAGE凝胶图像，显示用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理的IgG降解。凝胶在还原条件下移动导致轻链与重链的分离。消化导致重链分裂为大片段和小Fc片段。标明了重链和轻链、EndoPrepTM蛋白酶以及消化产物的位置。
图6显示胃蛋白酶对重组因子C(rFC)活性的影响。显示的数据来自60分钟的Lonza(Walkersville,MD)温育。数据点带闭合黑圆的黑色实线表示得自水中LPS的结果。数据点带空心圆的黑色实线表示得自含0.05％胃蛋白酶的水中LPS的结果。数据点带三角形的黑色虚线表示水的值。荧光的增强证明用胃蛋白酶处理提高了rFC酶的活性。
具体实施方式
由于内毒素含有负电荷、脂质和碳水化合物，因此已知许多蛋白质与内毒素结合并影响以试验正确检测内毒素的能力。具体来说，与内毒素结合的蛋白质在标准试验中可引起抑制或增强，导致假阳性和假阴性结果并影响精度。例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂(如大豆胰蛋白酶抑制剂、α2巨球蛋白、抑肽酶、抗纤溶酶、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶和水蛭素)妨碍内毒素的检测方法。如下面的例子所述，用酸性蛋白酶处理包括血清及血液样本在内的这种样本可降解样本中的蛋白质而不影响内毒素，因此可提高内毒素检测试验的精度。酸性蛋白酶可用于例如LAL、因子C和细胞因子ELISA试验。有许多试验方法可用于诊断革兰氏阴性菌感染。制药和医疗行业中目前采用的试验方法基于被称为鲎变形细胞溶解物(LAL)的物质。所述溶解物含在内毒素存在时发生反应的蛋白质。
因子C是丝氨酸蛋白酶酶原。它是由LPS激活以启动凝血级联反应的圆尾鲎变形细胞溶解物(C.rotundicauda amebocyte lysate，CAL)中的关键酶。因子C的活性是对用于药剂产品质量控制的内毒素进行毫微微克水平的灵敏试验的基础。因子C在内毒素检测中的重要性已导致将重组因子C(rFC)的表达作为用以减少内毒素检测灵敏度的批次变化和季节性变化的替代源。
诸如非活性胃蛋白酶和非活性HIV蛋白酶的非活性酸性蛋白酶通过充当分子伴侣并保持因子C的适当构象而增强因子C的活性。非活性蛋白酶和非活性HIV蛋白酶充当分子伴侣的能力已有描述(Hulko等人,Protein Science16:644-53(2007))。
本文提供检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的改进方法和试剂盒。例如，本文提供检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，该方法包括在非活性酸性蛋白酶存在下使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触，以及确定该一种或多种脂多糖结合多肽是否与样本结合。结合则表明样本中含有革兰氏阴性菌或脂多糖。任选地，该方法进一步包括在使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触之前使酸性蛋白酶失活。任选地，该方法进一步包括在使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触之前，在导致样本中蛋白质降解的条件下使样本与活性酸性蛋白酶接触。本文提供检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，该方法包括在导致样本中蛋白质降解的条件下使样本与活性酸性蛋白酶接触，在非活性酸性蛋白酶存在下使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触，以及确定该一种或多种脂多糖结合多肽是否与样本结合。结合则表明样本中含有革兰氏阴性菌或脂多糖。任选地，该方法进一步包括在样本与活性酸性蛋白酶接触之后使酸性蛋白酶失活。任选地，消化缓冲液包含活性酸性蛋白酶。任选地，约7.0的pH值使酸性蛋白酶失活。
本文还提供检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，该方法包括在导致样本中蛋白质降解的条件下使样本与活性酸性蛋白酶接触，进一步使样本与变形细胞溶解物接触，以及确定变形细胞溶解物中是否发生凝胶化反应。凝胶化反应表明样本含有革兰氏阴性菌或脂多糖。任选地，变形细胞溶解物选自美洲鲎(Limulus polyphemus)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)的溶解产物。
适合用于所提供的方法和试剂盒的脂多糖结合多肽包括变形细胞溶解物的脂多糖结合多肽。变形细胞溶解物任选地选自美洲鲎(Limulus polyphemus)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)的溶解产物。任选地，一种或多种脂多糖结合多肽是包含因子C蛋白质的脂多糖结合域的多肽。内毒素/因子C的脂质A-结合域位于被rFCES包围的蛋白质的氨基末端部分内(即，按在SEQ ID NO:8中编号的前350个氨基酸)。因子C蛋白质及其结构域(包括sushi结构域)描述在美国专利6,719,973中，该专利的内容全文以引用的方式并入本文。美国专利6,719,973还公开了因子C蛋白质的sushi肽以及制备和使用sushi肽的方法。因此，因子C蛋白质的脂多糖结合域任选地为sushi结构域或sushi肽。因子C蛋白质的脂多糖结合域例如为因子C蛋白质的氨基酸1-333(例如，SEQ ID NO:8的氨基酸1-333)、SEQ ID NO:8的氨基酸29-330、因子C蛋白质的sushi1结构域(例如，SEQ ID NO:8的氨基酸29-201)、因子C蛋白质的sushi2结构域(例如，SEQ ID NO:8的氨基酸195-260)、因子C蛋白质的sushi3结构域(例如，SEQ ID NO:8的氨基酸264-330)、sushi1肽(SEQ ID NO:1)、sushi2肽(SEQ ID NO:2)、sushi3肽(SEQ ID NO:3)、sushi1-肽(SEQ ID NO:4)、sushi3-肽(SEQ IDNO:5)、sushi4肽(SEQ ID NO:6)或sushi5肽(SEQ ID NO:7)。
任选地，使样本与一种或多种脂多糖结合多肽接触的步骤包括使样本与包含因子C蛋白质的脂多糖结合域的二聚体或四聚体接触。用在本文中的用语因子C二聚体指连接在一起的二个因子C蛋白质的分子或其部分。所提供的因子C二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽和第二多肽各包含因子C蛋白质的脂多糖结合域。任选地，第一多肽和第二多肽是相同的或不同的多肽。任选地，因子C蛋白质的脂多糖结合域是sushi1肽。sushi肽可以是sushi1肽(SEQ IDNO:1)、sushi2肽(SEQ ID NO:2)、sushi3肽(SEQ ID NO:3)、sushi1-肽(SEQ ID NO:4)、sushi3-肽(SEQ ID NO:5)、sushi4肽(SEQ ID NO:6)或sushi5肽(SEQ ID NO:7)。任选地，sushi肽是sushi3肽或sushi3-肽。任选地，因子C二聚体的多肽由二硫键连接。二硫键是半胱氨酸残基之间的键。任选地，包含因子C二聚体的第一多肽和第二多肽各由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7组成。
