JPH11313667A - β―１，６―分枝―β―１，３―グルカンを分離するためのスエヒロタケの液体培養方法及びこの方法により製造されたβ―１，６―分枝―β―１，３―グルカンを含有する外用剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを分離する
ためのスエヒロタケの液体培養方法、及び、この方法で
製造されたβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを含む皮膚
老化防止、皮膚損傷治癒、及び美白効果用の外用剤組成
物を提供する。 【解決手段】 本発明は、スエヒロタケの菌糸体を準備
する段階と、菌糸体を、ブドウ糖１〜１０％、酵母抽出
物０．１〜１％、二リン酸アンモニウム又は硫酸アンモ
ニウム０．０５〜０．５％、一リン酸カリウム０．０５
〜０．５％、硫酸マグネシウム０．００５〜０．２％を
含有し、かつ、ｐＨ４．０〜８．５に調整された液体培
地で培養する段階と、液体培地からβ−1,6-分枝−β−
1,3-グルカンを分離する段階と、β−1,6-分枝−β−1,
3-グルカンを精製する段階とを含むβ−1,6-分枝−β−
1,3-グルカンを分離するためのスエヒロタケの液体培養
方法、及びこの方法で製造されたβ−1,6-分枝−β−1,
3-グルカンを含む外用剤組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、β−1,6-分枝−β
−1,3-グルカン (β-1,6-branched-β-1,3-glucan)を分
離するためのスエヒロタケ (Schizophyllum commune F
r.)の液体培養方法及びこの方法により製造されたβ−
1,6-分枝−β−1,3-グルカンを含有する外用剤組成物に
関する。

【０００２】より詳しくは、皮膚細胞及びコラーゲン繊
維の増殖効果、日光火傷治癒等の皮膚機能の活性促進効
果、及び皮膚メラニン生成抑制効果があり、かつ、均一
の組成を有するβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを、ス
エヒロタケから短期間に多量に得る方法、及びこの方法
により製造されたβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを含
有する皮膚老化防止効果、美白効果、及び皮膚損傷緩和
効果を有する外用剤組成物に関する。

【０００３】

【従来の技術】皮膚は、人体の一次防御膜であって、体
内の諸器官を温度や湿度の変化、紫外線、公害物質等の
外部環境の刺激から保護する機能を有する。しかし、外
部から受ける過度な物理的又は化学的な刺激、ストレ
ス、栄養欠乏等は、皮膚の正常機能を低下させ、皮膚の
老化現象を促進し、皮膚を損傷させることになる。

【０００４】そこで、かかる現象を防止してより健康で
美しい皮膚を維持するため、従来より各種の動物、植物
又は微生物等から得られる生理活性物質を化粧品に添加
して使用することにより、皮膚の固有機能を維持させ、
皮膚細胞を活性化させて、皮膚老化を効果的に抑制する
ための努力がなされてきた。かかる努力の一環として、
皮膚老化の主な指標になる皮膚細胞、大食細胞（マクロ
ファージ）、ランゲルハンス (Langerhans) 細胞等の再
生減少と、コラーゲン及びエラスチン合成の低下、皮膚
色素沈着等のような機能を抑制させることができる物質
に関する研究が多く行われてきた。

【０００５】その結果、たけ抽出物を化粧品に含有させ
る場合、たけ細胞壁構成物質の保湿機能、又は細胞内物
質のメラニン生成抑制機能及び紫外線遮断機能により、
美白効果や抗酸化効果を有する化粧料組成物を製造する
ことができることを知見した。例えば、スエヒロタケの
培養物から抽出、濃縮された混合物を利用した美白効果
及び保湿効果を有する化粧料組成物が、特開平５−２８
６８４３号に開示されている。しかしながら、スエヒロ
タケ抽出物中のどのような物質が、化粧料において美白
効果や保湿効果を示すかは、まだ究明されたところがな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】これより、本発明者ら
は、スエヒロタケの成分のうち、化粧料において活性を
示す成分を究明するために研究を重ねた結果、スエヒロ
タケの液体培養により生産されたβ−1,6-分枝−β−1,
3-グルカンが皮膚細胞及びコラーゲン繊維の増殖作用、
日光火傷治癒等の皮膚機能活性促進作用、及びメラニン
生成抑制機能を有することを知見し、これを含有して皮
膚老化防止効果、美白効果、及び皮膚損傷治癒効果に優
れた化粧料又は日光火傷治癒用外用剤に関する本発明を
完成した。

【０００７】また、本発明者らは、スエヒロタケの菌糸
体を液体培養してβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを生
産するに際して、培養途中に活性炭を添加するか、又は
ブドウ糖を添加することによりβ−1,6-分枝−β−1,3-
グルカンの生産性を高めることができ、また、培養途中
に活性炭を添加した後にブドウ糖を更に添加した場合に
はより一層生産性を高めることができることを知見し、
本発明を完成した。

【０００８】従って、本発明の目的は、β−1,6-分枝−
β−1,3-グルカン (β-1,6-branched-β-1,3-glucan)を
分離するためのスエヒロタケ (Schizophyllum commune
Fr.)の液体培養方法を提供することにある。また、本発
明の他の目的は、上記方法により製造されたβ−1,6-分
枝−β−1,3-グルカンを含有する、皮膚老化防止、皮膚
損傷治癒、及び美白効果を有する外用剤組成物を提供す
ることにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明による液体培養方法は、（１）スエヒロタケ
の菌糸体を準備する段階と、（２）前記段階（１）の菌
糸体を、ブドウ糖１〜１０％、酵母抽出物０．１〜１
％、二リン酸アンモニウム〔（ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ₄〕又
は硫酸アンモニウム〔（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 〕０．０５〜
０．５％、一リン酸カリウム（ＫＨ₂ ＰＯ₄ ）０．０５
〜０．５％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂ Ｏ）０．００５〜０．２％を含有し、かつ、ｐＨ４．
０〜８．５に調整された液体培地で培養する段階と、
（３）前記液体培地からβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ンを分離する段階と、（４）前記β−1,6-分枝−β−1,
3-グルカンを精製する段階とを含むことを特徴とする。

