JP3429036B2 - エンドトキシンの特異的測定剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセート試薬を用いるエンドトキシンの特異的
測定剤、エンドトキシンの測定法、およびＧ因子活性化
阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートともいう）を使用して、エンドト
キシン（内毒素；以下Ｅｔということもある）を測定す
る方法（この測定法は一般的に「リムルステスト」と呼
ばれ、この測定に関与するライセートの反応は「リムル
ス反応」と呼ばれている）が従来から知られており、検
出感度が非常に高いため、医薬品、水などの汚染試験、
臨床検査など多方面に汎用されている。この方法は、微
量のＥｔによりライセートが凝固することに基づいてい
るが、その後の生化学的解明により、該反応はいくつか
の凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかにされ
ている（J. Protein Chem., 5, 255-268(1986)) 。

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにＥｔが加わ
ると、ライセート中に存在するＣ因子（Ｅｔ感受性因
子、分子量１２３，０００）が活性化され、生成した活
性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，０００）の特定箇所
を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子は
プロクロッティングエンザイム（分子量５４，０００）
を活性化してクロッティングエンザイムに変換し、クロ
ッティングエンザイムはコアギュローゲン（凝固タンパ
ク、分子量１９，７２３）のジスルフィド結合で架橋さ
れたループ内の特定箇所を、すなわち…Ａｒｇ¹⁸−Ｔｈ
ｒ¹⁹…の間および…Ａｒｇ⁴⁶−Ｇｌｙ⁴⁷…の間を限定水
解してＨ−Ｔｈｒ¹⁹…Ａｒｇ⁴⁶−ＯＨで表されるペプチ
ドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離しつつ残余の部分がコ
アギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カス
ケード反応とも呼ばれる；以下Ｅｔによる活性化に起因
するカスケード反応をＣ因子系反応という）である。

【０００４】一方、ライセートはＥｔだけでなく（１→
３）−β−Ｄ−グルカン（以下β−グルカンということ
もある）が加わっても反応することが明らかになった。
すなわち、図１におけるＧ因子（β−グルカン感受性因
子）が活性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッ
ティングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性
化し、コアギュリンゲルを生成するというカスケード反
応が起こる（以下β−グルカンによる活性化に起因する
カスケード反応をＧ因子系反応という）。

【０００５】また、上記の各カスケード反応により生成
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離させる。したがっ
て、生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度
を測定することによりＥｔまたはβ−グルカンの定量が
行われている。

【０００６】このように通常のライセート中にはＣ因子
系反応とＧ因子系反応の両方の反応に関与する成分が含
まれているため、これを用いて検体中のＥｔを測定する
際には検体に含まれる可能性のあるβ−グルカンによっ
てＧ因子系反応が進行して正しい結果を得られない場合
がある。このように、いわゆるリムルステストはＥｔに
特異的な測定法ではないことが明らかにされ、Ｅｔを特
異的に測定する方法が種々検討されている。

【０００７】例えば、（１→３）−β−Ｄ−グルコシド
構造単位が特定個数結合したポリグルコシドをライセー
トと共存させることによって、Ｃ因子系反応に影響を与
えることなくＧ因子の活性化を阻害し、エンドトキシン
を特異的に測定できることが知られている。

【０００８】しかし、この方法は、（１→３）−β−Ｄ
−グルカンを部分分解および／または分画し、Ｇ因子の
活性化を阻害する画分を分取し、さらにエンドトキシン
を除去する必要があり、煩雑な操作を必要とする（ＷＯ
９０／０２９５１）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ライ
セート試薬を用いて検体中のＥｔを測定するに際し、ラ
イセートに含まれるＧ因子（β−グルカン感受性因子）
の影響を受けずに、Ｃ因子系反応のみを利用して、Ｅｔ
を簡便かつ特異的に測定することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために、ライセート中のＣ因子系反応を阻
害せずに、Ｇ因子系反応、すなわちβ−グルカンによる
Ｇ因子の活性化および／または活性型Ｇ因子の活性を選
択的に阻害する物質について検討した。その結果、ライ
セートにアルキルグルコシドを共存させることによって
ＥｔによるＣ因子系反応が実質的に阻害されず、かつβ
−グルカンによるＧ因子系反応が強く阻害される事を見
出した。