术语蛋白质、肽、多肽或肽部分广泛地用在本文中，表示由肽键连接的两个或更多个氨基酸。应当认为，术语肽和多肽在本文中不是用来表明组成分子的氨基酸的具体尺寸或数量，并且肽可以含有多达数个或更多的氨基酸残基。所提供的肽由多肽的蛋白水解反应产生，即，经由多肽中的肽键断裂产生肽。任选可利用化学合成法或重组DNA技术生成合成多肽来产生所提供的肽。例如，利用标准Fmoc保护基和假脯氨酸，在2-氯三苯甲基树脂上进行逐步固相肽合成，由此合成所提供的肽。作为另外的选择，通过使两种或更多种较小的化学合成肽结合来合成肽。
还公开了编码上述肽序列、其变体及片段的核酸。这些序列包括与特定的多肽序列相关的所有简并序列，即，具有对一种具体多肽序列进行编码的序列的所有核酸，以及编码所公开的多肽序列的变体及衍生物的所有核酸，包括简并核酸。因此，尽管在本文中可能没有写出每个具体的核酸序列，但应理解的是，每个序列实际上都是通过所公开的蛋白质序列而公开和描述在本文中的。多种表达系统用于产生因子C肽以及片段、亚型和变体。
本文所提供的核酸序列是核酸种类的例子而不是旨在限制。还提供了包含编码肽序列、其变体或片段的核酸的表达载体，其中核酸可控地连接于表达控制序列。还提供了包含表达载体的培养细胞。这种表达载体和培养细胞可用于制备所提供的肽。
分离的或纯化的表示的是基本上不含其它物质的组合物(例如，多肽或核酸)，所述的其它物质包括通常在性质上与该组合物相关的物质。
本发明的多肽或其片段的获得方式例如是，从自然来源物中提取，编码多肽的重组核酸的表达(例如在细胞中或在无细胞翻译系统中)，或化学合成多肽。
在所提供的方法及试剂盒中，脂多糖结合多肽任选用可检测部分进行标记，或者还包含报告蛋白或亲和标记物。脂多糖结合多肽被直接标记或间接标记(例如，通过用可检测部分标记的二级或三级抗体)。有许多标记可供使用，包括但不限于放射性同位素、荧光标记物和酶底物标记物。放射性同位素包括例如35S、14C、125I、3H和131I。荧光标记物包括例如稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺酰(dansyl)、丽丝胺(Lissamine)、藻红蛋白(phycoerythrin)和德克萨斯红(Texas Red)。采用例如CurrentProtocols in Immunology,Volumes1and2,Coligen et al.,Ed.,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.,(1991)中所公开的技术任选地使标记物与抗原结合配偶体共轭。
当使用酶底物标记物时，优选酶催化发色底物的化学变化，这种化学变化可采用各种技术测量。例如，酶催化底物的颜色变化，这种颜色变化可用分光光度法测量。作为另外的选择，酶改变底物的荧光性或化学发光性。化学发光底物通过化学反应被电子激发，然后发射可测的光(例如使用化学发光计)，或者向荧光受体提供能量。酶标记物的例子包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶，HRP)、碱性磷酸酶、J-半乳糖苷酶、葡萄糖化酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
共轭结合酶的技术描述于O'Sullivan et al.,Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay,in Methods in Enzym.(ed J.Langone&H.Van Vunakis),Academic press,New York,73:147-166(1981)。酶-底物结合的例子包括例如辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢酶结合、碱性磷酸酶(AP)与作为发光底物的磷酸对硝基苯酯结合以及J-D-半乳糖苷酶(J-D-Gal)与发色底物(例如，对硝基苯-J-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮-J-D-半乳糖苷酶结合。
任选进行试验，其中使脂多糖结合多肽附着于例如柱、薄片或板之类的固相支持体。固相支持体可以是可移动的固相支持体(例如，微球)。使来自受试者或对照的样本经过固相支持体(例如与固相支持体接触)。然后将标记的脂多糖结合多肽加到固相支持体上。附着于靶物质上的检测标记物量与样本中的靶物质量相关。例如，把脂多糖结合多肽固定在微量滴定板的底部。然后在允许脂多糖结合多肽与革兰氏阴性菌、内毒素或脂多糖(如果样本中有的话)结合的条件下把待测样本加到微量滴定板上。把用例如生物素标记的第二脂多糖结合多肽加到微量滴定板上。用与碱性磷酸酶连接的抗生物素蛋白检测标记的多肽。与碱性磷酸酶连接的抗生物素蛋白通过从磷酸对硝基苯酯(pNA)底物中释放对硝基苯酚而产生可在405nm测定的黄光来检测结合并标记的多肽。
采用FACS分选对例如荧光标记的微球进行检测和定量。例如，使脂多糖结合多肽连接于微球。然后使微球与待测样本接触。把用例如荧光标记物标记的第二脂多糖结合多肽加到已经与测试样本接触的微球上。然后根据一种或多种荧光标记物，使用FACS分选仪对结合、标记的微球进行检测和定量。任选地，微球可以是磁性微球或荧光微球。例如，使脂多糖结合多肽连接于诸如微球的可移动的固相支持体，其可被加到诸如全血或血液制剂(如血清)的生物样本中，并通过离心除去。任选地，使脂多糖结合多肽连接于诸如铁微球的磁性微球，并通过磁场除去。
作为另一例子，使脂多糖结合多肽固定在固定的固相支持体(例如柱、滤纸或膜)上。如此，把脂多糖结合多肽固定在例如血液透析膜或过滤系统上，用以从全血或血液制剂中除去细菌和/或内毒素。因此，用在本文中的支持体是指任何支持基质，如本领域中已知用来固定脂多糖结合多肽的固相支持体。合适的支持体包括但不限于包含或涂有纤维素、丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、多羟基甲基丙烯酸酯(polyhydroxymethacrylates)、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、多糖、亲水乙烯基聚合物、聚合衍生物的玻璃、琼脂糖、塑料、二氧化硅、聚丙烯酰胺、水凝胶、凝胶体、膜、滤纸、网、微球或颗粒，以及任何多孔或无孔基质。
任选地，脂多糖结合多肽还包含报告蛋白和亲和标记物。合适的报告蛋白包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶。亲和标记物包括但不限于多组氨酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素。
样本任选为生物样本。用在本文中的测试生物样本是来自诸如哺乳动物或人的受试者的样本，包括但不限于包括体液在内的任何生物流体。体液的例子包括但不限于全血、血清、尿液、唾液、组织渗透物、胸腔积液、肺灌洗液等。生物流体包括细胞培养基或培养细胞的上清液。例如，样本可以是血液样本或血清样本。任选地，样本是液体样本，如在研究或临床实验室或医院中使用的水或其它药剂。任选地，样本是环境样本，包括但不限于流体、废弃物、水或雨样。任选地，环境样本得自于例如医院中用于所提供方法的分析中的表面。例如，样本可得自在医院、诊所或实验室设备中用来分析革兰氏阴性菌存在的装置。任选地，分析前在溶液中稀释样本。任选地，待测样本包含需要降解的多肽。因此，举例来说，样本包含抑制标准内毒素分析的多肽，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂。