【００１０】また、本発明の液体培養方法は、前記段階
（２）の際、液体培地に活性炭を添加する段階を更に含
むことを特徴とする。また、本発明の液体培養方法は、
前記段階（２）の際、液体培地にブドウ糖を添加する段
階を更に含むことを特徴とする。また、本発明の液体培
養方法は、前記段階（２）の際、液体培地に活性炭及び
ブドウ糖の両者を添加する段階を更に含むことを特徴と
する。また、本発明の外用剤組成物は、上記方法により
製造されたβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを、組成物
の総重量に対して０．００００１〜１０重量％の量で含
有することを特徴とする。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳しく説明す
る。スエヒロタケは、Singer, R.の分類書 (The Agaric
ales in modern taxonomy,1975)によると、分類学上、
担子菌類のハラタケ目マツタケ科スエヒロタケ属に属す
る木質腐朽菌であって、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ン多糖類を細胞外に生産する菌株である。スエヒロタケ
は、野生で採取することができ、次のような形態学的特
性や分類学的指標により確認することができる。

【００１２】スエヒロタケの子実体は、柄 (stipe)がな
く、傘の側面が基質に取り付けられ、サイズが普通１．
０〜３．０ｃｍである。また、扇子状又は貝状の形状を
有し、縦に褶があり、末端は不規則に分けられて微細な
毛で覆われている。褶 (gill) は白色であるが、成熟す
ると淡灰色又は淡紫褐色を呈する。肉 (flesh)組織は、
乾燥すると収縮されるが、水分を吸収すると回復され
る。胞子絞 (spore print)は白色である。また、胞子
は、４×１．５μｍ〜６×２μｍのサイズの円錐状を有
し、平滑で白色を呈する。スエヒロタケは、闊葉樹林の
枯木や切り株に束で発生する。これに対する詳細な摂生
及び形状は、韓国タケ図鑑 (KIM, Sam-Soonand KIM Yan
g-Seob 共著、YOOPOONG出版社, 1990) 及びSinger, R.
の分類書 (The Agaricales in modern taxonomy, 1975)
に詳細に記載されている。

【００１３】一方、β−グルカンは、β−1,3-結合、β
−1,4-結合、β−1,6-結合等のようなβ型のブドウ糖結
合を特に区別することなく使用しているが、実際に、か
かる結合の類型が多様であるだけでなく、後述するタケ
類から明らかなように、起源によって構成糖の均一性、
分枝度、分子量、３次構造等に大きい差異があって、そ
の物理化学的特性及び生態機能が全く異なることが多
い。例えば、万年だけ (Ganoderma licidum)のβ−グル
カンは、主に細胞壁から抽出されるが、細胞外にも少量
分泌されており、グルコース、マンノース、ガラクトー
ス等の結合形態を有する。Coriolus versicolor のβ−
グルカンは、細胞壁から抽出され、β−1,3-結合だけで
なく、β−1,4-結合類型も多く含む。椎茸 (Lentinus e
dodes)のβ−グルカンは、細胞壁から抽出され、β−1,
3-主糖鎖の毎５つの残基内に２つずつβ−1,6-残基を有
するβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンである。ヒラタケ
(Pleurotus ostreatus)のβ−グルカンは、細胞壁から
抽出され、いろいろの類型のグルカンから構成され、グ
ルコース、マンノース、ガラクトース等の結合形態を有
する。キコブタケ (Phelllinus linteus) のβ−グルカ
ンは、細胞壁から抽出され、いろいろの類型のグルカン
から構成され、グルコースを７０〜９０％含有し、その
他、マンノース、ガラクトース等を含む。また、酵母
(Saccharomycescerevisiae) のβ−グルカンは、細胞壁
から抽出され、分枝がほとんどなく、不均一かつ不溶性
である。

【００１４】一方、本発明のスエヒロタケのβ−グルカ
ンは、均一のβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンであっ
て、β−1,3-主糖鎖の毎３つの残基当たりβ−1,6-残基
を有することにより、分枝された均一かつ特有の構造を
有し、細胞外に分泌され、安定した中性多糖類特性を有
し、グルコースだけより構成される。分子量（Ｍ．
Ｗ．）は、２００〜５００万で、他のタケ類が数十万〜
２００万であるのに対して非常に大きい。従って、スエ
ヒロタケのβ−グルカンは、他のタケ類のβ−グルカン
と異なる物性及び機能性を有する。

【００１５】以下、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを
分離するためのスエヒロタケの液体培養方法について詳
しく説明する。 （１）スエヒロタケの菌糸体を準備する段階；スエヒロ
タケの菌糸体は、野生で採取したスエヒロタケの胞子を
培養して準備する。すなわち、野生で採取したスエヒロ
タケの子実体から得られた胞子を、蒸留水で数回洗浄し
た後、酵母−麦芽抽出寒天培地（酵母抽出物３ｇ、麦芽
抽出物３ｇ、ペプトン５ｇ、ブドウ糖１０ｇ、寒天１５
ｇ、蒸留水１リットル）に接種して、２４℃の温度で７
日間培養することにより得られる。一方、菌糸体は、酵
母−麦芽抽出寒天培地が入れられた試験管に斜面培養し
て４℃に保管し、１ヶ月毎に継代培養して使用する。

