CN113384513A - 一种酵母菌发酵产物滤液的制备方法及在化妆品中的应用 - Google Patents

一种酵母菌发酵产物滤液的制备方法及在化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合物的制备方法，包括如下步骤：将珍珠母粉与水混合，得到第一混合物，对第一混合物进行第一离心，得到第一上清液；将酵母接种于复合培养基中进行发酵增殖，得到酵母培养液，其中，复合培养基含有第一上清液和麦芽汁；将酵母培养液中的酵母菌体进行细胞破裂，得到酵母溶胞产物；将酵母溶胞产物与第一上清液混合，得到复合物。本发明还公开了了一种组合物，包括前述复合物、丁二醇、果糖、弹性蛋白、β‑葡聚糖、甘草酸二钾、烃苯甲酯、透明质酸钠、黄原胶、PEG—40氢化蓖麻油、香精。前述复合物与前述组合物能够起到良好的抗氧化作用，可应用于化妆品。

Description

一种酵母菌发酵产物滤液的制备方法及在化妆品中的应用
技术领域
本发明属于日用化妆品领域，具体涉及一种酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液的制备方法。
背景技术
近年来，由于化妆品和个人护理产品的矫正，装饰和卫生功能，它们在全球的使用量有所增加。在全球范围内，化妆品行业代表着活跃的经济行业，每年持续增长约6％。利用生物活性化合物的化妆品的新配方的发展已迅速扩大，鉴于消费者对产品的需求与源自天然来源的保护性和治疗性功能。目前市场出现新的化妆品制剂，提供分子与对人的皮肤，影响皮肤的生物学功能，诸如蜂窝保护，体温调节，和免疫的效果。这些化合物多为植物化学物质(例如植物提取物，多酚)，微生物的代谢产物(例如微生物提取物，乳酸，透明质酸)，和矿物/维生素(例如硒，维生素E)。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为最著名的微生物之一，由于其高发酵速率，安全性和耐用性而被广泛用于生物乙醇和其他特殊化学品的工业生产。根据衰老的氧化应激理论(最早于1954年提出)，衰老与正常细胞新陈代谢所产生的ROS触发的细胞损伤累积有关。因此，在整个老化过程中，抗氧化剂会减少，从而增加氧化损伤，研究表明酿酒酵母的氧化应激反应与哺乳动物相似，包括ETC中ROS的形成位点和主要的抗氧化酶。像哺乳动物的复合体I一样，Nde1和Nde2是酿酒酵母ETC中ROS的重要来源，酿酒酵母代谢产物不仅富含蛋白质和氨基酸，而且还包含各种生物小分子，例如β-葡聚糖，甘露寡糖，几丁质和核酸，可以提供特定的生理功能来改善皮肤健康。
研究表明珍珠母是一种生物材料，由矿物相，文石形式结晶的碳酸钙和有机基质组成，MS/MS片段化后获得的一些水溶性肽序列显示57Da位移对应于甘氨酸残基的重复。此外，甘氨酸与丙氨酸的交换解释了在某些肽之间观察到的14Da位移。这些数据首次表明小分子，尤其是肽是珍珠母的普遍成分。
中国专利申请(申请号CN202011004894.3)中公开了一种酵母菌发酵溶胞产物及其制备方法与应用，其特征在于，(1)所述酵母菌发酵溶胞产物的提取方法包括酵母的发酵增殖、酵母菌体的获取、酵母浓缩液的制备和酵母菌发酵溶胞产物的获取。(2)公开的酵母菌发酵溶胞产物用于毛发护理组合物中时可显著改善角蛋白纤维，对毛发具有调理作用，可增加毛发光泽和触感、修复损伤毛发。
中国专利申请(申请号CN201310581487.2)中公开了一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征在于，取珍珠母生品，加入蒸馏水，加热回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至适量后，冻干成粉，即得珍珠母生品冻干粉。将其冻干粉经Sephadex LH-20和反相硅胶C8的两次柱层析的分离纯化及高效液相色谱的进一步纯化得到一个单体寡肽化合物。经现代质谱技术和肽键裂解规律得到分子量为302的寡肽。为首次从珍珠母中分离得到。结果显示珍珠母炮制品的抗氧化活性强于生品，是生品抗氧化性的七倍。具有广泛推广的意义。
中国专利申请(申请号CN201910574472.0)中公开了一种含乳酸杆菌发酵溶胞产物药用植物精华液及其制备方法和应用，其特征在于，所述精华液包括下述重量百分比的活性组分：乳酸杆菌发酵溶胞产物1.0～3.0％、川贝母鳞茎提取物1.0～3.0％、禹白附块茎提取物1.0～3.0％、半夏曲块茎提取物1.0～3.0％，余量为辅料及去离子水。可以有效应对因皮肤油脂分泌旺盛而产生毛孔阻塞后产生痘痘发炎化脓现象,加强了活性组分导入毛囊通道的能力，使得活性组分对于抚平痘印的效果加强。
