KR102198589B1 - 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨(phytol)의 복합물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물 - Google Patents
바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨(phytol)의 복합물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바위돌꽃(Rhodiola rosea), 바위손(Selaginella tamariscina), 맨드라미(Celosia cristata) 및 쑥(Artemisia princeps)을 혼합하여 추출한 후 피톨(phytol)을 첨가하여 제조한 복합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물은 그 상승작용에 의하여 멜라닌 생성에 작용하는 효소의 활성 억제, 각질세포의 이동 및 콜라겐 생성 촉진, 염증매개인자의 생성 억제 활성이 우수하여, 피부 미백용, 피부재생 및 회복 촉진용, 주름개선용 및 피부진정용 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 바위돌꽃(Rhodiola rosea), 바위손(Selaginella tamariscina), 맨드라미(Celosia cristata) 및 쑥(Artemisia princeps) 혼합추출물과 피톨(phytol)의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 이들 복합물을 유효성분으로 함유하여 피부미백 효능을 나타내며 피부재생 및 회복을 촉진하고 주름개선 및 피부진정에 도움을 줌으로써 결과적으로는 피부기능 개선 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 한국 화장품 시장에서는 소비자들의 건강과 미용, 환경에 대한 관심 증가로 인하여 천연자원을 이용한 안전한 화장품용 소재개발 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 또한 소비자들의 요구에 따라 식물성 소재를 이용한 고효능 화장품 소재개발이 매우 활발하다. 특히 소비자들은 각종 매체 또는 실제 체험을 통해 자외선, 환경오염물질, 스트레스 등의 요인들에 의해 발생하는 피부색소 침착, 주름생성, 탄력 감소 등의 각종 노화의 징후를 효과적으로 개선할 수 있는 제품에 대해 높은 관심을 보이고 있으며, 이에 따라 관련 제품의 매출도 급증하고 있다. 이와 더불어 소비자들의 요구에 따라 근본적인 항노화의 해답으로서 피부재생과 회복에 효과가 있는 제품, 서구식 생활방식이나 실내외 환경변화 등으로 민감해진 피부를 효과적으로 개선할 수 있는 피부진정용 제품이 다수 개발되고 있다. 그러므로 이러한 효능을 발휘할 수 있는 천연 유래 소재에 대한 연구가 필요하다.
또한 다양한 피부고민을 해결할 수 있는 제품에 대한 요구가 급증하면서 더마, 코스메슈티컬 제품에 적용할 수 있는 고기능성 성분도 활발히 연구되고 있다. 이러한 제품군에 적용하기 위해 화장품 산업계에서는 피부기능 개선 효능에 대한 연구가 다수 보고되어 있고, 소비자들에게 친숙한 성분을 주로 사용한다. 천연소재의 추출물 형태보다는 콜라겐, 히알루론산, 나이아신아마이드, 아스코르빅애씨드, 토코페롤, 펩타이드, 아미노산, 판테놀, 마데카소사이드, EGF 등의 성분을 대표적으로 사용한다.
그러므로 '친환경', '자연주의', '더마', '코스메슈티컬' 등을 모두 만족하는 제품을 위한 소재를 개발하기 위해 피부기능 개선용 주요 성분에 천연 추출물을 혼합하는 형태의 소재 연구가 다수 진행되고 있다. 대한민국 공개특허 제2019-0068363호, '보검 선인장 열매 추출물과 판테놀, 히알루론산 및 베타인의 복합 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부보습용 화장료 조성물', 대한민국 공개특허 제2011-0012700호, '비오밥 나무 열매 추출물과 콜라겐 펩타이드를 함유하는 피부 보습 및 탄력 개선 화장료 조성물' 및 대한민국 공개특허 제2019-0033334호, '민들레 뿌리 추출물, 카페인 및 토코페롤의 혼합물을 포함하는 피부 외용제 조성물' 등의 특허에서 관련 연구를 확인해볼 수 있다. 또한 종래 대한민국 등록특허 제10-1064904호, "천연 추출물을 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물"에는 황련 추출물, 어성초 추출물, 은행 추출물 및 마데카소사이드를 유효성분으로 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2019-0010299호, "희렴 추출물을 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물"에는 희렴 추출물에 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물이 개시된 바 있다.
