KR0141685B1

KR0141685B1 - 참게 아메보사이트 라이세이트 g 인자 활성화 저해제

Info

Publication number: KR0141685B1
Application number: KR1019900700914A
Authority: KR
Inventors: 시게노리 다나까; 준 아께따가와; 마꼬또 오오끼; 쇼오지 다까하시; 히로시 다무라; 유우꼬 시바따
Original assignee: 야마따니 와따루; 세이가가꾸고오교가부시끼가이샤
Priority date: 1988-09-01
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1998-07-01
Also published as: US5641643A; US5474984A; KR900702372A

Abstract

내용없음

Description

참게 아메보사이트 라이세이트 G 인자 활성화 저해제

[기술분야]

본 발명은 어떤 효소 전구체의 활성하를 저해하는 약제에 관한 것이고, 보다 상세하게는 참게 아메보사이트 라이세이트의 응고계에 관여하는 인자중 (1→3)-β-D-글루칸의 반응에 의해 응고가 시작되는 계의 (1→3)-β-D-글루칸 감수성 인자인 G 인자의 활성화 저해물질 또는 G 인자 활성화 저해제에 관한 것이다.

[배경기술]

1964년 레빈과 방은 참게 아메보사이트 라이세이트(horseshoe crab (limulus)amebocyte lysate ; 이하 LAN로 약칭)가 그람-음성 세균 내독소에 의해 즉시 응고(겔화)되는 현상을 발견했다. [J. Levin and F. B. Bang : Bull. Johns Hopkins Hospital, 115, 265~274(1964)]. 그 후 LAN은 내독소의 특이적 검출법에서 소위 리물루스테스트 시약으로 널리 사용되어 왔다.

참게의 현존종은 3 속 4종 리물루스 폴리페무스(Limulus poly-phemus), 마키플레우스 트리덴타투스(Tachypleus tridentatus), 타키플레우스 기가스(Tachypleus qiqas) 및 카르시노스코트피우스 로툰디카우다(Carcinoscorpius rotundicauda)가 공지되어 있다. 리물루스테스트 시약은 미국산 엘, 폴리페무스 및 일본 및 중국산 티. 트리덴타투스의 아메보사이트 라이세이트를 함유하는 것이 시판되었다. [예컨대, Progress in Clinical and Biological Research : volume 93 ; Endotoxins and their Detection with the Limulus Amebocyte Lysate Teat , edited by Stanly W. Watson, Jack Levin and Thomas J. Novitsky, published in 1982 by Alan R. Liss Inc., pages7~24, entiled : The Limulus Test and Bacterial Endotoxins : Some Perspectives by J. Levin 참조].

LAN 은 처음에는 내독소와만 특이적으로 반응한다고 생각되었다. 그러나, 최근 연구에서 LAN은 내독소뿐 아니라 (1→3)-β-D-글루칸과도 반응한다는 것이 판명되었다. LAN의 응고계는 포유동물의 혈색응고개처럼 둘 이상의 응고 인자의 단계적 반응으로 구성되고, 내독소-중재경로(C 인자 경로)뿐 아니라 (1→3)-β-D-글루칸 경로(G 인자 경로)를 포함한다. [T. Morita etal., FESS LETTERS, 129, 318~321(1981), 및 S.Iwanagaet al., J Protein Chem., 5,255~268(1986)]

따라서, 리물루스테스트를 가능한한 내독소-특이성으로 만들기위한 연구가 수행되었다. 예컨대[T. Obayashi et al., Clin Chim. Acta, 149, 55~65(1985)]에서는 응고인자의 분리 및 재구성에 의해 LAN로부터 G 인자를 제거하여 수득한 시약을 사용함으로써 내독소를 측정하는 방법이 제안되었다. 이 방법에 의한 내독소 특이적 분석 키트가 세이까가꾸고오교가부시끼가이샤에 의해 엔도 스페시라는 상품명으로 판매된다.

상기 분석법은 내독소-특이적 분석법으로서 아주 강력히 요망된다. 그러나 이 방법은 하기 결점을 갖는다.

(1) 복수 응고계 인자로 구성되는 참게 아메보사이트 라이세이트로부터 G 인자를 분리 제거하기 위해서는 내독소 또는 (1→3)-β-D-글루칸의 부재하에 각 인자의 분리조작을 수행하는 것이 필수적이다. 따라서 내독소 또는 (1→3)-β-D-글루칸은 분별용 분리조작시 사용되는 기구, 장치 및 약품에서 미리 완전제거되어야만 한다.

(2)분리 조작이 진행됨에 따라 아메보사이트 라이세이트가 희식되므로 가끔 농축되어야만 한다.

(3)분리 조작할 때 마다 인자의 활성이 감소되고 분획이 손실된다.

(4) G 인자와 함께 코아글로겐 (응고성 단백질 전구체)이 분리 제거된다.

상기 결점에 때문에, 상기 분석법은 색소 생성법에만 적용되고, 겔화법, 혼탄도측정법 및 혼탁로측정 시간 분석법 같은 겔화현상을 이용하는 방법에는 적용될 수 없다. 본 발명자들은 LAN 응고 기작에서 (1→3)-β-D-글루칸에 의해 시작되는 경로(G 인자)를 연구하는 과정중에, 지금까지 G 인자의 활성화에만 관여한다고 생각된 (1→3)-β-D-글루칸류 중에서 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위가 특정개수로 연속결합되어 구성된 구조 부분을 함유한 것이 전혀 반대로 G 인자의 저해작용을 나타내는 것을 발견했다.

이 발견에 의거하여 본 발명이 완성되었다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 서로 연속 결합되는 하기식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위(분자량 162) 2~370개로 구성된 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 적어도 하나 함요하는 폴리글리코시드를 활성 성분으로 함유하는 참게 아메보사이트 라이세이트 G 인자 활성화 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 유효량의 폴리글리코시드를 리물루스 아메보사이트 라이세이트에 가함을 특징으로 하는, LAN 속에 존재하는 G 인자의 활성화를 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명을 이하에 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 저해제에서 활성 성분으로 사용되는 폴리글리코시드는 서로 연속 결합되는 하기식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위 2~370개, 바람직하게는 3~310개, 보다 바람직하게는 4~180개로 구성되는 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조부분(이하, 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분으로 약칭)을 분자당 적어도 하나 함유한다.

본 발명에 사용되는 폴리글리코시드가 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 적어도 하나 함유하는 한 폴리글리코시드 분자의 나머지 부분의 구조는 특별히 한정되지 않고 광범위하게 선택될 수 있다.

그러나, 다른 구조 부분은 내독소 및 C 인자 활성화계와 실질상 반응하지 않아야 한다는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명에 사용되는 폴리글리코시드는 실질상 하나의 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분, 예컨대 하기식(I-1)로 표시되는 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드로 구성된다.

[상기 식중,

n 은 2~370, 바람직하게는 3~310, 보다 바람직하게는 4~180의 정수이다. ]

또는,적어도 하나의 하기식(II)로 표시되는 (1→4)-β-D-글루코시트 구조단위 및/ 또는 적어도 하나의 하기식(III)로 요 표시되는 (1→6)-β-D-글루코시트 구조단위 및/ 또는 적어도 하나의 하기식(IV), (V) 또는 (VI)의 변형 β-D-글루코시트 구조로 구성되는 당 사슬의 결합으로 생성되는 구조일 수 있다.

[상기 식중,

R₁, R₂및 R₃의 적어도 하나는 메틸기, 히드록시메틸기, 카르복시메틸기, 아세틸기, 황산기 또는 인산기 같은 화학적으로 도입할 수 있는 작용기, 또는 그의 금속염, 암모늄염 또는 유기아민염을 나타내고 나머지는 수소원자를 나타낸다. ]

상기 당 사슬은 폴리-(1→3)글루코시드 구조 부분에 대해 가지 사슬로서 결합될 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 폴리글리코시드는 둘 또는 그 이상의 폴리-(1→3)글루코시드 구조 부분이, 하기식에 표시된 것처럼 폴리-(1→3)글루코시드 구조 부분들 사이에 있는 다른 당 사슬 구조부분와 결합되는 것일 수 있다.

