KR101747202B1 - 홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법{COMPOSITION COMPSING POLYSACCHARIDE EXTACTED FROM RED GINSENG OR OLOGOSACCHARIDE EXTACTED FROM RED GINSENG AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은 홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 홍삼으로부터 추출된 다당체 또는 이의 가수분해물을 함유하는 피부 외용제, 화장료 조성물 및 그 조성물 제조방법에 관한 것이다.

피부는 인체를 보호하는 1차적 기관이면서, 신체의 표면을 덮고 있는 가장 넓은 기관으로서, 표피, 진피 및 피하조직으로 구성된다. 이중, 표피의 가장 바깥층에 위치하는 각질층은 각질과 지질로 구성되어 있으며, 유해물질 침투나 수분증발을 억제하고, 박테리아나 외부 자극으로부터 인체를 보호한다. 또한 진피 윗부분에 많이 분포하는 섬유아세포는 탄력과 보호의 기능을 갖고 있는 섬유단백질인 콜라겐과 엘라스틴을 만들어 내는 역할을 하고 있다.

한편, 환경오염 및 다양한 외부 요인으로 피부손상, 면역력 등 피부재생 능력이 약해져, 각질층과 지질층이 손상되고 경피 수분 손실이 급격하게 증가하고, 피부건조, 주름생성, 가려움증, 세균감염에 따른 염증이 발생되기도 한다. 사람의 각질형성 세포나 표피 내의 대식세포인 랑게르한스 세포에서는 외부의 물질에 의해 다양한 사이토카인을 만들어 방출할 수 있는데, 이러한 사이토카인은 피부의 자극유발이나 국소적인 염증반응의 진행에 필수적이다(J. Appl. Toxicol., 1996, 16, 65-70). 실제로 자극성 접촉피부염에서 IL-6(Interleukin-6), IL-1(Interleukin-1), TNF-α(Tumornecrosis factor-α) 등이 증가된다고 보고된 바 있다(Contact Dermatitis, 1996, 35, 355-360). 또한 알러지 유발물질에 의해서도 IL-6(Interleukin-6)가 특이하게 증가되며, 특정 화학물질이 피부에 도포될 때도 IL-6, TNF-α가 유도된다는 것이 보고된 바 있다. TNF-α는 외부의 자극이나 감염원에 대해 염증세포 또는 면역세포에서 주로 분비되는 대표적인 사이토카인(cytokines)으로서, IL-1과 함께 감염, 염증, 자가면역, 알레르기성 질환의 매개에 중심적인 역할을 수행하는 염증 촉진 사이토카인(proinflammatory cytokine)이다. TNF-α에 의해 매개되는 피부에서의 만성 염증질환에는 건선, 습진 또는 지루성 피부염 등이 있으며, 급성 염증 질환으로는 접촉성 피부염 등이 포함된다. 피부재생 및 상처치유 는 손상된 조직이 정상적으로 복구하기 위한 일련의 순차적인 과정 즉 염증기(inflammatory stage), 증식기(proliferation stage) 및 리모델링기(remodeling stage)로 이루어진다(Kokane DD, Evaluation of wound healing activity of root Mimosa pudica, J Ethnopharmacol , 2009, 124(2),311-315).

여러 종류의 식물 및 허브가 상처치유, 피부재생을 증진시키기 위해 사용되고 있으며, 또한 더 나은 전통의학 치료 및 약용식물 탐색이 진행 중이나 (Lodhi S, Wound healing potential of Tephrosia purpurea(Linn.) Pers. in rats, J Ethnopharmacol, 2006, 108(2),204-210; Majumdar M, Evaluation of Tectona grandis leaves for wound healing activity, Pak J Pharm Sci, 2007, 20(2),120-124), 전통 홍삼에서 추출한 다당체 및 이를 올리고화한 올리고당의 효능에 대해서는 구체적으로 알려진 바가 없다.

Lodhi S, Wound healing potential of Tephrosia purpurea(Linn.) Pers. in rats, J Ethnopharmacol, 2006, 108(2),204-210; Majumdar M, Evaluation of Tectona grandis leaves for wound healing activity, Pak J Pharm Sci, 2007, 20(2),120-124

본 발명은 우수한 피부 재생 효과, 피부 상처 치유 효과, 산화 스트레스 억제 효과, 항노화 효과, 보습 효과, 피부 주름 억제 효과, 피부 주름 개선 효과, 광노화 억제 효과 및 미백 효과를 가지는 피부 외용제를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 홍삼으로부터 다당체를 추출하는 방법 및 상기 다당체를 가수분해시켜 가수분해물을 얻는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 홍삼을 상온 추출하여 홍삼 다당체를 얻는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 홍삼 다당체를 올리고화하여 홍삼 올리고당을 얻는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 우수한 피부 재생 효과, 피부 상처 치유 효과, 산화 스트레스 억제 효과, 항노화 효과, 보습 효과, 피부 주름 억제 효과, 피부 주름 개선 효과, 광노화 억제 효과 및 미백 효과을 가지는 홍삼의 다당체 및 올리고당을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제를 제공한다.