中国专利申请(申请号CN201910753546.7)中公开了一种保持皮肤微生态平衡的护肤品及制备方法，所述护肤品成分包括：水、甘油、丁二醇、戊糖乳酸杆菌发酵溶胞产物、七肽、银耳提取物、芽孢杆菌、大豆发酵产物提取物，其中各个成分的重量比为水20％-50％、甘油10％、丁二醇5％、戊糖乳酸杆菌发酵溶胞产物10％、七肽1％-5％、银耳提取物20％、芽孢杆菌1％、大豆发酵产物提取物1％。并且添加皮肤有益细菌生长的七肽，戊糖乳酸杆菌发酵溶胞产物具有很好的舒缓、镇静和保湿功效，实验证明，使用含有戊糖乳酸杆菌发酵溶胞产物2％以上皮肤的微生物群落相对丰度提高、微生物种类更加多样。
发明内容
本发明第一方面提供了一种复合物的制备方法，所述复合物的制备方法包括如下步骤：
S1：将珍珠母粉与水混合，得到第一混合物，对所述第一混合物进行第一离心，得到第一上清液；
S2：将酵母接种于复合培养基中进行发酵增殖，得到酵母培养液，其中，所述复合培养基含有所述第一上清液和麦芽汁；
S3：将所述酵母培养液中的酵母菌体进行细胞破裂，得到酵母溶胞产物；
S4：将所述酵母溶胞产物与所述第一上清液混合，得到所述复合物。
第一上清液中含有珍珠母粉中的有效小分子成分。
在一些实施方式中，所述复合物的制备方法还包括如下步骤：
S5：纯化所述复合物，得到精制的所述复合物。
在一些实施方式中，在步骤S1中，将珍珠母干燥，粉碎，过100目筛，取筛下物，得到所述珍珠母粉。
在一些实施方式中，在步骤S1中，将所述珍珠母粉灭菌后使用。
在一些实施方式中，在步骤S1中，所述珍珠母粉与水的用量重量比为：3-60：1。
在一些实施方式中，所述第一离心的条件为6000-8000rpm，3-10min。
在一些实施方式中，将所述第一上清液经0.45μm孔径滤膜抽滤，取滤液，得到精制的所述第一上清液。
在一些实施方式中，在步骤S1中，将所述第一混合物进行超声处理，超声功率为30-40W，超声时间3-10min，在pH4.0-6.0、2-6℃条件下静止6-24h，然后进行所述第一离心。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述酵母为酿酒酵母。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述第一上清液和所述麦芽汁的用量重量比为：1:9-16。
上清液过多成本较高，麦芽汁过多不利于酵母生长。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述酵母的干重与所述复合培养基的重量之比为：1:10-20。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述发酵增殖的条件为：28-30℃，培养2-5天。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述酵母培养液中酵母含量达到0.5-3×107个/mL。
在一些实施方式中，在步骤S3中，用溶菌酶进行所述酵母菌体细胞破裂。
在一些实施方式中，在步骤S3中，用溶菌酶对所述酵母菌体溶液中的酵母菌体进行细胞破裂，所述酵母菌体浓度为10-30mg/L。
在一些实施方式中，在步骤S3中，所述溶菌酶与所述酵母菌体的重量比为：1:300-1000。
在一些实施方式中，在步骤S3中，将所述酵母培养液在3000-6000rpm条件下进行第二离心5-12min，取沉淀，得到所述酵母菌体。
在一些实施方式中，在步骤S3中，将所述酵母溶胞产物在1000-3500rpm条件下第三离心20-60min，取上清，得到精制的所述酵母溶胞产物。
在一些实施方式中，在步骤S4中，所述酵母溶胞产物与所述第一上清液的用量体积比为：1:0.5-5。
在一些实施方式中，在步骤S5中，用截留分子量为100kDa-2000kDa的超滤膜对所述复合物进行纯化。
在一些实施方式中，用水将所述复合物的浓度调整为5-15mg/ml。
本发明第二方面提供了一种复合物，所述复合物是通过本发明第一方面所述的复合物的制备方法制备得到的。
本发明第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括本发明第二方面所述的复合物、丁二醇、果糖、弹性蛋白、β-葡聚糖、甘草酸二钾、烃苯甲酯、透明质酸钠、黄原胶、PEG—40氢化蓖麻油、香精。
进一步改善产品质地以及提高皮肤对有效成分的吸收效率，配方安全。
在一些实施方式中，本发明第二方面所述的复合物、所述丁二醇、所述果糖、所述弹性蛋白、所述β-葡聚糖、所述甘草酸二钾、所述烃苯甲酯、所述透明质酸钠、所述黄原胶、所述PEG—40氢化蓖麻油、所述香精的用量比为：1.0-1.5ml：2.5-7.5g：2-4g：5-15g：2.5-7.5g：0.5-1.5g：1-3g：2.5-7.5g：0.5-1.5g：1.5-4.5g：1-3g。
在一些实施方式中，所述香精为黄瓜香精。