피톨(phytol)은 diterpene alcohol의 일종으로 비타민 E와 비타민 K의 합성 전구체로 사용된다. 피톨은 자연계에 널리 분포하는 성분으로, 식물조직에서 녹색의 색소성분인 클로로필의 구성성분으로 존재하여 식물조직 파괴 시 가수분해되어 생성된다. 피톨과 그의 유도체들은 항산화, 항염, 면역 보조, 항균, 항암, 기형유발 억제, 항당뇨, 지질강하, 진경, 항경련, 진통, 항불안, 항우울 등의 효능이 알려져 있다. 또한 피톨의 피부 효능에 대해서도 다양한 연구결과가 보고된 바 있는데, 멜라닌 생성 억제 효능, 인간각질형성세포에서의 항산화 효능, 피부 알러지 진정 효과, 모발성장 및 탈모억제 효능 등이 보고되었다(정선희, 2017; Gyeong-A Ko et al., 2018; Kwon-Ryeol Ryu et al., 2011). 그럼에도 불구하고 피톨은 일반적으로 안전한 향미 성분으로서 주로 향수, 샴푸, 비누 등에 사용되어 왔다. 상기 언급한 피톨의 다양한 효능과 안전성을 고려하였을 때 앞으로 주요한 피부 기능 개선용 화장품 성분으로서의 개발 가능성이 높다.
종래 대한민국 등록특허 제10-2089209호, "구아이아콜, 피톨 및 카바크롤을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물"에는 구아이아콜, 피톨 및 카바크롤과 이들의 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 및 건강기능식품 조성물이 개시되어 있다. 또한 대한민국 공개특허 제2011-0102336호, "휘발성물질과 테르펜 알콜을 함유한 개인위생조성물"에는 피톨 등의 테르펜 알콜 성분을 함유한 장기간의 피부이익을 제공하는 발포성 개인위생 조성물이 개시되어 있다.
본 발명자들은 피톨을 화장품의 유효한 활성성분으로서 효과적으로 이용하기 위하여 연구해 왔으며, 피톨에 다양한 천연소재를 혼합사용하여 그 활성을 평가하였다. 그 결과 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥이 피톨과의 혼합 소재로서 최종 선택되었다.
본 발명자들은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물에 피톨을 첨가하여 복합물을 제조하는 경우에 피부유래 세포주 및 효소반응을 이용한 실험 모델에서 피부 미백, 재생 및 회복, 주름개선, 진정 효과가 크게 증진됨을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥이 각각 1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 추출되는 것이며, 더욱 바람직하게는 2:1:1:1의 비율로 혼합되어 추출되는 것이다.
상기 복합물은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물 99~99.9999 중량% 및 피톨 0.0001~1 중량%의 비율로 이루어진다.
상기 화장료 조성물은 피부미백, 피부재생 및 회복 촉진, 주름개선 및 피부진정용으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 천연 추출물을 함유하여 안전하며, 그 상승작용에 의하여 우수한 멜라닌 생성 효소 활성 억제, 피부 각질세포 이동 촉진, 콜라겐 생성 증가 및 염증성 인자 생성 억제 효능을 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 발명의 내용을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물에 피톨을 혼합하여 복합물로서 제조하여 사용하는 경우 피부 미백효능 증진, 피부재생 및 회복 촉진, 주름개선 및 피부염증 완화 효과가 상승하여 더욱 우수해진다는 것을 이용한 것이다.
본 발명의 유효성분인 혼합추출물의 제조에 사용되는 바위돌꽃(Rhodiola rosea)은 고지대의 바위틈이나 풀숲에 자라는 여러해살이풀로 우리나라 북부지방에 자생한다. 뿌리와 줄기는 중요한 약리적 효능이 있는 것으로 알려져 있으며 생약으로 사용된다. 전통 의학에서 원기를 회복시켜 체내 독소축적을 해소할 수 있는 약재로 이용되어 왔으며, 또한 항산화, 항암, 면역반응, 스트레스 억제 등의 생리활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 이러한 효능을 나타내는 대표적인 생리활성 물질은 tyrosol, salidroside 등이 있다(배기화 등, 2012). 본 발명에서는 바위돌꽃의 전초 또는 뿌리가 사용될 수 있다.
