JPH0711523B2 - 試薬の調製方法 - Google Patents
試薬の調製方法Info
- Publication number
- JPH0711523B2 JPH0711523B2 JP63062142A JP6214288A JPH0711523B2 JP H0711523 B2 JPH0711523 B2 JP H0711523B2 JP 63062142 A JP63062142 A JP 63062142A JP 6214288 A JP6214288 A JP 6214288A JP H0711523 B2 JPH0711523 B2 JP H0711523B2
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- JP
- Japan
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- solution
- derivative
- glps
- insoluble
- curdlan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は、カブトガニの血球成分（Amoebocyte Lysat
e）抽出液（以下、AL溶液と略記する。）を原料とし
た、エンドトキシンに特異的な試薬の調製方法に関す
る。
e）抽出液（以下、AL溶液と略記する。）を原料とし
た、エンドトキシンに特異的な試薬の調製方法に関す
る。
［発明の背景］ エンドキシン（以下、ETと略記する。）は主にグラム陰
性菌の細胞表層中に存在するリポ多糖であり、発熱物質
（Pyrogen）の一種としても知られる物質である。その
ため、試料中のET濃度の測定は、医学、薬学、微生物学
の分野に於いて、重量なものの１つなっている。
性菌の細胞表層中に存在するリポ多糖であり、発熱物質
（Pyrogen）の一種としても知られる物質である。その
ため、試料中のET濃度の測定は、医学、薬学、微生物学
の分野に於いて、重量なものの１つなっている。
現在のところ、このETの測定法としては、AL溶液がETに
よって活性化されて凝固する現像を利用した、所謂リム
ルステストがその簡便性、費用が安価な点等から広く利
用されている。
よって活性化されて凝固する現像を利用した、所謂リム
ルステストがその簡便性、費用が安価な点等から広く利
用されている。
しかしながら、このAL溶液はETのみならず、カルボキシ
メチル化したβ−1,3−グルカンとも反応することが見
出され［Kakinuma et al.,Biochem.Biophys.Research C
ommunication,101(2),434-439（1981）］、その現象
は、AL溶液中に存在するβ−1,3−グルカン（以下、GL
と略記する。）と反応して凝固反応を惹起する因子（以
下、GL感受性因子と略記する。）がGL又はその誘導体と
反応することにより惹起されることが明らかにされた
［岩永ら、日本細菌学雑誌、38(6)、781-803（198
3）］。
メチル化したβ−1,3−グルカンとも反応することが見
出され［Kakinuma et al.,Biochem.Biophys.Research C
ommunication,101(2),434-439（1981）］、その現象
は、AL溶液中に存在するβ−1,3−グルカン（以下、GL
と略記する。）と反応して凝固反応を惹起する因子（以
下、GL感受性因子と略記する。）がGL又はその誘導体と
反応することにより惹起されることが明らかにされた
［岩永ら、日本細菌学雑誌、38(6)、781-803（198
3）］。
そのため、現在市販されているリムルステストの大部分
は、ETのみならずGLとも反応し、この測定法では試料中
に存在しているのがETであるのかGLであるのか或は両者
の混合物であるのかを判定することは難しく、その特異
性が問題となっている。
は、ETのみならずGLとも反応し、この測定法では試料中
に存在しているのがETであるのかGLであるのか或は両者
の混合物であるのかを判定することは難しく、その特異
性が問題となっている。
このような問題点を解決すべく、AL溶液からGL感受性因
子を除去してETに特異的な試薬を調製する方法が報告さ
れている（特開昭58-13516号公報、特開昭59-27828号公
報）。しかしながら、これらに開示された方法は、何れ
もAL溶液をゲル濾過法或はヘパリン，デキストラン硫酸
を結合させた担体を用いたクロマトグラフィ等によって
処理し、凝固酵素前駆体の分画、GL感受性因子の分画及
びETと反応して凝固反応を惹起する因子（以下、ET感受
性因子と略記する。）の分画に分離してGL感受性因子の
除去を行うと言う極めて煩雑な操作を要する方法であ
る。従って、分離操作中にAL溶液或はその分画液がETに
よる汚染を受けるのを紡糸するためには、この操作を行
なうための専用設備等が必要であり、しかも、最終的に
ETに特異的な試薬を得るには各分画を改めて適宜混合し
なければならないという欠点をも有していた。
子を除去してETに特異的な試薬を調製する方法が報告さ
れている（特開昭58-13516号公報、特開昭59-27828号公
報）。しかしながら、これらに開示された方法は、何れ
もAL溶液をゲル濾過法或はヘパリン，デキストラン硫酸
を結合させた担体を用いたクロマトグラフィ等によって
処理し、凝固酵素前駆体の分画、GL感受性因子の分画及
びETと反応して凝固反応を惹起する因子（以下、ET感受
性因子と略記する。）の分画に分離してGL感受性因子の
除去を行うと言う極めて煩雑な操作を要する方法であ
る。従って、分離操作中にAL溶液或はその分画液がETに
よる汚染を受けるのを紡糸するためには、この操作を行
なうための専用設備等が必要であり、しかも、最終的に
ETに特異的な試薬を得るには各分画を改めて適宜混合し
なければならないという欠点をも有していた。
［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、AL
溶液を原料としてETに特異的な試薬を得るための、GL感
受性因子の簡便で且つ効率の良い除去方法を提供するこ
とを目的とする。
溶液を原料としてETに特異的な試薬を得るための、GL感
受性因子の簡便で且つ効率の良い除去方法を提供するこ
とを目的とする。
［発明の構成］ 上記目的を達成するために、本発明は下記の構成よりな
る。
る。
カブトガニ血球成分抽出液と、これに対して0.1W/V％以
上の濃度となる量のβ−1,3−グルカン又は／及びその
