CN111202708B - 包含植物细胞复合体培养物的皮肤改善用化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含植物细胞复合体培养物的皮肤改善用化妆品组合物，更详细地，涉及如下的化妆品组合物，即，包含：高山火绒草细胞培养物或其提取物；海冬青细胞培养物或其提取物；海茴香细胞培养物或其提取物；苹果细胞培养物或其提取物；葡萄细胞培养物或其提取物；沙漠玫瑰细胞培养物或其提取物；熏衣草细胞培养物或其提取物；黄荆细胞培养物或其提取物；莲花细胞培养物或其提取物；没药细胞培养物或其提取物；以及茉莉细胞培养物或其提取物作为有效成分，具有赋予皮肤活力、提高皮肤活力、预防或改善皮肤皱纹、保护或增强皮肤屏障功能、预防或改善痤疮、保护因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡、皮肤美白、抗老化等功能。

Description

包含植物细胞复合体培养物的皮肤改善用化妆品组合物
技术领域
本发明涉及包含植物细胞复合体培养物或其提取物的皮肤改善用化妆品组合物，更详细地，涉及如下的化妆品组合物，即，包含：高山火绒草细胞培养物或其提取物；海冬青细胞培养物或其提取物；海茴香细胞培养物或其提取物；苹果细胞培养物或其提取物；葡萄细胞培养物或其提取物；沙漠玫瑰细胞培养物或其提取物；熏衣草细胞培养物或其提取物；黄荆细胞培养物或其提取物；莲花细胞培养物或其提取物；没药细胞培养物或其提取物；以及茉莉细胞培养物或其提取物作为有效成分，具有赋予皮肤活力、提高皮肤活力、预防或改善皮肤皱纹、保护或增强皮肤屏障功能、预防或改善痤疮、保护因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡、皮肤美白、抗老化、抗氧化、抑制皮脂、收缩毛孔、提高皮肤弹力、改善、收敛皮肤、特应性、抗炎等功能。
背景技术
最近，通过研究查明了控制昼夜节律的生物钟(biological clock)分子网络。自从20世纪70年代以来逐渐查明，根据地球自转生成的昼间和夜间一天周期，调节生物体的生理代谢及身体节奏有关的多个基因的表达，与昼夜节律有关的疾病研究也正在积极进行中。美国缅因大学教授杰弗理·霍尔(Jeffrey C.Hall)、布兰迪斯大学教授迈克尔·罗斯巴殊(Micheal Rosbash)、洛克菲勒大学教授迈克尔·杨(Michael W.Young)通过作为动物模型的醋蝇阐明由昼夜24小时周期显示的昼夜周期性多个基因的作用机制的功劳得到了认可，荣幸获得了2017年诺贝尔奖。本次获奖者们在首次确认与生物钟有关的基因的存在之后的19世纪80年代连续找出了多个相关基因，并阐明了其生物钟的基本机制。这些生物钟基因的分子网络中有一种适应于昼间和夜间的变化来发达的CLOCK基因。被称为“CLOCK(时钟昼夜节律调节器(Clock circadian regulator))”，“PER1(周期性昼夜节律蛋白(Period circadian protein))”等多个CLOCK基因不仅存在于脑组织，如小脑、中脑、下丘脑，而且存在于脏器中，如心脏或肺、脂肪、血管、肾脏。
基于这些研究，阐明了生物周期为被称为周期(period)的基因表达的蛋白质(PER)的浓度以24小时为周期发生变化时发生的生物学现象。由周期基因产生的PER蛋白增加并连续积累于细胞核外细胞质时，PER蛋白与另一酶相结合并进入细胞核内以移植周期基因的表达。像这样，生物钟的周期以由PER蛋白的浓度增加先增后减的分子振动方式出现。后来，连续发现了调节这种基本机制的稳定性和功能性的另一种基因(蛋白质)，并精心调节的“生物钟”的机制变得众所周知。在此步骤中，CLOCK和BMAL1蛋白的的二聚体触发作为转录因子位于其下游步骤的多个反馈基因的周期(PER)及隐花色素(CRY，Cryptochrome)系列的多个基因的表达，其基因产物构成使多个上游步骤转录因子灭活的一系列分子循环结构。众所周知，这些分子网络通过触发受下游调节的多个基因的昼夜周期性来影响多种生理过程(Stratmann and Schibler，2006，J Biol Rhythms 21：494)。即，通过CLOCK/PER蛋白的相关反馈来调节生物节奏，以使每日重复，从而使生物钟工作。
作为皮肤细胞的角质细胞、黑色素细胞、成纤维细胞中也存在独立的生物钟系统。皮肤生物钟用于调节皮肤生理活性，皮肤细胞增殖及分化、水化(hydration)和水分流失(transepidermal water loss，TEWL)、毛细血管血流、皮脂生成、温度、表面pH、皱纹形成具有昼夜节律。若这种过程的节奏被打破，则无法在正确的时间引起必要的生理反应，从而打破皮肤的稳态、促进皮肤老化，严重的情况下还可诱发皮肤癌。
随着年龄增长，人的皮肤经历各种基于内在因素、外在因素的变化。作为内在的，调节新陈代谢的各种激素的分泌减少，免疫细胞的功能和多个细胞的活性下降，因此对生物体所需的免疫蛋白质及多个生物体构成蛋白质的生物合成减少。作为外在的，由于臭氧层的破坏增加了到达太阳光表面的紫外线的含量且环境污染更严重，从而自由基及活性有害氧气等增加，因此经常引发各种变化，如皮肤的厚度减少、皱纹增加、不仅弹力降低，而且经常发生皮肤问题。
若皮肤老化现象进行，则发生角质形成细胞及成纤维细胞的分裂减少、胶原合成减少、基质金属蛋白酶(MMP)生成增加、黑色素生成的信号传递增加等，由此，皱纹增加且皮肤弹力降低、暗斑、雀斑和黑斑等增加。尤其，由于在40岁前后激素平衡被打破，细胞再生能力、胶原合成能力、对皮肤保湿重要的角质层的水分含量显著下降。这被认为是角质层脂质构成成分的减少、天然保湿因子的减少、干性皮肤临床甘油(glycerol)量的减少等为其原因。结果，由于在老化皮肤中从下表皮供应到角质层的水分含量不足，使皮肤变得更干燥，因此容易发生炎症和瘙痒症。相反，皮肤的皱纹由胶原的合成和分解的不平衡引起的，在正常皮肤中作为I型(type I)胶原的合成和其分解酶的基质金属蛋白酶1(MMP-1)形成平衡。但是，在光老化的皮肤中I型、III型胶原的合成下降，基质金属蛋白酶1的活性增加。这种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)具有利用蛋白分解酶分解细胞外基质(extracellular matrix)的功能，在正常状态下，参与伤口愈合或组织再生过程。
发明内容