바위손(Selaginella tamariscina)은 바위에 붙어 자라며, 우리나라에서 자생한다. 겨울철에는 죽은 것처럼 오그라들었다가 봄철 비가 오면 새파랗게 살아나는 특성을 가진다. 부처손이라고도 불리고 생약명으로 권백이라고 부른다. 바위손은 마음을 안정시키고 혈액순환을 좋게 하는 약재로 사용되어 왔으며, 동양에서 암환자 치료를 위해 사용하는 대표적인 전통약용식물로 알려져 있다. 주요생리활성 성분으로는 amentoflavone, hinokiflavone, isocryptomerin 등과 같은 flavonoid류가 보고된 바 있다(이범천 등, 2006; 심관섭 등 2006). 본 발명에서는 바위손의 전초가 사용될 수 있다.
맨드라미(Celosia cristata)는 비름과(Amaranthaceae)에 속하는 한해살이풀로 커다란 주름이 진 모양의 빨간색의 꽃을 피우므로 관상용으로 흔히 재배하는데, 한방에서는 맨드라미의 꽃을 계관화라고 하여 양혈, 지혈, 치루로 인한 하혈, 이질, 토혈, 객혈, 혈림 등의 치료에 사용해왔다. 맨드라미의 주요한 유효성분으로 betacyanin, kaempferitrin, amaranthin, pinitol 등이 함유되어 있으며, 우수한 항산화 효과를 나타내는 flavonoid, isoflavone, phenolic compound, 강한 항바이러스 당단백질인 CCP-25, CCP-27 등이 보고된 바 있다(김현영 등, 2012; 표영희 등, 2008). 본 발명에서는 맨드라미의 꽃이 사용될 수 있다.
쑥(Artemisia princeps)은 우리나라에 자생하는 대표적인 국화과(Asteracea)의 식물로 독특한 맛과 향 때문에 차, 떡, 각종 요리에 다양하게 사용된다. 민간요법에서는 소염, 진통, 감기, 당뇨, 류머티즘, 기관지 질환 및 위 질환을 치료하고 피부미용을 위해 사용되어왔다. 현재까지 쑥의 효능으로는 항균, 항산화, 항암, 돌연변이 억제 등이 알려져 있으며, 쑥에 함유되어 있는 주요 생리활성 물질로는 phenolic compound, flavonoid, esculin, 정유성분 등이 있다. 쑥에는 특히 phytol을 비롯하여 다양한 정유성분이 함유되어 있는데, 항산화, 항균, 항바이러스 등 우수한 생리활성이 알려져 있어 식품, 화장품 및 의약품에 다양하게 활용되고 있다(정미숙, 2010; 최윤경 등, 2014). 본 발명에서는 쑥의 잎이 사용될 수 있다.
피톨(phytol)은 식물의 클로로필에서 유래되는 diterpene alcohol의 일종으로. 피톨과 그의 유도체들은 항산화, 항염, 면역 보조, 항균 등의 다양한 효능이 알려져 있다. 또한 미백, 항산화, 항알러지 등 피부기능 개선 효능에 대해서도 보고된 바 있다.
본 발명에 따르면 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물은 건조된 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥이 각각 1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 추출되는 것이다. 특히 2:1:1:1의 비율로 혼합되어 추출되는 경우에 피부미백, 피부재생 및 회복 촉진, 주름개선 및 피부진정 효과가 가장 우수하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 다음과 같은 방법에 의하여 상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물 제조한다.
먼저, 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥을 혼합하여 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매를 가한 후 추출하고 여과, 농축하여 추출물을 제조한다. 바람직하게는 물을 사용하여 통상의 추출 방법으로 추출한다.
상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥이 각각 1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 추출되는 것이며, 2:1:1:1의 비율로 혼합되어 추출되는 경우에 가장 우수한 활성을 나타내므로 더욱 바람직하다.
이와 같이 제조된 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물을 피톨과 혼합하여 복합물을 제조하는 경우에 더욱 우수한 피부미백, 피부재생 및 회복 촉진, 주름개선 및 피부진정 효과를 나타내어, 혼합에 따른 활성성분 간의 상승효과를 확인할 수 있었다. 이때, 상기 복합물은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물 99~99.9999 중량%, 피톨 0.0001~1 중량%의 비율로 이루어지며, 더욱 바람직하게는 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물 99 중량%, 판테놀 1 중량%의 비율로 이루어진다.