誘導体を含む、 β−1,3−グルカンを構成成分とする水不溶性の多
糖類又は／及びβ−1,3−グルカンを構成成分とする多
糖類の水不溶性の誘導体 或は β−1,3−グルカンを構成成分とする多糖類又は／
及びその誘導体を不溶性担体上に固定化したもの とを接続させた後、該カブトガニ血球成分抽出液から上
記或はを除去することを特徴とするエンドトキシン
に特異的な試薬の調製方法。
上の濃度となる量のβ−1,3−グルカン又は／及びその
誘導体を含む、 β−1,3−グルカンを構成成分とする水不溶性の多
糖類又は／及びβ−1,3−グルカンを構成成分とする多
糖類の水不溶性の誘導体 或は β−1,3−グルカンを構成成分とする多糖類又は／
及びその誘導体を不溶性担体上に固定化したもの とを接続させた後、該カブトガニ血球成分抽出液から上
記或はを除去することを特徴とするエンドトキシン
に特異的な試薬の調製方法。
即ち、本発明者らは、AL溶液を原料としたETに特異的な
試薬を簡便に且つ効率良く調製する方法につき鋭意研究
の結果、AL溶液を凝固させる物質として知られるGLを構
成成分とする水不溶性の多糖類（以下、GLNSPSと略称す
る。）又は／及びGLを構成成分とする多糖類（以下、GL
PSと略記する。）の水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／
及びその誘導体を不溶性担体に固定化したものを大量に
AL溶液中に添加する等してAL溶液と接触させた後、該AL
溶液からこれらを除去すれば、ETに特異的に反応する試
薬が容易に得られることを見出し、本発明を完成するに
至った。
試薬を簡便に且つ効率良く調製する方法につき鋭意研究
の結果、AL溶液を凝固させる物質として知られるGLを構
成成分とする水不溶性の多糖類（以下、GLNSPSと略称す
る。）又は／及びGLを構成成分とする多糖類（以下、GL
PSと略記する。）の水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／
及びその誘導体を不溶性担体に固定化したものを大量に
AL溶液中に添加する等してAL溶液と接触させた後、該AL
溶液からこれらを除去すれば、ETに特異的に反応する試
薬が容易に得られることを見出し、本発明を完成するに
至った。
本発明に用いることのできるGLNSPS及びGLPSの水不溶性
の誘導体としては、GLPS或はその誘導体であって、AL溶
液に不溶性のものであれば特に限定されることなく用い
ることができる。更に具体的には、GLPSとして一般に知
られている、例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes
属,Agrobacterium属等）、酵母類（例えば,Saccharomyc
es属等）、キノコ類（例えば、シイタケ，スエヒロタ
ケ，カワラタケ等）等の細胞壁から得られる天然の多
糖、具体的には例えばカードラン，パキマン，スクレロ
タン，レンチナン，シゾフィラン，コリオラン等、或
は、藻類（例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等）の貯
蔵性多糖、具体的には例えばラミナラン，パラミロン等
の中から選択される水不溶性のもの、これらを加熱等の
処理により水不溶化したもの、これらに常法、例えば大
有機化学第19巻、第７版,70〜101頁，小竹無二雄監修，
昭和42年５月10日，朝倉書店等に記載された方法に準じ
てエチル基，ブチル基等を導入することにより水不溶性
誘導体としたものが好ましく挙げられ、これらを単独で
用いる或は２種以上組み合わせて用いる等は任意であ
る。
の誘導体としては、GLPS或はその誘導体であって、AL溶
液に不溶性のものであれば特に限定されることなく用い
ることができる。更に具体的には、GLPSとして一般に知
られている、例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes
属,Agrobacterium属等）、酵母類（例えば,Saccharomyc
es属等）、キノコ類（例えば、シイタケ，スエヒロタ
ケ，カワラタケ等）等の細胞壁から得られる天然の多
糖、具体的には例えばカードラン，パキマン，スクレロ
タン，レンチナン，シゾフィラン，コリオラン等、或
は、藻類（例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等）の貯
蔵性多糖、具体的には例えばラミナラン，パラミロン等
の中から選択される水不溶性のもの、これらを加熱等の
処理により水不溶化したもの、これらに常法、例えば大
有機化学第19巻、第７版,70〜101頁，小竹無二雄監修，
昭和42年５月10日，朝倉書店等に記載された方法に準じ
てエチル基，ブチル基等を導入することにより水不溶性
誘導体としたものが好ましく挙げられ、これらを単独で
用いる或は２種以上組み合わせて用いる等は任意であ
る。
また、本発明に於いては、上記した如きGLPS及びその誘
導体を適当な不溶性担体上に固定化したものも、GLNSPS
及びGLPSの水不溶性の誘導体と同様に利用できることは
言うまでもない。GLPS又はその誘導体を固定化するため
に用いられる不溶性担体としては、セルロース、アガロ
ース、デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラ
ス等、アフィニティクロマトグラフィに於いて通常用い
られる不溶性担体であれば、何れも使用可能であるが、
中でもアガロースが特に好ましい。アガロース系担体の
具体的商品としては、セファローズ（ファルマシア社商
品名）、バイオゲルＡ（BIO-RAD社商品名）等があり、
デキストラン系のものとしては、セファデックス（ファ
ルマシア社商品名）、セファクリル（ファルマシア社商
品名）が、また、ポリアクリルアミド系のもとしては、
エンザフィックスＰ（和光純薬工業（株）社製）、バイ
オゲルＰ（BIO-RAD社商品名）等が夫々市販されている
が、これらに限定されるものではない。これらの不溶性
担体にGLPS又はその誘導体を結合させるためには不溶性
担体を活性化させる必要があることは言うまでもない。
不溶性担体の活性化法は種々あり、特に限定されるもの
ではないが、例えば、エピクロルヒドリンで活性化する
方法等が適当なものとして挙げることができる。
導体を適当な不溶性担体上に固定化したものも、GLNSPS
及びGLPSの水不溶性の誘導体と同様に利用できることは