本发明第四方面提供了一种组合物的制备方法，所述组合物的制备方法为：将本发明第二方面所述的复合物、丁二醇、果糖、弹性蛋白、β-葡聚糖、甘草酸二钾、烃苯甲酯、透明质酸钠、黄原胶、PEG—40氢化蓖麻油、香精混合，得到所述组合物。
在一些实施方式中，将所述组合物过80目滤网后去渣，得到精制的所述组合物。
在一些实施方式中，将所述组合物灭菌，得到灭菌的所述组合物。
本发明第五方面提供了本发明第一方面所述的复合物的制备方法，本发明第二方面所述的复合物，本发明第三方面所述的组合物或本发明第四方面所述的组合物的制备方法，在制备用于抗氧化的制剂中的用途。
在一些实施方式中，所述制剂为化妆品。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：以本发明公开的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物用于皮肤护理中时可修复受损肌肤，提高皮肤抗氧化能力，加强肌肤防御外界刺激能力，能够淡化色斑，保湿抗过敏并且制备方法简单，适于工业化生产。
附图说明
图1为细胞中谷胱甘肽含量随时间变化对比示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1：发酵液的制备
本实施例的目的在于提供一种抗氧化、美白、修复肌肤损伤的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液的制备方法。
为实现上述目的，本实施例所采取的技术方案包含如下步骤：
(1)将来自双壳纲的三角帆蚌的珍珠母60℃过夜干燥后粉碎，用200目的筛子过筛，将所得样品(筛下物)置于高温灭菌锅中121℃，15分钟灭菌处理，将去离子水与样品以50:1的重量比混合，置于超声机中超声5min，功率为：35w，接着以1mmol/L的盐酸溶液调节pH值为5.0，置于4℃过夜；于4℃温度下7000转/分钟离心5分钟，并收集上清液，将上清液经0.45μm孔径滤膜抽滤得到的滤液即为珍珠母粉中活性成分。
(2)待步骤(1)完成后将所得滤液加入基础培养基中形成复合培养基后，再向复合培养基中添加酵母进行发酵增殖；滤液与基础培养基的用量质量比为1:15，酵母干粉与复合培养基的质量比为1:12。
酵母的发酵增殖过程为：取酵母，接种于复合培养基中，在29℃恒温下培养3.5天，酵母数达到16×106个/mL。
本步骤的酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。基础培养基为麦芽汁。所选麦芽汁为食品级，纯度为98％。
(3)待步骤(2)完成后，将增殖的酵母离心分离，离心速度为5000rpm，离心时间为8分钟。取沉淀物即得酵母菌体；
(4)待步骤(3)完成后，使用去离子水作为溶剂配制20mg/L酵母菌体溶液，接着加入溶菌酶将所获得的酵母菌体进行溶菌，酵母菌体与溶菌酶的质量比为：酵母菌体：溶菌酶＝10000:17。对溶菌后的酵母菌体进行离心分离，离心速度为2800rpm，离心时间为40分钟；取上清液即得酵母溶胞浓缩液。
所述步骤(4)酵母溶胞浓缩液为酿酒酵母代谢产物，不仅富含蛋白质和氨基酸，而且还包含各种生物小分子，如β-葡聚糖，甘露寡糖，几丁质和核酸。
(5)待步骤(4)完成后，将获得的酵母溶胞浓缩液与步骤(1)所得珍珠母液滤液体积比为5:3混合，接着进行超滤，超滤膜的截留分子量为1000kDa，未通过超滤膜的过滤物(分子量大于1000kDa)即为酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物。
实施例2：发酵液的制备
与实施例1的差别在于，在步骤(5)中，将获得的酵母溶胞浓缩液与步骤(1)所得珍珠母液滤液体积比为5:10混合，得到酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物。
实施例3：发酵液的制备
与实施例1的差别在于，在步骤(1)中，去离子水与样品以50:15的重量比混合；在步骤(5)中，将获得的酵母溶胞浓缩液与步骤(1)所得珍珠母液滤液体积比为5:15混合，得到酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物。
实施例4
酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液抗氧化性能采用DPPH法进行测定，分析其对DPPH˙自由基的抑制率。将150μL0.05mM DPP(Sigma-Aldrich，美国)乙醇溶液添加到50μL实施例1步骤(5)制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液的乙醇溶液中，在96孔板中实施例1步骤(5)所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物在乙醇中的浓度为从0.97到250μg mL-1不等。采用抗坏血酸(Sigma-Aldrich，美国)用作相同浓度的标准品，以便验证DPPH法的有效性。反应在室温下在黑暗中发生30min，然后在分光光度计(λ＝510nm)中读取吸光度。DPPH自由基的抑制使用方程计算。
