KR101972123B1 - 갈산 및 당단백질을 유효성분으로 포함하는 장미 추출물과 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장미를 물 및 효소로 열수추출 하는 단계;를 포함하는 장미 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 장미 추출물에 관한 것으로, 유기용매를 사용하지 않고도 유효성분인 갈산 및 저분자화된 당단백질을 높은 수율로 추출할 수 있으며, 이 장미 추출물은 활성산소종 생성 억제, MMP-1 활성 억제 및 프로콜라겐의 합성 증진을 통하여 피부의 노화를 방지 또는 개선할 수 있다.

Description

갈산 및 당단백질을 유효성분으로 포함하는 장미 추출물과 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료 조성물 {Rose extract comprising gallic acid and glycoprotein, and method of manufacturing the same, and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 갈산 및 당단백질을 유효성분으로 함유하는 장미 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 유기용매를 사용하지 않고도 항산화 및 항노화 효능을 나타내는 유효성분을 높은 수율로 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

피부의 노화는 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 진행되는 현상으로 이를 막는다는 것은 불가능하지만 그 대표적인 증상인 피부의 주름생성을 억제하고 늦추기 위하여 여러 방법들이 시도되어 지고 있다.

피부노화를 막기 위하여 가장 많이 연구되고 있는 방법은 노화의 원인을 막는 것으로 인체 내 ‘산화적 스트레스’에 의한 노화가 그 대표적인 예이다. ‘산화적 스트레스’란 free radical 생성에 따른 신체의 산화를 뜻하는 것으로 세포 호흡 과정 중 미토콘드리아에서 생성되며, 이는 ROS(reactive oxygen species)의 형태로 세포의 DNA를 직접적으로 손상시켜 새로운 피부 세포를 만드는 화학적 변화를 막아 피부의 노화를 발생하게 한다.

이런 ROS를 발생시키는 주요원인으로 자외선이 알려져 있다. 자외선은 그 파장의 길이에 따라 UVA(320~400 ㎚), UVB(280~320 ㎚), UVC(100~280 ㎚)로 나누어지며, UVC는 X선과 근접한 파장을 가진 광선으로 발암성이 매우 높다고 알려졌지만 오존층에 의해 모두 차단된다. 따라서 인체에 영향을 끼치는 파장은 UVA와 UVB이다. UVA는 피부에 대한 자극이 미약하여 UVB보다는 영향이 적지만 오랜 노출이 누적될 경우 색소 침착이 일어나고 피부 노화를 심화시키며, 종래에는 피부암까지 발생시킬 수 있다. UVB는 피부에 가장 많이 영향을 끼치는 파장으로 일광 화상이나 피부암을 일으킬 수 있고 피부노화의 주된 원인으로 알려져 있다. 이 외에도 인체 내 발생하는 H₂O₂ (hydrogen peroxide) 또한 ROS의 생성에 영향을 미친다.

위와 같은 원인들로 인해 발생한 ROS는 피부 내 콜라겐 분해효소인 MMPs(matrix metalloproteinase)를 증가시켜 피부의 콜라겐을 분해하고, 콜라겐 합성 전구물질인 프로콜라겐(procollagen)의 합성을 저해시켜 새로운 콜라겐의 생성을 억제하여 피부의 주름생성을 촉진하게 된다.

따라서 피부의 노화를 억제하기 위하여 ROS를 억제하기 위한 다양한 연구들이 진행되어오고 있으나, 대부분 여러 화학적 방법으로 합성한 합성유기물들이 알려져 있고 천연에서 유래한 물질들은 많이 없을뿐더러 실제로 천연유래 항산화 물질이 피부에 그 효능을 나타내는 물질이 많지 않아 끊임없는 연구가 이루어지고 있는 실정이다. 본 연구에서는 천연물 중 동서구적으로 피부미용에 많이 사용되고 있는 장미의 항노화능 및 효능물질의 추출 및 제조방법에 관하여 조사하였다.

장미는 북반구의 온대와 한대 지방의 야생에 분포하던 식물로 주로 향료용, 약용으로 재배되어 왔다. 중세시대 이후 야생종으로 자라던 장미를 관상용으로 개량하여 원예종이 되었다. 원예종은 세계 곳곳에서 재배되고 있으며, 우리나라에는 19세기 후반 미국과 유럽으로부터 들어와 다양한 원예종의 장미를 재배할 수 있게 되었다.

장미의 꽃은 줄기 끝에 단생꽃차례나 산방꽃차례로 피며, 꽃잎은 홑꽃으로 5개 이지만 원예종으로 개량이 되면서 겹꽃, 반겹꽃을 이루는 것이 많아졌다. 잎은 어긋나기를 하고 보통 홀수 깃꽃겹잎을 이루지만 홑잎인 것도 있으며, 턱잎이 있다.