A₁- B₁- A₂- B₂··········

[상기 식중,

A₁- A₂···은 각각 서로 연속 결합되는 식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조단위 2~370, 바람직하게는 3~310, 보다 바람직하게는 4~180개로 구성되는 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 나타내고, 구조부분 A₁- A₂···에서 식(I)의 단위수는 상이할 수 있으며 ;

B₁- B₂···은 각각 동일하거나 상이한 다른 당 사슬 구조부분을 나타낸다. ]

B₁- B₂···에 의해 나타나는 다른 당 사슬 구조 부분은 예컨대 식(II), (III), (IV), (V) 또는 (VI)의 구조 단위 하나 또는 둘 또는 그 이상으로 구성되는 구조 부분일 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 폴리글리코시드는 상기 폴리-(1→3)글루코시드 구조 부분이 각각 서로 연속 결합되는 식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위 371개 이상으로 구성되는, 식 B₁- B₂···의 다른 당 사슬 구조가 사슬을 중단시키는 긴사슬 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분으로 구성된 구조일 수 있다.

따라서, 본 발명에 사용되는 폴리글리코시드는 (1→3)글루코시드 구조 부분을 분자당 적어도 하나 함유하는 한 그 분자량은 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 통상적인 분자량은 500,000 이하, 바람직하게는 500~240,000, 보다 바람직하게는 650~80,000이다. 분자량이 상기 범위를 벗어날 경우는 물에 대한 용해도가 저하되고 용액의 점도가 증가하여 취급상 곤란하게 되거나, 일정 품질의 내독소 분석 키트 제조시 불리한 점이 발생한다.

본 발명에 사용되는 바람직한 폴리글리코시드는 실질상 분자당 하나의 이사용의 폴리-(1→3)글루코시드 구조 부분으로 구성된다. 그러나, 서로 연속 결합되는 식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위 371개 이상으로 구성된 고분자량 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 함유하는 폴리글리코시드를 포함할수도 있다. 왜냐하면, 본 발명에 의한 폴리글리코시드 G 인자 활성물질인 고분자량 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 보다 더 빠르고 강하게 LAN 의 G 인자 활성화 경로의 개시 인자이는 G 인자에 결합하여 G 인자를 활성화 시키는 것을 저해하고, 그 저해작용은 고분자량 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드의 존재에 의해 실질상 영향을 받지 않기 때문이다.

다른 성분을 포함하는 폴리글리코시드를 저해제로 사용시,로 저해제중의 폴리글리코시드 양은 특별히 한정되지 않는다. 그러나 그 양이 너무 작으면, G 인자를 저해하는데 다량의 저해제중의 폴리글리코시드 양은 5 중량% 이상, 바람직하게는 10 중량% 이상, 보다 바람직하게는 20중량% 이상이 바람직하다.

본 발명의 폴리글리코시드의 분자량은 분자량을 알고있는 표준물질을 사용하여 하기 조건하에 겔 침투 크로마토그래피로 수행하고, 표준 곡선을 작성한 후 시험 시료에 대하여 동일한 조건하에 겔 침투 크로마토그래피를 수행하고, 결과를 표준 곡선 비교함으로서 측정된다.

겔 침투 크로마토그래피에 사용되는 조건

컬럼 : TSK 겔 G-PWXL 시리즈(토소(주))

7.8 × 300mm, 여러 유형의 여러 컬럼.

이동상 : 0.3M NaOH

유속 : 0.5ml / 분

시료농도 : 0.1 ~ 5mg/ml

시료 주입량 : 0.1 ml

컬럼 온도 : 실온

검출법 : 감별굴절제 (LKB 사)에 의한 측정, 또는 페놀-황산법에 의한 당 분석

표준물질 : TSK 표준 산화폴리에틸렌(토소(주)) 및 폴리에틸렌글리콜 (나까라이 화학(주)), 중량 평균 분자량범위 1,000~860,000 의 10종

본 발명에서 G 인자 활성화 저해제로 사용되는 상기 특성을 갖는 폴리글리코시드는 천연유래 또는 합성산물, 또는 식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위를 3개 이상 함유하는 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드의 일부를 화학적으로 변형한 생성물일 수 있다. 통상적으로는 천연 유래 폴리글리코시드가 용이하게 수득된다.

폴리글리코시드의 구체적인 예를 하기에 나타낸다.

(1) 실질상 식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위만으로 구성되는 직쇄 폴리글리코시드, 예컨대 알칼리게네스(Alcaligenes) 속 세균 유래의 (1→3)-β-D-글루칸 ; 유글레나(Euglena) 편모층 유래의 피라밀론 ; 고등식물의 섬유조직 유래의 β-글루칸 또는 체관에서 추출되는 칼로스 ; 라미나리아(Laminaria) 또는 에이세니아(Eisenia)속 갈조류 유래의 라미나란류의 부분 가수분해물에 함유된 고 중합도의 (1→3)-β-결합으로 구성된 D-글루코스 중합체, 또는 (1→3)-β-D-글루칸류 ; 10~20의 중합도를 갖는 라미나리덱스트린류 ; 및 10 미만의 중합도를 갖는 라미나리올리고당.

(2) 식 (I)의 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위 및 식 (III)B (1→6)-β-D-글루코시드 구조 단위를 함유하는 폴리글리코시드, 예를 하기에 나타낸다.

(a) (1→3)-β- 결합으로 구성된 주쇄를 1~수개의 (1→6)-β-결합과 열결시켜 수득한 글루코스 중합체 또는 글루코스가 섞인 폴리글리코시드, 예컨대 에이세니아 속 갈조류 유래의 라미나란류.

(b) (a)에서 (1→3)-β-결합으로 연결된 글루코스중합체 또는 글루코스에 (1→3)-β-결합의 당 사슬이 (1→3)-β-결합으로 붙고, 또 당 사슬의 일부에 따른 당 부분을 포함할 수 있는 폴리글리코시드, 예컨대 라미나리아 속 갈조류 유래의 라이나란류, 오크로모나스(Ochromonas), 파에오닥틸륨(Phaeodactylum), 스켈레토네마(Skeletonema), 비둘피아(Biddulphia), 코스시노디에스쿠스(Coscinodiescus) 및 카에토세로스(Chaetoceros) 같은 이원자 유래의 크리솔라미나란류, 및 포리아(Poria)유래의 파키만.

(c) 더 많은 가지를 갖는 수지상의 폴리글리코시드, 예컨대 피토프토다(Phytophthora)의 세포벽 유래의 글루칸.

(d) (1→3)-β-결합으로 구성된 직쇄글루칸에 글루코스가(1→6)-β-결합에 의해 연결되는 폴리글리코시드, 예컨대 주쇄의 글루코스 3 잔기당 글루코스 1가지를 갖는 스쿨레로티니아(Sclerotinia) 유래의 수클레로탄, 스키조필름(Schizophyllum)유래의 스쿨레로탄, 스키조필룸(Sclerotium), 코르티시움(Corticim) 및 스트로마티니아(Stromatinia)유래의 스클래로루칸류 ; 및 (1→3)-β-결합으로 구성된 직쇄글로칸에 글루코스가 (1→6)-β-결합으로, 직쇄글루칸의 글루코스 5 단위당 글루코스 2 잔기의 비율로 폴리글리코시드 , 예컨대 렌티누스(Lentinus)의 레티난.

(e) 주쇄의 글루코스 잔기의 C-3 위치에 복수의 (1→3)-β-글루코스 사슬의 가지를 갖는 (1→6)-β-결합으로 구성된 직쇄 글루칸, 예컨래 사카로미세스(Saccharomyces) (빵 효모) 의 세포벽의 유래의 β-글루칸.

(3) 식(I) 의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위 및 식(II)의 (1→4)-β-D-글루코시드 구조 단위를 함유하는 폴리글리코시드, 예컨대 세트라리아(Cetraria), 우스네아(Usnes) 및 에버니아(Evernia)유래의 리케난류, 및 보리 알부민에 함유되며 (1→3)-β-결합에 의해 연결된 (1→4)-β-올리고 글루코스드 부분으로 구성된 폴리글리코시로 이루어진 것.