言うまでもない。GLPS又はその誘導体を固定化するため
に用いられる不溶性担体としては、セルロース、アガロ
ース、デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラ
ス等、アフィニティクロマトグラフィに於いて通常用い
られる不溶性担体であれば、何れも使用可能であるが、
中でもアガロースが特に好ましい。アガロース系担体の
具体的商品としては、セファローズ（ファルマシア社商
品名）、バイオゲルＡ（BIO-RAD社商品名）等があり、
デキストラン系のものとしては、セファデックス（ファ
ルマシア社商品名）、セファクリル（ファルマシア社商
品名）が、また、ポリアクリルアミド系のもとしては、
エンザフィックスＰ（和光純薬工業（株）社製）、バイ
オゲルＰ（BIO-RAD社商品名）等が夫々市販されている
が、これらに限定されるものではない。これらの不溶性
担体にGLPS又はその誘導体を結合させるためには不溶性
担体を活性化させる必要があることは言うまでもない。
不溶性担体の活性化法は種々あり、特に限定されるもの
ではないが、例えば、エピクロルヒドリンで活性化する
方法等が適当なものとして挙げることができる。
本発明の調製法に於いて使用可能なAL溶液としては、リ
ムルス（Limulus）属、タキプレウス（Tachypleus）属
或はカルシノスコルピウス（Csrcinoscorpius）属に属
するカブトガニの血球から抽出されたもので、ETとの反
応により凝固反応が生じるものであれば特に限定される
ことなく挙げられる。また、例えばACC（ASSOCIATES OF
CAPE COD）社，ヘマケム社,Whittaker Bioproducts社
等により市販されているAL溶液の凍結乾燥品をもとに調
製したものも当然使用することが可能であることは言う
までもない。
ムルス（Limulus）属、タキプレウス（Tachypleus）属
或はカルシノスコルピウス（Csrcinoscorpius）属に属
するカブトガニの血球から抽出されたもので、ETとの反
応により凝固反応が生じるものであれば特に限定される
ことなく挙げられる。また、例えばACC（ASSOCIATES OF
CAPE COD）社，ヘマケム社,Whittaker Bioproducts社
等により市販されているAL溶液の凍結乾燥品をもとに調
製したものも当然使用することが可能であることは言う
までもない。
本発明の調製法によりETに特異的な試薬を得る方法とし
ては、AL溶液と、GLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘
導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固
定化したものとを接触させた後に、AL溶液からGLNSPS又
は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及び
その誘導体を不溶性担体に固定化したものを除去するこ
とができる方法であれば、特に限定されることなく挙げ
られるが、例えばAL溶液に、GLNSPS又は／及びGLPSの水
溶性の誘導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性
担体に固定化したものをAL溶液中に添加して接触させ、
その後、濾過、遠心分離等の手法によってGLNSPS又は／
及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及びその
誘導体を不溶性担体に固定化したものを除去する、或
は、GLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGL
PS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固定化したもの
を充填したカラムにより、AL溶液を処理する等の方法が
挙げられる。
ては、AL溶液と、GLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘
導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固
定化したものとを接触させた後に、AL溶液からGLNSPS又
は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及び
その誘導体を不溶性担体に固定化したものを除去するこ
とができる方法であれば、特に限定されることなく挙げ
られるが、例えばAL溶液に、GLNSPS又は／及びGLPSの水
溶性の誘導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性
担体に固定化したものをAL溶液中に添加して接触させ、
その後、濾過、遠心分離等の手法によってGLNSPS又は／
及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及びその
誘導体を不溶性担体に固定化したものを除去する、或
は、GLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGL
PS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固定化したもの
を充填したカラムにより、AL溶液を処理する等の方法が
挙げられる。
本発明の調製方法に於いて、AL溶液と接触させるGLSPS
又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及
びその誘導体を不溶性担体に固定化したものの量として
は、通常、AL溶液中に添加されたGLNSPS又は／及びGLPS
の水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を
不溶性担体に固定化したものに含まれるGL又は／及びそ
の誘導体の量がAL溶液に対して0.01W/V％以上、更に好
ましくは0.1W/V％以上となるようにすればよい。また、
AL溶液とGLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或
はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固定化した
ものとを、接触させる場合のpHとしては、AL溶液中のET
感受性因子及びETとET感受性因子との反応により惹起さ
れる凝固反応に関与する因子が失活しないpHであればよ