【００１１】特に、非イオン性界面活性剤として容易に
入手可能なアルキル−β−Ｄ−グルコシドを適量用いる
ことにより上記目的が容易に達成されることを見出し
た。

【００１２】本発明は、カブトガニ・アメボサイト・
ライセート試薬と、グルコースとアルキル基がグルコシ
ド結合によって結合したアルキルグルコシドを含み、か
つ硝酸を含まなく構成され、カブトガニ・アメボサイト
・ライセート試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子
系反応を阻害するのに必要な量の該アルキルグルコシド
を共存させることを特徴とするエンドトキシンの特異的
測定剤、アルキルグルコシドがアルキル−Ｏ−β−Ｄ
−グルコシドまたはアルキル−Ｓ−β−Ｄ−グルコシド
である前記記載のエンドトキシンの特異的測定剤、お
よびグルコースとアルキル基がグルコシド結合によっ
て結合したアルキルグルコシドのみを主成分として含有
し、硝酸を含まず、カブトガニ・アメボサイト・ライセ
ート試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子の（１→
３）−β−Ｄ−グルカンによる活性化を阻害する作用を
有することを特徴とするＧ因子活性化阻害剤である。

【００１３】また本発明は、カブトガニ・アメボサイト
・ライセート試薬と、主成分としてグルコースとアルキ
ル基がグルコシド結合によって結合したアルキルグルコ
シドのＧ因子系反応を阻害するのに必要な量のみを含有
し、硝酸を含まない試薬であって、カブトガニ・アメボ
サイト・ライセート試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、
Ｇ因子系反応を阻害することができるＧ因子活性化阻害
用試薬を構成試薬として含有するエンドトキシン特異的
測定用キットを提供する。

【００１４】さらに本発明は、カブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート試薬を用いて検体中のエンドトキシンを
測定するに際し、カブトガニ・アメボサイト・ライセー
ト試薬中および／または検体中に、主成分としてグルコ
ースとアルキル基がグルコシド結合によって結合したア
ルキルグルコシドのみを含有し、硝酸を含有しないＧ因
子活性化阻害剤を、カブトガニ・アメボサイト・ライセ
ート試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子系反応を
阻害するのに必要な量共存させることを特徴とするエン
ドトキシンの特異的測定法を提供する。

【００１５】そして、本発明は、β−グルカンによって
活性化されるＧ因子を含有するカブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート試薬にアルキルグルコシドを共存させる
ことを特徴とするＧ因子の活性化を阻害する方法を提供
する。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１７】本発明で使用されるアルキルグルコシド
は、グルコースとアルキル基がグルコシド結合によって
結合したもので、Ｇ因子活性化阻害作用を有するもので
あれば限定されない。α−グルコシド、β−グルコシド
のいずれであってもよいが、特にβ−グルコシドが好ま
しい。また、グルコースとアルキル基とが酸素原子を介
して結合した通常のグルコシド（Ｏ−グルコシド）だけ
でなく、硫黄原子を介して結合したチオグルコシド（Ｓ
−グルコシド）であってもよく、その他セレン（Ｓ
ｅ）、テルル（Ｔｅ）等を介して結合したものであって
もよい。グルコースと結合するアルキル基の炭素数は、
アルキルグルコシドが水溶性または水分散性である限り
特に限定されないが、通常炭素数１〜３０程度、特に６
〜１２程度が好ましい。また、還元末端がグルコースと
アルキル基がグルコシド結合によって結合したアルキル
グルコシドである限り、このアルキルグルコシドにさら
に他のオリゴグリコシドもしくはポリグリコシドが結合
したオリゴグリコシドもしくはポリグリコシドも本発明
のアルキルグルコシドに包含される。グルコースとアル
キル基がグルコシド結合によって結合したアルキルグル
コシドに結合する他のオリゴグリコシドもしくはポリグ
リコシドとしては、Ｇ因子活性化阻害剤として公知（Ｗ
Ｏ９０／０２９５１）の（１→３）−β−Ｄ−グルコシ
ド構造単位が特定個数結合したポリグリコシドが例示さ
れる。特に非イオン性界面活性剤として市販されている
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β
−Ｄ−グルコシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコシド、
ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル
−β−Ｄ−チオグルコシド等は入手が容易な点で好まし
い。