用在本文的酸、酸性的、天冬氨酸的或天冬氨酸蛋白酶是指在低pH值下具有活性的蛋白酶。例如，蛋白酶在约0.0至约6.0的pH值下具有活性，或者在0.0-6.0(含)之间的任何pH值下具有活性。这种蛋白酶在约6.0至约14.0的pH值下不具活性。用在本文中的非活性酸性蛋白酶指不具有蛋白水解活性的蛋白酶(即，不能分裂诸如多肽或蛋白质的氨基酸序列的蛋白酶)。用在本文中的活性酸性蛋白酶指具有蛋白水解活性的蛋白酶(即，能够分裂氨基酸序列的蛋白酶)。作为例子，6.5或更高的pH值可以使活性酸性蛋白酶失活(即，蛋白酶存在于pH值为6.5或更高的溶液中)。可通过向溶液中添加化学物质来改变溶液的pH值。例如，可使用盐酸降低pH值，使用氢氧化钠升高pH值。可使用磷酸使pH值保持在约6.5。任选地，使用胃蛋白酶抑制剂使胃蛋白酶失活。胃蛋白酶抑制剂包括但不限于乙脒、N-乙酰基-D-苯丙氨酰基-L-双碘酪氨酸、N-乙酰基-L-苯丙氨酰基-D-苯丙氨酸、对氨基苯甲脒、苯甲脒、丁胺(butyamine)、重氮甲酮、乙胺、胃酶抑素和苯乙脒(phenylactamidine)。
酸或酸性蛋白酶(如肽链内切酶)是已知的，它们分为三大类，即胃蛋白酶(A1)、反录胃蛋白酶(retropepsin，A2)和来自拟反录病毒(pararetroviruses)的酶(A3)。已知A1和A2类成员彼此相关，而A3类成员显示出与A1和A2有一些关联性。微生物酸蛋白酶对肽键两侧的芳族或大的氨基酸残基表现出特异性，这与胃蛋白酶相似，但是它们的作用没有胃蛋白酶那样精确。酸蛋白酶包括微生物、真菌、病毒、动物和植物酸性蛋白酶。微生物天冬氨酸蛋白酶大致可分为两组，(i)由曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)、根霉(Rhizopus)和脉孢菌(Neurospora)产生的类似胃蛋白酶的酶，和(ii)由内座壳属(Endothia)和毛霉属(Mucor spp)产生的类似肾素的酶(Rao等，Microbiology andMolecular Biology62(3):597-635(1998)；Richter等，Biochem J.335:481-90(1998))。酸性蛋白酶的例子包括但不限于胃蛋白酶(包括胃蛋白酶A、B和C)；肾素；凝乳酶；半胱氨酸蛋白酶；组织蛋白酶，如组织蛋白酶D和组织蛋白酶E；人尿酸蛋白酶；和类似HIV蛋白酶的病毒蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于源自脉孢菌属(Neurosporaoryzae)、微小毛霉(Mucor pusillus)、毛霉属(Mucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、华根霉(Rhizopus chinensis)或内座壳属(Endothiaparasitica)的真菌蛋白酶。微生物蛋白酶包括但不限于酵母蛋白酶A、曲菌胃蛋白酶原(aspergillopepsinogen)、根霉胃蛋白酶(rhizopuspepsin)、青霉胃蛋白酶(penicillopepsin)和内座壳属胃蛋白酶(endothiapepsin)。
实施例1-6表明酸性蛋白酶可用于增强含有通常妨碍内毒素检测的分子的样本中的内毒素检测。通常妨碍内毒素检测的分子包括多种不同类型的肽，如短的阳离子肽(即肽X)、酶(即sushi3肽)、金属蛋白(即血红蛋白)、循环蛋白(即白蛋白)和免疫球蛋白(即IgG)。实施例包括全部蛋白质和小肽。另外也对内源性和外源性内毒素的检测进行了说明。在所有给出的实施例中，用EndoPrepTM蛋白酶组合物的处理提高了内毒素检测的精度。
提供了用于检测革兰氏阴性菌或脂多糖的试剂盒。该试剂盒包含酸性蛋白酶。该试剂盒还包含一种或多种变形细胞溶解物和/或一种或多种脂多糖结合多肽。任选地，脂多糖结合多肽是变形细胞溶解物的脂多糖结合多肽。任选地，变形细胞溶解物选自美洲鲎(Limuluspolyphemus)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)的溶解产物。如上所述，酸性蛋白酶可以是任何酸性蛋白酶。例如，酸性蛋白酶选自胃蛋白酶、肾素、凝乳酶、半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、脉孢菌属(Neurospora oryzae)蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉属(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲酶(Aspergillus niger)蛋白酶、华根霉(Rhizopus chinensis)蛋白酶、栗疫菌(Endothia parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶A、曲菌胃蛋白酶原(aspergillopepsinogen)、根霉胃蛋白酶(rhizopuspepsin)、青霉胃蛋白酶(penicillopepsin)和内座壳属胃蛋白酶(endothiapepsin)。同样如上所述，一种或多种脂多糖结合多肽例如是包含因子C蛋白质的脂多糖结合域的多肽。试剂盒任选地包含固相支持体，如柱、板、薄片或可移动的固相支持体。可移动的固相支持体例如是磁性或荧光微球。任选地，试剂盒还包含一种或多种缓冲液，如消化缓冲液。任选地，一种或多种变形细胞溶解物和酸性蛋白酶在相同或分开的容器中。任选地，一种或多种脂多糖结合多肽和酸性蛋白酶在相同或分开的容器中。任选地，酸性蛋白酶是非活性的。任选地，试剂盒包含活性酸性蛋白酶和非活性酸性蛋白酶，其中活性酸性蛋白酶与非活性酸性蛋白酶相同或不同。因此，举例来说，如果蛋白酶是不同的，则活性蛋白酶是胃蛋白酶，非活性蛋白酶是凝乳酶。
公开了材料、组合物和组分，所述材料、组合物和组分可用于所公开的方法及组合物，可与所公开的方法及组合物联用，可用于所公开的方法及组合物中的制备，或者是所公开的方法及组合物的产物。本文中公开了这些及其它材料，应该理解的是，这些材料的组合、子集、相互作用物、群组等也是公开的，虽然可能并没有明确地具体公开提到这些化合物的每个不同的个体和集体组合及置换，但本文中具体地设想和描述了每一种。例如，如果公开并讨论了一种方法，并可以对在该方法或该方法的步骤中所使用的材料进行若干变动，则可具体地设想该方法及可能的变动的每种组合及置换，除特明确指出相反的情况以外。同样设想并公开了上述的任何子集或组合。因此，如果在方法中有许多可以实施的附加步骤，应该理解的是，这些附加步骤的每一步都可以与所公开方法的任何具体的方法步骤或方法步骤的组合一同实施，并且可具体地设想每一这种组合或组合的子集，并且应该认为这都是公开的。因此已经描述了许多方面。然而应该理解的是，可以做出各种修改。此外，当描述一种特征或一个步骤时，该特征或步骤可以与本文中的任何其它特征或步骤组合，尽管没有明确指出这种组合。因此，即使本文中没有明确公开，但也提供了所公开的试剂、步骤和特征的所有组合。
本文中的范围可以表示为从大约一个具体值和/或到大约另一个具体值。当表示为这样的范围时，其包括从一个具体值和/或到另一个具体值。同样，当使用先行词约将数值表示为近似值时，应理解为公开了具体的值。
整个本申请中引用了许多出版物。在此将这些出版物的公开内容全文以引用的方式并入本申请。
给出以下实施例对本领域技术人员提供有关实施和评价本文权利要求的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，这些纯粹是示例性的，不旨在限制本文所提供的方法和材料的范围。
实施例
一般方法
材料
根据制造商的说明，利用Lonza(Walkersville,MD)的试验进行内毒素检测和定量，使用或不使用1EU/ml阳性对照产物(PPC)验证试验的可靠性。试验的检测范围是0.001至10EU/ml。血红蛋白(牛红细胞)购自Calbiochem(La Jolla,CA)，，其含有的内源性内毒素的水平为300EU/mg。兔IgG(血浆的)也来自Calbiochem，含大约2EU/mg。牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma(St.Louis,MO)，含<1EU/mg。Sushi3肽由American Peptide(Sunnyvale,CA)化学合成，不含可测的内毒素。由专利来源提供肽X，含<1EU/mg。无内毒素的水得自BioDtech,Inc.(Birmingham,AL)。当样本内毒素含量低时，添加内源性内毒素到所指的水平。内毒素以大肠杆菌O55:B5脂多糖的形式购自List Biological Laboratories,Inc.(Campbell,CA)。