상기의 몇몇 폴리글리코시드는 시판되어 본 발명의 저해제로 직접 이용할 수 있다. 필요에 따라 당 사슬은 부분적으로 분해되고 및 /또는 분리처리되며, 식 (I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조단위를 특정량 함유하는 폴리글리코시드가 풍부한 분획을 제조한다. 이 분획은 본 발명의 저해제로 이용될 수 있다.

당 사슬의 부분적 분해 및 분리처리는 공지 방법으로 수행될 수 있다. 예컨대, 당 사슬의 부분 분해는 산 또는 알칼리 또는 β-글루카나제에 의한 가수분해, 아세토라이시스 또는 음파처리에 의해 수행될 수 있다. 분자량에 기초한 분획은 알코올, 아세톤 또는 에테르 같은 유기용매 또는 염류에 의한 분별침전별 또는 분자사제 또는 분자사막에 의한 분획법으로 수행될 수 있다.

상기 (1)~(3)에서 예시된 폴리글리코시드의 당 사슬 부분은 메틸기 같은 알킬기, 히드록시메틸기 같은 히드록시알킬기, 카르복시메틸기 같은 카르복시알킬기, 아세킬기, 황산기, 인산기 같은 산기 또는 기타 작용기에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 이런 작용기는 그 자체로 공지된 방법으로 도입할 수 있다. 예컨대[(1)Seikagaku Kenkyuhou I, Methods of Studying Biochemistry I, 283~303(1967) Ando, Terayama, Nishizawa and Yamakawa, Asakura Shoten, (2) Whistler,R, L., Methods in Carbohydrate Chemistry III, 193~267,271~331(1964), Academic Press, New York and London 참조]. G 인자 활성화 작용을 갖는 약 60,000이 상의 분자량의 (1→3)-β-D-글루칸의 부분 화학적 변형에 의해, 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분에서 서로 연속 결합된 식(I)의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위의 수는 370이하로 조정된다. 이 화학적 변형 글루칸은 본 발명의 저해제로 이용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 바람직한 폴리글리코시드의 구체적인 예를 하기에 나타낸다.

분자량 342~1,638 라미나리 올리고당 ;

평균 분자량 1,800~3,258의 라미나리 텍스트린 ;

평균 분자량 2,000~60,000의 (1→3)-β-D-글루칸 ;

평균 분자량 3,000~23,000의 라미나란 ;

평균 분자량 3,000~20,000의 스클레로탄 ;

평균 분자량 500,000이하의 스키조필란 ;

평균 분자량 1,100,000이하의 렌티난 ;

평균 분자량 12,000이하의 빵 효모 글루칸의 수용성 분획 ;

평균 분자량 33,000이하의 리케난 ;

평균 분자량 200,000이하의 보리 β-글루칸.

쿠르들란의 부분 카르복시메틸화등에 의해 수득되는 평균 분자량40,000~240,000의 부분 카르복시메틸화 (1→3)-β-D-글루칸 및 그의 염(치환도 : 0.003~1.0) ;

평균 분자량 23,000이하의 부분 카르복시메틸화 라미나란 및 그의 염(치환도 : 1.0이하)

평균 분자량 80,000이하의 부분 메틸화(1→3)-β-D-글루칸(치환도 : 0.03~1.0) ; 및

평균 분자량 23,000 이하의 부분 황산화 라미나란 및 그의 염 (치환도 : 1.0이하).

후술하는 실시예에 의해 나타나듯이 본 발명에 따르는 폴리글리코시드는 LAN에서 G 인자의 활성화를 강력히 저해하는 작용을 가지므로 G 인자계에 의한 역효 과없이 리물루스테스트에 의한 시료분석시 내독소를 특이적으로 검출 및 분석하는데 사용될 수 있다. G 인자 활성화 저해제로서의 폴리글리코시드는 LAN의 G 인자의 활성을 완전히 저해하는데 필요한 양 이상으로 리물루스테스트에 사용될 수 있다. 폴리글리코시드(1)검출 및 분석시, (2) 미리 LAN에, 또는 (3) LAN의 추출 및 제조시에 가할 수 있다.

LAN 중의 G 인자의 활성화를 완전히 저해하는데 필요한 저해제의 양은 하기 방법으로 결정될 수 있다. 빙냉하, 통상적인 분석 조건하에 LAN 을 활성화하는데 충분한 G 인자 활성화 물질(내독소를 함유하지 않거나 최소량의 G 인자 활성화 저해제를 함유함)을 일정량으로 일정량의 LAN에 가한다. 이 혼합물에 농도를 달리하여 저해제(내독소를 함유하지 않은것)를 가한다. 통상의 LAN을 사용되는 경우와 동일한 조건하에 반응을 수행한다.

이들 조건하에, LAN의 활성화를 완전히 저해하는 저해세 농도를 결정한다.

상기의 결정된 농도를 갖는 저해제를 일정량의 LAN에 가하고, G 인자 활성화 물질을 달리하면서 더 가하고, G 인자 활성화 물질의 어떤 농도에서도 LAN은 활성화되지 않음을 확인한다.

상기 조작에 의해, 일정량의 LAN에서 G 인자의 활성화를 완전히 저해하는데 필요한 저해제 양(농도)을 결정할 수 있다.

시판되는 라이세이크의 G 인자의 활성화를 완전히 저해하는데 필요한 G 인자 활성화 저해제 양을 표1에 나타낸다.

(주) * G 인자 활성화 저해제 ; 제조에 4-1에서 수득되는 쿠르들란 포름산-분해 생성물의 GPC 분획 4 (표 2에서 시료번호14)

상기 저해제의 필요량에서 명백히 나타나듯이, LAN로 구성된 리물루스테스트 시약에 함유되는 본 발명의 폴리글리코시드의 적절한 양은 LAN 1ml당 50ng이상, 바람직하게는 100ng이상, 보다 바람직하게는 100~230ng, 특히 바람직하게는 230~500ng이다.

본 발명의 G 인자 활성화 저해제의 제조법, 작용기작, 저해제를 함유한 리물루스테스트시약 키트를 이하에 상세히 설명한다.

[도면의 간단한 설명]

제 1 도는 시판되는 쿠르들란의 분자 사(sieve) GPC 분획 패턴을 나타내고 ;

제 2 도는 제 2 도의 분획번호 44~46의 재-크로마토그래피 분획 패턴을 나타낸다.

본 발명의 G 인자 활성화 저해제의 제조법

본 발명의 G 인자 활성화 제해제를 하기 제조예에 나타낸 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 범위 내의 시판되는 (1→3)-β-D-글루칸을 직접 사용할 수 있다.

[제조예1]

시판되는 쿠르들란으로부터 분자사 크로마토그래피의 분별에 의한 제조.

1g 의 쿠르들란 시료번호 101(와꼬퓨어 케미칼 인더스트리즈, Lot No PEQ 9080, Mn 136,000, Mw / Mn 2.76 )을 5mg/ml 의 농도로 0.3M NaOH중에 용해시킨다. 용액의 100μℓ 씩을 하기 조건하에 겔 침투 크로마토그래피 (이하 GPC로 약칭)한다.

컬럼 : TSK 겔 G6000 PW_XL및 G5000 PW_XL

(둘다 7.8 × 300mm)

이동상 : 0.3 M NaOH

유속 : 0.5 ml / 분

용출되는 저분자량 분획(번호 44~46)을 수거하여 다시 크로마토그래피해서 수평균 분자량 3,050 및 다분산도 1.29의 시료(번호 1) 0.015mg 을 수득한다. GPC 분획 패턴을 제 1 도에 나타낸다. 다시 크로마토그래피한 제 1 도의 분획 번호 44~46의 분획 패턴을 제 2 도에 나타낸다.

시료번호 1 을 β-1,3-글루카나제(Zymolyase 100T, 세이까가꾸고오교(주))로 소화시킨다. 효소 소화 생성물을 하기 조건하에 GPC로 분석한다.

컬럼 : TSK 겔 G4000 PW_XL, 및 G3000 PW_XL및 G2500 PW_XL를 직렬연결

이동상 : 증류수

유속 : 0.6 ml / 분

효소 소화 생성물의 당 조성을 결정한다 : 글루코스 40%, 라미나리비오스 30%, 라미나리트리오스 20%, 라미나리트리오스 8%, 라미나리펜타오스 2% (회수율 94% ). 이 분석은 시료번호 1의 당 구조가 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 갖는 β-폴리글리코시드임을 시사한다.