도 1은 시험예 1에서 시료 1의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 시험예 1에서 시료 1의 각 농도 별 각질 세포의 증식률을 도시한 것이다.
도 3은 시험예 1에서 시료 2의 각 농도 별 각질 세포의 증식률을 도시한 것이다.
도 4는 시험예 1에서 시료 1의 각 농도 별 섬유아세포의 증식률을 도시한 것이다.
도 5는 시험예 1에서 시료 2의 각 농도 별 섬유아세포의 세포 증식률을 도시한 것이다.
도 6은 시험예 2에서 시료 1 및 2의 긁힘 손상에 대한 HaCaT 세포주의 회복 양상을 나타낸 것이다.
도 7은 시험예 2에서 시료 1 및 2의 긁힘 손상에 대한 nHDF 세포주의 회복 양상을 나타낸 것이다.
도 8은 시험예 3에서 UVA 처리에 따른 시료 1의 각 농도 별 세포 증식률을 도시한 것이다.
도 9는 시험예 3에서 UVA 처리에 따른 시료 2의 각 농도 별 세포 증식률을 도시한 것이다.
도 10은 시험예 3에서 H₂O₂ 처리에 따른 시료 1의 각 농도 별 세포 증식률을 도시한 것이다.
도 11은 시험예 3에서 H₂O₂ 처리에 따른 시료 1의 각 농도 별 세포 증식률을 도시한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 있어서, 홍삼 (紅蔘)은 두릅나무과에 속하는 인삼 (Panax ginseng)의 몸통 또는 뿌리를 찐 것을 의미한다. 상기 홍삼은 말리지 않은 인삼, 즉, 수삼을 물로 깨끗하게 씻고, 크기에 따라 일정시간 쪄 증삼(蒸蔘)하고, 이 증삼을 태양열을 이용하거나 기타 방법으로, 전체 중량에 대하여, 수분이 12.5 내지 13.5 중량％ 정도 될 때까지 건조한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼은 건조된 홍삼, 홍미삼 및 홍삼박으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이다.

본 발명에 있어서, 홍미삼 (紅尾粕)은 상기 홍삼에서 잔뿌리를 따로 떼어낸 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 홍삼박 (紅蔘粕)은 홍삼을 물 또는 알코올 등의 용매로 추출하고 남은 잔사를 의미한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 다당체는 홍삼을 상온 추출하여 얻은 것이며, 구체적으로, 하기의 단계들을 포함하는 방법으로 얻은 것이다.

(a1) 홍삼을 세절하는 균질화 단계,

(b1) 홍삼을 상온 추출하여 추출물을 얻는 추출 단계,

(c1) 상기 추출을 여과하여 농축액을 얻는 농축 단계, 및

(d1) 상기 농축액에 용매를 첨가하여 홍삼 다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물 수득 단계.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (a1) 균질화 단계는 상기 홍삼을 직경 1 내지 3 mm로 세절하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (b1) 추출 단계는 홍삼을 20 내지 30 ℃의 온도로 상온 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (c1) 농축 단계에서 여과는 여과체를 사용한다. 상기 여과체는 메쉬 단위 350일 수 있다.

본 명세서에 있어서 메시 (mesh) 단위는 1인치 길이에 들어가는 여과 구멍의 개수를 의미한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (c1) 농축 단계에서 여과는 원심분리기를 사용한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (d1) 조성물 수득 단계의 용매는 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 홍삼 다당체의 분자량은 5,000 내지 5,000,000 Da이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 다당체는 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 만노오스(mannose), 푸코오스(fucose), N-아세틸갈락토사민(N-Acetylgalactosamine), N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine), N-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid), 자일로오스(xylose), 람노오스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose) 및 프록토오스 (fructose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상 또는 둘 이상의 당이다.

상기 홍삼 다당체의 주요 구성 당은 하기 화학식 1로 표시되는 글루코스일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 다당체의 함량은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.1 내지 20 중량%이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 올리고당은 홍삼 다당체를 올리고화하여 얻는 것이다. 상기 홍삼 올리고당은 바람직하게는 전술한 홍삼을 상온 추출하여 얻은 홍삼 다당체을 올리고화하여 얻은 것이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 올리고당은, 구체적으로, 하기의 단계들을 포함하는 방법으로 얻은 것이다.

(a2) 홍삼 다당체에 효소를 첨가하여 홍삼 다당체 분해물을 얻는 효소 분해 단계,

(b2) 상기 홍삼 다당체 분해물을 상온 추출하여 추출물을 얻는 추출 단계 및

(c2) 상기 추출물에서 불용성 침전물을 제거하여 홍삼 다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물 수득 단계.

상기 (a2) 효소 분해 단계에서, 첨가된 효소와 홍삼 다당체의 효소 분해 반응을 통하여 홍삼 다당체가 저분자로 분해된다.