EndoPrepTM方案
EndoPrepTM试剂盒由BDTITM消化缓冲液(20mM醋酸钠，pH值4.5)(BioDtech,Inc.,Birmingham,AL)和EndoPrepTM蛋白酶组合物(BDTITM消化缓冲液中的5％胃蛋白酶原液)构成。按以下方案进行所有实验。用BDTITM消化缓冲液把蛋白质样本稀释到合适的工作水平。将此溶液270μl等份试样与30μL的BDTITM蛋白酶溶液混合并涡旋10秒。每组实验中包括含30μL的BDTITM消化缓冲液而不是BDTITM蛋白酶溶液的样本，用以确定没有消化的基准内毒素。混合后用石蜡膜盖住管，在37℃水浴中温育指定的时间。处理后在无内毒素的水中以1:100稀释样本，然后进行测试。考虑源于添加BDTITM蛋白酶溶液的10％样本稀释，并计算到给出的结果中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
用每个样本处理进行PAGE分析以监测内毒素检测与蛋白质降解的相关性。对于PAGE分析，把20μL未稀释的消化样本添加至含45μL无内毒素的水、10μL5mM DTT和25μLCBS ScientificClearPAGETM(Del Mar,CA)4x样本缓冲液(对于非还原性电泳，以另外的水取代DTT)的混合物中。该样本在70℃水浴中加热10分钟，将17μL样本载入浸在CBS Scientific ClearPAGE1x Tris-Tricine-SDS电泳缓冲液(还原或非还原)的CBS Scientific ClearPAGE10-20％TEO-CI SDS凝胶中，在200伏特下电泳45分钟，电流梯度为从60mA至30mA。按制造商的说明书，所有的凝胶均用Sigma ProteoSilverTM(St.Louis,MO)银染试剂盒染银。
PPC抑制试验
用阳离子肽进行PCC抑制试验以确定对PPC回收的抑制程度。在无内毒素水中配制系列的肽10倍稀释液。把270μL每种稀释液的等份试样加入含有30μL10EU/ml LPS的无内毒素玻璃管中至最终的内毒素浓度为1EU/ml。在Lonza(Walkersville,MD)试验中对每个样本50μL进行测试。没有肽的样本作为对照和参考。
凝胶凝结试验
为验证EndoPrepTM蛋白酶组合物对凝胶凝结试验的适用性，用Lonza系统(Walkersville,MD)测试消化的样本。对于试验，在无内毒素的玻璃小瓶中混合100μL样本与100μL试验溶解产物并涡旋10秒。然后样本在37℃水浴中无搅拌温育60分钟。温育后，目视检查样本的凝块形成。连同样本一起对一系列0.03至0.12EU/ml的标准物和空白进行三重测试，用以验证试验的可靠性。
实施例1：肽X
肽X(专利的)是显示在治疗装置中极其有效的短阳离子肽混合物。这种产品的分子量为2.0至6.5kDa，平均大小为3.5kDa。在LAL和rFC试验中，肽X完全抑制内毒素检测，甚至阻止确定的内毒素加样的回收。初步实验确定抑制作用是由肽与内毒素的紧密结合造成的。这种结合不能被盐、洗涤剂、超滤或加热取代。这种抑制机理也造成大量的稀释变得不充分。为了显示肽X的内毒素抑制程度，把1EU/ml内毒素搀入肽在水中的稀释液，并用试验测试加样回收率(图1A)。以浓度0.1mg/ml开始，前几个10倍稀释液仍显示出100％或接近100％的抑制。检测到超过50％的内毒素需要稀释到0.1μg/ml。要实现完全的内毒素回收，必须将肽稀释到浓度为10ng/ml，这代表对治疗剂量的2,000,000倍稀释。这种类型的稀释阻止内源性内毒素的检测。
用EndoPrepTM样本制备试剂盒处理肽X以消除这种抑制活性。在BDTITM消化缓冲液中配制0.1mg/ml肽X样本，并在用或不用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理的情况下测试PPC回收率。与上述结果一致，未处理样本的PPC被100％抑制(图1B)。用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理且不进行37℃水浴中的温育将PPC回收率提高到超过63％。适当的温育进一步将回收率提高到超过75％。这种PPC回收水平超过了FDA所要求的50％的水平，后者被认为是可接受的试验报告。为进一步对此进行测试，测定EndoPrepTM蛋白酶组合物允许检测污染内毒素的能力。在含大约250EU/mg内毒素的BDTITM消化缓冲液中配制新的0.1mg/ml肽X样本。与PPC结果相似，用EndoPrepTM蛋白酶组合物进行处理，在处理过程中，检测量从0EU/ml提高到多于150EU/ml(图1C和表1)。这表示检测到起始加入内毒素的计算值的60％以上。PAGE分析显示内毒素检测量的增加与肽X的降解相对应(图1D)。添加EndoPrepTM蛋白酶组合物而不进行温育将肽的量减少大约25-30％。适当的温育进一步减少原生肽的量，30分钟处理后减少到低于10％，120分钟处理后减少到几乎可以忽略的量。
表1.60分钟(Lonza；Walkersville,MD)温育的荧光数据。
除了用试验测试肽X消化外，也用Lonza(Walkersville,MD)的凝胶凝结试验进行测试，用以说明EndoPrepTM蛋白酶组合物适用于不止一种类型的内毒素检测系统。试验的灵敏度为0.06EU/ml，对未处理和经处理的0.1mg/ml肽样本进行试验，该未处理和经处理的肽样本分别含有和不含0.1EU/ml PPC加样。所有的对照反应按照预期进行测定。使用或不使用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理，0.1mg/ml的肽样本均不引起凝块形成，这表明内源性内毒素的水平低(表2)。当未处理的肽样本含0.1EU/ml PPC加样(这超过了试验的灵敏度水平)时，没有凝块形成，说明内毒素被肽所掩蔽。当在经处理的肽样本中搀入0.1EU/ml PPC时，有凝块形成，说明消化消除了抑制因素，并且试验检测到内毒素水平超过0.06 EU/ml。
表2：凝胶凝结试验中的EndoPrepTM处理样本
实施例2：Sushi3肽
因子C是在LAL和rFC试验中启动酶级联反应的酶。因子C的内毒素结合位点已被分离为34个氨基酸的肽，称为Sushi3(S3)。已知S3通过静电和疏水性相互作用(Li等，Biochemistry45:10554-62(2006)；Li等，Biochem.Soc.Trans.34:270-2(2006))与内毒素紧密结合(Tan等，FASEB J.14:1801-13(2000))。这种结合很强，已用于内毒素移除介质的研发，并可以购得这种内毒素移除介质(Ding等，B.Biomed.Sci.Appl.759:237-46(2001))。与肽X很相似，S3与内毒素的紧密相互作用掩蔽了常见试验可检测的活性。PPC抑制测试的结果(图2A)表明需要肽的大量稀释以防止1EU/ml的掩蔽。为了实现完全的PPC回收，必须把肽稀释到浓度为0.1μg/ml。对于肽X，这种程度的稀释阻止了精确的内毒素检测或定量。