本发明人努力寻找具有赋予皮肤活力、提高皮肤活力、改善皮肤皱纹、再生皮肤、增强皮肤屏障功能、改善皱纹等多种功能的材料的结果，阐明了高山火绒草、海冬青、海茴香、苹果、葡萄、沙漠玫瑰、熏衣草、黄荆、莲花、没药、茉莉的各个叶子的愈合组织复合体提取物具有生物钟调节效果，确认可成为多种功能性化妆品材料，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含：高山火绒草细胞培养物或其提取物；海冬青细胞培养物或其提取物；海茴香细胞培养物或其提取物；苹果细胞培养物或其提取物；葡萄细胞培养物或其提取物；沙漠玫瑰细胞培养物或其提取物；熏衣草细胞培养物或其提取物；黄荆细胞培养物或其提取物；莲花细胞培养物或其提取物；没药细胞培养物或其提取物；以及茉莉细胞培养物或其提取物作为有效成分的皮肤改善用化妆品组合物及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供包含：高山火绒草细胞培养物或其提取物；海冬青细胞培养物或其提取物；海茴香细胞培养物或其提取物；苹果细胞培养物或其提取物；葡萄细胞培养物或其提取物；沙漠玫瑰细胞培养物或其提取物；熏衣草细胞培养物或其提取物；黄荆细胞培养物或其提取物；莲花细胞培养物或其提取物；没药细胞培养物或其提取物；以及茉莉细胞培养物或其提取物作为有效成分的皮肤改善用化妆品组合物及其制备方法。
以下，进一步具体说明本发明。
在一方面，本发明涉及包含：高山火绒草细胞培养物或其提取物；海冬青细胞培养物或其提取物；海茴香细胞培养物或其提取物；苹果细胞培养物或其提取物；葡萄细胞培养物或其提取物；沙漠玫瑰细胞培养物或其提取物；熏衣草细胞培养物或其提取物；黄荆细胞培养物或其提取物；莲花细胞培养物或其提取物；没药细胞培养物或其提取物；以及茉莉细胞培养物或其提取物作为有效成分的皮肤改善用化妆品组合物。
在本发明中，上述各个细胞培养物可以为愈合组织(callus)培养物，可以使用上述各个植物的叶子。
具体地，对上述细胞培养物或其提取物含量没有限制，但是，相对于组合物的总重量，可包含0.1重量百分比至10重量百分比。
在本发明中，对于成为有效成分的各植物细胞的各个植物的说明如下。
(1)高山火绒草(Leontopodium alpinum)
高山火绒草属于菊科植物，生长在欧洲的阿尔卑斯山脉和亚洲高山地带。高度为10～20cm，整体上敷满白色柔毛。叶子在根中比较常见，茎中很少，是线型。茎的末端聚集有苞，并向四周展开，中央具有头状花。
(2)海冬青(Eryngium maritimum)
海冬青俗称刺芹(Eryngium)，古希腊名字为“eryggion”，起源于本属中任何物种的名称。60cm左右高度的两年生或多年生草。上部枝裂开很多。下部叶片为圆状心脏形，裂成3～5个，具有针状锯齿。上部叶片没有叶柄，包围茎。约有6个苞，呈略宽的椭圆形，两侧具有2～3的锯齿。末端呈针状。花从夏天开到秋天，花序为圆形且呈金属性的浅紫色。
(3)海茴香(Crithmum maritimum)
海茴香是属于伞形目伞形科的可食用的野生植物，是主要生长于欧洲纯净海边的石缝的特殊的盐生植物，对浪花、高盐度、温度和风等具有抵抗力的极端植物。花集中生长于茎端，呈绿黄色，大小小，具有5个花瓣。当植物被破碎时，可闻到清香的柠檬香。几个世纪以来作为食材使用，也用作药，据说将种子、根和叶放入葡萄酒中有助于治疗黄疸和泌尿道疼痛，对因缺乏维生素C而引起的坏血病也有效，因此，将叶子和种子腌制并带到航行中。
(4)苹果(Malus domestica)
作为双子叶植物红木玫瑰科落叶乔目植物的苹果树的果实呈长度为5～10cm左右的圆形，颜色通常为红色或黄色。据悉，原产地为巴尔干半岛。作为碱性食品，卡路里低且具有很多对身体有益的成分。膳食纤维可将血管中积聚的有害胆固醇向体外排出，并通过增加有益胆固醇来预防动脉粥样硬化。
(5)葡萄(Vitis vinifera(Grape))
葡萄是一种种科，里面有大量的肉和水分，在7～8月成熟并呈黑色。据悉，原产地为亚洲西部的黑海沿岸和卡夫卡地方。
(6)沙漠玫瑰(Adenium obesum)
沙漠玫瑰为双子叶常绿灌木，热带非洲和阿拉伯半岛等沙漠气候中可见的多肉植物之一。花名来源于作为出生地之一的也门(Aden)，由于花像玫瑰一样美丽而被称为“沙漠的玫瑰(Desert Rose)”。
(7)熏衣草(Lavandula angustifolia(Lavender))
熏衣草俗称熏衣草花(Lavandula)来源于“洗”的意思的拉丁语，这是因为罗马人在洗澡或洗衣时喜欢向水中放入熏衣草。它是一种花茎上长了紫色星形的小花的唇形科多年生植物，覆盖花、叶、茎的毛之间具有产生香气的油泉，从而用于生产精油。
(8)黄荆(Vitex negundo)
黄荆为欧洲南部山的马鞭草属的灌木，叶子呈毛状长得茂盛，绽放具有香气的淡紫花。
(9)莲花(Nelumbo nucifera)
莲的原产地为亚洲南部和澳大利亚北部。生长于黏土，是一种清洁及高贵的植物，是一种对于许多国家的人熟悉的植物。根茎厚并横生，多节，特别是在末端秋天变厚。花在7～月绽放，呈红色或白色，花茎末端各结一个，直径为15～，花茎带刺。花瓣呈倒卵形，雄蕊有多个。花托大而扁平，直径为10cm左右，果实为坚果。种子埋藏于花托内。
(10)没药(Commiphora myrrha)
没药又被称为甜酒(myrrha)。它是一种淡黄色或暗褐色的大小块物质，没药为从橄榄树科的没药树或哈地树中获得的橡胶树脂，是一种中药材。
(11)茉莉(Jasminum sambac(Jasmine))
印度为原产地，主要分布于中国、中国台湾、菲律宾、印度、印度尼西亚等地的热带和亚热带地方。叶对生或一个接一个地轮生，呈椭圆形或阔卵形。边缘较平，末端稍尖，有光泽。
在本发明中，上述各个试样以植物细胞培养物、提取物、过滤物等形态可包含于本发明的组合物。例如，可购买使用作为在本发明所属技术领域中通常利用的细胞培养物、提取物或过滤物的高山火绒草愈合组织培养提取物、海冬青愈合组织培养过滤物、海茴香愈合组织培养过滤物、苹果细胞培养提取物、葡萄细胞提取物、沙漠玫瑰叶细胞提取物、熏衣草叶细胞提取物、黄荆叶细胞提取物、莲花叶细胞培养粉、没药叶细胞提取物及茉莉叶细胞提取物产品，但并不限定于此。
在本发明中，“愈合组织(callus)”是指当植物体受伤时细胞通过恢复分裂能力来防伤并变得肥大的愈伤组织，是指将从植物体切割的组织培养在含生长素的培养基，或者当对某种植物留伤或用生长素处理伤口部位时生成的未分化组织或细胞块，在新的培养基中继代培养，从而可永久分裂及增殖。这种愈合组织为失去引起正常器官形成或组织分化的能力的无定形的组织或细胞块，大多数为乳细胞，广义上讲，还包含通过土壤杆菌(agrobacterium)等感染生成的植物肿瘤组织。即，若植物体内的细胞增殖，则立即定向，并不仅有规律的组成特定的组织，而且还组成器官。但是，通过组织培养形成的作为未分化细胞块的愈合组织被解释为若受到来自外部的刺激如多种植物生长激素，则保持到那时位置的控制被解除，从而细胞将任意增殖。
若将通过脱分化获得的愈合组织放入具有相同组成液体培养基中震荡培养，则细胞彼此分开以悬浮状态继续增殖。可通过在新的培养基中继代培养该愈合组织或培养细胞来使其永久分裂及增殖，从而本质上与完整植物体通过老化死去的分化细胞不同。若将继代培养几代的愈合组织或培养细胞涂敷于去除多种植物生长激素的固体培养基，则生出芽和根来使个体植物复原。该再生植物来源于一个培养细胞的分裂增殖，该培养细胞的根源是从胚轴或水组织诱导的。