【００１６】（２）前記段階（１）の菌糸体を液体培地
に培養する段階；前記菌糸体を無菌的に均質化した後、
これを液体培地に１〜１０％(v/v) 、好ましくは３％(v
/v) になるように接種する。液体培地としては、ブドウ
糖１〜１０％、好ましくは３％、酵母抽出物０．１〜１
％、好ましくは０．３％、二リン酸アンモニウム〔（Ｎ
Ｈ₄ ）₂ ＨＰＯ₄ 〕又は硫酸アンモニウム〔（ＮＨ₄ ）
₂ ＳＯ₄ 〕０．０５〜０．５％、好ましくは０．０５
％、一リン酸カリウム（ＫＨ₂ ＰＯ₄ ）０．０５〜０．
５％、好ましくは０．１％、及び硫酸マグネシウム（Ｍ
ｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ）０．００５〜０．２％、好ましく
は０．０５％を含有し、ｐＨ４．０〜８．５、好ましく
はｐＨ６．５に調整された栄養培地を使用する場合、菌
糸体成長の観点から良好である。菌糸体の液体培養は、
発酵槽内で温度２０〜３５℃、好ましくは２８℃、回転
数１００〜４００rpm 、好ましくは２００rpm 、通気量
０．３〜２vvm 、好ましくは１vvm の条件で３〜７日
間、好ましくは５日間培養する。

【００１７】図１から、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ンの生産性は、培養２日後から増加し始め、培養５日後
に最高値に至ることがわかる。すなわち、初めの２日間
の培養は、菌糸体の成長のためのもので、その後の培養
は、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの生産のためのも
のである。一方、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの培
養後半部に多少の分解が生ずることがわかる。従って、
培養は５日間行われることが好ましい。

【００１８】（３）前記培養培地からβ−1,6-分枝−β
−1,3-グルカンを分離する段階；β−1,6-分枝−β−1,
3-グルカンは、活性炭粉末で不純物を吸着させることに
より分離される。すなわち、培養終了液に、活性炭粉末
を０．１〜６％、好ましくは１％の量で添加し、攪拌す
ることにより色素及び蛋白質成分などの不純物を吸着し
て除去する。その後、圧縮濾過装置にて濾過することに
より、菌糸体一部及び活性炭が除去されたβ−1,6-分枝
−β−1,3-グルカン溶液を得る。この際、活性炭粉末の
処理は、圧縮濾過後に行っても構わない。

【００１９】（４）前記β−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ンを精製する段階；β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの
精製は、エチルアルコールを用いた沈殿の手段による。
すなわち、前記溶液を更に１μｍ及び０．４５μｍサイ
ズの微細孔を有する濾過膜に順に通過させて、菌糸体及
び活性炭を完全に除去された清浄の無色又は薄茶色の濾
液を得た後、この濾液にβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ンを沈殿させるためにエチルアルコールを添加する。エ
チルアルコールの添加による沈殿は２〜３回繰り返して
実施する。一方、エチルアルコールは、初期濾液の嵩の
３〜４倍量、好ましくは３．５倍量で添加することが好
ましく、エチルアルコールの添加を繰り返しながら、徐
々にエチルアルコールの使用量を少なくし１倍量まで減
らす。沈殿物を回収した後、２０〜１００℃の温度で熱
風乾燥してアルコール成分を揮発させ、次いで−７０℃
で凍結させ、凍結乾燥器を用いて乾燥する。乾燥された
β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンは、粉砕器により粉砕
して粉末試料を製造する。

【００２０】一方、図１から、培養段階（２）において
β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンだけでなく、β−1,6-
分枝−β−1,3-グルカンを分解させ、かつ、菌糸体の成
長を抑制する副産物が生成されることがわかる。この副
産物は、エンドグルカナーゼ(endo-1,3-beta-glucanas
e)、及びＦＩＳ (fruiting-inducing substance 、子実
体形成誘導物質) として知られたセレブロシド(cerebro
sides)の一種である(4E, 8E)-N-D-2'-ヒドロキシパルミ
トイル-1-o−β−D-グルコピラノシル−9-メチル−4,8-
スフィンガジエニン｛(4E,8E)-N-D-2'-hydroxypalmitoy
l-1-O-beta-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadi
enine ｝と(4E, 8E)-N-D-2'-ヒドロキシステアロイル-1
-o−β−D-グルコピラノシル−9-メチル−4,8-スフィン
ガジエニン｛(4E,8E)-N-D-2'-hydroxystearoyl-1-O-bet
a-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine｝で
ある。

【００２１】ところで、エンドグルカナーゼ (Prokop e
t al.,1994. Can. J. Microbiol. Rev. Vol. 40, No.
1, pp. 18) は、スエヒロタケ培養過程の後半部に生産
され、既に生産されたβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカン
を分解して収率を減少させる要因になる。また、ＦＩＳ
(Mizushina et al. 1998. Biochem. Biophys. Res.Com
mun. Vol. 249, pp. 17)は、菌糸体の生長を抑制し、子
実体形成を誘導する物質であって、ＦＩＳにより菌糸体
の生長が中断されると、β−グルカンの生成も中断され
る要因になる (Wessels. 1978. Genetics and Morphoge
nesis in the Basidiomycetes. pp. 81-104. Academic
Press; Prokop et al., 1992. Experimental Mycology.
vol. 16. pp.197-206) 。それで、菌糸体培養の際には
これらを除去しなければならない。