为测试EndoPrepTM蛋白酶组合物减轻S3的抑制作用的能力，在BDTITM消化缓冲液中由1mg/ml原液配制0.1mg/ml样本。之前的实验显示该肽不含可检测的内毒素，所以向样本中加入外源性内毒素到最终浓度为70EU/mg。没加EndoPrepTM蛋白酶组合物的对照样本测试到17EU/ml，表明抑制超过75％(图2B)。用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理，短暂温育后回收29EU/ml的内毒素活度，120分钟的温育后回收51EU/ml的内毒素活度。此最终样本在检测精度上增加了300％。PAGE分析对应于内毒素回收(图2C)。15-30分钟温育后有显著降解，60分钟的样本有进一步降解。120分钟处理后几乎检测不到肽。
实施例3：血红蛋白
之前的实施例涉及导致完全或接近完全的内毒素掩蔽的阳离子肽。然而，EndoPrepTM蛋白酶组合物也可用于提高并不表现出这种显著效应的蛋白质样本中的内毒素检测精度，
血红蛋白是红细胞中的金属蛋白，负责在全身中运送氧。如超滤、密度离心、乙醇沉淀和非变性PAGE所示，它对内毒素有适度的(kD3.1x10-8)亲和力(Roth和Kaca,Artif.Cells Blood Substit.Immobil.Biotechnol.22:387-98(1994)；Kaca等,J.Biol.Chem.269:25078-84(1994))。考虑到它在生物学上的重要性及其在人造血研发方面的潜在作用，精确检测血红蛋白中的内毒素有着重要的意义。
为了测试EndoPrepTM蛋白酶组合物处理对血红蛋白(牛红细胞)的影响，在BDTITM消化缓冲液中由50mg/ml原液配制1mg/ml的样本，并用前面所述的方式处理。未经处理的不含EndoPrepTM蛋白酶组合物的样本给出的值为330EU/mg(图3A)。用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理30分钟之后，所测得的内毒素值增加近70％，达560EU/mg。在120分钟的时间进程中这种活性的增加持续不断，在60分钟时的结果是650EU/mg，120分钟后结果是850EU/mg。这个最终的数据点表示所测得的内毒素的增加超过了150％。图中附有样本的PAGE结果，表明血红蛋白随时间进程的消化程度(图3B)。除16kDa单体外，血红蛋白还形成在还原条件下可见的32kDa二聚体和64kDa四聚体。通过比较第一泳道中未经处理的样本与第二泳道中含血红蛋白和EndoPrepTM蛋白酶组合物但没有水浴温育的样本可以看出蛋白质消化的程度。这里，这三个血红蛋白群都已经有显著的减少。37℃下温育30分钟后，二聚体和四聚体群都被完全消化。此外，单体群的减少超过75％。处理120分钟后，单体群进一步减少到不到起始材料的10％。
这些结果表明随着血红蛋白的消化伴随有内毒素活性的增加。这种模式表明血红蛋白抑制内毒素的检测。这与文献中一些声称由血红蛋白增强效果的报道(Roth和Kaca,Artif.Cells Blood Substit.Immobil.Biotechnol.22:387-98(1994)；Kaca等,J.Biol.Chem.269:25078-84(1994)；Roth,Blood83:2860-5(1994)；Roth人,Transfusion33:919-24(1993))相反。对于增强效果给出的一种解释是血红蛋白有类似洗涤剂的活性，可减小LPS聚集体的尺寸并使LPS单体更具有生物学可得性。然而，大多数内毒素解聚分子(包括蜂毒肽、溶菌酶、补体蛋白、BPI和多粘菌素B)导致活性降低。也有提出增强的原因可能是由于磷脂过氧化，这仅在某些试验标准下才有可能。这种类型的修饰用试验是不可行的，这可解释一些报道中给出抑制而另一些出版物中报告增强的原因。另外也已表明，蛋白质浓度和试验方法也是促成涉及蛋白质对内毒素的作用结果不一致的因素(Kaca等，J.Biol.Chem.269:25078-84(1994))。不管作用的方向如何，上述方案均从样本中除去血红蛋白并使内毒素含量的测定更精确。
实施例4：牛血清白蛋白
白蛋白是最丰富的循环蛋白，浓度大约是50mg/ml(0.75mM)。它参与全身的脂肪酸、激素、胆红素、胆汁盐和药物的递送。它由三个同源结构域构成，其中两个具有被认为结合内毒素分子的脂质A部分的暴露疏水袋(David,Endotoxin in Health and Disease(ed.Brade,H.).New York:Marcel-Dekker,Inc.,413-22(1999))。这与提出人血清白蛋白通过非静电相互作用结合脂质A的其它报道(Jurgens等,J.Endotoxin.Res.8:115-26(2002))一致。
为测试白蛋白对内毒素检测的影响，在无内毒素水中配制100mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)的原液。在BDTITM消化缓冲液中由此原液配制1mg/ml的样本。之前的实验确定BSA原液的内毒素污染物水平非常低(约0.05EU/mg)，所以加入外源性内毒素到最终浓度为100EU/mg。试验前使此样本在室温下静置30分钟，以便使内容物之间建立起可能的相互作用。不含EndoPrepTM蛋白酶组合物的未处理样本给出的值是58EU/ml(图4A)，比计算的加入量少40％以上。用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理15分钟以后，所测得的内毒素值增加到67EU/ml。在这个同样的时间点，PAGE数据显示了大量的BSA消化(图4B)。延长消化时间将可检测的内毒素水平提高到77EU/ml。这表明与未处理的样本相比，回收了近80％的已知污染内毒素，精度提高了30％以上。
文献中没有关于白蛋白对内毒素检测的影响的共识。已有研究表明白蛋白有助于内毒素的脂质A部分的溶解性，从而增加LAL试验中的发热性和凝胶化(Rietschel等,Infect.Immun.8:173-7(1973))。对重组人血清白蛋白(rHSA)的研究显示，蛋白质引起胶束形成的变化，从通常具有中度毒性的立方体形式到非层状结构。然而，这种胶束结构的变化引起细胞因子诱导方面的最小变化。此外，用rHSA测试已显示出在LAL凝固试验中的复杂变化，没有任何可辨别的图案(Jurgens等，J.Endotoxin.Res.8:115-26(2002))。纯化HSA的类似报道已显示了发色LAL测试的增强活性，但在凝胶化LAL试验中没有影响(Kaca等,J.Biol.Chem.269:25078-84(1994))。通过比色分析或动态浊度LAL试验或兔热源测试确定，其它组没有发现HSA对内毒素活性的影响(Asakawa等,Yakugaku.Zasshi.114:888-93(1994))。目前的测试表明，BSA对内毒素检测有轻微的抑制作用。不管怎样，对血红蛋白来说，这些测试显示出蛋白质的完全降解和检测精度的提高，对试验系统没有负面影响。
实施例5：IgG
IgG是最丰富的免疫球蛋白，占全部血清抗体的约75％。它是由两条重链(每条约50kDa)和两条轻链(每条约23kDa)组成的四聚体分子。每条重链通过二硫键与轻链连接。同样，重链以二硫键连接在一起使分子呈“Y”结构。抗体疗法的数量在近十年来显著增加，并在进行的预批准临床研究中占400以上(Dubel,Appl.Microbiol.Biotechnol.74:723-9(2007))。适应症包括关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、移植技术、牛皮癣、自身免疫、RSV、多发性硬化症和哮喘。这是除了癌症疗法之外的领域中具有对白血病、间皮瘤、淋巴瘤及结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、子宫癌和胰腺癌有潜力的抗体候选物(Dubel,Appl.Microbiol.Biotechnol.74:723-9(2007)；Creput等,Curr.Opin.Mol.Ther.9:153-9(2007)；Rasmussen等,Biotechnol.Lett.29:845-52(2007)；Nayeem and Khan,Curr.Protein Pept.Sci.7:165-70(2006))。这种疗法增加的一个原因是重组抗体的出现。虽然这是有前途的技术，但它要求对内毒素去除和检测有更高的侧重性和灵敏度。