현재의 장미는 개량과 교잡을 통하여 많은 종이 존재하나, 원종은 로사 시넨시스, 로사 오드라타, 로사 모스카타, 로사 몰티폴로라, 로사 위츄라이아나, 로사 루고사, 로사 다마스케나, 로사 포에티다, 로사 다부리카 9종이 원종이다.

그 중 다마스크 장미는 로사 다마스케나 종의 하나로 크고 아름다운 꽃 덕분에 가장 널리 알려졌고, 오래 관상용 식물로 사용되며 불가리아, 이란 및 터키 등지에서 주로 재배되고 있다.

고대에는 다마스크 장미오일이나 증류추출을 통한 장미수가 통증을 완화시키고 목의 염증을 치료하는 효능이 있다고 알려져 사용되어 왔으며, 그 오일의 향은 긴장을 완화시키는 효능이 있어 그리스인에 의해 향수로 사용되었다. 근래에는 식품에도 사용되고 있으며 특히 화장품으로 많이 개발되어 오일, 샴푸, 향수 등 다양한 제품에 사용되고 있다.

지금까지 보고된 다마스크 장미의 성분들로는 캠퍼롤(kaempferol), 케르세틴(quercetin)과 같은 플라보노이드(flavonoid)와 그 배당체, 케르세틴 3-O-갈락토시드(quercetin 3-O-galactoside), 캠퍼롤 3-O-갈락토시드(kaempferol 3-O-glucoside) 등과 갈산(gallic acid)와 같은 폴리페놀(polyphenol)이 많이 함유되어 있다고 밝혀졌다. 하지만 이런 기능성 성분을 추출하기 위해서 기존에는 유기용매를 이용해 왔으나, 추출물에 유기용매의 잔존 가능성 있어 안전성 문제가 대두되고 있는 실정이다. 이에, 본 발명에서는 유기용매를 사용하지 않고 장미의 유효성분인 갈산을 다량 추출하는 방법을 찾고자 본 발명을 연구하게 되었다. 또한 추출 과정 중 갈산과 함께 추출되는 당단백질의 효능을 확인하였다.

장미 추출물에 대한 유사 선행문헌으로는 대한민국 공개특허 제10-2017-0036011호 등이 보고되어 있다.

대한민국 공개특허 제10-2017-0036011호 (2017.03.30)

본 발명은 유기용매를 사용하지 않고도 항산화 및 항노화 효능, 피부 재생 효능, 피부 주름 억제 효능, 피부 주름 개선 효능, 광노화 억제 효능을 갖는 유효성분을 높은 수율로 추출할 수 있는 장미 추출물의 제조방법 및 이로부터 추출된 갈산 및 당단백질을 유효성분으로 하는 장미 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 장미를 물 및 효소로 열수추출 하는 단계;를 포함하는 장미 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 일 양태에 있어, 상기 효소는 펙티나아제, 셀룰라아제, 자일라나아제 및 나린지나아제에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

상기 일 양태에 있어, 상기 열수추출은 a) 30 내지 60℃에서 1 내지 10시간 동안 숙성시키는 단계; 및 b) 70 내지 100℃에서 30분 내지 5시간 동안 추출하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다.

상기 일 양태에 있어, 상기 장미는 물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 첨가되며, 상기 효소는 물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 5 중량부로 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 양태는 장미를 물 및 효소로 열수추출 하여 제조된 장미 추출물에 관한 것이다.

상기 다른 일 양태에 있어, 상기 장미 추출물은 총 중량 중 0.005 내지 0.1 중량%의 갈산을 포함할 수 있다.

상기 다른 일 양태에 있어, 상기 장미 추출물은 총 중량 중 5 내지 15 중량%의 당단백질을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 장미 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 방지용, 피부 주름 개선용, 광노화 방지용 화장료 조성물일 수 있으며, 상기 피부 주름 방지용, 피부 주름 개선용, 광노화 방지용 화장료 조성물은 항산화능을 통한 활성산소종 억제, MMP-1의 활성 억제 및 프로콜라겐 합성 증진 등을 통해 피부 주름을 방지, 피부 주름을 개선, 광노화를 방지하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 장미 추출물의 제조방법은 유기용매를 사용하지 않고 유효성분인 갈산 및 당단백질을 추출할 수 있음에 따라, 장미 추출물에 유기용매가 잔존할 가능성이 없으며, 이에 따라 안전성 높은 장미 추출물을 제공할 수 있다.

아울러, 유기용매를 사용하지 않음에도 불구 효소를 사용함으로써 높은 수율로 유효성분인 갈산 및 당단백질을 추출할 수 있다는 장점이 있다.