在本发明中，“愈合组织”可以是从植物的任何一个部位诱导的，作为一具体例，花瓣、花托、果实、子房、胎座组织的一部分，或者可以为从种子的发芽的幼苗中提取子叶并诱导的愈合组织。
在本发明中，“细胞培养物”、“愈合组织培养物”或“植物细胞培养物”是将愈合组织培养于培养基的。上述培养基若有在技术领域中通常使用于愈合组织培养，可不受限制地使用。
在本发明中，上述用于改善皮肤包括多种皮肤活力改善功能，如赋予皮肤活力、增加皮肤活力、再生皮肤、保湿、预防或改善皮肤皱纹、保护或增强皮肤屏障功能、预防或改善痤疮、保护因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡、皮肤美白、抗老化、抗氧化、抑制皮脂、收缩毛孔、增加皮肤弹力、改善、收敛皮肤、特应性、抗炎。
在本发明中，含有植物细胞复合体培养物或其提取物的皮肤改善用化妆品组合物的制备方法包括如下步骤：
步骤1，准备将从高山火绒草、海冬青、海茴香、苹果、葡萄、沙漠玫瑰、熏衣草、黄荆、莲花、没药及茉莉诱导的各个植物细胞培养物或其提取物混合而成的混合物；以及
步骤2，制备包含在上述步骤1中准备的混合物的化妆品组合物。
在本发明中，上述各个植物细胞培养物可以为愈合组织(callus)培养物，上述各个植物可使用植物的叶子。
在本发明中，在上述步骤1中，可包括通过从各个植物组织分离植物细胞来诱导培养愈合组织来准备植物细胞培养物的步骤。
在本发明中，在上述步骤2中，可包括通过干燥从步骤1中获得的各个植物细胞培养物并进行粉末化来混入纯净水来制备组合物的步骤。
在本发明中，在上述步骤2中，可包括通过干燥从步骤1中获得的各个植物细胞培养物并进行粉末化来混入纯净水后，通过超声波提取或热水提取来制备组合物的步骤。
在本发明中，使用上述植物细胞培养物(培养体)本身，或者过滤使用培养物，或者破碎使用培养物，或者可通过干燥并粉末化培养物后，溶于纯净水来使用。
在本发明中，“提取物”是指对上述植物细胞培养物的提取物进行粉末化，或者通过已知的多种方法如冷水提取方法、热水提取方法、乙醇提取方法来获得的提取物。
在本发明中对于提取方法没有特别限制，例如，可以为冷提取、超声波提取、回流提取、热水提取等。其中，在热水提取的情况下，以80～100℃的温度在热汤蒸馏器中加入8～48小时来获得热水提取物。
在冷水提取的情况下，例如，在冷水(15～25℃)中混合上述植物细胞培养物本身或其干燥的粉末来提取3天，从而获得冷水提取物。
或者，可通过使用水、有机溶剂或其混合溶剂来提取的方法制备。提取的液体可直接使用或浓缩和/或干燥使用。在使用有机溶液来提取的情况下，使用作为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、1，3-丁二醇、丙二醇或它们的混合溶剂的有机溶剂，在没有破坏或最小化生药的有效成分的条件下，可在室温或通过加热来提取。可根据提取的有机溶剂药剂的有效成分的提取程度和损失程度具有差异，因此选择使用合适的有机溶剂。尤其，在本发明中，使用乙醇提取物，优选为20～50％的乙醇提取物，作为一例，优选为50％的乙醇提取物，提取方法如实施例所述，与50％乙醇混合后通过搅拌3天来获得。
在本发明中，上述提取物可浓缩或稀释使用，还可使用提取物的蒸馏液。
在本发明中，“作为有效成分包含”是指包含作为化妆品组合物可具有预防或改善皮肤皱纹、保护或增强皮肤屏障功能、预防或改善痤疮、保护因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡、皮肤美白、抗老化、抗氧化、抑制皮脂、基于收缩毛孔的皮肤改善效果，例如，作为化妆品组合物可具有合成与皱纹改善功效有关的胶原、增加弹性、收敛皮肤、改善皱纹、改善皮肤屏障、改善、收缩毛孔、抑制皮脂、改善痤疮、美白、抗炎等功能性程度的有效量。
在本发明中，皮肤收缩作用原理是指与皮肤蛋白质的高分子黄酮类(flavonoids)结合形成交联键，从而使皮肤收缩的现象。收敛的含义基本上意味着有皱纹或收缩，收敛剂具有收敛皮肤和血管等的作用，通过横档细胞间隙及淋巴间隙来具有抑制粘液分泌的效果。并且，由于收敛剂具有与蛋白质相结合的性质，因此，可根据血红蛋白的蛋白质与提取物相接程度来判断收敛效果程度。可以说这些收敛作用具有通过外用或内用来在皮肤和粘膜的表面形成难溶性皮膜，其结果保护局部，或者使组织稠密来减少细胞膜的渗透性的效果。这种对于皮肤的收敛作用分为化学收敛作用和物理收敛作用两种，化学收敛作用是指通过起到蛋白质凝聚作用的物质如鞣酸来暂时收缩汗腺和毛孔。相反，物理收敛是指对皮肤适用冷水或通过乙醇的挥发来降低皮肤的温度，从而暂时收缩汗腺和毛孔。
并且，这种皮肤收敛由于夏天或压力而生成更多的皮脂，从而发生皮肤问题，发生皮肤问题的部位变得越来越红，皮肤镇定是指缓解这种皮肤问题。
在根据本发明的保护或增强皮肤屏障功能中，皮肤屏障(skin barrier)为作为表皮的最外层的角质层(stratum corneum)主要由无核的扁平的角质细胞(corneocyte)形成。通过正常的表皮细胞的分裂及分化过程维持的皮肤屏障的角质细胞和合成的诸如神经酰胺、胆固醇及脂肪酸等细胞间脂质形成的多层脂质膜(multi lamella lipid layer)，起到防御膜作用，以防止皮肤中的水分蒸发。另一方面，这些细胞间脂质中ω-羟基神经酰胺与作为角质细胞(corneocyte)外层的蛋白质的外皮蛋白(involucrin)化学共价键连接来形成角质细胞脂质膜(corneocyte lipid envelope，CLE)，从而起到物理上使多层脂质膜形态的细胞间脂质稳定的作用，进而起到强化皮肤屏障功能的作用。
本发明的组合物通过皮肤涂敷来传递到角质层，从而促进角质细胞的分化，不仅具有改善表皮层的厚度变厚的效果，并且使皮肤屏障损失恢复的效果优秀，因此可有效地使用于通过皮肤屏障的损伤诱发的皮肤疾病的治疗及预防。通过上述皮肤屏障损伤诱发的皮肤疾病有特应性皮肤炎(atopic dermatitis)、干皮病(xeroderma)、牛皮癣(psoriasis)、鱼鳞病(ichthyosis)、痤疮等，但并不限定于此。
并且，皮肤屏障功能保护机制通过作为紧密连接结构蛋白质的封闭蛋白(occludin)和紧密连接蛋白1(claudin-1)的蛋白质量增加来确认。中间丝相关蛋白(Filaggrin)为角质形成细胞在分化步骤中表达的多个结构蛋白质之一，参与使从表皮的基层到角质层进行分化，还形成皮肤组织的保湿性必需的天然保湿因子(Naturalmoisture factor，NMF)的主体，因此用作皮肤的保湿性及皮肤膜功能的主要指标，根据本发明的植物细胞复合体培养物随着中间丝相关蛋白的基因表达显著增加，可具有优秀的保护、强化、改善皮肤屏障功能。
同时，根据本发明的植物细胞复合体培养物或其提取物还可用于保护因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡。