[제조예2]

물에 대한 용해로 차에 의한 쿠르들란의 분획.

50g 의 시판되는 쿠르들란 (시료번호 101)을 증류수에서 현탁시키고, 하기 작업공정도에 나타낸 조작으로 분획한다.

[제조예3]

포름산-분해에 의한 쿠르들란의 수용성 당 분획의 제조.

45g 의 시료번호 102를 포름산으로 분해한다. [K. Ogawa etal., Carbohydr. Res. 29. 397~403(1973)]. 조작법을 하기 작업 공정도에 나타낸다.

[제조예4-1]

쿠르들란의 포름산-분해 생성물의 수용성 분획의 분자사에 의한 제분획

제조예3에서 수득한 수용성분획(시료번호3) 0.15g 을 증류수 30ml중에 용해시키고, GPC (컬럼 : TSK 겔 G3000 PW_XL× 2, 및 G2500 PW_XL× 1 ; 이동상 : 증류수 ; 유속 : 0.5 ml / 분)에 의해 0.5ml 분획들을 수거한다. 재-크로마토그래피에 의해 상이한 분자량을 갖는 시료 6개(번호 11~16)를 수득한다.

[제조예4-2]

쿠르들란의 포름산-분해 생성물의 비수용성 분획의 분자사에 의한 재분획

제조예 3에서 수득한 비수용성 분획(시료번호 4) 0.2g 을 0.3M NaOH 용액 40ml 중에 용해시키고, GPC (컬럼 : TSK 겔 G3000 PW_XL× 2, 및 G2500 PW_XL× 1 ; 이동상 : 0.3M NaOH ; 유속 : 0.5ml / 분)에 의해 제조예 4-1 과 동일한 방법으로 재-크로마토그래피 한다. 0.3M HCl 용액을 용출액에 가하여 중화하고, 분자량이 상이한 시료들(번호17 및 18)을 수득한다.

[제조예5]

쿠르들란의 비수용성 분획의 음파처리에 의한 시료의 제조

시료번호 102(1g )를 5mM NaOH 약 100ml에 현탁하고, 빙냉하 소니케이터^R(모델 5202 PZT, 오오따께 워크)에 의해 12분간 20 KHz 및 80KW에서 음파처리하여 해축하 (depolymerization) 한다.

5M NaOH를 처리된 용액에 가하여 상기 시료의 0.3M NaOH 용액을 제조하고, 제조예 4-2에서처럼 크로마토그래피에 의 분획화하여 분자량이 상이한 8개의 시료(번호 19~22 및 103~106)를 수득한다.

[제조예6-1]

해조 유래의 저해제의 제조(I)

[(T. Usui al., Agric. Biol. Chem. 43,603~611(1979)] 의 방법에 의해, 에이세니아 비시클리스(Eisenia bicylis)의 시판되는 건조 프론드(frond)(100g , 스이따쇼뗑(주))를 분쇄하고 80% 에탄올로 처리하여 저분자량 가량 분획을 제거한다. 라미나란분획을 CaCl₂의 2% 수용액을 사용하여 잔유물에서 추출한다.

95% 에탄올을 추출물에 가하여 최종 에탄올 농도 75% 를 갖는 라미나란 분획 용액을 제조한다. 생성되는 침전물을 원심분리침사에 의해 수거한 후 에탄올로 세척하여 조 라미나란 시료를 수득한다.

조 시료를 증류수중에 제용해 시키고 음이온 교환기(DEAE_Toyopearl)에 적용시켜 산성 물질(알긴산 등)및 색소를 제거한다. 남은 용액을 다시 에탄올로 침전시켜시료번호 25를 수득한다.

[제조예6-2]

해조 유래의 저해제의 제조(II)

[J. J. Connell et al., J. Chem . Soc., 3494(1950)]의 방법에 따라, 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica)의 시판되는 건조 프론드(100g , 스이따 쇼뗑)을 분쇄하고, 0.09M HCl로 3일간 추출한다. 불용성 물질을 여과분리하고, 여액을 1일간 방치한다. 형성된 소량의 침전물을 원심분리로 제거하고, 3부피양의 에탄올을 상층액에 가한다. 침전물을 알코올로 세척하고 건조시켜수용성 라미나란 분획(시료번호 27)을 수득한다.

[제조예7-1]

진균 유래의 저해제의 제조(I)

스클레로티니아 리베드티아나(Sclerotinia libertiana)유래의 스크레토탄을 하기와 같이 수득한다 :

[Kitahara et al.,Res. Bull. Fac. Agri. Gifu University 8,100~105(1957)]의 방법에 의해, 스클레로티니아 리베르티아나의 스클레로티움의 탈지 건조 분말 30g 을 물로 완전히 추출한다.

잔류물 NaOH의 7% 수용액으로 추출한다. 10% CuSO₄용액을 추출물에 가하여 침전물을 형성한다. 침전물을 분리하고, 메탄올의 염산으로 세척하여 구리를 제거한후 80메탈올로 세척해서 HCl을 제거하고, 메탄올 및 에테르로 세척 후 건조한다. 이과정을 3회 반복하여 정제하고, 시료번호 28을 6g 수득한다.

[제조예7-2]

진균 유래의 저해제의 제조(II)

스키조 필룸 콤무네(Schizophyllum commune)유래의 시료를 하기와 같이 수득한다. :

[Tabata et al., Carbohydr. Res., 89, 121~135(1981)]의 방법의 의해, 시판되는 스키조필란(상품명 : 소니필란, 가껭케미칼(주)medicine Lot No. J61040)을 제조예 5의 방법에 따라 수용액에서 10시간 동안 음파처리 시킨다. 알칼리 조건하에 분자 사 분획에 의해 분자량이 상이한 시료 셋(번호 29~31)을 수득한다.

[제조예7-3]

진균 유래의 저해제의 제조(III)

사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(빵효모) 유래의 β-글루칸 시료를 하기와 같이 수득한다. :

증류수 50ml을 시판되는 빵 효모 글루칸(90mg, Lot No. 56F-4027, 시그마 케이칼(주))에 가한 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한 후, 원심분리한다. 약 50ml의 상층액을 감압 농축하여 1ml이 되게 한다. 불용성 물질을 다시 원심분리 제거하여 상층액에서 시료번호 33(0.64mg)을 수득한다.

[제조예8]

보리 β-글루칸으로부터 시료의 제조

시판되는 보리 β-글루칸(시그마 캐미칼(주),Lot No. 56F-0652)을 0.3M NaOH 중에 용해시켜 5mg/ml 농도의 용액을 형성한다. 알칼리 조건하에 분자 사 분획에 의해 좁은 분자량 분포를 갖는 β-글루칸 시료(번호 36)를 제조한다.

별도로, 상기 보리 β-글루칸을 5mg/ml 농도의 뜨거운 물에 용해 시킨다. 용액을 원심분리(3,500rpm, 10분)한다.

100μℓ의 상충액을 제조에 4-1에 따라 이동상으로 증류수를 사용하는 GPC에 50회 적용시킨다. 분획을 동일 조건하에 재분획하여 분자량이 상이한 시료 둘(번호 37 및 38)을 수득한다.

[제조예9]

부분 카르복시메틸화 (1→3)-β-D-글루칸(평균 치환도 : 0.63)의 제조

제조예 2에 따라 수득한 쿠르들란의 비수용성분획을 카르복시메틸화한다. [A. E. Clarke and B. A. Stone , Phytochemistry 1, 175~188(1962)]. 쿠르들란의 비수용성 분획 100g 을 질소기류하 0°C에서 5M 수산화나트륨 수용액 1ℓ중에 용해시킨다.