いが、通常、６〜８の範囲が好ましく用いられる。ま
た、接触させる場合の温度としては、AL溶液中のET感受
性因子及びETとET感受性因子との反応により惹起される
凝固反応に関与する因子が失活しない温度であればよい
が、通常、０〜40℃、より好ましくは０〜10℃が用いら
れる。
又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及
びその誘導体を不溶性担体に固定化したものの量として
は、通常、AL溶液中に添加されたGLNSPS又は／及びGLPS
の水不溶性の誘導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を
不溶性担体に固定化したものに含まれるGL又は／及びそ
の誘導体の量がAL溶液に対して0.01W/V％以上、更に好
ましくは0.1W/V％以上となるようにすればよい。また、
AL溶液とGLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体、或
はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固定化した
ものとを、接触させる場合のpHとしては、AL溶液中のET
感受性因子及びETとET感受性因子との反応により惹起さ
れる凝固反応に関与する因子が失活しないpHであればよ
いが、通常、６〜８の範囲が好ましく用いられる。ま
た、接触させる場合の温度としては、AL溶液中のET感受
性因子及びETとET感受性因子との反応により惹起される
凝固反応に関与する因子が失活しない温度であればよい
が、通常、０〜40℃、より好ましくは０〜10℃が用いら
れる。
AL溶液に添加する際の、或はAL溶液の処理を行うカラム
の充填剤としてのGLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘
導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固
定化したものの形状としては特に限定はなく、例えば、
GLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体をそのまま
で、或は、適当な形状、例えばGLPSとしてカードランを
用いる場合には特開昭52-50352号公報に記載の方法に従
ってビーズ状に加工する等したものでもよい。
の充填剤としてのGLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘
導体、或はGLPS又は／及びその誘導体を不溶性担体に固
定化したものの形状としては特に限定はなく、例えば、
GLNSPS又は／及びGLPSの水不溶性の誘導体をそのまま
で、或は、適当な形状、例えばGLPSとしてカードランを
用いる場合には特開昭52-50352号公報に記載の方法に従
ってビーズ状に加工する等したものでもよい。
本発明の調製法により得られるETに特異的な試薬を用い
たETの測定法としては、試薬として本発明の調製法によ
り得られるETに特異的な試薬を用いる以外は、AL溶液を
用いた自体公知のET測定法に準じてこれを行えばよく、
使用されるその他の試薬等も自体公知のET測定に於いて
用いられる試薬等に準じて、適宜選択して用いればよ
い。AL溶液を用いた自体公知のET測定法としては、例え
ばAL溶液と試料を混合した後、適当な温度で一定時間イ
ンキュベートし、凝固反応によるゲル生成の有無を調べ
るゲル化転倒法、凝固に伴って生ずる濁度を測定する比
濁法、凝固に伴って生ずる濁度が一定の値に達するまで
の時間を測定する比濁時間分析法、AL溶液の成分ETとの
反応に伴って活性化されるプロテアーゼの活性を合成基
質を用いて測定する合成基質法等が挙げられるが、本発
明の方法により得られるETに特異的な試薬の適用範囲は
これらに限定されるものではなく、AL溶液とETの反応を
利用した測定方法であれば、何れにも適用可能である。
たETの測定法としては、試薬として本発明の調製法によ
り得られるETに特異的な試薬を用いる以外は、AL溶液を
用いた自体公知のET測定法に準じてこれを行えばよく、
使用されるその他の試薬等も自体公知のET測定に於いて
用いられる試薬等に準じて、適宜選択して用いればよ
い。AL溶液を用いた自体公知のET測定法としては、例え
ばAL溶液と試料を混合した後、適当な温度で一定時間イ
ンキュベートし、凝固反応によるゲル生成の有無を調べ
るゲル化転倒法、凝固に伴って生ずる濁度を測定する比
濁法、凝固に伴って生ずる濁度が一定の値に達するまで
の時間を測定する比濁時間分析法、AL溶液の成分ETとの
反応に伴って活性化されるプロテアーゼの活性を合成基
質を用いて測定する合成基質法等が挙げられるが、本発
明の方法により得られるETに特異的な試薬の適用範囲は
これらに限定されるものではなく、AL溶液とETの反応を
利用した測定方法であれば、何れにも適用可能である。
また、本発明の方法により得られた、ETに特異的な試薬
は凍結保管により、或は凍結乾燥により安定に保存でき
るので、大量に調製した場合にはこれらの方法により保
存しておけばよい。
は凍結保管により、或は凍結乾燥により安定に保存でき
るので、大量に調製した場合にはこれらの方法により保
存しておけばよい。
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。
（実施例） 実施例1.カードランを用いた試薬の調製 カードラン（和光純薬工業（株）製）1gに注射用蒸留水
100mlを加え、乾熱滅菌したガラスフィルターで濾過し
た。この操作を、５回繰り返し、得られたカードラン約
10mgを注射用蒸留水約10mlに懸濁させた。これをポアサ
イズ0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した。リム
ルス属のカブトガニ由来のAL溶液の凍結乾燥品（以下、
LALと略記する。和光純薬工業（株）販売、ゲル化感度:
0.5EU/ml、5ml用。）を注射用蒸留水5mlで溶解して得た
LAL溶液を、このカードランが表面に付着したフィルタ
ーを用いて濾過し、目的とするETに特異的な試薬（以
下、CT-LAL溶液と略記する。）を得た。
100mlを加え、乾熱滅菌したガラスフィルターで濾過し
た。この操作を、５回繰り返し、得られたカードラン約
10mgを注射用蒸留水約10mlに懸濁させた。これをポアサ