본 발명의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물은 피부 유래 세포주의 생존률에 영향을 미치지 않았으며(시험예 6), 멜라닌 생성에 주요하게 작용하는 효소인 tyrosinase의 활성을 억제하였다(시험예 7). 뿐만 아니라 각질세포의 이동(시험예 8)과 콜라겐 전구체의 생성을 증가시켰으며(시험예 9), 항염증성 인자의 생성을 감소시켰다(시험예 10). 또한 이 복합물을 세럼 및 크림 제형에 적용하였을 때 실온, 냉장, 항온 조건에서 제형안전성을 나타내었다(시험예 11). 그러므로 상기 화장료 조성물은 피부 미백용, 피부재생 및 회복 촉진용, 주름개선용 또는 피부진정용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물은 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 여성청결제, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1: 바위돌꽃 추출물의 제조
건조된 바위돌꽃 뿌리에 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간동안 추출하였다.
위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 바위돌꽃 추출물을 제조하였다.
제조예 2: 바위손 추출물의 제조
건조된 바위손 전초에 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 바위손 추출물을 제조하였다.
제조예 3: 맨드라미 추출물의 제조
건조된 맨드라미 꽃에 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 맨드라미 추출물을 제조하였다.
제조예 4: 쑥 추출물의 제조
건조된 쑥 잎에 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 쑥 추출물을 제조하였다.
제조예 5 ~ 12: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물의 제조
건조된 바위돌꽃 뿌리, 바위손 전초, 맨드라미 꽃 및 쑥 잎의 총 혼합중량을 동일하게 하여 중량비를 하기 표 1과 같이 조절하였다. 이후 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물을 각각 제조하였다.
| 중량비 | 바위돌꽃 | 바위손 | 맨드라미 | 쑥 |
| 제조예 5 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 제조예 6 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| 제조예 7 | 1 | 1 | 2 | 1 |
| 제조예 8 | 1 | 2 | 1 | 1 |
| 제조예 9 | 2 | 1 | 1 | 1 |
| 제조예 10 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| 제조예 11 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 제조예 12 | 2 | 1 | 1 | 2 |
시험예 1: 세포 독성 여부 확인
세포 독성 여부를 확인하기 위해 인간 각질세포주인 HaCaT와 인간 피부유래 멜라닌세포 NHEM(normal human epidermal meanocyte) 및 섬유아세포 NHDF(normal human dermal fibroblast)를 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며 96 well plate에 HaCaT은 5×105 cells/well, NHEM 및 NHDF은 각각 3×104 cells/well의 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예에서 제조한 추출물을 농도가 0.1% 또는 1.0% 가 되도록 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma, USA)용액을 각 well에 100 μl 씩 첨가한 후 (3 mg/ml) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 μl의 DMSO를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.
세포생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100
| 구분 | 세포생존률 (%) | |||||
| HaCAT | NHEM | NHDF | ||||
| 0.1% | 1.0 % | 0.1 % | 1.0 % | 0.1 % | 1.0 % | |
| 대조군 | 100 | |||||
| 제조예 1 | 100 | 100 | 99 | 97 | 102 | 97 |
| 제조예 2 | 102 | 99 | 101 | 103 | 100 | 98 |
| 제조예 3 | 100 | 101 | 100 | 100 | 100 | 99 |
| 제조예 4 | 101 | 102 | 100 | 98 | 98 | 100 |
| 제조예 5 | 100 | 99 | 99 | 101 | 100 | 97 |
| 제조예 6 | 99 | 100 | 99 | 100 | 102 | 99 |
| 제조예 7 | 99 | 102 | 98 | 97 | 97 | 100 |
| 제조예 8 | 101 | 100 | 101 | 102 | 98 | 101 |
| 제조예 9 | 98 | 100 | 100 | 101 | 100 | 100 |
| 제조예 10 | 100 | 99 | 102 | 100 | 101 | 102 |
| 제조예 11 | 100 | 98 | 98 | 100 | 102 | 99 |
| 제조예 12 | 101 | 99 | 100 | 97 | 99 | 101 |
상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 또는 쑥 각각의 추출물, 또는 이들의 혼합추출물을 적용한 시료 모두 HaCaT, NHEM 및 NHDF에 처리하였을 때 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 인간 피부유래 세포의 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.
시험예 2: Tyrosinase 활성 억제 여부 확인
Tyrosinase는 멜라닌 합성의 속도 결정단계인 초기반응에 작용하는 효소이므로 피부미백용 소재를 개발하는데 있어서 tyrosinase 활성 억제 실험을 주요하게 다룬다. 본 발명자들은 tyrosinase의 활성 억제 효능을 확인해보기 위해 mushroom tyrosinase(Sigma, USA)를 사용하여 억제 정도를 측정하였다. 96 well plate에 80 mM phosphate buffer(pH 6.8)에 8.3 mM의 농도로 녹여 조제한 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine) 용액 100 μl을 넣고 상기 제조예가 각각 최종 0.1% 또는 1%가 되도록 50 μl 씩 첨가하였다. 양성 대조군으로는 kojic acid를 사용하였다. 이후 80 mM phosphate buffer에 250 U로 녹여 조제한 mushroom tyrosinase을 각 well에 100 μl 씩 첨가하였다. 30분간 37℃의 차광 배양기에서 반응시킨 후 multimicroplate reader를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 활성 억제율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.