상기 (b2) 추출 단계에서, 상기 홍삼 다당체 분해물이 상온 추출로 인하여 수용성 분획물과 불용성 침전물로 분리된다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (b2) 추출 단계는 상기 홍삼 다당체 분해물을 50 내지 55 ℃의 온도로 상온 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (c2) 조성물 수득 단계에서 불용성 침전물 제거는 연속식 원심분리기를 사용한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 올리고당은 홍삼 다당체를 효소를 이용하여 분해시킨 것이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 효소는 β-글루코시다제 (β-lucosidase), α,β-아라비노시다제 (α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제 (α,β-rhamosidase), β-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase), β-갈락토시다제 (β-galactosidase) 및 아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 효소는 펙티나제 (pectinase), 나린지나제 (naringinase) 및 셀룰라제 (cellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 복합 효소이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 홍삼 올리고당의 함량은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.1 내지 20 중량%이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 상기 홍삼 다당체 및 상기 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 상처 치유용이다. 구체적으로, 상기 피부 외용제 조성물은 각질세포 및 섬유아세포의 증식률을 증가시킴으로써 피부를 재생하고, 피부의 상처를 치유할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 산화 스트레스 활성 억제용이다. 구체적으로, 상기 피부 외용제 조성물은 자외선, 오존 등으로 인한 산화 스트레스을 억제시킴으로써 활성 산소로 인한 세포 생존율을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 항산화용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 보습용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 주름 억제 또는 피부 주름 개선용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 광노화 억제용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 미백용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물이다. 상기 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말 (foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 구체적으로 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 젤, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 수중유(O/W) 제형, 유중수(W/O) 제형, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 홍삼을 상온 추출하여 홍삼 다당체를 얻는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법은 특별한 언급이 없는 한 전술한, 피부 외용제 조성물의 홍삼 다당체에 관한 설명이 적용된다.

본 발명의 홍삼 다당체를 올리고화하여 홍삼 올리고당을 얻는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법은 특별한 언급이 없는 한 전술한, 피부 외용제 조성물의 홍삼 다당체에 관한 설명이 적용된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 홍삼으로부터 다당체 분리 제조 방법과 다당체를 올리고화한 올리고당 및 이를 함유하는 것을 특징으로 하는 보습, 항산화, 미백, 피부 주름개선, 항염, 아토피개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 비교예, 시험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예로 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

[제조예 1] 홍삼 다당체의 제조

건조된 홍삼을 잘게 분쇄하고, 3차 증류수를 가하고, 이를 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, 일본)를 이용하여 250～500 rpm, 25℃ 조건에서 15시간동안 교반하면서 추출하였다. 추출한 후, 원심 탈수기를 사용하여 잔사를 제거한 추출액을 얻고, 이 추출액을 추출액의 부피의 1/10 내지 4/10로 농축하여 농축액을 얻었다. 이어서 이러한 농축액에 에탄올을 서서히 가하여 에탄올 침전반응을 진행하였다. 이때 에탄올의 첨가속도는 50~200ml/min이 바람직하고, 에탄올의 양은 농축액의 4-5배정도가 바람직하고, 분산기(T.K.Homodisper, Primix, Model 2.5)를 이용하여, 1,000 내지 1,500rpm, 25℃ 조건에서 분산시킨 후, 30분 내지 1시간동안 정치하여 다당체를 침전시켰다. 에탄올 침전 반응이 완료되면 에탄올을 제거하고 세척공정을 거쳐 얻어진 홍삼 다당체를 40 내지 50℃에서 진공 건조하여, 파우더 형태의 홍삼 다당체를 얻었다. 이와 같이 수득된 홍삼 다당체를 “시료 1”이라 한다.

[제조예 2] 홍삼 올리고당의 제조

상기 제조예 1의 과정을 거쳐 시료 1을 제조하였으며, 이러한 시료 1에 3차 증류수에 가하여 녹인 후 가수분해 효소를 상기 홍삼다당체 분말과 1:0.5의 비율(w/w)로 첨가하였다. 이때, 상기 가수분해 효소는 셀룰라제(cellulase)를 사용하였으며, 3시간 동안 180rpm으로 교반하여 가수분해 후, 가수분해가 완료되면 80℃에서 2시간 실활하여 반응을 종료시켰다. 반응액은 원심분리기를 사용 후 필터 여과하고 난 뒤, 농축시킨 다음 동결건조하여 홍삼 다당체를 가수분해물인 홍삼 올리고당을 제조하였다. 이와 같이 수득된 홍삼 다당체를 “시료 2”라 한다.

[참고예 1] 홍삼 다당체의 성분분석

상기 제조예 1에 의하여 제조된 시료 1의 단백질 함량, 당 함량, 구성당 성분, 분자량 측정, FT-IR을 이용하여 하기와 같이 홍삼 다당체의 성분을 분석하였다.

1) 단백질 함량 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

홍삼 다당체의 총 단백질 함량을 측정하기 위해 BCA Assay법을 수행하였다.

BCA Assay는 단백질이 구리 이온(Cu^{2 +}, Cu^{1 +})을 환원 (Reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용한 것으로 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서 보라빛의 화합물(Cu⁺/BCA chromophore)을 생성하게 되는데, 이 보랏빛 화합물은 특정 파장 562 nm에서 최대 흡광도를 보인다. 따라서, 단백질의 양이 많을수록 보랏빛 화합물(Cu⁺/BCA chromophore)이 더 많이 생기며 562nm에서의 흡광도가 증가함을 이용, 단백질의 양을 측정한다. 실험방법은 하기와 같다.

우선 micro BCA protein assay reagent kit (Pierce, cat. no. 23227)를 이용, 각 96 microplate well에 각각 150 μL 씩 표준액, 희석된 시료를 넣은 후 bicinchoninic acid(BCA) kit WR(Working Reagent)시약을 첨가하여 30초간 볼텍싱 (voltexing)하였다. 그 후 37 ℃, 2시간 동안 반응 시킨 후 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하고 단백질 정량을 하였다. 결과는 하기 표 1과 같다.