교반하에, 물 200ml 중에 모노클로로아세트산 236g 용액을 적가한다. 첨가후 용액을 60~65°C에서 2시간 동안 교반한다. 생성되는 겔을 2.5 부피양의 에탄올 중에서 강력하게 교반시켜 세분화하고 여과한다. 잔류물을 70% 에탄올로 완전히 세척한 후, 에탄올 및 에테르로 더 세척하여 건조시킨다. 생성물을 물 7ℓ중에 용해시키고 1M 아세트산으로 중화한다. 활성탄 40g 을 가한다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반하고 여과한다. 여액을 감압농축하여 1ℓ 부피가 되게 한다. 이 부피의 3배로 에탄올을 농축물에 가하여 첨전물을 형성시킨다. 침전물을 에탄올 및 에테르로 세척하고 진한 황상으로 감압 건조시켜 113.85g 의 부분 카르복시메틸화 (1→3)-β-D-글루칸을 수득한다.

생성되는 글루칸은 D. F. Durso 의 우라닐 니트레이트법에 의한 측정으로 에스테르와 정도 (치환도)0.63을 가짐이 밝혀졌다. [Methods in Carbohydrate Chem., VIII, 127~129(1980)]. 이것은 다당류 사슬을 형성되는 글루코스 잔기하나에 히드록실기 3개중 0.63개가 치환되는 것을 의미한다.

생성되는 부분 카르복시메틸화(1→3)-β-D-글루칸 25mg 을 0.1M 알모늄 아세테이트 수용액 5ml 중에 용해시키고 , GPC(컬럼 : Toyopearl HW65F , 5 × 100cm ; 이동상 : 0.1M 암모늄 아세테이트 수용액 ; 유속 : 5.8g /분)에 의해 분획화한 후, 다른 컬럼을 사용하는 GPC (컬럼 : TSK 겔 G6000 PW_XL+ G500 PW_XL직렬연결 ; 이동상 : 0.1M 암모늄 아세테이트 수용액 ; 유속 : 0.6ml / 분)에 의해 재분획화하여 좁은 분자량 분포를 갖는 시료번호 41(Mn=231,000)을 수득한다.

또, 부분 카르복시메틸화(1→3)-β-D-글루칸 0.3g 을 증류수 30ml 중에 용해 시키고 , 소니케이터(Insonator 모델 201M, 쿠보타 워크) 에 의해 음파처리(9kHz, 180~130W, 1시간)하여 해축화한다. 해축화 생성물 4.5ml 을 1M 암모늄 아세테이트 수용액 0.5ml과 혼합한다. 혼합물을 시료번호 41을 수득하는 방법과 동일한 방법으로 GPC 분획화 및 GPC분획화 시켜 분자량이 상이한 시료 둘(번호 39 및 40)을 수득한다.

[제조예10]

치환도 1.2 를 갖는 부분 카르복시메틸화(1→3)-β-D-글루탄의 제조.

제조예 9에서 수득한 치환도 0.63을 갖는 카르복시메틸화(1→3)-β-D-글루칸 10g 을 질소기류하 10.5M NaOH 25ml 에 하하여 페이스트로 제조한다.다. 격렬한 교반하에 모노클로로아세트산 수용액 10g (12ml)을 가한다. 혼합물 60°C로 가온하고 4시간동안 교반한다. 냉각후, 2M HCl 30ml을 가하고, 용액을 에탄올중의 염산 200ml(40ml HCl/에탄올)에 주입한다. 생성되는 침전물을 수거하고, 70% 에탄올로 세척한 후, 에탄올 및 에테르로 더 세척하고 감압 건조시켜 시료번호 107을 수득한다.

제조에 9의 경우와 동일한 방법으로 측정시 이 시료의 치환도는 1.20이었다.

[제조예11]

부분 카르복시메틸화 라미나란의 제조

부분 카르복시메틸화 라미나란을 라미나리아 리기타타(Laminaria digitata)의 라미나란(Lot No. 77F-3885, 시그마케미칼(주))을 처리함으로써 제조에 9의 부분 카르복시메틸화법과 동일한 방법으로 제조한다 [A. E. Clarke and B. A. Stine : Phytochem. 1, 175(1962)] . 이렇게 하여 0.06의 치환도를 갖는 시료 번호 42를 수득한다.

[제조예12]

부분 카르복시메틸화(1→3)-β-D-글루칸의 제조

제조예 2에서 수득한 쿠르들란의 비수용성 분획 3.0g 을 [M. Samec , Kolloid-Beiheft, 51, 369(1940)]의 방법에 따라 물 80ml에 현탄시키고, 질소기류하 수산화나트륨 포화 수용액 1.35ml을 가하여 비수용성 분획을 완전히 용해시킨다.

4°C에서 디메틸술페이트 60g 을 서서히 가하고, 약 1 시간 후 반응용액을 아세톤에 적가한다. 생성되는 침전물을 수거하고 아세톤으로 충분히 세척한 후, 진한 황산으로 감압건조시켜 3.15g (시료번호 43, 치환도 : 0.16)을 수득한다.

[제조예13]

부분 황산화 라미나란의 제조

라미나리아 디기타타에서 라미나란의 황산화를 피리딘-삼선화황 착체(Lot No. PPL 8823, 와꼬 퓨어 케미칼 인더스트리즈)를 사용하는 하기 방법에 의해 피리딘 중에서 수행한다.

완전히 건조된 라미나리아 디기타타 라미나란(시그마 캐미칼(주); Lot No. 77F -3885)0.5g 을 탈수된 피리딘 50ml 중에 용해 시키고, 피리딘-삼선화항 착체 1g 을 가한다. 60°C에서 1시간동안 반응시킨다. 물 100ml을 냉각하에 반응 혼합물에 가한다. 이어서, 수산화나트륨으로 중화하고, 알칼리 수용액으로 완전히 세척하여 글루칸을 제거한 투석막(스펙트로포어 ; 분자량 1,000커트)으로 물에 대해 투석한다. 투석물을 농축하고 2배 부피양의 아세톤을 가하여 당 성분을 침전 시킨다. 당 성분을 아세턴으로 세척하고 진한 황산으로 감압건조시켜 0.38g (시료번호44, 치환도 0.14)을 수득한다.

제조예 12~13에서 수득한 제제에서 메틸기 및 황상기의 치환도는 [(1)Ochiai, Tsuda and Sakamoto, Yuki Teiryo Bunsekiho(Biryo), Methods of Organic Quantitative Analysis(Tiny Amounts), Nanzando (1956), (2) Whistler, R. L. Method in Carbohydrate Chemistry III , p. 229~235, 277~280 (1964), Academic Press] 방법에 따라 측정 산출된다.

[시판시료]

하기 시판시료의 특성을 결정한다. 시료를 직접 측정하거나 이어서 알칼리-가용화 및 중화시킨다.

글루코스 : (와코순약, JIS 특급시약) : 시료번호 108

라미나란 올리고당 : (생화확공업, 퓨어시약) : 시료번호 5~10

라미나란 : 에이세니아 아라보레아(Eisenia araborea)

유래 : (나카라이 화학, 시약) : 시료번호 23

라미나란 : 이. 아라보레아(E. araborea) 유래 : (토오쿄화성, 시약)

: 시료번호 24

라이나란 : 라미 나리아 디기타타(Laminaria digitata) 유래 : (시그마사 시약) : 시료번호 26

렌리난 : 렌티누스 에도데스(표고버섯) 유래 : (야마노우찌 제약의약 Lot No. CKC7) : 시료번호 32

리케난 세트라리아 이슬란디카 (Cetraria islandica) 유래 : (시그마사, 시약) : 시료번호 34

리케난 우스네아 바르바타 (Usnea barbata) 유래 : (시크마사, 시약) : 시료번호 35

[실시예 1~44]

상기 각 시료의 분자량, G 인자 활성화 저해 역가 등의 측정 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

(주)(^*1) : 수치는 본 명세서에 기재된 분류번호이다.

(^*2) : 클루코스 및 라미나리 올리고당의 분자량은 절대 분자량(이론치)이고, 다른 시료의 분자량은 하기 측정법으로 결정된 산화 폴리에틸렌 및 폴리에틸렌글리콜에 대한 계산치이다.

(^*3) : PE 는 제조에를 나타낸다.

시료번호 1~44는 본 발명의 G 인자 활성화 저해제인 반면, 시료번호 101~108은 비교용이다.