【００２２】従って、本発明者等は、前記副産物を除去
して、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの収率を増加さ
せるため、研究を重ねた結果、段階（２）の際に液体培
地に活性炭を添加することにより、前記目的を達成する
ことができることを知見した。すなわち、副産物が菌糸
体の成長及びβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの生産に
影響を与えることなく、活性炭粉末に吸着され除去され
ることができる。

【００２３】活性炭は、培養２〜４日後に０．１〜５％
の量で添加することが好ましい。活性炭添加後、１〜４
日間更に培養する。その結果、単純液体培養法を実施す
る場合より約３０％向上した収率でβ−1,6-分枝−β−
1,3-グルカンを生産することができた。

【００２４】また、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの
収率を高めるため、スエヒロタケの菌糸体を液体培養す
る間にブドウ糖を供給することができる。すなわち、高
い細胞成長速度及び細胞濃度を得るためには比較的低い
Ｃ／Ｎ比率が効果的であり、β−1,6-分枝−β−1,3-グ
ルカンの生産性を向上させるためには高いＣ／Ｎ比率が
要望される。従って、本発明では、初期炭素源の量を減
少させること、すなわちブドウ糖１〜３％及び酵母抽出
物０．３〜０．５％を含有することにより、比較的低い
Ｃ／Ｎ比率を有する液体培地を製造することができ、β
−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの生産のため、培養中、
ブドウ糖を添加することにより、比較的高いＣ／Ｎ比率
を有する液体培地を製造することができる。ブドウ糖
は、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの生産が最高に至
ったとき、又は菌糸体の成長が減少されるとき、すなわ
ち培養３〜５日後に１〜１０％の量で添加することが好
ましい。ブドウ糖を添加した後、培養を１〜３日間続け
た。その結果、単純な液体培養法に比べて約３８％向上
した収率でβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを生産する
ことができた。

【００２５】また、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの
収率は、液体培地に活性炭及びブドウ糖の両者を添加す
ることにより更に増加させることができる。活性炭及び
ブドウ糖は、培養３〜５日後に、各々０．１〜２％及び
１〜１０％の量で添加することが好ましい。初期液体培
地は、低いＣ／Ｎ比を有するように、炭素源としてブド
ウ糖１〜３％と酵母抽出物０．３〜０．５％を含有する
ことが好ましい。活性炭及びブドウ糖を添加した後、１
〜５日間更に培養することができる。その結果、単純な
液体培養方法より約６０％向上した収率でβ−1,6-分枝
−β−1,3-グルカンを生産することができた。

【００２６】一方、図４から、β−1,6-分枝−β−1,3-
グルカンの生産性は、培養２日後から増加し始め、培養
６日後に最高に至ることがわかる。すなわち、活性炭及
びブドウ糖は、生産性を向上させ、生産期間を延長させ
て、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの収率を向上させ
る。

【００２７】上記した方法により製造されたβ−1,6-分
枝−β−1,3-グルカンは、皮膚老化防止、皮膚損傷治
癒、及び美白効果を有する外用剤組成物に使用される
が、その使用量は、その処方によって適当量選定される
ことができ、好ましくは外用剤組成物の総重量に対して
０．００００１〜１０重量％の量で含有される。

【００２８】本発明の外用剤組成物は、その処方 (form
ulation)において特に限定されるものではなく、例え
ば、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄
養クリーム、パック又はゲル (gel)の処方を有する化粧
料組成物であることができ、ローション、軟膏、ゲル、
クリーム、パッチ又はスプレーの処方を有する外用剤組
成物であることができる。

【００２９】また、各処方の外用剤組成物において、上
記β−1,6-分枝−β−1,3-グルカン以外の他の成分は、
外用剤の処方又は使用目的等によって、当業者が適宜選
定して配合することができる。

【００３０】

【実施例】以下、製造例及び試験例により本発明をより
詳しく説明する。しかしながら、本発明がこれらの例に
より限定されるものではない。

【００３１】〈製造例１〉 （１）酵母−麦芽抽出寒天培地（酵母抽出物３ｇ、麦芽
抽出物３ｇ、ペプトン５ｇ、ブドウ糖１０ｇ、寒天１５
ｇ、蒸留水１リットル）が入っている試験管にスエヒロ
タケの菌糸体を斜面培養した後、無菌的に均質化した。

【００３２】（２）これを、ブドウ糖３％、酵母抽出物
０．３％、二リン酸アンモニウム０．０５％、一リン酸
カリウム０．１％、及び硫酸マグネシウム０．０５％を
含有し、かつ、ｐＨ６．５に調整された栄養培地に３％
(v/v) となるように接種した後、３０リットル発酵槽内
で温度２８℃、回転数２００rpm 、通気量１vvm の条件
で５日間培養した。培養完了後、測定された菌糸体の濃
度は約４．０ｇ／リットルであり、β−1,6-分枝−β−
1,3-グルカンの濃度は９．５ｇ／リットルであった（図
１）。

【００３３】（３）培養終了後に、培養液に活性炭粉末
１％（韓国の第一化学社製）を添加し、３０分間攪拌し
て色素及び蛋白質成分を吸着して除去した後、圧縮濾過
装置で濾過することにより、菌糸体一部と活性炭が除去
された溶液を得た。