이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 갈산 및 당단백질을 유효성분으로 함유하는 장미 추출물 및 이의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명은 장미로부터 유효성분을 추출함에 있어, 유기용매를 사용하지 않고도 높은 수율로 유효성분인 갈산 및 당단백질을 추출할 수 있는 장미 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

상세하게, 본 발명의 일 예에 따른 장미 추출물의 제조방법은 장미를 물 및 효소로 열수추출 하는 단계;를 포함할 수 있다.

이처럼, 본 발명에 따른 장미 추출물의 제조방법은 유기용매를 사용하지 않고 유효성분인 갈산을 추출할 수 있음에 따라, 장미 추출물에 유기용매가 잔존할 가능성이 없으며, 이에 따라 안전성 높은 장미 추출물을 제공할 수 있다.

아울러, 유기용매를 사용하지 않음에도 불구 효소를 사용함으로써 높은 수율로 유효성분인 갈산을 추출할 수 있으며, 또한, 효소처리로 인해 항산화 및 항노화, 피부 재생 효능, 피부 주름 억제 효능, 피부 주름 개선 효능, 광노화 억제 효능을 나타내는 저분자화된 당단백질을 추출할 수 있다는 장점이 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 일 예에 있어, 상기 효소는 펙티나아제(pectinase), 셀룰라아제(cellulase), 자일라나아제(xylanase) 및 나린지나아제(naringinase) 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 이와 같은 효소를 열수추출 단계에 첨가함으로써 갈산의 추출 함량을 크게 향상시킬 수 있으며, 당단백질을 저분자화 하여 저분자화된 당단백질을 추출할 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어, 상기 장미는 특별히 한정하진 않으나, 로사 시넨시스(Rosa chinensis), 로사 오드라타(Rosa odorata), 로사 모스카타(Rosa moschata), 로사 몰티폴로라(Rosa multiflora), 로사 위츄라이아나(Rosa wichuraiana), 로사 루고사(Rosa regosa), 로사 다마스케나(Rosa damascena), 로사 포에티다(Rosa foetida), 로사 다부리카(Rosa davurica) 및 이들의 개량종에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 바람직하게는 로사 다마스케나 종의 하나인 다마스크 장미를 사용하는 것이 갈산의 함량이 높은 장미 추출물을 제조하는데 있어 바람직하다.

더욱 바람직하게, 갈산의 추출 함량을 더욱 증가시키기 위해서는 저온에서 일정 시간동안 숙성 단계를 진행한 후, 온도를 높여 실질적인 추출 단계를 수행하는 것이 좋다.

구체적으로, 상기 열수추출은 a) 30 내지 60℃에서 1 내지 10시간 동안 숙성시키는 단계; 및 b) 70 내지 100℃에서 30분 내지 5시간 동안 추출하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다.

이처럼 저온 숙성 후 고온 추출을 수행함으로써 갈산의 추출 함량을 800 ㎍/㎖ 이상으로 향상시킬 수 있다.

보다 바람직하게, 숙성 단계는 30 내지 60℃에서 3 내지 5 시간 동안 수행될 수 있으며, 추출 단계는 80 내지 100℃에서 1 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.

아울러, 본 발명의 일 예에 있어, 상기 장미, 물, 효소의 혼합 비율은 특별히 제한되진 않으나, 상기 장미는 물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 첨가되며, 상기 효소는 물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 5 중량부로 첨가될 수 있으며, 보다 좋게는 장미는 물 100 중량부에 대하여 1 내지 10 중량부로 첨가되며, 상기 효소는 물 100 중량부에 대하여 0.05 내지 1 중량부로 첨가될 수 있다. 이와 같은 범위에서 갈산 및 당단백질을 효과적으로 추출될 수 있으며, 또한, 상기 표시된 함량의 효소처리를 수행함으로써 추출물 내 포함된 당단백질의 분자량이 1000 달톤 이하, 보다 좋게는, 500 내지 800 달톤으로 낮아질 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 장미 추출물의 제조방법은 이 외에도 분획 또는 정제 등의 통상적으로 수행되는 단계가 더 수행될 수 있음은 물론이다.

또한, 본 발명은 전술한 장미 추출물의 제조방법으로부터 제조된 갈산 및 당단백질을 유효성분으로 함유하는 장미 추출물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 장미를 물 및 효소로 열수추출 하여 제조된 장미 추출물을 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 장미 추출물은 유기용매를 사용하지 않고 추출된 것임에 따라, 유기용매가 추출물에 잔존하는 것을 완전히 방지할 수 있으며, 이에 따라 안전성이 높은 장미 추출물을 제공할 수 있다.