Sample	단백질 함량(%)
홍삼다당체 (시료 1)	11.13

상기 표 1과 같이 시료1의 단백질 함량은 11.13 %로 확인되었다.

1) 당 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다.

홍삼다당체의 총 당 함량을 측정하기 위해 Phenol-sulfate법을 수행하였다. Phenol-sulfate법은 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 furfural 또는 그 유도체가 형성되는데 이 유도체의 흡광도를 490nm에서 측정하여 정량하는 방법으로 실험방법은 하기와 같다.

우선 sample 0.5 ml에 5 % phenol을 0.5 ml 가한 후 황산 2.5 ml 를 강하게 넣는다. 그 후 vortex mixer를 사용, 30초간 vortexing 후 25 ℃ 20분간에 방치하고 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정, 검량선을 작성하고 총당량 정량을 하였다. 검량 표준선은 Glucose standard(Sigma, USA)를 사용하였고, 결과는 하기 표 2와 같다.

Sample	당 함량(%)
홍삼 다당체 (시료 1)	45.09

상기 결과와 같이 실시예 1(홍삼다당체, 시료1)의 당 함량은 45.09%로 확인되었다.

3) 구성당 및 그 함량 측정

상기 제조예 1에 의하여 제조된 시료 1의 2.5 mg을 1 ml의 3차 증류수에 용해한 후 trifluoroacetic acid (TFA)를 이용하여 가수 분해 (hydrolysis)시켰다. 그 후, CarboPac^TM PA1 컬럼과 Bio LC (HPAEC-PAD system, Dionex, USA에서 제조)를 이용하여 18mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1 ml/min로 표준물질 1 mM 혼합물 (Fucose, Rhamnose, Arabinose, Galactose, Glucose, Mannose, Xylose, Fructose, Galacturonic acid)를 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 홍삼 다당체 (시료 1)의 성분 당을 확인 후 그 결과를 하기 표1에 나타내었다. 상기 제조예1에 의하여 제조된 홍삼 다당체를 구성하는 당의 종류를 알아보기 위하여, 2.5mg의 홍삼 다당체(실시예 1)을 1mL의 3차 증류수에 용해한 후 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)를 이용하여 가수분해시켰다. 그 후 CarboPacTM PA1 컬럼과 Bio LC(HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 18mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1 ml/min로 표준물질 1 mM 혼합물(Fucose, Rhamnose, Arabinose, Galactose, Glucose, Fructose)을 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 홍삼 다당체를 구성하는 당의 종류를 확인한 후 그 결과를 표 3에 나타내었다.

홍삼 다당체(시료 1)
번호	당 종류	함량(mg/시료 1mg)
1	Fucose	0.014
2	Rhamnose	0.002
3	Arabinose	0.021
4	Galactose	0.023
5	Glucose	0.080
6	Mannose	0.002

4) 분자량 분석

본 발명의 홍삼다당체 (시료 1)의 분자량을 확인하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다.

pL aquagel OH-30, 40, 50 (7.5 X 300 mm, VARIAN, USA) 컬럼과 고압액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC/GPC, Agilent, USA), ELSD 검출기(ELSD 3300, Alltech, USA)를 이용하여, 이동상 DeIonized Water, 컬럼 온도 25 ℃, 분당 0.7 ㎖ 유속, 검출기 온도 50℃, 질소가스 유속 1.4 L/min의 조건으로 검출하였으며, 표준물질로 각 분자량별 PEG(PolyEthyleneGlycol)를 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성, 시료 1의 분자량 분포를 확인하였다. 그 결과, 홍삼 다당체(시료 1)의 분자량 범위는 5,000에서 5,000,000 Da로 다양하게 분포되어 있음으로 밝혀졌으며, 5,000,000 Da 이상의 거대분자도 소량 포함되어 있었다. 분자량 분포에 의한 수평균 분자량은 하기 표 3과 같이, 약 2,100,000 Da 으로 밝혀졌다.

	검량곡선식	R2 value	Mw(Da)
홍삼 다당체 (시료 1)	y=-0.289x + 9.068	0.992	2,100,000

[참고예 2] 홍삼 올리고당의 분자량 분석

상기 제조예 2에 의하여 제조된 홍삼 올리고당 (시료 2)의 겔 투과 크로마토그래피를 수행하여 분자량 측정하여 하기와 같이 홍삼 올리고당의 성분을 분석하였다.

pL aquagel OH-30, 40, 50 (7.5 X 300 mm, VARIAN, USA) 컬럼과 고압액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC/GPC, Agilent, USA), ELSD 검출기(ELSD 3300, Alltech, USA)를 이용하여, 이동상 탈이온수 (DeIonized Water), 컬럼 온도 25 ℃, 분당 0.7 ㎖ 유속, 검출기 온도 50℃, 질소가스 유속 1.4 L/min의 조건으로 검출하였으며, 표준물질로 각 분자량별 PEG(PolyEthyleneGlycol)를 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성, 본 발명의 홍삼 올리고당 (시료 2)의 분자량 분포를 확인하였다. 그 결과, 홍삼 올리고당(시료 2)의 분자량 범위는 5,000에서 2,500,000 Da로 다양하게 분포되어 있음으로 밝혀졌으며, 홍삼 올리고당 내에서의 분자량 분포는 80%내지 90%가 약 8,000 Da이며, 10% 내지 20%가 약 2,500,000 Da 으로 포함되어 있었다. 분자량 분포에 의한 수평균 분자량은 하기 표 4와 같이 약 210,000 Da 으로 밝혀졌다.