イズ0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した。リム
ルス属のカブトガニ由来のAL溶液の凍結乾燥品（以下、
LALと略記する。和光純薬工業（株）販売、ゲル化感度:
0.5EU/ml、5ml用。）を注射用蒸留水5mlで溶解して得た
LAL溶液を、このカードランが表面に付着したフィルタ
ーを用いて濾過し、目的とするETに特異的な試薬（以
下、CT-LAL溶液と略記する。）を得た。
実施例2.サイモサンを用いた試薬の調製 ザイモサン（シグマ社製）1gに注射用蒸留水100mlを加
え、乾熱滅菌したガラスフィルターで濾過した。この操
作を、10回繰り返し、得られたザイモサン約10mgを、LA
L（和光純薬工業（株）販売、ゲル化感度:0.5EU/ml、5m
l用。）を注射用蒸留水5mlで溶解して得たLAL溶液に懸
濁させた。これをボアサイズ0.45μｍのメンブランフィ
ルターで濾過し、目的とするETに特異的な試薬（以下、
ZT-LAL溶液と略記する。）を得た。
え、乾熱滅菌したガラスフィルターで濾過した。この操
作を、10回繰り返し、得られたザイモサン約10mgを、LA
L（和光純薬工業（株）販売、ゲル化感度:0.5EU/ml、5m
l用。）を注射用蒸留水5mlで溶解して得たLAL溶液に懸
濁させた。これをボアサイズ0.45μｍのメンブランフィ
ルターで濾過し、目的とするETに特異的な試薬（以下、
ZT-LAL溶液と略記する。）を得た。
参考例1. （試料） 以下に示すカードラン溶液及びET溶液を試料とした。
・カードラン溶液 ETを含まないカードラン（和光順薬工業（株）製）をET
を含まない50mM水酸化ナトリウムに5mg/mlとなるように
溶解した後、注射用蒸留水で適宜希釈したしたものを使
用した。
を含まない50mM水酸化ナトリウムに5mg/mlとなるように
溶解した後、注射用蒸留水で適宜希釈したしたものを使
用した。
・ET溶液 大腸菌レファレンスエンドトキシン（和光純薬工業
（株）製、E.coli UKT−Ｂ株由来のリポ多糖、１バイア
ル当たりFDAレファレンスエンドトキシンEC−２として5
00ng相当量を含有、5ml用）を注射用蒸留水5mlで溶解し
た後、注射用蒸留水で適宜希釈したものを使用した。
（株）製、E.coli UKT−Ｂ株由来のリポ多糖、１バイア
ル当たりFDAレファレンスエンドトキシンEC−２として5
00ng相当量を含有、5ml用）を注射用蒸留水5mlで溶解し
た後、注射用蒸留水で適宜希釈したものを使用した。
（測定操作法） 実施例１で調製したCT-LAL溶液0.1mlに0.1mlの試料を加
え、良く混合した後、37℃で、トキシノメーターET-201
（和光純薬工業（株）製）を用いて、試料の透過光量が
５％減少するまでの時間（以下、Tgと略称する。）を測
定した。
え、良く混合した後、37℃で、トキシノメーターET-201
（和光純薬工業（株）製）を用いて、試料の透過光量が
５％減少するまでの時間（以下、Tgと略称する。）を測
定した。
（結果） 横軸の各ET濃度の対数値に対応するTgの対数値を縦軸に
沿ってブロットした点を結んで得られた検量線を第１図
に−○−で示す。尚、カードラン溶液を試料として用い
た場合には、いずれのカードラン濃度でも、80分以内に
試料の透過光量が５％の減少を示さなかった。
沿ってブロットした点を結んで得られた検量線を第１図
に−○−で示す。尚、カードラン溶液を試料として用い
た場合には、いずれのカードラン濃度でも、80分以内に
試料の透過光量が５％の減少を示さなかった。
比較例1. 参考例１に於いて使用したCT-LAL溶液の代りに、実施例
１で使用したのと同ロットのLAL溶液（以下、未処理LAL
溶液と略称する。）を用いた以外は、参考例１と同じ試
料を用い、同様の測定操作法により測定を行った。
１で使用したのと同ロットのLAL溶液（以下、未処理LAL
溶液と略称する。）を用いた以外は、参考例１と同じ試
料を用い、同様の測定操作法により測定を行った。
（結果） 横軸の各ET濃度の対数値に対応するTgの対数値を縦軸に
沿ってブロットした点を結んで得られた検量線を第１図
に−●−で示す。また、横軸の各カードラン濃度の対数
値に対応するTgの対数値を縦軸にブロットした点を結ん
で得られた検量線を、第２図に−●−で示す。
沿ってブロットした点を結んで得られた検量線を第１図
に−●−で示す。また、横軸の各カードラン濃度の対数
値に対応するTgの対数値を縦軸にブロットした点を結ん
で得られた検量線を、第２図に−●−で示す。
第１図より明らかな如く、ET溶液を試料とした場合に
は、CT-LAL溶液及び未処理LAL溶液の何れを試薬として
用いた場合でも、良好な直線性を示す検量線が得られ
た。
は、CT-LAL溶液及び未処理LAL溶液の何れを試薬として
用いた場合でも、良好な直線性を示す検量線が得られ
た。
また、第２図より明らかな如く、未処理LAL溶液はカー
ドラン溶液とも反応して、良好な直線性を示す検量線が
得られることが判る。
ドラン溶液とも反応して、良好な直線性を示す検量線が
得られることが判る。
以上の結果から明らかな如く、本発明の方法によってAL
溶液を処理することにより、ETに特異的な試料が得られ
ることが判る。
溶液を処理することにより、ETに特異的な試料が得られ
ることが判る。
参考例2. 参考例１で調製したエンドトキシン1.5EU/mlを含む試料
（試料−１）、及びカードラン20ng/mlを含む試料とエ
ンドトキシン3.0EU/mlを含む試料とを等量混合したもの
（試料−２）を試料として参考例１と同様の測定操作法
によりを測定した結果を表１に示す。
（試料−１）、及びカードラン20ng/mlを含む試料とエ
ンドトキシン3.0EU/mlを含む試料とを等量混合したもの
（試料−２）を試料として参考例１と同様の測定操作法
によりを測定した結果を表１に示す。
比較例2. 参考例２に於いて使用したCT-LAL溶液の代りに、実施例
１で使用したのと同ロットの未処理LAL溶液を用いた以
外は、参考例２と同じ試料を用い、同様の測定操作法に
より測定を行った結果を表１に併せて示す。
１で使用したのと同ロットの未処理LAL溶液を用いた以
外は、参考例２と同じ試料を用い、同様の測定操作法に
より測定を行った結果を表１に併せて示す。
表１の結果から明らかな如く、試薬としてCT-LALを用い
た場合には、ET溶液に更にカードランを添加した場合で
も、TgはET溶液により得られるそれと同等の値が得られ
る、即ちCT-LALはカードランとは反応しないことが判