【００１８】本発明で使用されるカブトガニ・アメボサ
イト・ライセート試薬（以下、単にライセート試薬とも
いう）としては、リムルス・ポリフェムス（Limulus p
olyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypl
eus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（T. giga
s）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carci
noscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ液
から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-10
21(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げること
ができる。また、これらの抽出物にＣ因子の活性化に有
効な二価金属塩〔例えば、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水
素酸塩（塩化物など）、硫酸塩等〕、クロッティングエ
ンザイムの基質（例えば、前記のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡのような合成基質）、ｐＨ調整剤
（トリス−塩酸緩衝液などの緩衝剤）を必要に応じて添
加したものであってもよい。さらに、ライセート試薬と
しては、市販のものも使用することができる。なお、こ
のようなライセート試薬は液体、粉末、固形物等のいず
れの形態であってもよい。

【００１９】本発明の目的を達成するためには、（Ａ）
ライセート試薬にアルキルグルコシドを添加することに
よって共存させ、Ｇ因子系反応に関与する成分が不活化
されたライセート試薬（以下「アルキルグルコシド含有
ライセート試薬」ということもある）として測定に供す
る方法、または（Ｂ）検体中にアルキルグルコシドを添
加することによって共存させ、通常のライセート試薬を
使用してこのアルキルグルコシド添加検体を測定する際
にライセート試薬中のＧ因子系反応に関与する成分の活
性化を阻害する方法、あるいは（Ａ）および（Ｂ）の併
用、すなわちライセート試薬と検体中にアルキルグルコ
シドを共存させる方法等が採用される。

【００２０】ここで、ライセート試薬中のＧ因子系反応
を完全に阻害するのに必要なアルキルグルコシドの量
は、例えば、次のようにして決定することができる。氷
冷下、一定量のライセート試薬に、アルキルグルコシド
（Ｅｔを含有しないもの）の量を変えて加え、それらに
通常の測定条件下においてライセート試薬を充分に活性
化する一定量のβ−グルカン（Ｅｔを含有しないもの）
を加えて、通常のライセート試薬使用時と同条件で反応
させる。この条件下でβ−グルカンによるライセート試
薬の活性化を完全に阻害するアルキルグルコシドの量を
求める。

【００２１】このようにして求めたアルキルグルコシド
量から、検体中のＥｔ濃度に応じた測定感度を与えるＣ
因子系反応の活性を得るアルキルグルコシド量を決定す
る。

【００２２】Ｅｔを測定する方法においてアルキルグル
コシドをライセート試薬および／または検体中に共存さ
せる方法としては、例えば、下記〜等が挙げられ
る。 ライセート試薬の抽出調製時にアルキルグルコシド
を添加して調製したアルキルグルコシド含有ライセート
試薬を使用する方法。 抽出したライセート試薬にアルキルグルコシドを添
加したアルキルグルコシド含有ライセート試薬を使用す
る方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品をアルキルグルコシド
含有溶液で溶解したアルキルグルコシド含有ライセート
試薬を使用する方法。 ライセート試薬の凍結乾燥品を適当な溶解液で溶解
した溶液にアルキルグルコシドを添加して調製したアル
キルグルコシド含有ライセート試薬を使用する方法。 アルキルグルコシドを添加して抽出調製したライセ
ート試薬またはライセート試薬中に予め必要量のアルキ
ルグルコシドを共存させ凍結乾燥して得た試薬を適当な
溶解液で溶解したアルキルグルコシド含有ライセート試
薬を使用する方法。 ライセート試薬と合成基質の凍結乾燥品をアルキル
グルコシド含有溶液で溶解するかまたは適当な溶液で溶
解して調製した溶液に、アルキルグルコシドを添加する
方法。 ライセート試薬と合成基質の混合液中に予め必要量
のアルキルグルコシドを共存させ凍結乾燥して得た試薬
を適当な溶解液で溶解して用いる方法。 必要量のアルキルグルコシドを検体に添加する方
法。 検体試料をライセート試薬に添加後、直ちに該アル
キルグルコシドを添加する方法。

【００２３】要するに、本発明を使用したＥｔの測定法
においては、ライセート試薬中のＣ因子系反応が目的に
合った感度及び測定範囲で機能し、Ｅｔの定量もしくは
定性的測定が可能であれば、アルキルグルコシドの使用
法は任意である。本発明の測定剤を用いてＥｔを測定す
るには、図１のカスケード反応によって生成するクロッ
ティングエンザイムの活性を公知の方法で測定すればよ
い。