표중의 분자량은 하기 방정식으로 정의되고 GPC에 의해 결정되는 수평균 분자량(Mn)이다. 분자량 분포는 다분산도(Mw/mN)로 표시된다.

[상기 방정식에서, Hi는 크로마토그램을 시간으로 등분 다분할했을 때의 i번째 피크의 높이 (시료농도)를 나타내고, Mi는 i번째 피크의 분자량을 나타낸다. ]

G 인자 활성화 저해 역가는 하기의 G 인자 활성화 저해제의 활성역가 측정법 으로 측정되고 단위/mg 으로 표시된다.

G 인자 활성화 저해제(이하, G로 약칭)의 활성역가 측정법 : 반응 혼합물 200μℓ에 하기 물질이 포함된다.

(1) 분석시료(주1) GI 시료 또는 증류수 50μℓ[G 인자 활성화 물질 (GA로 약칭, 주2)10pq 첨가 또는 첨가하지 않음]

(2) LAN의 응고효소 전구체 분획(A₂₈₀= 0.9 ; 주 3) 30μℓ

(3) LAL의 G 인자 분획(A₂₈₀= 0.9 ; 주 3) 20μℓ

(4) 트리스 - HCl완충액 (pH 8.0) 20μℓ mole

(5) MgCl₂20μ mole

(6)Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 0.13 μmole

상기 반응 혼합물을 37°C에서 30분간 보온하고, 0.04% 아질산 나트륨(0.48M HCl 용액) , 0.3% 술파민산암모늄 및 0.07% N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디히드로클로라이드를 각각 0.5ml 씩 순차적으로 가하고, 디아조 커플링에 의해 색을 변화시킨다.

방출되는 pNA양을 545 nm에서 흡광도(A₅₄₅)로서 측정한다.

GI 활성을 하기 반응식으로 산출한다.

이들 조건하에 GA에 의한 G 인자의 활성화를 100% 정도로 저해하는 GI양을 100단위로 정의한다.

(주1) 비수용성 시료를 0.3M NaOH 중에 용해시킨 후 딩일한 부피양의 0.3M HCl 로 중화하여 사용한다.

(주 2) 제조에 5에서 제조한 쿠르들란의 음파처리 생성물의 GPC 분획화 순수 시료(표2, 시료번호 106, 분자량 216,000).

(주3) [T. Obayashi et al., Clin. Chim. Acta. 149,55 ~ 65(1985)]에 의해 기재된 방법에 따라 일본산 참게, 티. 트리덴타투스로부터 제조한다.

상기 표2의 자료로부터 하기 결론을 수득할 수 있다.

(a) G 인자 활성화 물질로 공지된 시판쿠르들란(시료번호 101)은 수용성하며 저분자량을 갖는 G 인자 활성화 저해제를 함유한다. (시료번호 1 및 2)

(b)(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 구성하는 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 단위의 연결 수가 2~370인 폴리글리코시드는 G 인자 활성화 저해 작용을 나타낸다.

(c) 저해활성을 인정할 수 없는 고분자량 β-글루칸 분획(시료번호 102)으로부터 각종 해축화조작에 의해 수득된 분자량 60,000 이하의 분획은 G 인자 활성화 저해 역가를 나타낸다 (시료번호 3,4 및 11~22).

(d) 중합도 10이하의 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분와 폴리-(1→4)-β-D-글루코시드 구조 부분이 블럭으로 서로 연결되는 보리글루칸으로부터 수득되는 분획(제조예 8,시료번호 36~38)[Ballancde et al., Carbohyd. Res., 61, 107~118(1978)]은 라미나미 테트라오스 또는 라미나리펜타오스에 해당하는 활성을 나타내고, 글루칸 전체의 분자량이 60,000이상 또는 이하일지라도 본 발명의 저해제로 사용할 수 있다.

(e) 제조예 10에서 수득한 1.0이상의 평균 치환도를 갖는 부분 카르복시메틸와 (1→3)-β-D-글루칸(시료번호 107, DS=1.2)은 G 인자 활성화 저해 효력을 상실한다. 높은 G 인자 활성화 저해 역가를 갖는 시료번호 26을 부분 카르복시메틸와하여 (제조예 11)(1→3)-β-D-글루코시드 부분의 사슬 길이를 감소시키고 (시료번호42), 제조예 13의 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 슬페이트 변형으로 단축시키면 인자활성화 저해효과는 감소된다.

(f) (1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분에서 370이상의 중합도를 갖고 60,000 이상의 분자량을 갖는 글루칸을 부분메틸화(제조예12)또는 부분 카르복시메틸화(제조예 9, 시료번호41)시켜 본 발명에 정의된 구조를 수득할 경우, 생성되는 생성물은 G 인자 활성화 저해 효과를 갖는다.

[G 인자에 대한 본 발명의 저해제의 작용 기작]

참게 혈액 응고계의 G 인자 활성화 경로는 하기 챠트로 표시된다.

[T. Morita et al., FEBS Letters, 129, 318~321(1981)참조].

본 발명의 저해제의 상기 응고 경로의 어느 부분이 저해하는지 결정하기 위해 하기 실험을 실시한다.

하기 조성의 반응 혼합물을 사용한다. 반응 혼합물 200μℓ은 G 인자 활성화 저해제(라미나리헵타오스 ; 시료번호 10 ; I로 약칭) 5μℓ, G 인자 활성화 물질(음파처리된 쿠르들란의 GPC 분획 ; 시료번호 106 ; A로 약칭) 3pg, [T. Obayashi et al., Clin. Chim, Acta, 149. 55~65(1985)]에 기재된 방법으로 LAN로부터 제조된 G 인자 분획(G 로 약칭) 20μℓ 및 응고효소전구체(p로 약칭) 30μℓ, 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 20 μmole, MgCl₂20 μ mole 및 색소생성기질 Boc-Leu-Gly-Arg-pNA(S로 약칭) 0.13 mole 을 함유한다.

실험 1~5의 각각에서, 성분의 첨가순서 및 보온 조건을 변화시키고, G 인자 경로의 저해정도를 저해제를 가하지 않은 대조실험과 비교하여 측정 및 결정한다. 결과를 하기에 나타낸다.

실험 수행번호 1~3에서 명백하듯이, G 인자 (전구체)에 본 발명의 저해제(I)을 가하면 G 인자의 활성화는 G 인자 활성화 물질(A)의 존재에 상관없이 100% 정도로 저해된다.

한편, 실험수행번호 4 및 5에서 명백하듯이, 일단 G 인자가 (A)에 의해 활성화되면 활성형 G 인자는 저해제 (I)가 존재해도 저해되지 않는다.

따라서, 본 발명의 저해제(I)은 G 인자(전구체)에만 작용한다고 결론지을 수 있다.

LAN중의 G 인자를 100% 저해하는데 충분한 양으로 본 발명의 저해제(I)이 존재하면, 다량의 활성화 물질(A)가 존재하더라도 G 인자는 활성화되지 않는다. 그러나, 다량의 활성화 물질(A)를 100% 정도로 G 인자를 저해하는데 필요한 것보다 더 소량의 저해제(I)의 존재하에 존재시키면, 저해제(I)에 의해 저해되지 않는 G 인자의 부분이 활성화물질(A)에 의해 활성화됨이 확인되었다.

따라서 ,[A. Kakinuma et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 101. 434~439(1981)]에 의해 지적된 (1→3)-β-D-글루칸유도체 또는 [T. Morita et al., Prog. Chim. Biol. Res., 189.53~64(1985)]에 의해 나타낸 각종 β-글루칸의 참게 G 인자 활성화 능력에 있어서의 최대 활성화 농도 존재를 상기 실험 및 분석에 의해 분석할 수 있다.

[실시예45]

G 인자 활성화 저해제를 함유하는 키트와 이를 함유하지 않은 키트의 사이의 내독소 특이적 분석 능력 비교.

본 발명의 G 인자 활성화 저해제를 LAN 레스트에 가한 경우 및 가하지 않은 경우, 하기 방법으로 각종 분석 시료를 사용하여 내독소 특이성을 비교한다.

LAN 레스트는 하기 조성을 갖는 톡시칼러테스트(비색법, 생화학공업(주))이다.