并且，根据本发明的植物细胞复合体培养物或其提取物具有弹性蛋白表达增加能。弹性蛋白(Elastin)为存在于结合组织的细胞外基质的结构物质，是存在于皮肤并赋予弹性的物质。弹性蛋白以作为弹性蛋白原(Tropo elastin)的多肽在细胞中合成后，在细胞外通过弹性蛋白原间的交叉结合来生成。因此，弹性蛋白通过弹性蛋白原的交叉结合来具有二维或三维弹性。因此，根据本发明的植物细胞复合体培养物或其提取物可用于增加、改善皮肤弹力。
因此，根据本发明的化妆品组合物，尤其具有原骨胶原增加、胶原生物合成增加能，可适用于预防或改善抗老化或皮肤皱纹，除此之外，可适用于因弹性蛋白表达增加的皮肤弹力增强、保护或强化皮肤屏障功能。
另一方面，本发明涉及包含植物细胞复合体培养物或其提取物的皮肤改善用化妆品组合物的制备方法，包括：步骤1，准备将从高山火绒草、海冬青、海茴香、苹果、葡萄、沙漠玫瑰、熏衣草、黄荆、莲花、没药及茉莉诱导的各个植物细胞培养物或其提取物混合而成的混合物；以及步骤2，制备包含在上述步骤1中准备的混合物的化妆品组合物。
在本发明中，上述各个植物细胞培养物可以为愈合组织(callus)培养物，上述各个植物可使用植物的叶子。
在上述步骤1中，具体地，为了制备植物细胞培养物，可选择适合用于诱导及培养愈合组织的培养基。若有在技术领域中通常使用的培养基，可不受限制地使用。在植物中，一般情况下，主要使用MS培养基、B5培养基等，作为一例，MS培养基的组成(1L为基准时)为1650mg的NH4NO3、1900mg的KNO3、440mg的CaCl2.2H2O、370mg的MgSO4.7H2O、170mg的KH2PO4、0.83mg的KI、6.2mg的H3BO3、22.3mg的MnSO4.4H2O、8.6mg的ZnSO4.7H2O、0.25mg的Na2MoO4.2H2O、0.025mg的CuSO4.5H2O、0.025mg的CoCl2.6H2O、27.8mg的FeSO4.7H2O、37.3mg的Na2EDTA.2H2O、100mg的肌醇(Myoinositol)、0.5mg的烟酸(Nicotinic acid)、0.5mg的盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl)、0.5mg的盐酸硫胺素(Thiamine-HCl)、2mg的甘氨酸(Glycine)、30000mg的蔗糖(Sucrose)。
在本发明中，在上述步骤2中，将直接包含通过步骤1的培养获得的各个植物细胞培养物的组合物制备成适当形态的化妆品组合物，或者可通过提取方法以提取物形态获取上述培养物来制备成适当形态的化妆品组合物。
例如，在上述步骤2中，可包括通过干燥从步骤1中获得的各个植物细胞培养物并进行粉末化来混入纯净水来制备组合物，或者可包括通过干燥从步骤1中获得的各个植物细胞培养物并进行粉末化来混入纯净水后，通过冷水提取、热水提取或乙醇提取来制备组合物的步骤。
作为另一例，对在上述步骤1中获得的培养物进行热风干燥后，可通过粉末化来使水分增加来制备。
在上述化妆品组合物中，化妆品制剂可包含可收容的载体。其中，“化妆品制剂种的可收容的载体”是指可包含于化妆品制剂的公知使用的化合物或组合物，或者作为将来开发的化合物或组合物与皮肤接触时人体可适应的没有毒性、不稳定性或刺激性的。
相对于本发明的化妆品组合物的总重量，包含约1重量百分比至约99.99重量百分比的上述载体，优选地可包含组合物的重量的约90重量百分比至约99.99重量百分比。但是，上述比率根据制备本发明的化妆品组合物的后述的剂型和其具体作用部位(脸、脖子等)或其优选施用量而不同，因此，在任何方面，上述比率也不应被解释为限制本发明的范围。
作为上述载体可例示乙醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、润湿剂、保湿剂、粘稠改性剂、乳化剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、着色剂、香料等。在本技术领域中公知可用作上述乙醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、润湿剂、保湿剂、粘稠改性剂、乳化剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、着色剂、香料的化合物或组合物等，因此对于本技术领域的技术人员而言，可选择使用适当的对应物质或组合物。
作为本发明的一实例，根据本发明的化妆品组合物除了包含作为上述有效成分的愈合组织提取物之外，还可包含甘油、丁二醇、丙二醇、聚氧乙烯硬化蓖麻油、乙醇、三乙醇胺等，根据需要可包含微量的防腐剂、香料、着色剂、纯净水。
并且，还可包含以往公知的生理活性成分或其他植物细胞培养物或提取物。例如，还可包含绞股蓝或丝瓜或绞股蓝及丝瓜杂种植物细胞培养物或植物细胞培养提取物等。
根据本发明的化妆品组合物可制备成多种形态，例如，化妆水、精华素、凝胶、乳液、护肤液、面霜(水中油滴型、油中水滴型、多重状)、溶液、悬浮液(污水及水类)、无水产物(油及乙二醇类)、凝胶、罩、面膜、粉末或明胶等具有皮膜的胶囊(软胶囊、硬胶囊)剂型。
本发明中的皮肤概念不仅包括脸，而且还包括头皮、全身，作为可适用于这种头皮的化妆品组合物有洗发水、护发素、发膜、生发剂等，可制备成适用于全身的沐浴露等用途的形态。
根据本发明的化妆品组合物的制备方法并不限定于前述的制备方法，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，可以部分地修改上述制备方法来制备。
在制备成化妆品组合物的情况下，作为乳化剂型的化妆品具有滋养乳液、面霜、精华素等，作为可溶剂型的化妆品有柔软化妆水。并且，包含皮肤科学上可接受的媒质或基质，从而可制备成通常使用于皮肤科学领域的可局部适用或全身适用的辅助剂形态。
并且，作为合适的化妆品的剂型能够以例如溶液、凝胶、固体或浆料无水产物、在水相中分散油相来获得的乳液、悬浮液、微胶囊、微粒或离子型(脂质体)、非离子型的小囊分散剂的形态、面霜、柔肤水、乳液、粉末、软膏、喷雾或锥形棒的形态提供。并且，可制备成还包含泡沫(foam)的形态或压缩的推进剂的气雾剂组合物的形态。
并且，本发明的化妆品组合物还可包含通常使用于化妆品或皮肤科学领域的辅助剂，例如，通常使用于脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂及胶凝剂、柔软剂、抗氧化、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、隔离剂、金属离子封闭剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻滞剂、润湿剂、必需油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质囊泡或化妆品的另一种成分。而且，上述成分可以由通常使用于皮肤科学领域的量加入。