る。また、試薬として未処理LAL溶液を用いて測定を行
った場合には、ET溶液に更にカードランを添加すること
により、Tgが非常に短縮される、即ち未処理LAL溶液が
カードランとも反応することが判る。
た場合には、ET溶液に更にカードランを添加した場合で
も、TgはET溶液により得られるそれと同等の値が得られ
る、即ちCT-LALはカードランとは反応しないことが判
る。また、試薬として未処理LAL溶液を用いて測定を行
った場合には、ET溶液に更にカードランを添加すること
により、Tgが非常に短縮される、即ち未処理LAL溶液が
カードランとも反応することが判る。
参考例3. （試料） 参考例１と同じ。
（測定試薬） 実施例２で得られたZT-LAL溶液1mlに、0.45M N,N−ビス
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸（N,N−Bis（２−hydroxyethyl）−２−aminoethanes
ulfonic acid）緩衝液（pH7.5）1ml及び基質溶液［1.02
mM Boc-Val-Leu-Cly-Arg-［（４−Ｎ−ethyl−Ｎ−２−
hydroxyethyl）aminoaniline］（和光純薬工業（株）
製）、2.25mMジエチルアニリン及び0.12M塩化マグネッ
ト含有］1mlを加えて測定試薬とした。
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸（N,N−Bis（２−hydroxyethyl）−２−aminoethanes
ulfonic acid）緩衝液（pH7.5）1ml及び基質溶液［1.02
mM Boc-Val-Leu-Cly-Arg-［（４−Ｎ−ethyl−Ｎ−２−
hydroxyethyl）aminoaniline］（和光純薬工業（株）
製）、2.25mMジエチルアニリン及び0.12M塩化マグネッ
ト含有］1mlを加えて測定試薬とした。
（測定操作法） 測定試薬0.2mlに試料0.1mlを加え、良く混合し、37℃で
30分間反応させた後、0.17％のメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ムと0.25％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を含む反
応停止液1mlを加えて反応を停止し、反応液の730nmにお
ける吸光度を測定した。
30分間反応させた後、0.17％のメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ムと0.25％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を含む反
応停止液1mlを加えて反応を停止し、反応液の730nmにお
ける吸光度を測定した。
（結果） 横軸の各ET濃度に対して得られた吸光度を縦軸に沿って
ブロットした点を結ぶことにより得られた検量線を第３
図に示す。また、横軸の各カードラン濃度に対して得ら
れた吸光度を縦軸に沿ってブロットした点を結ぶことに
より得られた検量線を、第４図に示す。
ブロットした点を結ぶことにより得られた検量線を第３
図に示す。また、横軸の各カードラン濃度に対して得ら
れた吸光度を縦軸に沿ってブロットした点を結ぶことに
より得られた検量線を、第４図に示す。
第３図及び第４図より明らかな如く、本発明の方法によ
り得られたZT-LALは、ETとは反応して良好な直線性を有
する検量関係を示したが、カードランではいずれの濃度
でも反応しなかった。
り得られたZT-LALは、ETとは反応して良好な直線性を有
する検量関係を示したが、カードランではいずれの濃度
でも反応しなかった。
また、カードラン20ng/mlを含む試料とET1.0EU/mlを含
む試料を等量混合したものを試料として測定を行ったと
ころ、反応液の730nmにおける吸光度は0.458となり、ET
0.5EU/mlのみを含む試料を測定した場合の吸光度（0.45
0）とほぼ同じ値となった。
む試料を等量混合したものを試料として測定を行ったと
ころ、反応液の730nmにおける吸光度は0.458となり、ET
0.5EU/mlのみを含む試料を測定した場合の吸光度（0.45
0）とほぼ同じ値となった。
これらの結果から明らかな如く、ZT-LALは、カードラン
には反応せず、ETによってのみ活性化がおこることが判
る。
には反応せず、ETによってのみ活性化がおこることが判
る。
（発明の効果） 以上述べた如く、本発明は、AL溶液を原料とした、ETに
特異的な測定試薬を、簡便で且つ効率良く、しかもAL溶
液中の成分の分画、再構成等の特殊な操作を行うことな
く調製し得る方法を提供するものであり、斯業に貢献す
るところ大なる発明である。
特異的な測定試薬を、簡便で且つ効率良く、しかもAL溶
液中の成分の分画、再構成等の特殊な操作を行うことな
く調製し得る方法を提供するものであり、斯業に貢献す
るところ大なる発明である。
第１図は、参考例１及び比較例１に於いて得られたエン
ドトキシン（以下、ETと略記する。）の検量線を示し、
横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られた透過光量が
５％減少するまでの時間（分）（以下、Tgと略記す
る。）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。図中、−○−は参考例１により得られた結果を、−
●−は比較例１により得られた結果を夫々示す。 第２図は、比較例１に於いて得られたカードランの検量
線を示し、横軸の各カードラン濃度（ng/ml）に対して
得られたTgを縦軸に沿ってプロットした点を結んだもの
である。 第３図は、参考例３に於いて得られたETの検量線を示
し、横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られた730nmの
吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 第４図は、参考例３に於いて得られたカードランの検量
線を示し、横軸の各カードラン濃度（ng/ml）に対して
得られた730nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。
ドトキシン（以下、ETと略記する。）の検量線を示し、
横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られた透過光量が