Figure BDA0003154877730000071
其中：A0为阴性对照(即，用乙醇代替酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液的乙醇溶液)的吸光度，As为样品的吸光度。由线性分散图方程计算出提取物抑制50％DPPH自由基的浓度值(IC50)。所有测试一式三份结果取平均值，结果表明由实施例1制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液的IC50浓度值为18μg ml-1。
实施例5
采用实施例2制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液，采用与实施例4相同的方法检测酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液抗氧化活性。结果表明IC50浓度值为14μg ml-1。
实施例6
采用实施例3制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液，采用与实施例4相同的方法检测酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液抗氧化活性。结果表明IC50浓度值为16μg ml-1。
实施例7:
在市场上购买丁二醇、果糖、弹性蛋白、β-葡聚糖、甘草酸二钾、烃苯甲酯、透明质酸钠、黄原胶、PEG—40氢化蓖麻油、植物香精(黄瓜香精)，以5：3：10：5:1:2:5:1:3:2质量比混合，以质量体积比为1g：50ml的比例，将前述混合物加入10mg/ml实施例1所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物水溶液(即，用无菌水将实施例1步骤(5)所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液稀释为10mg/ml)并搅拌均匀，过80目滤网后去渣得美容液，最后经过检验、消毒、灭菌和包装。经100名人员连续试用30天，用量：每日早，晚2mL，涂于面部，人员调查报告及现场科研人员检测表明无过敏，泛红，刺痛现象，皮肤状态显著改善，光滑，细嫩，轻微嫩白。符合实验预期：维持肌肤稳定状态，舒缓、保湿和改善皮肤健康吻合。
实施例8
用可见光照射指数生长的“人角质形成细胞(购自美国进口LONZA原代人表皮角质形成细胞)”(培养于培养瓶的磷酸盐缓冲液中：13mLNaCl，2.7mg KCL，8.3mgNa2HPO4，1.5mgKH2PO4，pH 7.4)，具体照射为：使用1000W卤素灯(飞利浦PF811)，光源距离细胞33cm持续照射30分钟。分为三组，分别为添加1、用无菌水将实施例1步骤(5)所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液稀释到10mg/ml，2、用无菌水将实施例1步骤(4)所制备的酵母菌发酵溶胞产物滤液稀释到10mg/ml，3、空白对照(无菌水)，三组中，前述液体在人角质形成细胞磷酸盐缓冲液中的添加量为2μl/mL，利用谷胱甘肽测试盒(购自上海信裕生物科技有限公司)使用可见分光光度计，24h后采用循环法测组织中总谷胱甘肽含量，如图1。
结果分析：根据IC50值将抗氧化活性分为最佳(IC50＜15μg ml-1)、良好(15μg ml-1＜IC50＜50μg ml-1)、平均(50μg ml-1＜IC50＜100μg ml-1)、和弱(IC50≥100μg ml-1)，实施例4，5，6表明所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液具有良好的抗氧化活性，尤其是实施例5所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液显示出最佳抗氧化活性，实施例8表明，与空白对照相比，实施例1步骤(4)所制备的酵母菌发酵溶胞产物能够显著降低细胞中谷胱甘肽的含量，实施例1步骤(5)所制备的酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物降低细胞中谷胱甘肽的含量的能力更强。实施例8表明复配珍珠母滤液对肌肤美白有显著效果细胞内的谷胱甘肽对于修复由UVA和可见光引起的氧化嘌呤至关重要，添加酵母菌-珍珠母发酵溶胞产物滤液有利于谷胱甘肽含量水平上升，有利于肌肤修复。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (10)