文献包括许多报道表明IgG结合并中和内毒素。在IgG存在的情况下，响应内毒素的TNF表达减少，大鼠死亡率相应降低(Yentis等,Cytokine6:247-54(1994)；Xuan等,Chemotherapy47:194-202(2001))。在依赖剂量的方法中(如当进行显色LAL试验时)，IgG也显示出中和游离的内毒素(Xuan等，Antimicrob.Agents Chemother.41:1512-6(1997))。为测试EndoPrepTM蛋白酶组合物在抑制IgG活性的应用，在BDTITM消化缓冲液中由12.5mg/ml的原液配制0.5mg/ml的兔IgG(血浆的)样本。之前的研究显示内毒素污染物低，因此加入外源性内毒素到最终浓度为大约100EU/ml。试验前使溶液在室温下静置30分钟以便形成IgG与内毒素之间的相互作用。从未处理的IgG样本得出的试验结果显示回收率为81EU/ml(图5A)。用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理将内毒素活性增加到高达123EU/ml，增加了50％以上。PAGE分析显示IgG结构的相应变化(图5B)。在还原条件下，重链和轻链的移动分别形成大约53kDa和23kDa的不同带。随着EndoPrepTM蛋白酶组合物的添加，重链群减少，并且相应地在25-30kDa出现大片段，在凝胶底部附近出现小Fc片段。与文献中的大部分报道一致，这些结果表明IgG对内毒素活性有抑制作用。用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理可消除这种作用。
每个内毒素分子包含长亲水糖链、疏水脂肪酸链和带负电荷的磷酸根基团。由于这些特征，已知内毒素与大量的蛋白质结合。已知这种结合改变胶束和/或聚集体结构并导致活性的变化。因为在临床设备中精确的内毒素检测是极为重要的，灵敏的检测方法至关重要。本文描述的是使用Endo-PrepTM蛋白酶组合物样本制备系统从含有内毒素的样本中消除蛋白质的影响。包括了整个蛋白质和小肽的例子。此外，说明了内源性内毒素和外源性内毒素的检测。在所有显示的实施例中，用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理提高了采用经典LAL或rFC试验的内毒素定量的精度。经由EndoPrepTM蛋白酶组合物的改变程度取决于被测试的蛋白质。例如，未处理的肽X完全抑制了大内毒素加样的回收，但是通过EndoPrepTM蛋白酶组合物处理后可回收。相反，BSA对内毒素回收仅有小的抑制作用。但是这种效应也通过EndoPrepTM蛋白酶组合物处理得到消除。
表3：结果概述
给出了EndoPrepTM蛋白酶组合物处理对各种蛋白质和肽的影响的总结。表中包括处理之前样本中的内毒素的实验确定量和处理之后的峰回收率。检测量的增加以内毒素回收率增加百分比的形式给出。
实施例6：使用胃蛋白酶提高内毒素检测方法的灵敏度
以下实验比较一系列LPS在水中的稀释液和含有确定量胃蛋白酶的类似系列稀释液。这些数据表明胃蛋白酶提高Lonza试验中rFC酶的活性并导致灵敏度的提高。这允许在目前的0.01EU/ml的LPS浓度以下进行LPS检测。
胃蛋白酶原液的配制。为了配制5％的胃蛋白酶原液(EndoPrepTM蛋白酶组合物)，将250mg的胃蛋白酶溶解于5ml消化缓冲液(20mM醋酸钠，pH值4.5)中。涡旋混合该混合物直到胃蛋白酶溶解于溶液中。5％的胃蛋白酶溶液在4℃下保存。
LPS样本制备。为配制一系列LPS稀释液，连续稀释(Lonza；Walkersville,MD)LPS原液(20 EU/ml)。用200μl原液稀释200μl水达到最终体积400μl而得到10EU/ml的LPS溶液。在450μl水中加入50μl10EU/ml的LPS溶液达到最终体积500μl而得到1EU/ml的LPS溶液。在450μl水中加入50μl1EU/ml的LPS溶液达到最终体积500μl而得到0.1EU/ml的LPS溶液。在450μl水中加入50μl0.1EU/ml的LPS溶液达到最终体积500μl而得到0.01EU/ml的LPS溶液。
LPS和胃蛋白酶样本制备。为得到也含有0.05％胃蛋白酶的相同系列的LPS稀释液，配制两个胃蛋白酶原液。在4μl5％胃蛋白酶中加入196μl水达到最终体积200μl而配制0.1％的胃蛋白酶原液。在18μl5％胃蛋白酶中加入1782μl水达到最终体积1800μl而配制0.05％的胃蛋白酶原液。在200μl的LPS原液(20EU/ml)中加入200μl0.1％的胃蛋白酶原液而得到400μl10EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液。将0.05％的胃蛋白酶原液等分(450μl)到4个试管中。在450μl0.05％的胃蛋白酶溶液中加入50μl10EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液而得到1EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液。在450μl0.05％的胃蛋白酶溶液中加入50μl1EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液而得到0.1EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液。在450μl0.05％的胃蛋白酶溶液中加入50μl0.1EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液而得到0.01EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液。在450μl0.05％的胃蛋白酶溶液中加入50μl0.01EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液而得到0.001EU/ml的LPS，0.05％的胃蛋白酶溶液。
试验。为测试上述配制的样本的内毒素含量，根据制造商说明书进行试验。简言之，把50μl的每个样本与50μl的工作试剂(20μl rFC试验缓冲液、5μlrFC酶溶液、和25μl荧光底物)混合，然后加到(Corning Incorporated LifeSciences；Lowell,MA)3604试验板的单个槽孔里。将板在37℃下在BioTek Synergy2读板仪(BioTek；Winooski,VT)中温育，并在时间点为15、30、45、和60分钟时取荧光读数。结果示出在表4和图6中。
表4.60分钟温育的荧光数据
样本 荧光
10EU/ml在水中 1,012,941
1EU/ml在水中 214,209
0.1EU/ml在水中 67,374
0.01EU/ml在水中 52,604
10EU/ml在水中有0.05％胃蛋白酶 3,161,479
1EU/ml在水中有0.05％胃蛋白酶 586,139
0.1EU/ml在水中有0.05％胃蛋白酶 140,712
0.01EU/ml在水中有0.05％胃蛋白酶 83,678
0.001EU/ml在水中有0.05％胃蛋白酶 76,873
水 52,096
对未处理和处理的LPS样本的系列稀释液进行采集数据。用0.05％胃蛋白酶处理样本。荧光增强证明处理的样本对重组因子C更敏感。
实施例1-6表明酸性蛋白酶可用于增强含有通常抑制内毒素检测的分子的样本的内毒素检测。通常抑制内毒素检测的分子包括各种不同类型的肽，诸如短阳离子肽(即，肽X)、酶(即，Sushi3肽)、金属蛋白(即，血红蛋白)、循环蛋白(即，白蛋白)、和免疫球蛋白(即，IgG)。实施例包括了整个蛋白和小肽。另外还说明了内源性内毒素和外源性内毒素的检测。在所有示出的实施例中，用EndoPrepTM蛋白酶组合物处理增加了内毒素检测的精度。