【００２４】クロッティングエンザイムのアミダーゼ活
性の測定には、基質として、例えば前記のｐ−ニトロア
ニリンのような発色性残基を有するペプチド合成基質も
しくは発色性残基を有するこれと類似の配列のペプチド
合成基質、またはこれと同一もしくは類似の配列のペプ
チドであって、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基に前
記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性残
基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペプチ
ド合成基質を使用することができる。クロッティングエ
ンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する反応生
成物を測定することによって、アミダーゼ活性の測定を
行うことができる。具体的には、本発明の測定剤とＥｔ
を含む反応系に上記ペプチド合成基質を共存させ、反応
（カスケード反応および必要に応じて生成物の他色素等
への変換反応）によって生成する色素、蛍光物質または
アンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４
８８６０）等によって測定する方法を例示することがで
きる。

【００２５】クロッティングエンザイムのプロテアーゼ
活性の測定には、本発明の測定剤中に含まれる（もしく
は別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッテ
ィングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成す
る際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁
度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉
眼で判定する方法を採用することができる。

【００２６】本発明を使用する際には、リムルス反応に
際し、前記カスケード反応系の活性化に有効な２価金属
塩を共存させる必要がある。このような２価金属塩とし
ては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウムなど
のアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物
等）、硫酸塩等が例示される。また、本発明の測定剤に
おいては、上記金属塩をリムルス反応時に別に添加して
もよいが、通常ライセート試薬に上記２価金属塩を共存
させた状態で、非加熱条件下での乾燥処理（例えば、凍
結乾燥）を行って固体状態にしたものが望ましい。さら
に、上記アミダーゼ活性を測定するための測定剤は、２
価金属塩のほかに前記ペプチド合成基質を共存させたも
のであることが好ましく、これを乾燥処理したものであ
ってもよい。

【００２７】本発明によりＥｔが測定される検体として
は、基本的には特に制限なく、Ｅｔ定量の必要があるも
のあるいはその存否を確認する必要があるものであれば
よい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用する
水等を挙げることができる。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１：ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（グルコ
ピラノシド）を、ライセート試薬に添加する例 １）日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．
０Ｌを４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈
殿部分（アメボサイト）約２１g に０．０２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ホモゲナ
イザー（ポリトロンＲ ＰＴ１０（商品名）、Kinemati
ca社製造）にて均一に破砕および抽出し、１０，０００
×Ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液（ライセート試薬）
１９０ｍＬを得た。

【００２９】このライセート試薬０．０４ｍＬに非イオ
ン性界面活性剤であるｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド０．１〜１．６ｍｇを含有する０．５Ｍトリス−塩酸
−０．４Ｍ硫酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．
０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡ ０．０２ｍＬを加え、ｎ−オクチル−β−
Ｄ−グルコシド含有ライセート試薬を得た（本発明）。
また別のライセート試薬０．０４ｍＬにｎ−オクチル−
β−Ｄ−グルコシドを含有しない０．５Ｍトリス−塩酸
−０．４Ｍ硫酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．
０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加えた。それらに検体とし
て、蒸留水（以下、ＤＷと記す。これをブランクとして
用いる）、後述により調製したβ−グルカン（５００ｎ
ｇ／ｍＬ）を別々に０．１ｍＬ加えた。それらを３７
℃、３０分間加温して反応させ、生じたパラニトロアニ
リンを０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ塩酸溶
液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．０７
％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩を各々
０．５ｍＬずつ順次加えてジアゾカップリングさせ、５
４５ｎｍで吸光度を測定し、ブランクとの差を反応性と
して、表１に示した（尚、以下の実施例の表もしくは図
中においてもΔの意味はブランクとの差を意味す
る。）。

【００３０】

【表１】

【００３１】表１から明らかなように、ライセート試薬
０．０４ｍＬに対して、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
シドを０．４ｍｇ以上添加すれば、β−グルカンによる
ライセート試薬中のＧ因子の活性化を完全に阻害するこ
とができることがわかる。２）ライセート試薬０．０４
ｍＬに１）で求めたライセート試薬中のβ−グルカンに
よるＧ因子系反応を完全に阻害したｎ−オクチル−β−
Ｄ−グルコシド（０．４〜１．６ｍｇ）をそれぞれ含有
する０．５Ｍトリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネシウム
緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加
え、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド含有ライセート
試薬を得た。また別のライセート試薬０．０４ｍＬにｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを含有しない０．５Ｍ
トリス−塩酸−０．４Ｍ硫酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ
８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加えた。それら
に検体として、ＤＷ（ブランク）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４株由来Ｅｔ
（シグマ社販売のＷｅｓｔｐｈａｌ ｔｙｐｅ；６．２
５、１２．５、２５．０、５０．０ｐｇ／ｍＬ）を別々
に０．１ｍＬ加えた。それらを１）と同様にして反応さ
せ、Ｅｔの検量線を作成した。その結果を図２に示し
た。この結果から、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド
（図中Ｏ．Ｇ．と略す）の添加量が増加するとともにＥ
ｔに対する反応性も低下することがわかる。これらの検
量線より、検体中のＥｔ濃度に応じた測定感度を与える
ライセート中のＣ因子系反応の活性を得るｎ−オクチル
−β−Ｄ−グルコシド量を任意に選ぶことができる。