(1)과염소산, (2)수산화나트륨, (3)완충액, (4)라이세이트+색소생성기질 , (5)내독소-미함유 증류수, (6)표준 내독소, (7)염산, (8)아질산나트륨, (9)술파민산암모늄, (10)N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 이염산염.

반응용액군(키트-A)을, 완충액(3)중에 G 인자 활성화 저해제로서 시료번호 13을 5μg/ml 농도로 용해시키고, 용액중에 LAL반응시약을 용해시킴으로써 제조한다.

반응용액군 (키트-B)을, 저해제를 함유하지 않은 완충액(3) 중에 (4)를 용해시킴으로써 제조한다. 분석 시료에 의한 키트A 및 B의 반응성을 비교하고 표3에 나타낸다.

(주)(^*1) : 에스캐리키아콜리(Escherichia coli)

0111 : B4 유래내독소(디프코사)

(^*2) : 쿠르들란의 비수용성 분획 ; 분자량159,000 ; 시료번호 102(표2에서 )

(^*3) : 쿠프트암모늄 레이온 막(재생 셀룰로스막)을 사용하여 제작한 홀로우 파이버형 혈액 투석기

(AM-Neo-3000 ; 아사히 메디칼(주))에 증류수를 관류시켜 세척함. 당 함량은 페놀-황산법으로 측정됨.

(^*4) : 규정 시료치(n=25)는 평균 ± 표준편차이다.

시료 b~j : 패혈중 합병이 의심되어 혈액배양한 결과,

b~e : 에스캐리키아 콜리에 양성

f~g : 슈도코나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 양성

i : 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 양성

j : 칸디다 구일리에드몬디이(Candida guilliermondii)에 양성

시료 h : 페 아스페르길로시스증

시료 k,ℓ : 부검시 진단된 전신성 진균 감염증

시료 m~r : 쿠프르암모늄 레이욘(재생 셀룰로스)을 사용하여 제조한 홀로우 파이버형 혈액투선기에 의해 혈액투석하에 만성신 부전증(미생물성 감염은 없음)

시료번호 1~5는 톡시칼러테스크의 메뉴얼에 따라 시료를 용매중에 직접 용해시키고, 각 용액의 0.1ml 을 반응에 사용한다.

시료번호 6(a~r)은 [T. Obayashi J. Clin. Med., 104, 321~330(1985)]의 방법에 따라 키트 조성(1) 및 (2)를 사용하여 혈장시료를 전처리하여 수득되고, 각각의 전처리생성물 0.1ml을 반응에 사용한다.

조성(3) 및 (4)를 사용하여 제조한 반응용액에 각 시료를 가하고 37°C에서 30분간 반응시킨다. 생성되는 pNA를 커플링시약 (7)~(10)으로 착색시킨다. 키트 A 및 B 의 반응성을 545nm에서의 흠광도로 표시한다.

본 키트 조성의 최대 반응성 △A₅₄₅는 1.5이다.

표3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 G 인자 활성화 저해제를 함유하는 키트-A 및 저해제를 함유하지 않은 통상적인 키트인 키트-B는 내독소(시료번호 1)에 대해 동일한 반응성을 나타낸다. 키트B는 G 인자 활성화 물질로서의 쿠르들란의 비수용성 분획(시료번호 2)에 대해 극히 고도의 반응성을 나타낸다. 한편, 키트 A는 이 시료에 대해 반응성을 전혀 나타내지 않지만, 내독소(시료번호 1)를 조합하여 사용할 경우 (시료번호 3) 키트A는 내독소(시료번호 1)에 대한 것과 동일한 반응성을 나타낸다.

리물루스테스트-반응성 물질(비내독소성)로 공지된 셀룰로스투석막을 세척하여 수득한 세척액을 시료(번호 4 및 5)로 사용할 경우[F. C. Pearson et al., Arrif. Organs 8,291~298(1984)], 키트-A 및 B른 모두 쿠르들란의 비수용성 분획 및 /또는 내독소 부재의 경우와 동일한 결과를 보인다.

상기 결과에 의해, 본 발명의 G 인자 활성화 저해제를 LAN 과 병용하면 내독소의 특이적 측정이 가능함을 알 수 있다.

종래의 LAN 테스트는 진정한 엔도톡세미아 환자인지 아닌지를 명확히 판정할 수 없다는 임상혈액 시료에 대해 다음과 같이 말할 수 있다.

키트-A 및 B는 모두 그램-음성 세균의 존재를 배양에 의해 결정한 시료번호 6, b~g에 대해 높은 반응성을 보인다.

한편, (1→3)-β-D-글루칸을 균체 세포벽에 갖는 것이 알려져 있는 진균의 존재가 확인된 시료(번호 6,h~ℓ)에 대해 , 키트-A는 어떠한 반응성도 보이지 않고 키트-B는 높은 반응성을 보인다. 또, 임상증상의 견지에서는 엔도톡세미아로 간주할 수 없는 혈액 투석하 만성신 부전증의 시료(번호 6; m~r)에 대해 키트-A는 반응성을 보이지 않는다. 키트-B에서는 비정상적으로 높은 수치를 보이는데, 이것은 투석막유래의 (1→3)-β-D-글루칸 때문일 것이다.

상기 시료처럼 내독소의 존재가 명확하지 않은 감염증 및 패혈증의 의심이 있는 임상 시료의 분석은, 진짜 그램-음성 세균 감염증(엔도톡세미아)을 정확히 판단할 수 있고 진균증로 검출할 수 있는 이점을 제공한다. 따라서 이것은 감염균 조기판정을 가능케 하고, 적절한 치료약제의 선택 및 치료 및 치료효과의 분석로 가능케한다. 본 발명의 저해제를 함유하는 키트의 제공은 진단 및 치료 등 의각의 진보에 크게 기여하리라 기대된다.

하기 참고에는 본 발명의 G 인자 활성화 저해제와 LAN을 조합하여 내독소의 특이적 검출용 키트를 제조하는 것을 나타낸다.

[참고예1]

G 인자 활성화 저해제를 내독소 측정시 시판 또는 종래 리물루스테스트 시약에 가함으로써 내독소-특이적 분석하는 방법.

1-1 : 리물루스테스트 시약(동결건조품)을 통상적인 방법으로 지정된 용해액(증류수 또는 완충액)중에 용해시키고, G 인자 활성화 저해제를 분석시료와 함께 또는 별도로 (첨가순서는 임의로)가한다.

예컨대, 0.1ml의 증류수를 프레겔-S-(동결건조품 ; 겔화법에 의한 리물루스테스트 생성물 ; 생화학공업(주))에 가하고, 저해제(쿠르들란의 포름산-분해물의 GPC 분획 4 : 표 2의 번호 14)의 수용액 0.01ml (120μg/ml LAN)및 시료 0.1ml 을 가한다. 혼합물을 조용히 진탕하고, 37°C에서 60분간 방치 가온한다. 혼합물은 내독소와만 반응하여 겔을 형성한다.

1-2 : 저해제로서 리물루스테스트 시약 용해액중에 미리 용해시키고, 생성되는 용액중에 리물루스테스트 시약을 용해시킨다. 코아테스트엔도톡신(색소생성 리물루스테스트 제품, 카비 비트륨)을 사용할 경우, 먼저 LAN(동결건조품)1 바이알을 저해제(라미나란 ; 표2의 번호 26) 0.7μg 을 용해시킨 증류수 1.4ml 중에 용해시킨다. 시료 0.1ml 을 생성 용액 0.1ml(500ng/ml LAN)에 가한다. 혼합물을 37°C에서 10분간 가열한다. 합성기질(S-2423)을 함유하는 완충액 0.2ml 을 가하고 용액을 37°C에서 3분간 가열할 경우, 혼합물은 내독소와만 반응하고 용액은 황색을 띤다. 측정시, 200μℓ의 50% 아세트산 용액을 가하고, 405nm에서 용액의 흡광도로 측정한다.

[참고예2]

G 인자 활성화 저해제를 미리 LAN에 가함으로써 내독소-특이적 리물루스 테스트 시약을 만드는 방법

2-1 : 저해제를 시판되는 LAN(소위, 리물로스 겔화 테스트 시약)에 미리 가하는 방법.