【００３４】（４）前記溶液を、１μｍ及び０．４５μ
ｍサイズの微細孔を有する濾過膜に順に通過させ、菌糸
体と活性炭が完全に除去された清浄の無色又は薄茶色の
培養液を得た。この培養液に３．５倍量のエチルアルコ
ールを徐々に加え、室温で一晩放置して沈殿させた後、
回収し、更に初期液量と同量の水に溶解させた。同じ方
法で、２倍量のエチルアルコールを徐々に加えた後、室
温で一晩放置して沈殿させた後、回収し、更に初期液量
と同量の水に溶解させた。同じ方法で、同量のエチルア
ルコールを徐々に加えた後、室温で一晩放置して沈殿さ
せた後、回収した。

【００３５】（５）回収された沈殿物を、８０℃の温度
で熱風乾燥してアルコール成分を揮発させた後、−７０
℃で凍結させ、凍結乾燥器を用いて乾燥した後、粉砕器
により粉砕して粉末の化合物を得た。このようにして製
造された粉末化合物の成分を、赤外線吸光器（Biorad
社、ＦＴＳ−４０）で確認し、スペクトルを得た。その
結果を図２に示す。図２の分析結果から、上記方法で製
造された物質が波長８８９．４ｎｍでβ結合を有するβ
−アノマ (beta-anomer)、すなわち目的化合物である一
次β−グルカンであることを確認した。

【００３６】また、核磁気共鳴分析器（Varian Gemini-
2000, 300MHa, FT-NMR）を用いて最終化合物について構
造分析を実施した。その結果、図３の¹³Ｃ−ＮＭＲスペ
クトルを得た。図３の分析結果から、主成分がβ−1,3-
D-グルコース３分子当たり１つのβ−1,6-D-グルコース
を有する構造、すなわちβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ンであることを確認した。この際、¹³Ｃ−ＮＭＲスペク
トルは、図３に示すように、若干の不純物によるピーク
が存在しているが、主成分がβ−1,6-D-グルコース３分
子当たり１つのβ−1,6-D-グルコースを有する構造であ
ることが確認された。

【００３７】¹³Ｃ−ＮＭＲ： C-6(61.15), C-4(68.58), C-6(70.25), C-2(72.74), C-
2(73.80),C-3(74.81), C-5(76.40), C-3(86.44), C-1(1
03.11)ppm 更に、しな藻屑蟹 (horseshoe crab) の変形細胞分解物
(amoebocyte lysate)とβ−グルカンとの反応によるビ
ジスタエイキット (BGSTAR A kit) を用いた確認法 (日
本国の和光純薬工業株式会社；Wako Pure Chemical Ind
ustries, Ltd.)により、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
ンの純度を測定した結果、９９．２％であった。

【００３８】〈製造例２〉 （１）前記斜面培地で継代培養されたスエヒロタケの菌
糸体を無菌的に均質化して、これを、ブドウ糖３％、酵
母抽出物０．３％、硫酸アンモニウム０．０５％、一リ
ン酸カリウム０．１％、及び硫酸マグネシウム０．０５
％を含有し、かつ、ｐＨ６．５に調整した栄養培地に３
％(v/v) になるように接種した後、３０リットル発酵槽
内で温度２８℃、回転数２００rpm 、通気量１vvm の条
件で３日間液体培養した後、滅菌された活性炭粉末を
０．５％の量で投与した後、３日間更に培養した。この
際、測定された菌糸体の濃度は約３．８ｇ／リットルで
あり、また、β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの濃度は
約１２．３ｇ／リットルであった 。

【００３９】（２）培養終了後、圧縮濾過装置で濾過し
た後、活性炭粉末（韓国の第一化学社製）０．５％を添
加し、３０分間攪拌して色素及び蛋白成分を吸着して除
去した。

【００４０】（３）製造例１の（４）〜（５）と同じ方
法によって実施して粉末の化合物を得た。製造例１と同
一の条件でビジスタエイキット法によりβ−1,6-分枝−
β−1,3-グルカンの純度を測定した結果、９９．５％で
あった。

【００４１】〈製造例３〉 （１）前記斜面培地で継代培養されたスエヒロタケの菌
糸体を無菌的に均質化して、これを、ブドウ糖２％、酵
母抽出物０．４％、二リン酸アンモニウム０．０５％、
一リン酸カリウム０．１％、及び硫酸マグネシウム０．
０５％を含有し、かつ、ｐＨ６．５に調整した栄養培地
に３％(v/v) になるように接種した後、３０リットル発
酵槽内で温度２８℃、回転数２００rpm 、通気量１vvm
の条件で４日間液体培養した後、ブドウ糖を３％の量で
添加して、２日間更に培養した。この際、測定された菌
糸体の濃度は約４．５ｇ／リットルであり、β−1,6-分
枝−β−1,3-グルカンの濃度は約１３．１ｇ／リットル
であった。

【００４２】（２）製造例１の（３）〜（５）と同じ方
法によって実施して粉末の化合物を得た。製造例１と同
一の条件でビジスタエイキット法によりβ−1,6-分枝−
β−1,3-グルカンの純度を測定した結果、９９．４％で
あった。