Tyrosinase 활성억제율(%)=(대조군의 흡광도-시료첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도 × 100
| 구분 | Tyrosinase 활성 억제율 (%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 100 | |
| 제조예 1 | 18 | 24 |
| 제조예 2 | 12 | 18 |
| 제조예 3 | 14 | 17 |
| 제조예 4 | 15 | 19 |
| 제조예 5 | 29 | 35 |
| 제조예 6 | 26 | 29 |
| 제조예 7 | 27 | 31 |
| 제조예 8 | 26 | 31 |
| 제조예 9 | 39 | 46 |
| 제조예 10 | 33 | 39 |
| 제조예 11 | 34 | 38 |
| 제조예 12 | 34 | 40 |
| Kojic acid | 53 | 78 |
상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 또는 쑥 추출물의 제조예 1~4 보다, 이들의 혼합추출물인 제조예 5~12에서 우수한 tyrosinase 활성 억제 효능을 나타내었다. 특히 제조예 9~12가 더욱 우수한 억제 효능을 나타내었으며, 이중 제조예 9가 가장 우수한 효능을 나타내었다.
시험예 3: 각질형성세포의 이동 촉진 효능 확인
세포의 이동은 피부 재생 및 상처치유에 중요한 과정이다. 피부에 상처가 발생하면 상처 부위의 회복 및 방어를 위하여 다양한 세포들의 세포 이동이 일어난다. 피부의 상처 치유 과정에서 피부 재생을 위하여 각질형성세포, 섬유아세포 등이 이동하고 이들은 콜라겐 등의 세포 외 기질을 합성하여 피부 복원에 중요한 역할을 수행한다(백민영 등, 2017).
본 발명자들은 각질형성세포의 이동 촉진 효능을 확인해보기 위해 HaCaT 세포주를 2 × 105 cells/well의 비율로 24-well plate에 가한 후 well에 가득 찰 때까지 배양하였다. 이 후 well의 가운데 라인에 200 μl pipette tip으로 바닥이 보이도록 긁어준 후 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 세척하고 제조예 시료를 0.1% 또는 1.0%의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 긁어낸 부위에서 세포가 이동된 정도를 사진으로 기록한 후 Image J software를 이용하여 세포간 거리를 수치화 시켰다. HaCaT 이동율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.
HaCaT 이동율(%)=(대조군의 세포간 거리-시료첨가군의 세포간 거리)/대조군의 세포간 거리 × 100
| 구분 | HaCaT 이동율 (%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 100 | |
| 제조예 1 | 12 | 18 |
| 제조예 2 | 7 | 13 |
| 제조예 3 | 9 | 15 |
| 제조예 4 | 8 | 15 |
| 제조예 5 | 22 | 32 |
| 제조예 6 | 18 | 25 |
| 제조예 7 | 18 | 27 |
| 제조예 8 | 17 | 26 |
| 제조예 9 | 33 | 41 |
| 제조예 10 | 26 | 35 |
| 제조예 11 | 25 | 36 |
| 제조예 12 | 27 | 34 |
상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 제조예의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 또는 쑥 각각의 추출물과 이들의 혼합추출물을 비교해 볼 때, 혼합추출물인 제조예 5~12에서 각질세포의 이동 촉진 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히 제조예 9에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.
시험예 4: Procollagen type 1 생성 증가 효능 확인
콜라겐은 주로 힘줄, 인대, 피부와 같은 섬유조직에서 발견되는 구조 단백질로 전체 콜라겐 중 1형이 전체 콜라겐의 약 90%를 차지한다. 피부에서는 주름개선, 탄력, 피부손상 회복 등을 담당한다. 본 발명자들은 섬유아세포에서 procollagen type 1의 생성 증가 효능을 확인하기 위해 NHDF 세포를 24 well plate에 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 상기 제조예에서 제조한 추출물을 시료농도가 0.1 또는 1.0% 가 되도록 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 Procollagen type I c-peptide EIA kit (TAKARA, Japan)를 사용하여 procollagen type 1의 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후 1N NaOH로 용해시켜 총 단백질 양을 측정하여, 일정 단백질 당 전구콜라겐 생성량을 계산하였다.