상세하게, 본 발명의 일 예에 따른 장미 추출물을 효소를 사용하여 추출된 것일 수 있으며, 이때 효소는 펙티나아제(pectinase), 셀룰라아제(cellulase), 자일라나아제(xylanase) 및 나린지나아제(naringinase) 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 이와 같은 효소를 열수추출 단계에 첨가함으로써 갈산의 추출 함량을 크게 향상시킬 수 있다.

구체적인 일 예로, 상기 장미 추출물은 총 중량 중 0.005 내지 0.1 중량%의 갈산을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 0.05 내지 0.1 중량%의 갈산을 포함할 수 있다.

갈산은 하기 화학식 1을 만족하는 것으로, 몰식자산으로도 불리며, 항산화, 항균 및 면역과 관련된 효능을 가진 것으로 알려진 화합물이다.

[화학식 1]

본 발명의 일 예에 따른 장미 추출물은 상기와 같이 갈산이 높은 함량으로 함유되어 있음에 따라 우수한 항산화 및 항노화, 피부 재생 효능, 피부 주름 억제 효능, 피부 주름 개선 효능, 광노화 억제 효능을 보일 수 있으며, 구체적으로 상기 장미 추출물은 항사화능을 통한 활성산소종 억제, MMP-1의 활성 억제 및 프로콜라겐(procollagen) 합성 증진을 통해 피부 주름을 방지, 피부 주름을 개선, 광노화를 방지할 수 있다.

또한, 상기 장미 추출물은 총 중량 중 5 내지 15 중량%의 당단백질을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 7 내지 15 중량%의 당단백질을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 당단백질은 효소처리에 의해 분자량이 1000 달톤 이하로 저분자화된 것으로, 피부 도포 시 그 흡수 능력이 크게 향상될 수 있으며, 이를 통해 항산화 및 항노화, 피부 재생 효능, 피부 주름 억제 효능, 피부 주름 개선 효능, 광노화 억제 효능 또한 크게 증진시킬 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 장미 추출물은 추출 외에도 분획 또는 정제 등의 통단계를 통해 수득되는 모든 추출물, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념으로, 경우에 따라서, 이들을 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선 건조 등의 방법을 사용하여 건조 가능하며, 건조된 추출물을 분쇄하는 과정을 더 가질 수 있다. 따라서, 상기 추출물은 여과 후 경우에 따라 건조 및 분쇄 과정과 같은 추가적인 과정을 가짐에 따라, 액상, 농축된 고상 및 동결 건조된 분말 형태를 가질 수 있다.

이처럼, 항산화 및 항노화, 피부 재생 효능, 피부 주름 억제 효능, 피부 주름 개선 효능, 광노화 억제 효능이 있는 갈산 및 당단백질을 유효성분으로 포함하고 있는 장미 추출물은 화장료 조성물로 응용이 가능하다. 즉, 본 발명은 전술한 장미 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 일 예에 따른 장미 추출물은 항산화능을 통한 활성산소종 억제, MMP-1의 활성 억제 및 프로콜라겐 합성 증진을 통해 피부 주름을 방지할 수 있음에 따라, 본 발명의 일 예에 따른 화장료 조성물은 또한 활성산소종 억제, MMP-1의 활성 억제 및 프로콜라겐 합성 증진을 통해 피부 주름을 방지, 피부 주름을 개선, 광노화를 방지할 수 있으며, 피부 주름 방지용, 피부 주름 개선용, 광노화 방지용 화장료 조성물로 활용할 수 있다.

한편, 화장료 조성물은 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 오일, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따른 장미 추출물 및 이의 제조방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. 또한 달리 정의되지 않은 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 또한 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. 또한 명세서에서 특별히 기재하지 않은 첨가물의 단위는 중량%일 수 있다.

[실시예 1]

다마스크 장미 100g에 증류수 1,000 g을 가하고 0.5 g의 펙티나아제를 첨가하여 3시간 쉐이킹 인큐베이터 (VS-8480, Vision scientific CO.,LTD., 한국)를 이용하여 300 rpm, 60℃ 조건에서 교반한 후, 90℃ 조건에서 3시간 열수침지 하여 추출물을 100 메쉬 단위 여과체를 이용하여 여과하여 장미 추출물을 수득하였다.