혼탁도 측정 시간분석법을 리물로스 HS-테스트 와꼬(동결건조품, 와꼬 퓨어 캐미칼 인더스트미즈)를 사용하여 수행시, LAN(동결 건조품)1바이알을 저해제(쿠르들란 포름산-분해물의 GPC 분획4 ; 표 2의 번호 14) 0.5μg를 용해시킨 증류수 5ml 중에 용해시킨다. 그 0.1ml(100ng/ml LAL)을 반응 시험관에 넣고, 시료 0.1ml을 더 가한다. 혼합물을 조용히 진탕한다. 혼합물을 혼탁도 측정시간 분석용 기구(톡시노미터 ET-201, 와꼬퓨어케이칼 인더스트리즈)의 분석모듈(37°C) 의 소정의 측광위치에 세팅하고, 출발 스위치를 넣는다. 혼합물은 내독소와만 반응하고, 겔화시간이 나타난다.

2-2 : 분석시료를 가하기 전에 LAN에 저해제를 가함므로써 목적 달성하는 방법.

예컨대, LAN을 사용하여 혼탁도를 측정하는 경우, ml 당 저해제(라미나란; 표2의 번호 26) 0.5μg을 용해시킨 1M -트리스-HCl- 1M MgCl₂완충액 (pH 8.0) 0.01(50ng/ml LAN)을 저장완충액을 사용하여 타키플레우스 트리덴타투스 아메보사이트에서 추출한 라이세이트 0.1ml에 가한다. 이어서, 0.1ml의 분석시료를 용액에 한가하고, 혼합물 37°C에서 가열한다. 혼합물은 내독소와만 반응하고, 용액은 백색으로 탁해진다. 내독소양을 경시적으로 660nm에서 용액의 흡광도를 측정함으로써 결정할 수 있다.

[참고예3]

G 인자 활성화 저해제를 LAN의 추출 및 제조시에 가함으로써 내독소-특이적 리물루스테스트 시약양 물질로서 라이세이트를 제조하는 방법.

참게(타키플레오스트리덴타투스, 티, 기가스, 리물루스 폴리페무스, 및 카르시노스코트피우스 로툰디카우다 중 어떤 것이라도 좋음)에서 채취한 혈임파를 원심분리하여 약 20g 의 아메보사이트를 수득한다. 이어서, 2. 0mg/ℓ 의 저해제(부분 카르복시메틸와 라미나란 ; 표2에서 번호 42)을 증류수 또는 0.-2M 트리스-HCl완충액(pH8.0)과 같은 저장완충액중에 용해시켜 수득한 저해제 용액 100ml 을 아메보사이트에 가한다. 혼합무를을 와링배합기로 균등질화시킨 후 원심분리(8,000rpm ; 30분 ; 4°C)하여 상층액 및 첨전물로 분리한다. 이 조작을 반복하여 약 150ml의 상층액을 LAN로서 수득한다. 일정량의 생성되는 LAN 을 통상적인 방법으로 추출된 LAN대신에 사용하고, 리물루스테스트 시약(겔화법, 혼탁도측정법, 혼탁도측정 시간법, 색소 생성 합성 기질법)을 제조한다. 생성 시약은 내독소와만 특이적으로 반응하는 내독소-특이적리물루스테스트 시약이다.

색소생성 기질법에 의한 내독소-특이적 리물루스테스트 시약의 제조법으로는, 예컨대 미합중국 특허 제4,495,294 호(Method for Determining Bacterial Endotoxin and Kit Therefor)에 기재되어 있는 기질 및 R-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA 및 메톡시카르보닐-D-헥사히드로티로실- Gly-Arg-Pha.AcOH (R은 아세틸기, α-N-벤조일기, α-N-카르보벤족시기, N-t-부톡시카르복닐기, p-톨루엔술포닐기 또는 기타 아미노산 N-말단 보호기)등의 기질을 사용하여 고감도의 시약을 제조하는 방법이 있다.

예컨대, 이런 시약은 라이세이트 0.04ml에 MgCl₂1.5μℓ및 합성기질(N-t-부톡시카르보닐-Leu-Gly-Arg-p-니트로아닐리드) 4.0μg 을 가하고, 혼합물을 동결건조하여 제조할 수 있다. 동결건조품에 0.2M 트리스-HCl 완충액(pH8.0) 0.1ml 및 분석시료 0.1ml 을 가한 혼합물을 37°C에서 30분간 가열할 경우, 혼합물은 내독소와만 반응하고, 용액은 황색을 띤다.

겔화법, 혼탁도측정법 및 혼탁도측정 시간 분석법에 대한 LAN 시약은 라이세이트 0.1ml에 MgCl₂10.0μg을 가한 혼합물을 동결건조시켜 제조할 수 있다. 이 시약을 참고예 1-1,2-1 및 2-2에 사용하면, 내독소와만 반응한다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 G 인자 활성화 저해제는 LAN 과 조합되어 내독소-특이적 LAN 테스트 시약을 제공하고, 내독소의 존재유무가 명확하지 않은 감염증 및 패혈증이 의심되는 임상시료분석에 유용하다. 이것은 진짜 그램-음성 세균 감염증(엔도톡세미아)을 정확히 결정할 수 있는 이점을 갖고, 통상적인 LAN 테스트를 병용함으로써 진균증을 감지할 수 있다. 이는 감염균을 조기 판정할 수 있게끔 하고, 적절한 약제 선택 및 치료 및 치료과 분석을 가능케한다.

본 발명의 저해제를 함유하는 키트의 제공은 진단 및 치료 등 의학진보에 상당히 기여할 수 있음이 기대된다.

Claims

하기식(I)로 표시되는 (1→3)-β-D-글루코시드 구조단위 2~370개가 연속결합된 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분을 하나 이상 함유하는 폴리글리코시드를 활성성분으로 함유함을 특징으로 하는 참게 아메보사이트 라이세이트 G 인자 활성화 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분이 식(I)로 표시되는 (1→3)-β-D-글루코시드 구조단위 3~310개가 연속결합되어 이루어지는 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리-(1→3)-β-D-글루코시드 구조 부분이 식(I)로 표시되는 (1→3)-β-D-글루코시드 구조 4~180개가 연속결합되어 이루어지는 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 342~1,638의 분자량을 갖는 라미나리올리고당인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 1,800~3,258의 분자량을 갖는 라미나리덱스트린인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 2,000~60,000의 평균 분자량을 갖는 (1→3)-β-D-글루칸인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 3,000~23,000의 평균분자량을 갖는 라미나란인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 3,000~20,000의 평균 분자량을 갖는 스클레로탄인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 500,000 이하의 평균분자량을 갖는 스키코필란인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 1,100,000 이하의 평균분자량을 갖는 렌티난인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 12,000 이하의 평균 분자량을 갖는 빵 효모 글루칸의 수용성 분획인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 33,000이하의 평균 분자량을 갖는 리케난인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 200,000이하의 평균 분자량을 갖는 보리 β-글루칸인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 40,000~240,000의 평균 분자량을 갖는 부분 카르복시메틸화 (1→3)-β-D-글루칸 또는 그의 염(치환도 : 0.003~1.0)인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 23,000 이하의 평균 분자량을 갖는 부분 카르복시메틸화 라미나란 또는 그의 염(치환도 : 1.0 이하)인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 80,000 이하의 평균 분자량을 갖는 부분 메틸화 (1→3)-β-D-글루칸(치환도 : 0.003~1.0)인 저해제.
제 1 항에 있어서, 폴리글리코시드가 23,000 이하의 평균 분자량을 갖는 부분 황산화 라미나란 또는 그의 염(치환도 : 1.0 이하)인 저해제.
제 1 항의 폴리글리코시드가 유효량을 참게 아메보사이트 라이세이트에 가함을 특징으로 하는, 참게 아메보사이트 라이세이트중에 존재할 수 있는 G 인자의 활성화 저해 방법.
제 1 항의 폴리글리코시드의 유효량을 함유하는 내독소-특이성 리물루스테스트 시약.
제 1 항의 폴리글리코시드를 참게 아메보사이트 라이세이트 1ml 50ng이상 함유하는 내독소-특이성 리물루스테스트시약.