그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
| 구분 | Procollagen 생성량 / 총 단백질량 | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 4.7 | |
| 제조예 1 | 5.5 | 6.1 |
| 제조예 2 | 5.1 | 5.6 |
| 제조예 3 | 5.3 | 5.7 |
| 제조예 4 | 5.3 | 5.8 |
| 제조예 5 | 6.4 | 6.9 |
| 제조예 6 | 5.9 | 6.4 |
| 제조예 7 | 6.1 | 6.4 |
| 제조예 8 | 6.0 | 6.6 |
| 제조예 9 | 7.2 | 7.7 |
| 제조예 10 | 6.6 | 7.2 |
| 제조예 11 | 6.7 | 7.3 |
| 제조예 12 | 6.7 | 7.2 |
상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 제조예의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 또는 쑥 각각의 추출물과 이들의 혼합추출물을 비교해 볼 때, 혼합추출물인 제조예 5~12가 인간 섬유아세포에서 procollagen type 1의 생성을 효과적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 제조예 9에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.
시험예 5: 염증매개인자의 생성 억제 효능 확인
피부 각질세포는 외부자극에 의해 활성화되어 염증매개인자인 IL-1β(interleukin 1β) 및 TNF-α(tumor necrosis factor α) 등을 다량 분비하고 피부염증을 유발한다(Hui-Man Cheng et al., 2008). 본 발명자들은 각질세포주에서의 염증매개인자 생성 억제 효능을 확인하기 위해 HaCaT 세포를 24 well plate에 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 LPS(lipopolysaccharide, Sigma, USA) 100 ng/ml을 1시간 전처리한 후 LPS와 함께 상기 제조예에서 제조한 추출물을 시료농도가 0.1 또는 1.0% 가 되도록 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 이후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 IL-1β Human ELISA kit 또는 TNF-α Human ELISA kit(R&D Systems, USA)를 사용하여 IL-1β 및 TNF-α의 양을 측정하였다.
그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
| 구분 | IL-1β(pg/ml) | TNF-α(pg/ml) | ||
| 0.1% | 1.0% | 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 2.3 | 1.3 | ||
| LPS 처리군 | 8.7 | 5.3 | ||
| 제조예 1 | 8.1 | 7.5 | 4.6 | 4.2 |
| 제조예 2 | 8.4 | 8.0 | 5.0 | 4.7 |
| 제조예 3 | 8.3 | 7.9 | 5.1 | 4.7 |
| 제조예 4 | 8.4 | 7.9 | 4.9 | 4.6 |
| 제조예 5 | 7.5 | 6.9 | 3.9 | 3.5 |
| 제조예 6 | 7.8 | 7.2 | 4.3 | 3.8 |
| 제조예 7 | 7.8 | 7.1 | 4.3 | 3.9 |
| 제조예 8 | 7.9 | 7.1 | 4.2 | 3.8 |
| 제조예 9 | 6.7 | 6.0 | 3.2 | 2.8 |
| 제조예 10 | 7.1 | 6.4 | 3.7 | 3.1 |
| 제조예 11 | 6.9 | 6.5 | 3.6 | 3.3 |
| 제조예 12 | 7.0 | 6.5 | 3.6 | 3.2 |
상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 제조예의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 또는 쑥 혼합추출물을 각각의 추출물과 비교해 볼 때, 이들의 혼합추출물인 제조예 5~12에서 인간 각질세포주에서 LPS에 의해 유도된 염증매개인자인 IL-1β 및 TNF-α의 생성 증가를 효과적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1 ~ 4: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물 제조
상기 시험예 2~5에서 가장 우수한 효능을 나타내었던 제조예 9에 피톨을 각각 중량비 0.0001%(실시예 1), 0.005%(실시예 2), 0.05%(실시예 3) 및 1%(실시예 4) 첨가하여 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 제조하였다.