Claims (9)

1.一种检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的方法，包括的步骤有：
(a)在导致所述样本中蛋白质降解的条件下使所述样本与活性酸性蛋白酶接触；
(b)进一步使所述样本与变形细胞溶解物接触；以及
(c)确定所述变形细胞溶解物中是否发生了凝胶化反应，凝胶化反应表明所述样本中含革兰氏阴性菌或脂多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述变形细胞溶解物选自美洲鲎(Limulus polyphemus)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)的溶解产物。
3.一种检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的试剂盒，包含变形细胞溶解物和酸性蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述变形细胞溶解物选自美洲鲎(Limulus polyphemus)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)的溶解产物。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述酸性蛋白酶选自胃蛋白酶、肾素、凝乳酶、半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、脉孢菌属(Neurospora oryzae)蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉属(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲酶(Aspergillus niger)蛋白酶、华根霉(Rhizopus chinensis)蛋白酶、栗疫菌(Endothia parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶A、曲菌胃蛋白酶原(aspergillopepsinogen)、根霉胃蛋白酶(rhizopuspepsin)、青霉胃蛋白酶(penicillopepsin)和内座壳属胃蛋白酶(endothiapepsin)。
6.一种检测样本中革兰氏阴性菌或脂多糖的试剂盒，包含一种或多种脂多糖结合多肽和酸性蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述一种或多种脂多糖结合多肽是变形细胞溶解物的脂多糖结合多肽。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述变形细胞溶解物选自美洲鲎(Limulus polyphemus)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)的溶解产物。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述酸性蛋白酶选自胃蛋白酶、肾素、凝乳酶、半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、脉孢菌属(Neurospora oryzae)蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉属(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲酶(Aspergillus niger)蛋白酶、华根霉(Rhizopus chinensis)蛋白酶、栗疫菌(Endothia parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶A、曲菌胃蛋白酶原(aspergillopepsinogen)、根霉胃蛋白酶(rhizopuspepsin)、青霉胃蛋白酶(penicillopepsin)和内座壳属胃蛋白酶(endothiapepsin)。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107727863A (zh) * 2017-09-14 2018-02-23 三峡大学 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法
CN109790561A (zh) * 2016-08-03 2019-05-21 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法
CN111638346A (zh) * 2015-07-28 2020-09-08 博斯特尔莱布尼茨林根岑特鲁姆研究中心 用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试
CN114317504A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 健帆生物科技集团股份有限公司 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用
CN118667037A (zh) * 2024-08-22 2024-09-20 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种用于结合内毒素的融合蛋白elp-ebp及其制备方法和去除水溶液中内毒素方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
WO2011146463A2 (en) * 2010-05-17 2011-11-24 BioDtech, Inc. Enhancing endotoxin detection
EP2681328A4 (en) * 2011-02-28 2014-10-29 Biodtech Inc ENHANCED DETECTION OF ENDOTOXINS
CA2862260A1 (en) * 2011-11-29 2013-06-06 Academisch Ziekenhuis Groningen Methods and kits for determining protein-bound biomarkers
CN102721795A (zh) * 2012-06-04 2012-10-10 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素检查方法
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
ES2759066T3 (es) * 2013-12-19 2020-05-07 Nestle Sa Usos de composiciones y métodos para reducir los alérgenos de gato en el ambiente
EP3427049A4 (en) * 2016-03-07 2019-10-16 Nanodx Healthcare Pvt. Ltd. DOSAGE AND KIT FOR ENDOTOXIN DETECTION
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN110628917B (zh) * 2019-09-27 2022-06-14 北部湾大学 一种中国鲎ssr引物组及其应用