	검량곡선식	R2 value	Mw(Da)
홍삼 올리고당(시료 2)	y=-0.289x + 9.068	0.992	210,000

5) FT-IR을 이용한 홍삼 다당체의 IR 분석

본 발명의 홍삼 다당체의 분자 구조 분석을 위해, 분광학적 분석법인 FT-IR분석(적외선 분광법)을 이용하여 하기와 같이 실험하였다. 실시예 1에서 얻어진 시료 1 0.001g을 KBr(Potassium bromide, FT-IR grade, Sigma) 0.5g과 함께 막자사발로 고르게 분쇄하였다. 그 후 소량을 펠렛 주형에 넣고 유압기를 사용하여 펠렛으로 만들었다. FT-IR(IR 100/200, ThermoFisher Scientific, 영국)을 이용하여 적외선 스펙트럼을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 3,300~3,400 cm^-1에서 당고리의 전형적인 O-H의 신축(stretching)진동, 2,900 cm^-1 부근에서 C-H 신축진동을 확인할 수 있었다. 1,000~1,100 cm^-1에서는 C-H와 C-O 변각운동이 일어나는 것, 850~800 cm^-1 부근의 피크는 글루코오스(Glucose), 갈락토오스(Galactose) 등의 C-O-C 결합을 확인할 수 있었다.

[시험예 1] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피부 재생 활성의 측정

본 발명의 홍삼 다당체 및 올리고당의 피부재생 효과 측정은 하기와 같이 분석하였다.

본 발명의 홍삼 다당체 및 올리고당의 피부재생 효과 측정하기 위하여 WST-1 Proliferation assay system에 의한 세포 증식활성에 대한 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

실험에 사용하기 위한 시료로서 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2(홍삼 올리고당)을 DMEM용매에 녹여 최종농도 25μg/㎖, 50μg/㎖, 100μg/㎖를 사용하였다. 각질형성세포(keratinocyte)주인 HaCaT(The Journal of Cell Biology, 106(1988), pp. 761-771)와 nHDF (ATCC)를 각각 10% FBS, 100μg/ml penicillin을 포함한 DMEM (Welgene Inc.,Dalseo-gu, Daegu, Korea)배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

5 X 10³ cells/ml 농도의 HaCaT 및 Nhdf를 96 well plate에 각 well 당 100 μl seeding하여 24 h 동안 안정화 시킨 후, 홍삼 다당체 및 홍삼 올리고당을 농도별(25μg/㎖, 50μg/㎖, 100μg/㎖)로 처리하여 24 h 동안 배양한 후에, 세포에 Premix-WST 용액 (Takara Bio Inc., Otsu Shiga, Japan)을 처리하여 440nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2(홍삼 올리고당)를 각질세포에 처리 시, 각질세포에 아무런 처리도 하지 않은 무처리군에 비하여, 500μg/㎖, 250μg/㎖, 125μg/㎖의 농도에서 각각 54%, 22%, 22% 과 28%, 14%, 22%의 세포 증식률을 나타내어, 피부재생의 효과가 있음을 확인할 수 있다.

또한, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2(홍삼 올리고당)를 섬유아세포에 처리 시, 섬유아세포에 아무런 처리도 하지 않은 무처리군에 비하여, 125μg/㎖, 50μg/㎖, 25μg/㎖의 농도에서 각각 9%, 8%, 6%과 6%, 3%, 2%의 세포 증식률을 나타내어, 피부재생의 효과가 있음을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 시험관 내 상처 치유 측정법(in vitro wound healing assay)을 통한 상처 치유 활성 확인

본 발명의 홍삼 다당체 및 올리고당의 상처 치유 활성 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

실험에 사용하기 위한 시료로서 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)를 각각 DMEM용매에 녹여 최종농도 200μg/㎖ 를 사용하였다. HaCaT(The Journal of Cell Biology, 106(1988), pp. 761-771)와 nHDF (ATCC)를 각각 10% FBS, 100μg/ml penicillin을 포함한 DMEM (Welgene Inc.,Dalseo-gu,Daegu,Korea)배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

5 X 10⁴ cells/ml 농도의 각질세포 및 2 X 10⁴ cells/ml 농도의 HaCaT를 24 well plate에 각 well 당 1 mL seeding하여 24 시간 동안 안정화시킨 후, 세포 단일층을 형성시키고, 각각의 세포 단일층을 p1000 피펫 팁으로 "긁힘 손상"을 유도하였다. "긁힘 손상"된 세포층을 제조예 1과 2에서 얻은 홍삼 다당체 (시료 1), 홍삼 올리고당 (시료 2)을 처리한 배양 배지에서 24시간 배양하고, 음성 대조군은 상기 홍삼 다당체 및 올리고당을 녹이는데 사용한 DMEM (Welgene Inc.,Dalseo-gu,Daegu,Korea)배지를 동량 처리하여 긁힘 상처가 회복되는 정도를 마이크로이미지 비디오 카메라(Boyertown, PA)가 장착된 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타냈다. 또한, 상기 과정을 nHDF에 대하여도 반복하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 6 및 7 에서 확인할 수 있듯이, 음성 대조군으로 처리된 세포의 "긁힘 손상"은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 홍삼 다당체 및 올리고당으로 처리된 세포에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 "긁힘 손상"이 치유되어 24시간 후 긁힌 면적이 거의 복구되었다. 따라서, 본 발명의 홍삼 다당체 및 홍삼 올리고당이 피부 상처치유 및 피부 재생 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 산화 스트레스 억제 활성에 관한 측정

본 발명의 상기 홍삼 다당체(시료 1) 및 홍삼 올리고당(시료 2)에 대한 산화 스트레스에 대한 보호 효과를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

실험에 사용하기 위한 시료로서 홍삼 다당체 및 홍삼 올리고당을 DMEM (Welgene Inc.,Dalseo-gu, Daegu, Korea)에 용해시켜 사용하였다.