【００３２】以上の結果より、通常のライセート試薬に
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを添加してリムルス
テスト試薬を調製し、検体の測定に用いることによっ
て、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測
定することができることがわかる。 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
^TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ＫＨ_Z、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷ_XL２本、Ｇ２５００ＰＷ_XL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品（β
−グルカン標品）を得た。

【００３３】尚、以下の実施例に使用されたβ−グルカ
ンも、上記と同様に調製されたものである。 実施例２：ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドをライセ
ート試薬の抽出調製時に添加する例 日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．０Ｌ
を４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈殿部
分（アメボサイト）約２１gにｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコシドを２．０ｇ含有する０．０２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ポリトロンＲ
ＰＴ１０にて均一に破砕および抽出し、１０，０００
×Ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液（ｎ−オクチル−β
−Ｄ−グルコシド含有ライセート試薬）１９０ｍＬを得
た。

【００３４】このｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド含
有ライセート試薬（本発明例）と上記においてｎ−オク
チル−β−グルコシドを添加しないで調製したライセー
ト試薬（比較例）各々０．０４ｍＬに２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ、０．４Ｍ塩化マグ
ネシウム０．０３ｍＬ、３．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加え、さらに検
体としてＤＷ（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを
別々に０．１ｍＬ加えた。また、それぞれ２倍濃度のＥ
ｔとβ−グルカンを０．０５ｍＬずつ同時に添加した。
それらを３７℃、３０分間加温して反応させ、０．８Ｍ
酢酸０．４ｍＬを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍの
吸光度を測定して、生じたパラニトロアニリンを定量
し、反応性を比較検討した。その結果を表２に示した。
この結果から、カブトガニ血リンパ液からライセート試
薬を抽出する際にｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを
添加して調製したｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド含
有ライセート試薬を用いれば、β−グルカンの影響を受
けずに、Ｅｔを特異的に測定することができることがわ
かる。言い換えれば、本発明による測定においては、Ｃ
因子系反応が阻害されることなくＧ因子系反応が実質的
に抑制されていることが証明された。

【００３５】

【表２】

【００３６】実施例３：凍結乾燥ライセート試薬の溶解
時にｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド（チオグル
コピラノシド）を添加する例 「パイロテル」（Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓより抽出調
製されたライセート試薬の凍結乾燥品；ゲル化法リムル
ステスト試薬製品；ケープコッド社製造、生化学工業販
売）１バイアルを、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコ
シド５５ｍｇを含有する水溶液５．０ｍＬで溶解した
（本発明例）。また、別の凍結乾燥品１バイアルはｎ−
オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを含有しないＤＷ
５．０ｍＬで溶解した（比較例）。それらの各０．１ｍ
Ｌを反応用試験管に分注した。さらに検体として、ＤＷ
（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１
ｍＬ加えた。また、それぞれに２倍濃度のＥｔとβ−グ
ルカンを０．０５ｍＬずつ同時に添加した。静かに混和
後、比濁時間分析装置「トキシノメーターＥＴー２０
１」（和光純薬工業販売）の専用アナリシスモジュール
にセットし、３７℃、６０分間加温して反応させ、ゲル
化時間（Ｔｇ）を記録し、本発明の測定剤の反応性を比
較検討した。その結果を表３に示した。この結果から、
市販のライセート試薬の凍結乾燥品（ゲル化法リムルス
テスト試薬）にｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド
を検体添加前に添加することによって、β−グルカンの
影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測定することができる
ことがわがる。