시험예 6: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물의 세포 독성 여부 확인
상기 제조예 9와 실시예 1~4를 대상으로 시험예 1의 방법과 동일하게 실험을 수행하여 피부유래 세포 독성 여부를 확인하였으며, 그 결과는 하기의 표 7에 나타내었다.
| 구분 | 세포생존률 (%) | |||||
| HaCAT | NHEM | NHDF | ||||
| 0.1% | 1.0 % | 0.1 % | 1.0 % | 0.1 % | 1.0 % | |
| 대조군 | 100 | |||||
| 제조예 9 | 101 | 100 | 100 | 99 | 100 | 101 |
| 실시예 1 | 102 | 101 | 101 | 98 | 102 | 99 |
| 실시예 2 | 99 | 100 | 102 | 99 | 101 | 98 |
| 실시예 3 | 101 | 100 | 99 | 100 | 98 | 100 |
| 실시예 4 | 100 | 98 | 98 | 101 | 99 | 100 |
상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 제조예 9 뿐만 아니라 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 추출물혼합추출물과 피톨의 복합물을 적용한 실시예 1~4 모두 HaCaT, NHEM 및 NHDF에 처리하였을 때 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 인간 피부유래 세포의 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.
시험예 7: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물의 tyrosinase 활성 억제 여부 확인
상기 제조예 9와 실시예 1~4를 대상으로 시험예 2의 방법과 동일하게 실험을 수행하여 tyrosinase의 활성 억제 효능을 확인하였으며, 그 결과는 하기의 표 8에 나타내었다. 비교예로서 피톨만을 함유한 시료를 사용하였으며, 실시예 4의 피톨 농도와 동일하게 1%로 제조하여 본 시험에 사용하였다.
| 구분 | Tyrosinase 활성 억제율 (%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 100 | |
| 제조예 9 | 37 | 43 |
| 비교예 1 | 39 | 46 |
| 실시예 1 | 42 | 52 |
| 실시예 2 | 44 | 56 |
| 실시예 3 | 45 | 60 |
| 실시예 4 | 51 | 69 |
| Kojic acid | 52 | 76 |
상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 제조예 9 및 비교예 1과 비교하여 볼 때 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물인 실시예 1~4에서 더욱 우수한 tyrosinase 활성 억제 효능을 나타내어 복합물로의 제조에 따른 상승효과를 확인할 수 있었다. 특히 실시예 4에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.
시험예 8: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물의 각질형성세포의 이동 촉진 효능 확인
상기 제조예 9와 실시예 1~4를 대상으로 시험예 3의 방법과 동일하게 실험을 수행하여 각질형성세포의 이동율을 확인하였으며, 그 결과는 하기의 표 9에 나타내었다. 비교예로서 피톨만을 함유한 시료를 사용하였다.
| 구분 | HaCaT 이동율 (%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 100 | |
| 제조예 9 | 30 | 39 |
| 비교예 1 | 31 | 39 |
| 실시예 1 | 37 | 48 |
| 실시예 2 | 38 | 51 |
| 실시예 3 | 43 | 54 |
| 실시예 4 | 49 | 61 |
상기 표 9의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출과 피톨의 복합물은 제조예 9 및 비교예 1과 비교해 볼 때, 각질세포의 이동 촉진 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 실시예 4에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.
시험예 9: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물의 procollagen type 1 생성 증가 효능 확인
상기 제조예 9와 실시예 1~4를 대상으로 시험예 4의 방법과 동일하게 실험을 수행하여 섬유아세포에서 procollagen type 1의 생성 증가 효능을 확인하였으며, 그 결과는 하기의 표 10에 나타내었다. 비교예로서 피톨만을 함유한 시료를 사용하였다.
| 구분 | Procollagen 생성량 / 총 단백질량 | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 4.9 | |
| 제조예 9 | 7.0 | 7.7 |
| 비교예 1 | 6.9 | 7.8 |
| 실시예 1 | 7.4 | 8.2 |
| 실시예 2 | 7.7 | 8.6 |
| 실시예 3 | 8.1 | 8.9 |
| 실시예 4 | 8.4 | 9.6 |
상기 표 10의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출과 피톨의 복합물은 제조예 9 및 비교예 1과 비교해 볼 때, 인간 섬유아세포에서 procollagen type 1의 생성을 더욱 효과적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 10: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물의 염증매개인자의 생성 억제 효능 확인
상기 제조예 9와 실시예 1~4를 대상으로 시험예 5의 방법과 동일하게 실험을 수행하여 LPS에 의해 증가된 염증매개인자인 IL-1β 및 TNF-α의 생성 억제 효능을 확인하였으며, 그 결과는 하기의 표 11에 나타내었다. 비교예로서 피톨만을 함유한 시료를 사용하였다.