包含根据本发明的植物细胞复合体培养物或其提取物的化妆品组合物作为具有赋予皮肤活力、增加皮肤活力、预防或改善皮肤皱纹、保护或增强皮肤屏障功能、预防或改善痤疮、包含因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡、皮肤美白、抗老化、抗氧化、抑制皮脂、收缩毛孔、增加皮肤弹力、改善、收敛皮肤、特应性、抗炎等功能的化妆品组合物，可用于多种功能性化妆品的材料。
附图说明
图1为确认是否有根据本发明的愈合组织复合体组合物的毒性的结果。
图2为确认根据本发明的愈合组织复合体组合物的皮肤屏障相关基因的信使核糖核酸(mRNA)表达率的结果。
图3为确认根据本发明的愈合组织复合体组合物的皱纹改善效果的结果。
图4为确认根据本发明的愈合组织复合体组合物的抗炎效果的结果。
图5为确认根据本发明的愈合组织复合体组合物的美白效果的结果。
图6为确认根据本发明的愈合组织复合体组合物的从紫外线保护皮肤细胞凋亡效果的结果。
图7为确认根据本发明的愈合组织复合体组合物的生物钟调节相关基因表达试验结果的结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则在本说明书中所使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属技术领域中熟练的专家通常理解的含义相同的含义。一般情况下，在本说明书中所使用过的命名法为本技术领域中公知的且通常所使用的。
实施例1：根据本发明的植物细胞复合体组合物制备
实施例1-1：11种植物试样的表面消毒
为了生产根据本发明的细胞，准备高山火绒草叶、海冬青叶、海茴香叶、苹果叶、葡萄叶、沙漠玫瑰叶、熏衣草叶、黄荆叶、，莲花叶、没药叶、茉莉叶，为了对表面进行杀菌，在70％的乙醇中浸渍30秒钟，在2％的次氯酸钠(Sodium hypochlorite)中震荡5分钟来进行杀菌后，用灭菌水清洗。
实施例1-2：从11种植物试样诱导愈合组织
如下培养11种植物试样的愈合组织。
1)利用锋利的刀一次性切割杀菌的高山火绒草叶，并在包含1mg/L的作为植物生长调物质(Plant Growth Regulators)的6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)、0.3mg/L的2，4-D、3％的蔗糖及8g/L的琼脂(agar)的基本MS培养基(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
2)利用锋利的刀一次性切割杀菌的海冬青叶，并在包含50mg/L的作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、5mg/L的玉米素(Zeatin)、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
3)利用锋利的刀一次性切割杀菌的海茴香叶，并在包含5mg/L作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸、10mg/L的玉米素、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashigeand Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
4)利用锋利的刀一次性切割杀菌的苹果叶，并在包含5mg/L作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸、10mg/L的玉米素、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashigeand Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
5)利用锋利的刀一次性切割杀菌的葡萄，并在包含0.1mg/L的作为植物生长调物质的2，4-D、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
6)利用锋利的刀一次性切割杀菌的沙漠玫瑰叶，并在包含5mg/L作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸、10mg/L的玉米素、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
7)利用锋利的刀一次性切割杀菌的熏衣草叶，并在包含0.1mg/L的作为植物生长调物质的2，4-D、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
8)利用锋利的刀一次性切割杀菌的黄荆叶，并在包含5mg/L作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸、10mg/L的玉米素、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashigeand Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
9)利用锋利的刀一次性切割杀菌的莲花叶，并在包含1mg/L的作为植物生长调物质(Plant Growth Regulators)的6-苄氨基嘌呤、0.3mg/L的2，4-D、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的1/2MS培养基(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
10)利用锋利的刀一次性切割杀菌的没药叶，并在包含5mg/L作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸、10mg/L的玉米素、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashigeand Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
11)利用锋利的刀一次性切割杀菌的茉莉叶，并在包含5mg/L作为植物生长调物质的吲哚-3-乙酸、10mg/L的玉米素、3％的蔗糖及8g/L的琼脂的基本MS培养基(Murashigeand Skoog 1962，Duchefa公司，Cat No.M0221)中，于25℃、湿度为70％的生长条件暗培养，并诱导为初始植物细胞。利用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基调整为pH5.8。继代培养以2周为间隔进行。