[실시예 2]

효소로 펙티나아제 대신 셀룰라아제를 사용한 것 외의 모든 과정을 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

[실시예 3]

효소로 펙티나아제 대신 자일라나아제를 사용한 것 외의 모든 과정을 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

[실시예 4]

효소로 펙티나아제 대신 나린지나아제를 사용한 것 외의 모든 과정을 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

[실시예 5]

효소로 펙티나아제: 셀룰라아제: 자일라나아제를 1 : 1 : 1로 혼합하여 사용한 것 외의 모든 과정을 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

[비교예 1]

다마스크 장미 100g에 50% (v/v) 에탄올 1,000 g을 가하여 3시간 쉐이킹 인큐베이터 (VS-8480, Vision scientific CO.,LTD., 한국)를 이용하여 300 rpm, 60℃ 조건에서 교반한 후, 90℃ 조건에서 3시간 열수침지 하여 추출물을 100 메쉬 단위 여과체를 이용하여 여과하여 장미 추출물을 수득하였다.

[비교예 2]

다마스크 장미 100g에 증류수 1,000 g을 가하여 3시간 쉐이킹 인큐베이터 (VS-8480, Vision scientific CO.,LTD., 한국)를 이용하여 300 rpm, 60℃ 조건에서 교반한 후, 90℃ 조건에서 3시간 열수침지 하여 추출물을 100 메쉬 단위 여과체를 이용하여 여과하여 수득하여 실험에 사용하였다.

1) 장미 추출물의 갈산 및 당단백질 함량 분석

실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2로부터 추출된 장미추출물의 갈산 함량을 분석하고자 하였다. 이를 위하여 농축된 장미추출물 100 ㎎에 100 ㎖의 50 %(v/v) 에탄올을 첨가하고 볼텍스 믹서(Vortex mixer, 동서과학(주), 한국)를 이용하여 5분간 용해한 후, 10분간 초음파 추출 (Ultrasonic bath, Bransonic, USA)하여 시료를 용해하여 실험에 사용하였다. 갈산 표준품은 시그마알드리치(G7384, Sigma aldrich, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 농도별로 검량곡선식을 작성하여 추출물의 갈산 함량을 확인하였다.

아울러, 실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2로부터 추출된 장미추출물 내 함유된 당단백질의 함량을 분석하기 위하여 각각의 장미추출물을 20 브릭스(brix)까지 농축하여 농축액 대비 3배수의 에탄올을 첨가한 후 당단백질을 침전시켜 분리하였다.

상기 준비된 각각의 시료를 Agilent 1200 Series pump (Agilent, USA에 DAD (Diode Array Detector)가 장착되어있는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 시료 분석에 사용된 컬럼은 C18 column (Agilent, 4 × 250 ㎜, 5 ㎛)으로 10 ㎕의 시료를 분석하였다. 컬럼의 온도는 40℃이며 274 ㎚의 UV 파장에서 확인하였고 3차 증류수와 아세토나이트릴(Acetonitrile, J.T baker, USA)을 분석용매로 사용하였다.

그 결과를 하기 표 1에 표기하였다.

	검량곡선식	R2 Value	갈산 함량 (㎍/㎖)	당단백질 함량 (중량%)
실시예 1	y=66.662x - 109.74	0.999	402.3	9.4
실시예 2			462.9	10.6
실시예 3			571.2	10.3
실시예 4			305.0	11.7
실시예 5			797.7	10.1
비교예 1			924.5	2.7
비교예 2			304.2	9.8

2) 장미 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 분석

실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2로부터 추출된 장미추출물의 항산화능을 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다.

DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-2-picryl hydrasyl)의 환원에 의하여 발생되는 흡광도의 변화를 이용하여 항산화능을 확인하였다. 상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2에서 수득한 시료 및 실시예 5에서 추출한 당단백질을 각각 1 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖의 농도로 3차 증류수에 용해한 후 에탄올로 희석하여 시료를 만들고, 반응액을 넣어 37℃에서 30분간 반응 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 대조시료로는 항산화능으로 널리 알려진 아스코르브산(Ascorbic acid)을 사용하였다.

	DPPH IC50 (㎍/㎖)
실시예 1	41.27
실시예 2	46.18
실시예 3	39.14
실시예 4	51.37
실시예 5	36.81
실시예 5의 당단백질	62.40
비교예 1	24.73
비교예 2	52.44
아스코르브산	21.09
갈산	6.27

3) 형광물질을 이용한 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS ) 생성 억제능 분석

시험에 사용한 세포주는 인간 각질형성세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로 형광측정용 96 well plate에 각 웰(well)당 5.0x10⁴ 개로 분주하고, 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10 중량%) 배지를 사용하여, 37℃, 5 부피% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후 장미 추출물을 처리하였다. 사용된 배지로 무혈청 DMEM (FBS free)을 사용하고 37℃, 5 부피% CO₂ 조건에서 1일간 배양하였다.