５％減少するまでの時間（分）（以下、Tgと略記す
る。）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。図中、−○−は参考例１により得られた結果を、−
●−は比較例１により得られた結果を夫々示す。 第２図は、比較例１に於いて得られたカードランの検量
線を示し、横軸の各カードラン濃度（ng/ml）に対して
得られたTgを縦軸に沿ってプロットした点を結んだもの
である。 第３図は、参考例３に於いて得られたETの検量線を示
し、横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られた730nmの
吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 第４図は、参考例３に於いて得られたカードランの検量
線を示し、横軸の各カードラン濃度（ng/ml）に対して
得られた730nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。
Claims (1)
- 【請求項１】カブトガニ血球成分抽出液と、これに対し
て0.1W/V％以上の濃度となる量のβ−1,3−グルカン又
は／及びその誘導体を含む、 β−1,3−グルカンを構成成分とする水不溶性の多
糖類又は／及びβ−1,3−グルカンを構成成分とする多
糖類の水不溶性の誘導体 或は β−1,3−グルカンを構成成分とする多糖類又は／
及びその誘導体を不溶性担体上に固定化したもの とを接触させた後、該カブトガニ血球成分抽出液から上
記或はを除去することを特徴とするエンドキシンに
特異的な試薬の調製方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63062142A JPH0711523B2 (ja) | 1988-03-16 | 1988-03-16 | 試薬の調製方法 |
| CA000593569A CA1334276C (en) | 1988-03-16 | 1989-03-14 | Process for preparing reagent for measuring endotoxin |
| US07/323,719 US5047353A (en) | 1988-03-16 | 1989-03-15 | Process for preparing reagent for measuring endotoxin |
| EP89104708A EP0333187B1 (en) | 1988-03-16 | 1989-03-16 | Process for preparing reagent for measuring endotoxin |
| AT89104708T ATE95612T1 (de) | 1988-03-16 | 1989-03-16 | Herstellungsverfahren eines reagenz zur messung von endotoxinen. |
| DE89104708T DE68909643T2 (de) | 1988-03-16 | 1989-03-16 | Herstellungsverfahren eines Reagenz zur Messung von Endotoxinen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63062142A JPH0711523B2 (ja) | 1988-03-16 | 1988-03-16 | 試薬の調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01235852A JPH01235852A (ja) | 1989-09-20 |
| JPH0711523B2 true JPH0711523B2 (ja) | 1995-02-08 |
Family
ID=13191550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63062142A Expired - Fee Related JPH0711523B2 (ja) | 1988-03-16 | 1988-03-16 | 試薬の調製方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5047353A (ja) |
| EP (1) | EP0333187B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0711523B2 (ja) |
| AT (1) | ATE95612T1 (ja) |
| CA (1) | CA1334276C (ja) |
| DE (1) | DE68909643T2 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0715474B2 (ja) * | 1988-02-27 | 1995-02-22 | 和光純薬工業株式会社 | エンドトキシンの測定法 |
| KR0141685B1 (ko) * | 1988-09-01 | 1998-07-01 | 야마따니 와따루 | 참게 아메보사이트 라이세이트 g 인자 활성화 저해제 |
| CA1328074C (en) * | 1988-09-01 | 1994-03-29 | Shigenori Tanaka | Horseshoe crab amebocyte lysate factor g inhibitor |
| DE69129365T2 (de) * | 1990-08-22 | 1998-10-08 | Seikagaku Kogyo K K Seikagaku | Testagens für endotoxin |
| JP2944721B2 (ja) * | 1990-08-22 | 1999-09-06 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの測定剤 |
| JP3122454B2 (ja) * | 1990-09-27 | 2001-01-09 | 生化学工業株式会社 | カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法 |
| US5681710A (en) * | 1991-03-14 | 1997-10-28 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Reagent for determining (1→3)-β-D-glucan |