【００４３】〈製造例４〉 （１）前記斜面培地で継代培養されたスエヒロタケの菌
糸体を無菌的に均質化して、これを、ブドウ糖２％、酵
母抽出物０．４％、硫酸アンモニウム０．０５％、一リ
ン酸カリウム０．１％、及び硫酸マグネシウム０．０５
％を含有し、かつ、ｐＨ６．５に調整した栄養培地に３
％(v/v) になるように接種した後、３０リットル発酵槽
内で温度２８℃、回転数２００rpm 、通気量１vvm の条
件で４日間液体培養した後、活性炭粉末０．５％及びブ
ドウ糖３％を投与して２日間更に培養した。この際、測
定された菌糸体の濃度は約４．５ｇ／リットルであり、
β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの濃度は約１５．１ｇ
／リットルであった。

【００４４】（２）製造例１の（３）〜（５）と同じ方
法によって実施して粉末の化合物を得た。製造例１と同
一の条件でビジスタエイキット法によりβ−1,6-分枝−
β−1,3-グルカンの純度を測定した結果、９９．６％で
あった。

【００４５】〈試験例１〉繊維芽細胞 (Fibroblast) の
増殖効能の測定 ２．５％のウシ胎仔血清が含有されたＤＭＥＭ (Dulbec
co's Modified Eagle's Media)培地で培養した人間の繊
維芽細胞を、９６孔平板培養器 (96-well microtiter p
late) に５０００細胞／wellになるように分株した。試
料として製造例１及び４により得られたスエヒロタケの
β−1,6-分枝−β−1,3-グルカン及び酵母由来のβ−1,
3-グルカンであるGluCare-S (Cosmoferm社製) を各々１
％の量で使用し、培養培地に順次的に希釈して添加した
後、３７℃の温度で４日間培養した。また、スエヒロタ
ケ抽出物は、製造例１と同様に培養した培養物を、圧縮
濾過装置を用いて濾過した後、濾液を１μｍ及び０．４
５μｍの微細孔を有する濾過膜に順に通過させて、通過
された濾液をそのまま１００％抽出物として使用した。
試料の培養を完了した後、０．２％ＭＴＴ｛3-[4,5-dim
ethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltertazolium bromid
e｝溶液を各well当たり５０μｌずつ添加し、更に３７
℃の温度で４時間培養した後、生成されたホルマザン
(formazan) をＤＭＳＯ (Dimethyl sulfoxide) を使用
して溶解させた。溶解されたホルマザンの吸光度を平板
培養測定器 (microplate reader)を用いて５７０ｎｍで
測定した。これを無処理群と比較して繊維芽細胞の増殖
如何を判定した。その結果を下記表１に示す。

【００４６】

【表１】

【００４７】前記表１から明らかなように、無処理群と
比較して、酵母由来のβ−1,3-グルカンであるGluCare-
S を処理した繊維芽細胞は最高約７％程度の増殖効能を
示したが、スエヒロタケ由来のβ−1,6-分枝−β−1,3-
グルカンを処理した繊維芽細胞は最高約４０％程度向上
した増殖効能を示した。一方、１００％スエヒロタケ抽
出物は最高約１７％程度繊維芽細胞を増殖させた。

【００４８】〈試験例２〉角質形成細胞 (Keratinocyt
e) の増殖効能測定 角質形成細胞を使用して、試験例１と同じ方法で角質形
成細胞の増殖効能を測定した。結果を下記表２に示す。

【００４９】

【表２】

【００５０】前記表２から明らかなように、無処理群と
比較して、酵母由来のβ−1,3-グルカンであるGluCare-
S を処理した角質形成細胞は最高約１２％程度の増殖効
能を示したが、スエヒロタケ由来のβ−1,6-分枝−β−
1,3-グルカンを処理した角質形成細胞は最高約２０％程
度向上した増殖効能を示した。一方、１００％スエヒロ
タケ抽出物は最高約１３％程度角質形成細胞を増殖させ
た。

【００５１】〈試験例３〉繊維芽細胞のコラーゲン合成
程度の測定 人体繊維芽細胞を２４孔平板培養器に培養した後、試験
例１と同一の試料を使用して培養培地に１／１０ずつ順
次的に希釈して添加した。培養３日目、１０％のウシ胎
仔血清が含有されたＤＭＥＭ培地を各well当たり０．５
ｍｌずつ添加した後、L[2,3,4,5-³H]-プロリン１０μＣ
ｉを添加した。２４時間後、各wellに入っている培地と
細胞を集めて、５％トリクロロアセト酸 (ＴＣＡ；Tric
hloroacetic acid) 溶液に入れ、水洗した後、２つの試
験管に分株した。

【００５２】１つの試験管には、タイプＩコラゲナーゼ
(type I collagenase) １unit／μｌを入れ、３７℃の
温度で９０分間培養し、もう１つの試験管は、４℃で保
管した。その後、全ての試験管に５０％ＴＣＡを０．０
５ｍｌずつ添加し、４℃で２０分間放置した後、各々１
２，０００rpm で１０分間遠心分離して、各々の上澄み
液と沈殿物を液体シンチレーション計数器 (ＬＳＣ；Li
quid Scintillation Counter) で測定してＤＰＭ (Deca
y Per Minute) 値を得た後、下記計算式１ ＲＣＢ＝｛コラーゲンDPM ／[(全体コラーゲン−コラー
ゲンDPM)×５．４＋コラーゲンDPM]｝×１００ に基づいてコラーゲン生合成値 (ＲＣＢ；Relative Col
lagen Biosynthesis) を求めた。結果を下記表３に示
す。