实施例1-3：11种根据本发明的植物的愈合组织培养及大量生产
在上述实施例1-2中，通过无菌继代培养来培养的高山火绒草、海冬青、海茴香、苹果、葡萄、沙漠玫瑰、熏衣草、黄荆、莲花、没药及茉莉的各个叶的愈合组织培养之后，利用生物反应器，除了琼脂之外，在相同的组成的液体培养基中，于25℃、70％的湿度、0.1vvm的供气量恒定调节，以14天为间隔通过培养及增殖来进行大量生产。
实施例1-4：11种根据本发明的植物的愈合组织复合体提取物制备
分别获取在上述实施例1-3中培养获得的11种愈合组织，并用干净的纸巾去除水分后，以60℃的温度干燥2天。为了获得根据本发明的组合物，用纯净水充分清洗40g的高山火绒草愈合组织、20g的海冬青愈合组织、20g的海茴香愈合组织、20g的苹果愈合组织、40g的葡萄愈合组织、40g的沙漠玫瑰愈合组织、40g的熏衣草愈合组织、20g的黄荆愈合组织、40g的莲花愈合组织、20g的没药愈合组织及20g的茉莉愈合组织后进行混合。在热汤蒸馏器中利用20L的纯净水以80～100℃的温度加热8～48小时来获得了愈合组织复合体的热水提取物。对于获得的组合物在12000rpm下于4℃的温度下离心30分钟，去除不溶性固体，获得上清液作为愈合组织复合体提取物(callus complex extract)。
实验例1：影响细胞存活率的试验
在本实验中，了解对于通过上述实施例1制备的愈合组织复合体提取物的细胞的增殖活性。
为此，首先，将人角质形成细胞(human keratinocyte，HaCaT，角质形成细胞)和Detroit551(human fibroblast，成纤维细胞)利用含有10％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基接种于96孔板(well plate)，在5％的CO2、37℃的温度条件的恒温器中培养24小时。24小时后，以愈合组织复合体提取物的最终浓度为0.5％、1％、2％的方式处理细胞，并培养24小时。随后，向各孔中分别加入4μL的5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，并培养4小时。去除培养液后，通过分别加入100μL的二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)溶液来溶解细胞后，使用分光光度计(spectrophotometer)在540nm下测定吸光度。
以使用纯净水的对照组的吸光强度为基准，根据下述数学式1计算皮肤细胞的存活率程度，并用百分率表示，结果如图1所示。
数学式1：细胞存活率(％)＝[(实验组吸光度-对照组吸光度)/对照组吸光度]×100
如图1所示，确认本发明的愈合组织复合体提取物在处理浓度下在三种皮肤细胞株中没有毒性。
实验例2：抗氧化效果(2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基清除活性(ABTS Radical Scavenging Activity))
利用2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基(ABTS radical)的抗氧化能的测定是利用通过与过硫酸钾(potassium persulfate)反应生成的ABTS自由基(ABTSfree radical)被提取物中的抗氧化物质去除来使基团(radical)特有的青绿色脱色的方法，通过修改范登伯格(Van den Berg)等方来测定。
混合1.0mM的2，2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2，2'-azo-bis 2-amidinopropanedeihydrochloride，AAPH)与溶于100mM的磷酸盐缓冲液(PBS buffer)的2.5mM的2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2'-azino-bis3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid，ABTS)后，在68℃的恒温槽中反应12分钟。将愈合组织复合体提取物20μL和980μL的2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液在37℃的温度的水浴(water bath)中反应10分钟，以使最终浓度为0.5％、1％、2％、5％，并测定在734nm下减少的吸光度，此时，阳性对照组使用了0.1％的水溶性维生素E(Trolox)。根据下述数学式2计算2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸基团清除能。
数学式2：
Figure GDA0003765028670000171
表1
处理物质 ABTS自由基清除能(％)
对照组 0
0.1％的水溶性维生素E 52.67
0.5％的愈合组织复合体提取物 31.33
1％的愈合组织复合体提取物 34.67
2％的愈合组织复合体提取物 47.33
其结果，如上述表所示，本发明的愈合组织复合体提取物在处理浓度下具有根据2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基清除能的抗氧化效果。
实验例3：皮肤屏障改善基因表达试验
在本实验中，为了观察通过上述实施例1制备的愈合组织复合体提取物的皮肤屏障改善功效，调查了作为水分或甘油运载体的AQP3和公知为天然保湿因子的FLG的表达量变化。
将人角质形成细胞接种于96孔板后，细胞培养条件下培养24小时。随后，与不含血清的DMEM培养基一起处理细胞，以使作为试验物质的愈合组织复合体提取物的最终浓度为1％，并进一步培养24小时。为了在AQP3和FLG的基因水平中进行确认，执行了实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法，其试验顺序如下。