CN115039737B (zh) * 2021-08-09 2023-07-25 北京中医药大学 一种建立尿酸盐肾沉积动物模型的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995020163A1 (en) * 1994-01-24 1995-07-27 Xoma Corporation Method for quantifying lbp in body fluids
CA2234165C (en) * 1996-08-12 2004-10-26 Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Containers and kits for the determination of cell functions, and method for the determination thereof
CN1815235A (zh) * 2005-02-05 2006-08-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3962039A (en) * 1974-08-08 1976-06-08 Center For Laboratory Medicine Analytical procedure for thyroid hormones
US3944391A (en) * 1974-12-27 1976-03-16 Preventive Systems, Inc. In vitro process for detecting endotoxin in a biological fluid
US4695392A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
DK255887D0 (da) * 1987-05-20 1987-05-20 Claus Koch Immunoassay
US5308834A (en) * 1989-02-14 1994-05-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and prevention thereof using a BPI protein
JP3429036B2 (ja) * 1993-09-30 2003-07-22 生化学工業株式会社 エンドトキシンの特異的測定剤
US6719973B1 (en) * 1998-12-24 2004-04-13 National University Of Singapore Recombinant proteins and peptides for endotoxin biosensors, endotoxin removal, and anti-microbial and anti-endotoxin therapeutics
CN100390193C (zh) * 2001-06-28 2008-05-28 拜奥维塔克尔公司 检测内毒素的方法和试剂
US7214427B2 (en) * 2002-03-21 2007-05-08 Aviva Biosciences Corporation Composite beads comprising magnetizable substance and electro-conductive substance
WO2004103288A2 (en) * 2003-05-13 2004-12-02 New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery Method of preventing recurrent miscarriages

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995020163A1 (en) * 1994-01-24 1995-07-27 Xoma Corporation Method for quantifying lbp in body fluids
CA2234165C (en) * 1996-08-12 2004-10-26 Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Containers and kits for the determination of cell functions, and method for the determination thereof
CN1815235A (zh) * 2005-02-05 2006-08-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. PETSCH ET AL.: "Proteinase K Digestion of Proteins Improves Detection of Bacterial Endotoxins by the Limulus Amebocyte Lysate Assay: Application for Endotoxin Removal from Cationic Proteins", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
刘厚奇 等: "《原位检测技术》", 31 March 2002 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111638346A (zh) * 2015-07-28 2020-09-08 博斯特尔莱布尼茨林根岑特鲁姆研究中心 用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试
CN109790561A (zh) * 2016-08-03 2019-05-21 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法
CN109790561B (zh) * 2016-08-03 2024-02-06 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法
US11906521B2 (en) 2016-08-03 2024-02-20 Lonza Walkersville, Inc. Method of detecting an endotoxin using limulus amebocyte lysate substantially free of coagulogen
CN107727863A (zh) * 2017-09-14 2018-02-23 三峡大学 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法
CN114317504A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 健帆生物科技集团股份有限公司 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用
CN114317504B (zh) * 2021-12-28 2023-07-25 健帆生物科技集团股份有限公司 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用
CN118667037A (zh) * 2024-08-22 2024-09-20 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种用于结合内毒素的融合蛋白elp-ebp及其制备方法和去除水溶液中内毒素方法

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