1.一种复合物的制备方法，所述复合物的制备方法包括如下步骤：
S1：将珍珠母粉与水混合，得到第一混合物，对所述第一混合物进行第一离心，得到第一上清液；
S2：将酵母接种于复合培养基中进行发酵增殖，得到酵母培养液，其中，所述复合培养基含有所述第一上清液和麦芽汁；
S3：将所述酵母培养液中的酵母菌体进行细胞破裂，得到酵母溶胞产物；
S4：将所述酵母溶胞产物与所述第一上清液混合，得到所述复合物。
2.如权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于，所述复合物的制备方法还包括如下步骤：
S5：纯化所述复合物，得到精制的所述复合物。
3.如权利要求1或2所述的复合物的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，将珍珠母干燥，粉碎，过100目筛，取筛下物，得到所述珍珠母粉；优选地，在步骤S1中，将所述珍珠母粉灭菌后使用；
优选地，在步骤S1中，所述珍珠母粉与水的用量重量比为：3-60：1；
优选地，所述第一离心的条件为6000-8000rpm，3-10min；
优选地，将所述第一上清液经0.45μm孔径滤膜抽滤，取滤液，得到精制的所述第一上清液；
优选地，在步骤S1中，将所述第一混合物进行超声处理，超声功率为30-40W，时间3-10min，在pH4.0-6.0、2-6℃条件下静止6-24h，然后进行所述第一离心；
优选地，在步骤S2中，所述酵母为酿酒酵母；
优选地，在步骤S2中，所述第一上清液和所述麦芽汁的用量重量比为：1:9-16；
优选地，在步骤S2中，所述酵母的干重与所述复合培养基的重量之比为：1:10-20；
优选地，在步骤S2中，所述发酵增殖的条件为：28-30℃，培养2-5天；
优选地，在步骤S2中，所述酵母培养液中酵母含量达到0.5-3×107个/mL；
优选地，在步骤S3中，用溶菌酶进行所述酵母菌体细胞破裂；
优选地，在步骤S3中，用溶菌酶对所述酵母菌体溶液中的酵母菌体进行细胞破裂，所述酵母菌体浓度为10-30mg/L；
优选地，在步骤S3中，所述溶菌酶与所述酵母菌体的重量比为：1:300-1000；
优选地，在步骤S3中，将所述酵母培养液在3000-6000rpm条件下进行第二离心5-12min，取沉淀，得到所述酵母菌体；
优选地，在步骤S3中，将所述酵母溶胞产物在1000-3500rpm条件下第三离心20-60min，取上清，得到精制的所述酵母溶胞产物；
优选地，在步骤S4中，所述酵母溶胞产物与所述第一上清液的用量体积比为：1:0.5-5；
优选地，在步骤S5中，用截留分子量为100kDa-2000kDa的超滤膜对所述复合物进行纯化；
优选地，用水将所述复合物的浓度调整为5-15mg/ml。
4.一种复合物，所述复合物是通过本权利要求1-3中任一项所述的复合物的制备方法制备得到的。
5.一种组合物，所述组合物包括权利要求4所述的复合物、丁二醇、果糖、弹性蛋白、β-葡聚糖、甘草酸二钾、烃苯甲酯、透明质酸钠、黄原胶、PEG—40氢化蓖麻油、香精。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，权利要求4所述的复合物、所述丁二醇、所述果糖、所述弹性蛋白、所述β-葡聚糖、所述甘草酸二钾、所述烃苯甲酯、所述透明质酸钠、所述黄原胶、所述PEG—40氢化蓖麻油、所述香精的用量比为：1.0-1.5ml：2.5-7.5g：2-4g：5-15g：2.5-7.5g：0.5-1.5g：1-3g：2.5-7.5g：0.5-1.5g：1.5-4.5g：1-3g；
优选地，所述香精为黄瓜香精。
7.一种组合物的制备方法，所述组合物的制备方法为：将权利要求4所述的复合物、丁二醇、果糖、弹性蛋白、β-葡聚糖、甘草酸二钾、烃苯甲酯、透明质酸钠、黄原胶、PEG—40氢化蓖麻油、香精混合，得到所述组合物。
8.如权利要求7所述的组合物的制备方法，其特征在于，将所述组合物过80目滤网后去渣，得到精制的所述组合物；
优选地，将所述组合物灭菌，得到灭菌的所述组合物。
9.权利要求1-3中任一项所述的复合物的制备方法，权利要求4所述的复合物，权利要求5或6所述的组合物或权利要求7或8所述的组合物的制备方法，在制备用于抗氧化的制剂中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述制剂为化妆品。
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