각질형성세포(keratinocyte)주인 HaCaT와 섬유아세포(Normal human dermal fibroblast)인 nHDF를 FBS (Welgene Inc.,Dalseo-gu,Daegu,Korea), 100μg/ml penicillin Welgene Inc., Dalseo-gu, Daegu, Korea)을 포함한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

0.4 X 10⁵ cells/ml 농도의 각질형성세포(HaCaT)를 96 well cell culture plate (SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, Korea)에 각 well 당 100μL seeding하여 24 시간 동안 안정화 시켰다. 홍삼 다당체 추출물을 농도별로 처리하였다. 24 시간 후 UV 처리군의 경우, 자외선 조사기 Vilber Lourmat stimulator (Marnela Vallee, France)를 통하여 Ultraviolat-A를 40mJ/cm² 처리하였다. 이후, 12시간 동안 시료를 다시 처치한 후 Premix-WST용액 (Takara Bio Inc., Otsu Shiga, Japan)을 처리하여 microplatereader(BioTek Eon, Winooski, VT)를 통해 440nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.

도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 홍삼 다당체(시료 1) 및 홍삼 올리고당(시료 2)의 시료를 처치하였을 때 세포 생존률이 양성 대조군인 N-acetyl-l-cystein (NAC)을 처리한 군보다 높게 나타났다. 따라서 홍삼 다당체(시료 1) 및 홍삼 올리고당(시료 2)은 UV 스트레스로 인한 산화 스트레스를 억제함을 확인할 수 있다.

또한, 상기의 과정을 UV 처리군 대신, H₂O₂ 처리군으로 1mM 의 H₂O₂을 한 시간 동안 처리한 것을 제외하고는 동일하게 수행하여 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.

도 10 및 11에 나타낸 바와 같이 홍삼 다당체(시료 1) 및 홍삼 올리고당(시료 2)의 시료를 처치하였을 때 세포 생존률이, 양성 대조군인 N-acetyl-l-cystein (NAC)을 처리한 군과 유사하게 나타남을 확인할 수 있다. 따라서, 홍삼 다당체(시료 1) 및 홍삼 올리고당(시료 2)은 H₂0₂ 로 인한 산화 스트레스를 억제함을 확인할 수 있다.

[시험예 4] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 항산화 효과 측정

본 발명의 상기 홍삼 다당체(시료 1) 및 올리고당(시료 2)에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다.

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540nm에서 최대 흡광도를 나타는 것을 이용, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 540nm파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 하기와 같은 검정시험방법에 의해 진행하였다.

먼저 0.1 mM 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical(DPPH, Sigma) 용액 1 mL에 상기의 실시예 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1 mL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치한 후 microplate reader (Thermo max, USA)를 이용하여 540nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼소거시험에서 대조군은 DPPH 1 ml과 메탄올 1 ml을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1 ml과 시료 1 ml을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 계산하여 하기 표 5에 나타내었다. 표 5에서 IC₅₀은 자유라디칼을 50% 소거하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 항산화활성이 높음을 나타낸다.

[수학식 1]

자유라디칼소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

활성산소소거시험은 잔틴/잔틴옥시데이즈(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용한 흡광도 변화를 측정함으로써 활성 산소의 소거능을 알 수 있다.

Na₂CO₃ 2.4 mL, 잔틴 (xanthine, Sigma사에서 제조) 0.1 mL, ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA) 0.1 mL, bovine serum albumin(BSA, Sigma 사에서 제조) 0.1 mL, NBT 0.1 mL 및 시료 0.1 mL을 넣고 vortex mixer(Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 볼텍싱 후 25 ℃에서 10분간 방치한 후 xanthine oxidase 0.1 mL을 넣고 25 ℃ 20분간 반응시킨 후, 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 활성산소소거활성시험에서의 대조군은 시료용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase) 용액 대신 3차 증류수를 넣어 추출 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 2를 이용하여 활성산소 소거율을 수치로 계산하여 하기 표 5에 나타내었다. 표 5에서, IC₅₀은 활성산소를 50% 소거하기 위해 소요되는 시료 농도이며, 값이 작을수록 항산화 활성이 강함을 의미한다.

[수학식 2]

활성산소소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)에 대하여 각각 시험을 실시한 결과를 표 6에 나타내었다.