【００５３】

【表３】

【００５４】前記表３に示す結果から明らかなように、
無処理群と比較して、酵母由来のβ−1,3-グルカンであ
るGluCare-S を処理した繊維芽細胞は最高約５％程度の
コラーゲン合成増加を示したが、スエヒロタケ由来のβ
−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを処理した繊維芽細胞は
最高約３２％程度向上したコラーゲン合成増加を示し
た。一方、１００％スエヒロタケ抽出物は最高約１２％
程度のコラーゲン合成増加を示した。

【００５５】〈試験例４〉日光による皮膚損傷治癒効能
試験 皮膚色素測定器 (Chromameter CM2002) を用いて照査部
位の皮膚色初期値を測定した。ソラーシミュレータ (So
lar simulator)を用いて被験者の上膊部位でＭＥＤを測
定した後、１．５ＭＥＤの紫外線を照査して紅斑 (eryt
hema) を誘発し、照査６時間後、８時間後、１０時間
後、１２時間後、１６時間後、２４時間後に、試験例１
と同一の試料を各々２０μｍずつ処理した。照査後１６
時間、２４時間、４８時間が経過した時に、皮膚色素測
定器を用いて前記試料の紅斑を測定し、対照群と比較し
て火傷治癒効能を評価した。この際、紅斑指数は、最初
紫外線照査前の皮膚色素測定値を１００に換算した値で
あり、紅斑指数は、アノバテスト (Anova test) を通じ
て通計的有意性 (significance) を検証し、ｐ＜０．０
５範囲を通計的に有意のものと判定した。その結果を下
記表４に示す。

【００５６】

【表４】

【００５７】前記表４から明らかなように、対照群と比
較して、酵母由来のβ−1,3-グルカンであるGluCare-S
を処理した皮膚損傷部位は、４８時間が経過した時に、
最高５．５６％の日光火傷治癒効能を示した。また、１
００％スエヒロタケ抽出物を処理した皮膚損傷部位は最
高約８．２４％の日光火傷治癒効能を示したが、スエヒ
ロタケ由来のβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを処理し
た皮膚損傷部位は最高約２２．３５％向上した日光火傷
治癒効能を示した。

【００５８】〈試験例５〉人体皮膚を対象とした美白効
能試験 試験対象者である１０人の男性各々に対して実験部位を
設定し、実験部位中の一定部位（直径１．５ｃｍの６つ
の孔）を除去した不透明テープで取り付けた後、ＵＶＡ
ランプ (TL20W/09U.V., フィリプス社) とＵＶＢランプ
(TL20W/12U.V., フィリプス社) を１：１で混合して２
００ｍＪ／ｃｍ² の強さで紫外線を照査した。紫外線照
査後、２週間放置して色素沈着が安定されると、２ヶ月
間１日２回ずつ製造例４及びGluCare-S を各々０．１％
処理した試料と、製造例１と同様に培養した培養物を、
圧縮濾過装置を用いて濾過した後、濾液を１μｍ及び４
５μｍの微細孔を有する濾過膜に順に通過させて通過さ
れた濾液である１００％スエヒロタケ抽出物を２５％で
希釈処理した試料とを各々塗布した。試料処置期間中、
一定の間隔で色素測定器 (Chromameter CM2002) を用い
て皮膚色を測定した。この際、紫外線照査後２週間が経
過して色素沈着が安定された時のＬ値（皮膚白色度）を
０にセットし、以後の変化程度（ΔＬ）を測定した。そ
の結果を下記表５に示す。

【００５９】

【表５】

【００６０】表５から明らかなように、試験対象者１０
人の皮膚色変化平均値を要約すると、β−グルカン処理
日から１０日が経過した時に全般的に白色度が増加した
が、β−グルカン無処理試料に比べて、製造例４は、
３．８倍程度の急激な白色度増加を示し、β−1,6-分枝
−β−1,3-グルカン処理日から６０日が経過した時に
も、無処理群に比べて１．６倍程度向上した白色度増加
を示した。

【００６１】〈試験例６〉人体皮膚を対象とした皮膚し
わの改善効果 ３５〜４５歳の顔面しわのある試験対象者１０人を対象
として、下記表６に示すような組成を有する栄養クリー
ムに、製造例１のスエヒロタケ由来のβ−1,6-分枝−β
−1,3-グルカンを処理した実施例１の場合と、β−1,6-
分枝−β−1,3-グルカンを含有しない比較例１の場合と
について、皮膚しわ改善効果を調べ、その結果を比較評
価した。

【００６２】

【表６】

【００６３】被験者の顔面左部には実施例１を、右部に
は比較例１を３ヶ月間使用するようにした。クリーム使
用前の顔面両側部の皮膚状態を測定しておいた後、クリ
ーム使用３ヶ月後、同一部位を再測定して、皮膚しわの
変化を測定した。皮膚測定は、温度２４℃、相対湿度４
０％の恒温恒湿室で行い、目尻部位のしわをレプリカ(r
eplica)で取ってビシオメタシステム (Visiometer syst
em; C+K社) で皮膚しわを測定した。皮膚しわの変化量
は下記計算式２ 変化量（Δ％）＝〔（Ｔ_di−Ｔ_do）÷Ｔ_do〕×１００ （但し、式中、Ｔ_diはＤ₉₀での測定部位値であり、Ｔ_do
はＤ₀ での測定部位値である）によって計算した。

【００６４】上記式に基づいて計算した結果、比較例１
を使用した部位の皮膚しわは、３．１±２．２％（平均
±標準偏差）の減少値を示す反面、実施例１を使用した
部位の皮膚しわは、１５±４．１％の減少値を示し、優
れた皮膚しわ改善効果を示した。