| 구분 | IL-1β(pg/ml) | TNF-α(pg/ml) | ||
| 0.1% | 1.0% | 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 2.4 | 1.2 | ||
| LPS 처리군 | 8.4 | 5.7 | ||
| 제조예 9 | 6.9 | 6.3 | 3.4 | 2.9 |
| 비교예 1 | 6.8 | 6.1 | 3.2 | 2.6 |
| 실시예 1 | 6.4 | 5.1 | 2.8 | 2.2 |
| 실시예 2 | 6.1 | 5.0 | 2.5 | 2.0 |
| 실시예 3 | 6.0 | 4.6 | 2.3 | 1.6 |
| 실시예 4 | 5.4 | 3.9 | 2.0 | 1.4 |
상기 표 11의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출과 피톨의 복합물은 제조예 9의 혼합추출물 및 비교예 1과 비교해 볼 때, 인간 각질세포주에서 LPS에 의해 증가된 염증매개인자인 IL-1β 및 TNF-α의 생성 증가를 더욱 효과적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 4에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.
실시예 5: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 함유하는 세럼의 제조
시험예 6~10의 결과에서 가장 우수한 효능을 나타내었던 상기 실시예 4의 복합물을 함유한 세럼을 하기의 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 원료 | 함량(중량%) |
| 실시예 4 | 1.0 |
| 밀납 | 1.0 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄 세스퀴올레이트 | 0.5 |
| 미네랄 오일 | 10.0 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.5 |
| 친유형 모노스테아린산 글리세린 | 1.0 |
| 스테아린산 | 1.5 |
| 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 | 1.0 |
| 프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 카르복시폴리머 | 0.1 |
| 트리에탄올아민 | 0.1 |
| 페녹시에탄올 | 적량 |
| 정제수 | To 100 |
실시예 6: 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 함유하는 크림의 제조
상기 실시예 4의 복합물을 함유한 크림을 하기의 표 13의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 원료 | 함량(중량%) |
| 실시예 4 | 1.0 |
| 시어버터 | 2.0 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄 세스퀴올레이트 | 0.8 |
| 미네랄 오일 | 10.0 |
| 디메치콘 | 3.0 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.5 |
| 친유형 모노스테아린산 글리세린 | 1.0 |
| 세테아릴알코올 | 2.0 |
| 글리세릴스테아레이트/피이지??400 스테아레이트 | 1.0 |
| 프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 카르복시폴리머 | 0.25 |
| 트리에탄올아민 | 0.25 |
| 페녹시에탄올 | 적량 |
| 정제수 | To 100 |
시험예 11 : 제형안정도 확인
상기 실시예 5, 6에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 24주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하였다. 또한 온도 순환조건(-5 ~ 50℃)에서도 안정성을 확인하였다. 결과는 표 14에 나타내었다.
| 온도조건 | 안정성 확인 | |||||
| 실시예 5 | 실시예 6 | |||||
| 변색 | 변취 | 분리 | 변색 | 변취 | 분리 | |
| 실온(25℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 냉장(4℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 항온(50℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 순환(-5 ~ 50 ℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
< 제형 안정 등급 >0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화
상기 표 14에서 나타낸 바와 같이 실시예 5, 6의 제형 모두 25℃, 4℃, 50℃ 온도 조건 및 순환조건 하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.
Claims (7)
- 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨의 복합물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥이 각각 1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 추출 제조되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 복합물은 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물 99~99.9999 중량%, 피톨 0.0001~1 중량%의 비율로 이루어진 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부미백용임을 특징으로 하는 화장료 조성물
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부재생 및 회복촉진용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부진정용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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|---|---|---|---|---|
| KR102398008B1 (ko) | 2021-12-02 | 2022-05-16 | 주소민 | 쑥 추출물을 함유한 세정제 및 화장료 조성물 |
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| KR20080079743A (ko) * | 2007-02-28 | 2008-09-02 | 최광석 | 아토피성 피부염 치료효과를 갖는 산야초를 이용한발효물의 제조방법 |
| KR20110132589A (ko) * | 2009-03-11 | 2011-12-08 | 이엘씨 매니지먼트 엘엘씨 | 중국 전통 의약 (ｔｃｍ) 성분의 발효 추출물을 포함하는 국소 조성물, 및 그의 제조 및 이용 방법 |
| KR101415963B1 (ko) * | 2012-06-15 | 2014-07-04 | 김진 | 화장료 조성물 |
-
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