시료	자유라디칼소거율, SC50(ppm, μg/ml)	활성산소소거율, IC50(ppm, μg/ml)
홍삼 다당체 (시료 1)	100	115
홍삼 올리고당 (시료 2)	100	120
BHT	125	154

상기 표 6의 결과 홍삼 다당체 및 올리고당 단백다당체 (시료 1)는 강력한 합성 항산화제인 BHT와 비교하여 더 좋은 항산화 능력을 나타내었으며, 자유라디칼 소거율 50%의 농도는 100 ppm, 활성산소소거율 50% 농도는 120 ppm으로 미량의 농도에서 항산화 효능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

[시험예 5] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 보습 활성 측정

본 발명의 홍삼 다당체(시료 1) 및 올리고당(시료 2)의 보습효과를 검정하기 위해 하기와 같은 보습효과 측정을 수행하였다. 실험 방법과 결과는 하기와 같다.

보습효과의 측정은 유수분측정기(WSK-P500U, Inforward. Inc, Japan)를 이용한 커패시턴스 측정법을 사용하고, 20-30대 여성 30명을 대상으로 하여, 시험 시작 직전에 전박 굴측면을 항온항습실 (22℃, 상대습도 40-60%)에서 20분동안 적응하게 하여 피부의 수분 자체를 일정하게 유지시켰다. 그 다음, 유수분측정기 (WSK-P500U, Inforward. Inc, Japan)를 사용하여 각 시료 도포부위의 초기 수분 보유량을 측정한 후, 시료를 도포하였다. 시료의 도포는, 2.0 mg/cm²를 전박 굴측면에 따른 오차를 최소화하기 위하여 피검자마다 도포하는 시료의 위치를 달리하면서 도포하였다. 도포 10분, 30분, 50분, 90분, 120분에서 시간대별로 피부 수분량을 1차 측정하고, 2시간 후에 다시 피부 수분량을 측정하였다. 각 측정부위를 3번 반복 측정하고 그 평균값으로 피부 수분량을 계산한다.

시험에 사용한 시료는 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)의 1 % 수용액과 여러 연구결과에서 피부보습효과가 뛰어나다고 알려진 히아루론산 (Hyaluronic acid sodium salt, Sigma사에서 제조) 1% 수용액을 비교하여 하기 표 7에 나타내었다. 하기 표 7에서 수분량의 단위인 A.U.는 WSK-P500U에서 측정된 수분량을 나타내는 단위이다.

수용액	도포후 시간 경과에 따른 수분량(A.U)
	10분경과	30분경과	50분경과	90분경과	120분경과
홍삼 다당체 (시료 1)	62.05	61.50	59.03	58.01	54.91
홍삼 올리고당(시료 2)	62.25	61.70	59.23	58.21	55.11
1 % 히아루론산	61.31	58.24	57.21	55.87	52.11

표 7에 나타낸 바와 같이, 제조예 1에서 수득한 홍삼 다당체(시료 1) 및 제조예 2에서 수득한 홍삼 올리고당(시료 2)의 1% 수용액은 현재 보습효과가 뛰어나다고 알려진 히아루론산의 1% 수용액과 비교하여 보습효과가 더 우수하였다.

[시험예 6] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 엘라스테이즈 활성의 저해 측정

본 발명의 홍삼 다당체(시료 1) 및 올리고당(시료 2)의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여 엘라스테이즈 활성저해시험 (elastase inhibition activity test)을 실시하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스 (matrix)층을 구성하는 성분으로 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스층이 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)₃ p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)₃ p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법이다. 완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl (Sigma), 기질액은 8.8 mM N-Succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10 μg/mL (Sigma사에서 제조)의 농도로 사용하였다. 완충액 60 μL, 기질액 20 μL와 상기 시료 각각을 농도별로 3차 증류수에 희석한 시료액 100 μL를 섞은 후, 효소액 20 μL를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 p-니트로아닐린의 생성량을 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 사용하여 파장 405nm에서 측정하였다.

상기 엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)와 엘라스테이즈 활성저해효과를 판단하기 위하여, 현재 주름개선 기능성 원료로 효과가 뛰어다고 알려진 레티놀 (Retinal, Sigma사에서 제조) 및 엘라스테이즈의 특이 저해제인 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma사에서 제조)를 비교군으로 설정하였고, 하기 수학식 3을 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 8에 나타내었다. 표 8에서 IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50% 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

[수학식 3]

엘라스테이즈활성저해율(%) = 100 - ((시료의흡광도)/대조군의 흡광도) x 100)

시료	엘라스테이즈 활성저해율, IC50(mg/mL)
홍삼 다당체 (시료 1)	1.25
홍삼 올리고당 (시료 2)	1.30
레티놀	1.20
PMSF	0.07

표 8에 나타난 바와 같이, 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)의 엘라스테이즈 활성저해율은 각각 1.30 mg/mL로 엘라스타아제 특이 저해제인 PMSF 0.07 mg/mL 보다는 낮았지만 레티놀과 비슷할 정도로 주름개선효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

[시험예 7] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 자외선 조사 후 MMP-1 발현억제 활성의 측정

본 발명의 홍삼 다당체(시료 1) 및 올리고당(시료 2)의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역분석법(ELISA)를 실시하였다. 실험 방법은 하기와 같다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37 ℃에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2(홍삼 올리고당)은 35% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율 보다 우수함을 확인할 수 있었다.

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현 억제율(%)
홍삼 다당체(시료 1)	0.1	35
홍삼 올리고당 (시료 2)	0.1	30

[시험예 8] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 활성의 측정

본 발명의 홍삼 다당체(시료 1) 및 올리고당(시료 2)의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포 (Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 홍삼 다당체 및 올리고당 단백다당체 (시료 1)를 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 홍삼 다당체 및 올리고당 단백다당체 (시료 1)의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 4에 의해 계산하였다.