【００６５】以下、処方例１〜９を挙げて、前記製造例
１〜４で製造されたスエヒロタケ由来のβ−1,6-分枝−
β−1,3-グルカンを含有する化粧料組成物の構成をより
詳しく説明する。しかし、本発明の組成物がこれらの処
方例に限定されるものではない。

【００６６】

【表７】

【００６７】

【表８】

【００６８】

【表９】

【００６９】

【表１０】

【００７０】

【表１１】

【００７１】

【表１２】

【００７２】

【表１３】

【００７３】

【表１４】

【００７４】

【表１５】

【００７５】

【発明の効果】以上説明したように、スエヒロタケの菌
糸体を液体培養することにより、スエヒロタケ由来のβ
−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを短期間に高収率で生産
することができる。また、このような方法により製造さ
れたβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを外用剤組成物に
含有させることにより、優れた皮膚老化防止効果、美白
効果及び皮膚損傷緩和効果を有する外用剤組成物を提供
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の液体培養によるスエヒロタ
ケ菌糸体の成長（◆）及びβ−1,6-分枝−β−1,3-グル
カンの生成量（□）の経時変化を示すグラフ図である。

【図２】 図２は、本発明の液体培養法により得られた
β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの赤外線吸光スペクト
ルを示すグラフ図である。

【図３】 図３は、本発明の液体培養法により得られた
β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンの核磁気共鳴スペクト
ルを示すグラフ図である。

【図４】 図４は、活性炭粉末及びブドウ糖を液体培地
に添加する２段階培養法により得られたスエヒロタケ菌
糸体の成長（◆）及びβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカン
の生成量（□）の経時変化を示すグラフ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 7/48 Ａ６１Ｋ 7/48 9/06 9/06 Ｇ 9/70 ３４１ 9/70 ３４１ 31/00 ６１７ 31/00 ６１７ ６４３ ６４３Ｃ 31/715 31/715 35/84 35/84 Ａ Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｑ Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 蘇 星 大韓民国京畿道水原市八達區梅灘３洞、新 梅灘アパート101棟506号 (72)発明者 金 武 成 大韓民国京畿道水原市八達區牛滿洞555− ３番地 (72)発明者 金 重 秀 大韓民国京畿道水原市八達區梅灘洞、盛一 アパート201棟911号 (72)発明者 金 永 澤 大韓民国京畿道龍仁市器興邑下褐里192− ５番地、明星ビラＡ棟301号 (72)発明者 李 聖 九 大韓民国京畿道龍仁市器興邑寶羅里314− １番地 (72)発明者 李 東 哲 大韓民国ソウル特別市江東區高徳２洞186 −４番地

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）スエヒロタケの菌糸体を準備する
   段階と、 （２）前記段階（１）の菌糸体を、ブドウ糖１〜１０
   ％、酵母抽出物０．１〜１％、二リン酸アンモニウム
   〔（ＮＨ₄ ）₂ ＨＰＯ₄ 〕又は硫酸アンモニウム〔（Ｎ
   Ｈ₄ ）₂ ＳＯ₄ 〕０．０５〜０．５％、一リン酸カリウ
   ム（ＫＨ₂ ＰＯ₄ ）０．０５〜０．５％、硫酸マグネシ
   ウム（ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ）０．００５〜０．２％を
   含有し、かつ、ｐＨ４．０〜８．５に調整された液体培
   地で培養する段階と、 （３）前記液体培地からβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカ
   ンを分離する段階と、 （４）前記β−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを精製する
   段階とを含むことを特徴とするβ−1,6-分枝−β−1,3-
   グルカンを分離するためのスエヒロタケの液体培養方
   法。
2. 【請求項２】 培養２〜４日後に前記液体培地に活性炭
   を０．１〜５％の量で添加した後、１〜４日間更に培養
   する段階を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の
   方法。
3. 【請求項３】 前記液体培地は、ブドウ糖１〜３％、酵
   母抽出物０．３〜０．５％、二リン酸アンモニウム又は
   硫酸アンモニウム０．０５〜０．５％、一リン酸カリウ
   ム０．０５〜０．５％、硫酸マグネシウム０．００５〜
   ０．２％を含有し、培養３〜５日後に前記液体培地にブ
   ドウ糖を１〜１０％の量で添加し、１〜３日間更に培養
   する段階を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の
   方法。
4. 【請求項４】 前記液体培地は、ブドウ糖１〜３％、酵
   母抽出物０．３〜０．５％、二リン酸アンモニウム又は
   硫酸アンモニウム０．０５〜０．５％、一リン酸カリウ
   ム０．０５〜０．５％、硫酸マグネシウム０．００５〜
   ０．２％を含有し、培養３〜５日後に前記液体培地に活
   性炭０．１〜５％及びブドウ糖１〜１０％を添加し、１
   〜５日間更に培養する段階を更に含むことを特徴とする
   請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法に
   より得られたβ−1,6-分枝−β−1,3-グルカンを、組成
   物の総重量に対して０．００００１〜１０重量％の量で
   含有することを特徴とする外用剤組成物。
6. 【請求項６】 前記組成物は、柔軟化粧水（スキンロー
   ション）、栄養化粧水（ミルクローション）、栄養クリ
   ーム、マッサージクリーム、パック又はゲルの処方を有
   する化粧料組成物であることを特徴とする請求項５に記
   載の外用剤組成物。
7. 【請求項７】 前記組成物は、ローション、軟膏、ゲ
   ル、クリーム、パッチ又はスプレーの経皮投与用処方を
   有することを特徴とする請求項５に記載の外用剤組成
   物。