为了核糖核酸分离(RNA isolation)和互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成，使用了SuperPrepTMcell lysis&RT Kit for qPCR(TOYOBO，Cat.SCQ-101)。将去除培养基的细胞用磷酸盐缓冲液清洗一次，加入50μL的细胞裂解混合物(cell lysis mixture)(包含基因组脱氧核糖核酸去除剂(gDNA remover))反应5分钟后，加入停止液(stop solution)。32μL的RT反应混合物(RT reaction mixture)中加入8μL的提取的信使核糖核酸，利用聚合酶链式反应，以在37℃的温度下15分钟、50℃的温度下5分钟、95℃的温度下5分钟的条件合成互补脱氧核糖核酸。为了比较分析基因的表达，将合成的互补脱氧核糖核酸作为模板(template)，利用ThunderbirdTM SYBR qPCR Mix(TOYOBO，Cat.QPS-201)进行实时荧光定量聚合酶链式反应分析。使用于实验的引物(primer)为凯杰(Qiagen)公司的QuantiTect引物分析(GAPDH；Cat.QT01192646，AQP3；Cat.QT00212996，FLG；Cat.QT02448138)，试样的AQP3、FLG的信使核糖核酸表达量利用GADPH定量化，并进行比较。实时荧光定量聚合酶链式反应条件为，首先在95℃的温度下反应15分钟后，以94℃的温度下15秒钟、60℃的温度下30秒钟、72℃的温度下为30秒钟为一周期，共进行40周期。
其结果确认，如图2所示，在处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物的细胞中AQP3和FLG的信使核糖核酸表达量增加，并具有保护或增强皮肤屏障功能的效果。
实验例4：皮肤再生及皱纹改善效果试验
在本实验中，为了观察通过上述实施例1制备的愈合组织复合体提取物的皮肤再生及皱纹改善效果，测定了作为胶原分解相关酶基质金属蛋白酶1(MatrixMetalloproteinase-1，mMP-1)和胶原的合成前体的原骨胶原(Procollagen Type I C-Peptide，PIP)的生物合成量。
4-1.mMP-1生物合成测定
将Detroit551细胞接种于48孔板后，在细胞培养条件下培养24小时。随后，与不含血清的DMEM培养基一起处理细胞，以使作为试验物质的愈合组织复合体提取物的最终浓度为1％，并进一步培养48小时。
取100μL的一部分稀释通过上述过程培养的培养基的上清液，与基质金属蛋白酶1Biotrak活性测定试剂盒(MMP-1 Biotrak Activity Assay Kit)(Amersham，Cat.RPN2629)中100μL的基质金属蛋白酶1标准物质一同分别放入抗体包膜微滴定板(antibody coated microtiter plate)，在25℃的温度下反应3小时。去除培养基，以200μL的磷酸盐缓冲液清洗四次后，向各孔中加入100μL的抗血清(antiserum)，并在25℃的温度下反应3小时。随后，去除溶液，用200μL的磷酸盐缓冲液清洗四次后，将100μL的过氧化物酶(peroxidase)标记抗体溶液(antibody solution)加入各孔中，在25℃的温度下进一步反应1小时。并且，去除溶液后，向各孔中加入100μL的底物溶液(substrate solution)，在遮光状态的室温下反应15分钟。随后，加入100μL的停止溶液(1N的H2SO4)后，在450nm下测定吸光度。在450nm的下测定吸光度后，制作基质金属蛋白酶1的标准浓度曲线，并算出试样中基质金属蛋白酶1量。
4-2.原骨胶原生物合成测定
将Detroit551细胞接种于48孔板后，在细胞培养条件下培养24小时。随后，与不含血清的DMEM培养基一起处理细胞，以使作为试验物质的愈合组织复合体提取物的最终浓度为1％，并进一步培养48小时。
取20μL的一部分稀释通过上述过程培养的培养基的上清液，与PIP EIA试剂盒(Takara，Cat.MK101)中20μL的原骨胶原标准物质一起，分别放入抗体包膜微滴定板(antibody coated microtiter plate)，并将100μL的过氧化物酶标记抗体溶液加入各孔中，在37℃的温度下反应3小时。去除培养基，200μL的磷酸盐缓冲液清洗四次后，向各孔中加入100μL的底物溶液，在遮光状态的室温下反应15分钟。随后，加入100μL的停止溶液(1N的H2SO4)后，在450nm下测定吸光度。在450nm的下测定吸光度后，制作原骨胶原标准浓度曲线，并算出试样中原骨胶原量。
其结果确认，如图3所示，处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物的细胞中，基质金属蛋白酶1的量减少，原骨胶原量增加，具有预防或改善皱纹的效果。
实验例5：抗炎效果
从Raw264.7细胞株生成的一氧化氮(nitric oxide，NO)的量通过利用作为存在于细胞培养液中的NO2-形态的Griess试剂来测定。为了在用1μg的脂多糖(LPS)活化的Raw264.7细胞中测定NO生成抑制，将处理含有最终浓度为1.0％的愈合组织复合体提取物的培养基的实验组和对照组培养24小时后，对于Griess试剂，100μl的细胞培养上清液和100μl的Griess试剂(1％的磺胺(sulfanilamide)中的5％的磷酸(phosphoric acid)，1％的α-萘酰胺(α-naphthylamide)中的H2O)混合在96孔板中反应10分钟后，在540nm下测定吸光度。NO2-的浓度通过稀释硝酸钠(sodium nitrate)测定吸光度来获得标准曲线。
其结果确认，如上述图4所示，在处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物的细胞中，用脂多糖诱导的炎症反应中NO含量减少，具有抗炎效果。
实验例6：黑色素生成抑制效果(美白效果)
利用含10％的胎牛血清的DMEM培养基将B16F1细胞以1×105细胞/孔向6孔板加入2ml，在5％的CO2、37℃的条件的恒温器中培养24小时。去除所有培养基后，在各孔中处理了2ml的包含最终浓度为1％的愈合组织复合体提取物。处理溶于DMEM培养基的α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)，以使最终为10nm后，将处理的细胞在5％的CO2、37℃的条件的恒温器中反应72小时。去除培养基，利用磷酸盐缓冲液清洗三次后，处理100μL的包含蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的1X RIPA缓冲液来溶解细胞，在15000rpm下离心20分钟后，将上清液回收在在新的容器。向96孔板中分别加入50μL的回收的上清液。
为了定量蛋白质，向孔中分别加入150μL的BCA溶液(A：B＝50：1)后，在37℃的条件的恒温器中反应30分钟，然后在540nm下利用酶标仪(ELISA reader)测吸光度。将测定的吸光度值代入利用0～1mg/mL的浓度范围的白蛋白(albumin)标准校准曲线来求出蛋白质量。
最后，为了定量分析黑色素，在60℃的温度下干燥颗粒(Pellet)，加入400μL的含10％的DMSO的1N的NaOH，并在90℃的温度的恒温槽中反应。将100μL的反应的溶液加入96孔板，利用酶标仪在492nm下测吸光度。将测定的吸光度代入利用0～2.5mg/mL的浓度范围的黑色素标准校准曲线来求出蛋白质量黑色素量。