[수학식 4]

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(S_t-B_o)/(B_t-B_o)〕X 100

B_o: 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

B_t: 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

S_t: 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험결과, 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)는 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.1 % 농도에서 각각 30, 32 % 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다 (표 10).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
홍삼 다당체 (시료 1)	0.1	30.0
홍삼 올리고당 (시료 2)	0.1	32.0

[시험예 8] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 타이로시네이즈 저해 활성의 측정

본 발명의 홍삼 다당체(시료 1) 및 올리고당(시료 2)의 미백효과를 검정하기 위해 타이로시네이즈(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 평가하였다. 타이로시네이즈는 생체 내에서 타이로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 멜라닌이란 흑색의 고분자로서 생체 내에서 상기와 같은 산화에 의해 멜라닌이 형성되어 피부 상층부로 이동하게 되면 피부가 검게 변하고 기미, 주근깨를 생성하게 된다. 이러한 타이로시네이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하여 미백효과를 검정하는 방법(Pomerantz S. H., J. Biochem., 24:161-168, 1966)을 응용해 판정하였다. 시험방법은 하기와 같다.

시료 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL 및 1.5 mM L-타이로신 용액 1.0 mL을 넣은 후, 37℃에서 10분간 유지시켰다. 머쉬룸타이로시네이즈(1,500 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV-vis spectrophotometer(Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 475nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율을 측정하였다.

상기 타이로시네이즈 활성저해시험을 위한 대조군은 시료액 대신 완충용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 타이로시네이즈 대신 완충용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체), 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당), 그리고 여러 연구결과에서 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴 (arbutin, 상품명 Arbutin synthetic, Sigma 사에서 제조)을 사용하였고 하기 수학식 5를 이용하여 타이로시네이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 11에 나타내었다. 표 11에서, IC₅₀은 타이로시네이즈 활성을 50% 저해하는데 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

[수학식 5]

타이로시네이즈저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

시료	Tyrosinase 활성저해율, IC50(mg/mL)
홍삼 다당체 (시료 1)	0.03
홍삼 올리고당(시료 2)	0.03
알부틴	0.03

표 11에 나타난 바와 같이, 상기 제조예 1에 따라 제조된 시료 1(홍삼 다당체) 및 상기 제조예 2에 따라 제조된 시료 2 (홍삼 올리고당)는 현재 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴과 비교하여 미백효과가 거의 비슷할 정도로 뛰어난 효능을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명에 따른 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예1] 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	홍삼 다당체 및/또는 홍삼 올리고당	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

[제형예2] 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	홍삼 다당체 및/또는 홍삼 올리고당	3.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

[제형예3] 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	홍삼 다당체 및/또는 홍삼 올리고당	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

[제형예4] 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	홍삼 다당체 및/또는 홍삼 올리고당	5.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

[제형예5] 팩

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	홍삼 다당체 및/또는 홍삼 올리고당	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims (16)

1. 홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하고,
   상기 홍삼 다당체는 단백질 함량이 11.13중량%이고, 당 함량이 45.09중량%이며, 수평균 분자량이 2,100,000 Da이고,
   상기 홍삼 올리고당은 홍삼 다당체를 효소처리하여 얻은 가수분해물로서 수평균 분자량이 210,000 Da인, 피부 보습용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 홍삼 다당체의 함량은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.1 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 홍삼 올리고당의 함량은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.1 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 홍삼은 건조된 홍삼, 홍미삼 및 홍삼박으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 β-글루코시다제 (β-lucosidase), α,β-아라비노시다제 (α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제 (α,β-rhamosidase), β-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase), β-갈락토시다제 (β-galactosidase) 및 아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 복합 효소인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 펙티나제 (pectinase), 나린지나제 (naringinase) 및 셀룰라제 (cellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 복합 효소인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 홍삼 다당체 또는 홍삼 올리고당을 유효성분으로 함유하고,
   상기 홍삼 다당체는 단백질 함량이 11.13중량%이고, 당 함량이 45.09중량%이며, 수평균 분자량이 2,100,000 Da이고,
   상기 홍삼 올리고당은 홍삼 다당체를 효소처리하여 얻은 가수분해물로서 수평균 분자량이 210,000 Da인, 피부 재생용 화장료 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 홍삼 다당체의 함량은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.1 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 제8항에 있어서,
    상기 홍삼 올리고당의 함량은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.1 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
11. 제8항에 있어서,
    상기 홍삼은 건조된 홍삼, 홍미삼 및 홍삼박으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
12. 제8항에 있어서,
    상기 효소는 β-글루코시다제 (β-lucosidase), α,β-아라비노시다제 (α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제 (α,β-rhamosidase), β-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase), β-갈락토시다제 (β-galactosidase) 및 아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 복합 효소인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
13. 제8항에 있어서,
    상기 효소는 펙티나제 (pectinase), 나린지나제 (naringinase) 및 셀룰라제 (cellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 복합 효소인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
14. 삭제
15. 홍삼을 상온 추출하여 제1항 또는 제8항의 홍삼 다당체를 얻는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
16. 제1항 또는 제8항의 홍삼 다당체를 올리고화하여 홍삼 올리고당을 얻는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.

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