【００３７】

【表３】

【００３８】実施例４：ライセート試薬と合成基質の凍
結乾燥品の溶解時にｎ−デシル−β−Ｄ−グルコシド
（グルコピラノシド）を添加する例 「トキシカラーシステムＬＳ−２００セット」（T.trid
entatus より抽出調製されたライセート試薬とＢｏｃ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ等との凍結乾燥品；発
色合成基質法リムルステスト試薬製品；生化学工業製造
販売）１バイアルを、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコシド
２８ｍｇを含有した０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）２．８ｍＬで溶解し、本発明の測定剤を調製し
た。また、別の凍結乾燥品１バイアルはｎ−デシル−β
−Ｄ−グルコシドを含有しない０．２Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）２．８ｍＬで溶解し、比較剤を調製
した。それらの０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加え
た。また、それぞれに２倍濃度のＥｔとβ−グルカンを
０．０５ｍＬずつ同時に添加した。それらを実施例１−
１）と同様にして反応させ、本発明の測定剤の反応性を
比較検討した。その結果を表４に示した。

【００３９】

【表４】

【００４０】この結果から、市販の発色合成基質法リム
ルステスト試薬（凍結乾燥品）にｎ−デシル−β−Ｄ−
グルコシドを検体添加前に添加することによって、β−
グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測定するこ
とができることがわかる。 実施例５：ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを添加し
て抽出調製したライセート試薬の凍結乾燥品を使用する
例 実施例２と同様にｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを
添加して抽出調製したｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド含有ライセート試薬２．０ｍＬと０．４Ｍ塩化マグネ
シウム０．４ｍＬとを混和後、凍結乾燥して本発明のＥ
ｔ特異的測定剤を得た。また、同じく実施例１−１）と
同様に調製したｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを含
まないライセート試薬２．０ｍＬと０．４Ｍ塩化マグネ
シウム０．４ｍＬとを混和後、凍結乾燥して比較の測定
剤を得た。両凍結乾燥品をそれぞれＤＷ２．０ｍＬに溶
解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ加
え、静かに混和後、３７℃、６０分間静置加温し、１８
０゜転倒してゲル形成の有無を肉眼で判定し、本発明の
測定剤の反応性を比較検討した。その結果を表５に示し
た。表中＋はゲル化したことを、−はゲル化しなかった
ことを表す。

【００４１】

【表５】

【００４２】この結果から、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グ
ルコシドを添加して抽出調製したｎ−オクチル−β−Ｄ
−グルコシド含有ライセート試薬を凍結乾燥することに
よって、β−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的
に測定することができることがわかる。 実施例６：ライセート試薬と合成基質とｎ−オクチル−
β−Ｄ−グルコシドとを混和後、凍結乾燥したＥｔ特異
的測定剤を使用する例 実施例１−１）で得たｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド不含ライセート試薬２．０ｍＬ、３．４ｍＭ発色合成
基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）０．
９ｍＬ、０．８Ｍ硫酸マグネシウム１．０ｍＬならびに
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド２５ｍｇを含有する
水溶液０．５ｍＬとを混和後、凍結乾燥して本発明のＥ
ｔ特異的測定剤を得た。また、ｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコシド水溶液の代わりにＤＷ０．５ｍＬを混和後、
凍結乾燥して比較の測定剤を得た。両凍結乾燥品をそれ
ぞれ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５．０
ｍＬに溶解し、その０．１ｍＬに検体として、ＤＷ（ブ
ランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々に０．１ｍＬ
加えた。また、それぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカン
を０．０５ｍＬずつ添加した。以後、実施例１−１）と
同様に反応させ、本発明の測定剤の反応性を比較検討し
た。その結果を表６に示した。

【００４３】

【表６】

【００４４】この結果から、ライセート試薬と合成基質
とｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドとを混和して凍結
乾燥することによって、β−グルカンの影響を受けず
に、Ｅｔを特異的に測定することができることがわか
る。 実施例７：ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを事前に
検体に添加する例 検体として、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔ、β−グルカンお
よびそれぞれ２倍濃度のＥｔとβ−グルカンの等量混合
液各々０．０５ｍＬを用意する。それらにｎ−オクチル
−β−Ｄ−グルコシド１．２ｍｇを含有する水溶液０．
０５ｍＬを加え、次いでそれらに０．２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）２．８ｍＬで溶解した「トキシカ
ラーシステム ＬＳ−２００セット」０．１ｍＬを加
え、以後、実施例１−１）と同様にして反応させた。ま
た、上記ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド水溶液の代
わりにＤＷを同量使用して、反応性を比較検討した。そ
の結果を表７に示した。