상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2에서 수득한 장미추출물과 실시예 5에서 추출한 당단백질을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 24시간 배양한 후 HBSS(Hanks’ Balanced Salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고, HBSS에 50 μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'-Dichlorofluorescein diacetate, Sigma)를 100 ㎕ 가하고 37℃, 5 부피% CO₂ 조건에서 1시간 배양하고, HBSS로 세척하였다. 이 후 HBSS에 50 μM 처리하여 파장 280~320 ㎚의 UVB로 자극한 후, 초기에 활성산소종으로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(tecan plate reader, Ex=485 ㎚, Em=530 ㎚)로 형광 강도를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 3 및 표 4에 표기하였다.

	처리 시료	ROS (% of control)
No UVB	-	63.2
UVB	-	100.0
	실시예 1	89.4
	실시예 2	94.7
	실시예 3	82.1
	실시예 4	95.3
	실시예 5	72.2
	실시예 5의 당단백질	72.7
	비교예 1	59.2
	비교예 2	92.7
	갈산	70.5

No UVB	UVB
-	-	갈산	실시예 5의 당단백질	실시예 5

4) 피부 재생 효과 확인

피부 재생 효과를 확인하기 위해 WST-1 Proliferation assay system에 의한 세포 증식 활성에 대한 효과를 측정하였다. 각질형성세포(keratinocyte)주인 HaCaT와 nHDF (normal human dermal fibroblasts, ATCC사)를 각각 10 중량% FBS, 100 ㎍/㎖ penicillin을 포함한 DMEM(Welgene Inc., Dalseo-gu, Daegu, Korea)배지에서 37℃, 5 부피% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 5 X 10³ cells/ml 농도의 HaCaT 및 nHDF를 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100 ㎕ seeding하여 24시간 동안 안정화 시킨 후, 상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2에서 수득한 추출물과 실시예 5에서 추출한 당단백질을 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 에, 세포에 Premix-WST 용액 (Takara Bio Inc., Otsu Shiga, Japan)을 처리하여 440 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 5에 표기하였다.

	처리 시료	Proliferation (% of control)
UVB	-	100
	실시예 1	123
	실시예 2	110
	실시예 3	96
	실시예 4	105
	실시예 5	124
	실시예 5의 당단백질	115
	비교예 1	53
	비교예 2	86
	갈산	104

5) UV에 의한 MMP -1 저해 효과 확인

MMP-1 저해 효과를 평가하기 위해 사람의 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast)에서의 MMP-1 발현량을 측정하였다. 사람섬유아세포를 6 웰 플레이트에 1X10⁵ 수만큼 분주한 후， 37℃， 5 부피% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 HBSS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 220 mJ/㎠의 UVB를 조사한 뒤 상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1, 2에서 수득한 추출물과 실시예 5 에서 추출한 당단백질을 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 72시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 Human Total MMP-1 ELISA KIT(R&D SYSTEMS) 방법대로 MMP-1을 정량하였다.

그 결과를 하기 표 6에 표기하였다.

	처리 시료	MMP-1 (% of control)
No UVB	-	76
UVB	-	100
	실시예 1	87
	실시예 2	83
	실시예 3	88
	실시예 4	79
	실시예 5	76
	실시예 5의 당단백질	72
	비교예 1	86
	비교예 2	84
	갈산	99

6) UV에 의해 저해된 프로콜라겐 ( Procollagen ) 생합성 증가 효과 확인

UV에 의해 저해된 프로콜라겐 생합성 증가 효과를 평가하기 위해 사람의 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast)에서의 프로콜라겐 발현량을 측정하였다. 사람섬유아세포를 6 웰 플레이트에 1X10⁵ 수만큼 분주한 후， 37℃， 5 부피% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 HBSS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 220 mJ/㎠의 UVB를 조사한 뒤 상기 실시예 1 내지 6 및 비교예 1, 2에서 수득한 추출물과 실시예 5에서 추출한 당단백질을 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 72시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 Human Pro-Collagen I alpha 1 ELISA KIT(R&D SYSTEMS) 방법대로 프로콜라겐을 정량하였다.

그 결과를 하기 표 7에 표기하였다.

	처리 시료	프로콜라겐 (% of control)
No UVB	-	100
UVB	-	74
	실시예 1	93
	실시예 2	95
	실시예 3	87
	실시예 4	81
	실시예 5	99
	실시예 5의 당단백질	98
	비교예 1	72
	비교예 2	78
	갈산	95

7) UV 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 활성능

자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포 (Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴ 수만큼 분주하고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS(Phosphate bufferd saline)로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 UVB를 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 실시예 1 내지 6 및 비교예 1, 2에서 수득한 추출물과 실시예 5에서 추출한 당단백질을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 1L-1α를 정량함으로서 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다.

그 결과를 하기 표 8에 표기하였다.