| JP3322700B2 (ja) * | 1992-09-14 | 2002-09-09 | 生化学工業株式会社 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
| CA2112776C (en) * | 1993-01-21 | 2002-11-12 | Masakazu Tsuchiya | Process for inhibiting activity of endotoxin |
| JP3242733B2 (ja) * | 1993-02-26 | 2001-12-25 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシン特異的測定剤 |
| US5795962A (en) * | 1993-06-29 | 1998-08-18 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Horseshoe crab amebocyte lysate factor G subunit A |
| JP3429036B2 (ja) * | 1993-09-30 | 2003-07-22 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの特異的測定剤 |
| EP0924220A3 (en) * | 1997-12-16 | 2000-04-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Inhibitor of the activation of beta-glucan recognition protein |
| US7264038B2 (en) * | 2005-07-12 | 2007-09-04 | Alcoa Inc. | Method of unidirectional solidification of castings and associated apparatus |
| CU24073B1 (es) | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem | COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4038029A (en) * | 1976-01-20 | 1977-07-26 | Worthington Biochemical Corporation | Limulus lysate turbidity test for pyrogens |
| FR2497798A1 (fr) * | 1981-01-09 | 1982-07-16 | Pharmindustrie | Nouveaux peptides portant un fluorophore, procede pour leur preparation et leur application au dosage fluorimetrique des endotoxines |
| JPS5813516A (ja) * | 1981-07-16 | 1983-01-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | エンドトキシン特異性のカブトガニ・アメボサイト・ライゼート及びその製造方法 |
| SE431228B (sv) * | 1981-12-17 | 1984-01-23 | Kenneth Soderhell | Sett att bestemma bakteriella endotoxin medelst profenoloxidashaltigt blodkroppslysat fran kreftdjur eller insekter och reagens herfor |
| JPS5927828A (ja) * | 1982-08-05 | 1984-02-14 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | アメボサイト・ライゼートの調製方法 |
| US4606824A (en) * | 1984-10-26 | 1986-08-19 | Chaokang Chu | Modified cellulose separation matrix |
-
1988
- 1988-03-16 JP JP63062142A patent/JPH0711523B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-03-14 CA CA000593569A patent/CA1334276C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-15 US US07/323,719 patent/US5047353A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-16 DE DE89104708T patent/DE68909643T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-16 AT AT89104708T patent/ATE95612T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-16 EP EP89104708A patent/EP0333187B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5047353A (en) | 1991-09-10 |
| DE68909643T2 (de) | 1994-04-28 |
| EP0333187A1 (en) | 1989-09-20 |
| ATE95612T1 (de) | 1993-10-15 |
| EP0333187B1 (en) | 1993-10-06 |
| DE68909643D1 (de) | 1993-11-11 |
| CA1334276C (en) | 1995-02-07 |
| JPH01235852A (ja) | 1989-09-20 |
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