【００４５】

【表７】

【００４６】この結果から、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グ
ルコシドを検体にあらかじめ添加することによって、β
−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔを特異的に測定する
ことができることがわかる。 実施例８：検体をライセート試薬に添加後、直ちにｎ−
オクチル−β−Ｄ−グルコシドを添加する例 「パイロテル」１バイアルをＤＷ５．０ｍＬで溶解し、
その０．１ｍＬを氷冷下で試験管に分注し、検体とし
て、ＤＷ（ブランク）、Ｅｔまたはβ−グルカンを別々
に０．０５ｍＬ添加し、次いで直ちにｎ−オクチル−β
−Ｄ−グルコシド１．３ｍｇを含有する水溶液０．０５
ｍＬを添加し、静かに混和後、３７℃、６０分間静置加
温して、ゲル形成の有無を実施例５と同様にして判定し
た。また、上記ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド水溶
液の代わりにＤＷを同量使用して、反応性を比較検討し
た。その結果を表８に示した。

【００４７】

【表８】

【００４８】この結果から、検体をライセート試薬に添
加後、直ちにｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを添加
することによってβ−グルカンの影響を受けずに、Ｅｔ
を特異的に測定することができることがわかる。 実施例９ 検体として敗血症の合併が疑われる患者から採取した多
血小板血漿を過塩素酸処理後中和し、その０．１ｍＬを
使用した以外は、実施例２と同様に本発明法で検体中の
Ｅｔを測定すると共に検体の培養を行ったところ、大腸
菌の検出とＥｔの反応性の定量化が対応していることが
確認された。

【００４９】また、上記試験を実施例３〜実施例８に準
じて行ったところ、本発明の測定剤あるいは本発明の方
法が有効であることが確認された。

【００５０】

【発明の効果】本発明は、Ｅｔ特異的測定剤をライセー
ト試薬とアルキルグルコシドを組み合わせるのみで容易
に製造ができるという経済性に優れ、かつＥｔの存在の
有無が明確でない感染症、敗血症を疑われている臨床検
体を測定する時に特に有用であり、真のグラム陰性菌感
染症（エンドトキセミア）を的確に判別できる利点があ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】リムルス反応の機構を説明する図。

【図２】エンドトキシン濃度に対する吸光度の検量線を
種々のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド添加量につい
て示したもので、実施例１−２）の結果を示す。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−16765（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−136763（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／002951（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/579

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
   試薬と、グルコースとアルキル基がグルコシド結合によ
   って結合したアルキルグルコシドを含み、かつ硝酸を含
   まなく構成され、カブトガニ・アメボサイト・ライセー
   ト試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子系反応を阻
   害するのに必要な量の該アルキルグルコシドを共存させ
   ることを特徴とするエンドトキシンの特異的測定剤。
2. 【請求項２】 アルキルグルコシドがアルキル−Ｏ−β
   −Ｄ−グルコシドまたはアルキル−Ｓ−β−Ｄ−グルコ
   シドである請求項１記載のエンドトキシンの特異的測定
   剤。
3. 【請求項３】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
   試薬を用いて検体中のエンドトキシンを測定するに際
   し、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬中およ
   び／または検体中に、主成分としてグルコースとアルキ
   ル基がグルコシド結合によって結合したアルキルグルコ
   シドのみを含有し、硝酸を含有しないＧ因子活性化阻害
   剤を、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬中の
   Ｃ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子系反応を阻害するのに
   必要な量共存させることを特徴とするエンドトキシンの
   特異的測定法。
4. 【請求項４】 グルコースとアルキル基がグルコシド結
   合によって結合したアルキルグルコシドのみを主成分と
   して含有し、硝酸を含まず、カブトガニ・アメボサイト
   ・ライセート試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子
   の（１→３）−β−Ｄ−グルカンによる活性化を阻害す
   る作用を有することを特徴とするＧ因子活性化阻害剤。
5. 【請求項５】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
   試薬と、主成分としてグルコースとアルキル基がグルコ
   シド結合によって結合したアルキルグルコシドのＧ因子
   系反応を阻害するのに必要な量のみを含有し、硝酸を含
   まない試薬であって、カブトガニ・アメボサイト・ライ
   セート試薬中のＣ因子系反応は阻害せず、Ｇ因子系反応
   を阻害することができるＧ因子活性化阻害用試薬を構成
   試薬として含有するエンドトキシン特異的測定用キッ
   ト。