	처리 시료	염증성 사이토카인 발현 억제율 (% of control)
UVB	-	0.0
	실시예 1	15.5
	실시예 2	13.2
	실시예 3	15.4
	실시예 4	18.3
	실시예 5	30.1
	실시예 5의 당단백질	27.5
	비교예 1	25.8
	비교예 2	10.4
	갈산	34.5

8) 장미추출물 내 당단백질의 구성당 및 분자량 분석

실시예 5로부터 추출된 장미추출물 내 함유된 당단백질의 구성당 및 분자량을 분석하기 위하여 장미추출물을 20 브릭스(brix)까지 농축하여 농축액 대비 3배수의 에탄올을 첨가한 후 당단백질을 침전시켜 분리하였다.

이 시료 1 g을 10 ㎖의 3차 증류수에 용해한 후 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)를 이용하여 가수분해 (hydrolysis)시켰다. 그 후, CarboPac^TM PA1 컬럼과 Bio LC (HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 18 mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1 ㎖/min로 표준물질 1 mM 혼합물 (푸코스(Fucose), 람노스(Rhamnose), 아라비노스(Arabinose), 갈락토스(Galactose), 글루코스(Glucose), 만노스(Mannose), 자일로스(Xylose), 글루쿠론산(Galacturonic acid) 및 갈락투론산(Glucuronic acid))를 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 장미추출물 내 당단백질의 구성당을 확인 후 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

당 종류	함량(mg/g)
푸코스	2.8
람노스	6.7
아라비노스	49.8
갈락토스	27.0
글루코스	90.6
만노스	15.2
자일로스	2.5
글루쿠론산	36.8
갈락투론산	2.1

또한, 장미추출물 내 당단백질의 분자량을 확인하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다.

PL aquagel OH-30, Mixed-M (7.5 X 300 mm, Agilent, USA) 컬럼과 RI 검출기가 장착된 고압액체크로마토그래피 (Agilent Technologies 1200 Series HPLC/GPC, Agilent, USA)를 이용하여, 이동상 탈이온수, 컬럼 온도 35℃, 분당 유속 1.0 ㎖, 검출기 온도 35℃의 조건으로 검출하였으며, 표준물질로 각 분자량별 다당류(Polysaccharide)를 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성, 당단백질의 분자량 분포를 확인하였다. 그 결과를 표 10에 나타내었다.

	검량곡선식	R2 Value	Mw(Da)
비교예 2의 당단백질	y=-0.219x + 9.067	0.995	659,751
실시예 5의 당단백질			519

9) 장미추출물 내 당단백질의 아미노산 함량분석

실시예 5로부터 추출된 장미추출물 내 함유된 당단백질의 구성 아미노산을 분석하기 위하여 시료 100 mg을 10 ㎖의 6N HCL에 용해한 후 24시간 동안 120℃로 가열하여 당단백질을 가수분해 (hydrolysis)시켰다. 그 후, C18 column (Agilent, 4 × 150 ㎜, 5 ㎛)과 Agilent 1200 Series pump (Agilent, USA에 FLD (Fluorescence Detector)를 이용하여 분석하였으며, 유속은 1 ㎖/min로 표준물질 혼합물 (Agilent Amino acid standard 250 pmol, P/N: 5061-3331) 아스파르트산(Aspartic acid), 글루타민(Glutamin), 세린(Serine), 히스티딘(Histidine), 트레오닌(Threonine), 아르기닌(Arginine), 알라닌(Alanine), 타이로신(Tyrosine), 시스테인(Cysteine), 발린(Valine), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 아이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 라이신(Lysine)를 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 장미추출물 내 당단백질의 아미노산을 확인 후 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

아미노산 종류	함량(㎍/g)
아스파르트산	0.50
글루타민	0.45
세린	0.04
히스티딘	N.D
트레오닌	N.D
아르기닌	0.05
알라닌	N.D
타이로신	N.D
시스테인	0.29
발린	N.D
메티오닌	N.D
페닐알라닌	N.D
아이소류신	N.D
류신	0.01
라이신	0.71

(*N.D : Not Detected)

[제형예 1]

정제수에 화장수 전체 중량에 대하여 글리세린 3 중량%, 부틸렌글리콜 2 중량%, 프로필렌글리콜 2 중량% 및 벤조인 0.2 중량%를 순서대로 반응용기에 투입 및 교반하여 용해시킨 후, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 1 중량%를 60℃로 가열하여 용해시켰다. 이후 실시예 5에서 수득된 장미 추출물 2 중량%, 에탄올 10 중량% 및 잔량의 정제수를 투입하여 충분히 교반한 후, 25℃에서 2일 동안 숙성시켜 화장수를 제조하였다.

[제형예 2]

정제수에 영양크림 전체 중량에 대하여 프로필렌글리콜 3 중량%, 덱스트린 베헤네이트 0.5 중량% 및 벤조인 0.2 중량%를 80 ℃에서 혼합 및 교반하였다. 이어서 유화기를 이용하여 밀납 1 중량%, 폴리솔베이트 60 1.5 중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량%, 유동 파라핀 10 중량%, 소르비탄스테아레이트 1 중량%, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량%, 스테아린산 1.5 중량% 및 글리세릴스테아레이트 1 중량%를 80 ℃에서 유화시켰다. 유화가 끝난 후, 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각하였다. 이후 실시예 5에서 수득된 장미 추출물 2 중량%를 투입하여 25℃까지 다시 냉각하고, 25℃에서 2일 동안 숙성시켜 영양크림을 각각 제조하였다. 상기 정제수의 함량은 최종 제조된 영양크림의 잔량에 해당한다.

[제형예 3]

영양세럼 전체 중량에 대하여 잔탄검 0.02 중량%, 부틸렌글리콜 10 중량% 및 하이드록시에틸셀룰로오즈 0.1 중량%를 40 ℃에서 혼합 및 교반한 후, 유화기를 이용하여 소이빈포스포리피드 10 중량%, 소듐히아루로네이트 5 중량% 및 정제수를 투입하여 유화시켰다. 유화가 끝난 후, 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 실시예 5에서 수득된 장미 추출물 2 중량%를 각각 투입하였다. 이어서 25℃까지 냉각한 후에 25℃에서 2일 동안 숙성시켜 영양세럼을 각각 제조하였다. 상기 정제수의 함량은 최종 제조된 영양세럼의 잔량에 해당한다.

[제형예 4]

시토스테롤 1.7 중량%, 폴리에틸렌글리콜 1.5 중량%, 세라마이드 0.7 중량%, 스테아르산 1.2 중량% 및 콜레스테롤 1.5 중량%를 25℃에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질 혼합물을 제조하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질 혼합물에 디세틸포스페이트 0.4 중량% 및 글리세린 5 중량%를 25℃에서 혼합 및 균질화하여 마이크로플루이다이져에 통과시킨 후, 마카다미아 오일 15 중량%를 55℃에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재통과시켰다. 이후 실시예 5에서 수득된 장미 추출물 2 중량%, 잔탄검 11 중량%, 벤조인 0.2 중량% 및 카르복시비닐폴리머(중량평균분자량 1,200,000) 0.3 중량%를 투입하여 분산 및 안정화시키고, 25℃에서 2 일 동안 숙성시켜 에센스를 각각 제조하였다. 상기 정제수의 함량은 최종 제조된 에센스의 잔량에 해당한다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있으며, 상기 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

Claims (10)

1. 알코올을 포함하지 않고, 장미를 펙티나아제, 셀룰라아제 및 자일라나아제를 포함하는 효소 및 물로 열수추출 하는 단계;를 포함하고,
   상기 열수추출은 상기 장미, 효소 및 물을 a) 30 내지 60℃에서 1 내지 10시간 동안 숙성시키는 단계; 및 b) 70 내지 100℃에서 30분 내지 5시간 동안 추출하는 단계;를 포함하여 수행하며,
   상기 장미는 물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 첨가되고, 상기 효소는 물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 5 중량부로 첨가되고,
   당단백질을 함유하는, 장미 추출물의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 알코올을 포함하지 않고, 장미를 펙티나아제, 셀룰라아제 및 자일라나아제를 포함하는 효소 및 물로 열수추출하여 제조되고,
   상기 열수추출은 상기 장미, 효소 및 물을 a) 30 내지 60℃에서 1 내지 10시간 동안 숙성시키는 단계; 및 b) 70 내지 100℃에서 30분 내지 5시간 동안 추출하는 단계;를 포함하여 수행하며,
   상기 장미는 물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 첨가되고, 상기 효소는 물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 5 중량부로 첨가되고,
   당단백질을 함유하는 장미 추출물.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 장미 추출물은 총 중량 중 0.005 내지 0.1 중량%의 갈산을 포함하는, 장미 추출물.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 장미 추출물은 총 중량 중 5 내지 15 중량%의 당단백질을 포함하는, 장미 추출물.
8. 제 5항 내지 제 7항에서 선택되는 어느 한 항의 장미 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 주름 방지용 또는 피부 주름 개선용인 화장료 조성물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 피부 주름 방지용 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물은 활성산소종 억제, MMP-1의 활성 억제 및 프로콜라겐 합성 증진을 통해 피부 주름을 방지하거나 개선하는 것인, 화장료 조성물.