其结果确认，如上述图5所示，在处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物的细胞中，抑制黑色素生成，从而具有美白效果。
实验例7：因紫外线照射引起的细胞凋亡抑制效果
作为使用于紫外线(UV)照射的光源使用了发射302nm波长的紫外线的紫外交联剂CL-1000(ultraviolet crosslinker CL-1000)(Ultra-Violet Products，CA)。将作为皮肤角质形成细胞的人角质形成细胞以1x105细胞/ml加入24孔板中并在培养器中培养24小时后，去除培养基并用磷酸缓冲液清洗。加入500μL的磷酸缓冲液后，以10mJ/cm2照射紫外线后，用不含胎牛血清的新鲜的细胞培养培养基替换，以最终浓度为1％的方式处理愈合组织复合体提取物后进一步培养24小时。其中，加入5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT，西格玛(Sigma))后，将在培养器中培养3小时后形成的(fomazan)溶于二甲基亚砜，移至96孔板后在595nm下利用酶标仪测吸光度，并与照射紫外线后未处理试样的对照组比较细胞存活率。
其结果确认，如上述图6所示，利用紫外线(UVB)诱导后减少的细胞存活率借助处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物来具有因紫外线照射引起的细胞凋亡抑制效果，因此细胞存活率增加。
实验例8：生物钟调节相关基因表达试验
在本实验中，为了观察通过上述实施例1制备的愈合组织复合体提取物的生物钟调节功效，调查了作为相关基因的CLOCK和PER1的表达量变化。
将人角质形成细胞接种于96孔板后，在细胞培养条件下培养24小时。随后，利用紫外线(UVB)诱导后，对细胞一同处理不含血清的DMEM培养基与作为试验物质的愈合组织复合体提取物，以使最终浓度为1％，并进一步培养8小时、16小时、24小时、32小时。为了确认CLOCK、PER1的基因水平，执行了实时荧光定量聚合酶链式反应法，其试验顺序如下。
为了核糖核酸分离和互补脱氧核糖核酸合成，使用了SuperPrepTMcell lysis&RTKit for qPCR(TOYOBO，Cat.SCQ-101)。将去除培养基的细胞用磷酸盐缓冲液清洗一次，加入50μL的细胞裂解混合物(包含基因组脱氧核糖核酸去除剂)反应5分钟后，加入停止液。向32μL的RT反应混合物中加入8μL的提取的信使核糖核酸，利用聚合酶链式反应，以在37℃的温度下15分钟、50℃的温度下5分钟、95℃的温度下5分钟的条件合成互补脱氧核糖核酸。为了比较分析基因的表达，将合成的互补脱氧核糖核酸作为模板，利用ThunderbirdTM SYBRqPCR Mix(TOYOBO，Cat.QPS-201)进行实时荧光定量聚合酶链式反应分析。使用于实验的引物(primer)为凯杰(Qiagen)公司的QuantiTect引物分析(GAPDH；Cat.QT01192646，AQP3；Cat.QT00212996，FLG；Cat.QT02448138)，试样的CLOCK、PER1的信使核糖核酸表达量利用GADPH定量化，并进行比较。实时荧光定量聚合酶链式反应条件为，首先在95℃的温度下反应15分钟后，以94℃的温度下15秒钟、60℃的温度下30秒钟、72℃的温度下为30秒钟为一周期，共进行40周期。
其结果确认，如图7所示，通过紫外线(UVB)刺激的不规则的CLOCK和PER1的表达形态在处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物的细胞中，几乎恢复成没有紫外线(UVB)刺激的细胞的CLOCK、PER1的表达形态。
实验例9：皮肤能量活性增加效果试验
在本实验中，为了观察通过上述实施例1制备的愈合组织复合体提取物的皮肤能量活性增加效果，测定了细胞能量(腺苷三磷酸(ATP))的活性程度。
将Detroit551细胞接种于12孔板后，在细胞培养条件下培养24小时。随后，对细胞一同处理不含血清的DMEM培养基与作为试验物质的愈合组织复合体提取物，以使最终浓度为0.5％、1％、2％，并进一步培养24小时。
取50μL的一部分通过上述过程培养的细胞的溶解物，将腺苷三磷酸检测试剂盒(ATP assay Kit)(艾博抗(Abcam)，Cat.ab83355)中50μL的腺苷三磷酸标准物质分别加入96孔板中，并将50μL的腺苷三磷酸反应混合物(ATP reaction mix)溶液加入各孔中，在室温的遮光状态下反应30分钟。随后，在570nm下侧吸光度，制作腺苷三磷酸标准浓度曲线，算出试样中腺苷三磷酸量。以使用纯净水的对照组的吸光强度为基准，根据下述数学式计算皮肤能量活性程度并用百分率表示。
表2
处理物质 能量活性效果(％)
对照组 0
愈合组织复合体提取物1％ 44.77
其结果确认，如上述表2所示，在处理1％的本发明的愈合组织复合体提取物的细胞中能量活性效果优秀。
实验例10：皮肤活力增进效果试验
在本实验中，为了观察通过上述实施例1制备的愈合组织复合体提取物的皮肤活力增加效果，针对20名身体质量指数(Body Mass Index，BMI)为21～27的20～45岁女性受试者，以每天一次，淋浴后按摩的同时使用试验物质12周，判断使用前和使用12周后的比较效果。评价项目通过问卷评估进行，在表3中示出回答感觉到皮肤细胞活化及皮肤活力增加效果的受试者数量。
表3
Figure GDA0003765028670000221
Figure GDA0003765028670000231
其结果确认，如上述表所示，对于本发明的愈合组织复合体提取物，在处理浓度下使用感评估中回答，大多数被调查人在使用对照组12周后几乎没感觉到皮肤细胞活化及皮肤活力增加效果，但是通过愈合组织复合体提取物感觉到皮肤细胞活化和皮肤活力增加。
实验例11：痤疮改善效果
以10名具有痤疮的男女为对象，以早晚在整个脸部均匀地抹上在实施例1中制备的浓度为1％的愈合组织复合体提取物4周。针对痤疮改善效果判定，根据参加实验的本人所感觉到的程度，参考下述判定基准，以1～3分对试验前状态进行评价后，对痤疮治愈效果进行评价，其结果如下述表所示。
试验前状态的评价
1＝略有痤疮、2＝有一点痤疮、3＝痤疮严重
痤疮效果判定
-：几乎没有效果，+：略有效果，++：缓解很多，+++：完全治愈
表4
受试者 试验前状态 经过2周后 经过4周后
受试者1 1 - -
受试者2 3 + ++
受试者3 1 - +
受试者4 2 + ++
受试者5 1 + +
受试者6 2 + +
受试者7 2 + ++
受试者8 2 - ++
受试者9 1 - +
受试者10 3 ++ +++
可其结果，如上述表所示，在使用包含1％的本发明的愈合组织复合体提取物的柔软化妆水4周后，可确认大多数受试者具有痤疮改善效果。
实验例12：皮脂抑制效果试验
为了确认愈合组织复合体提取物的皮脂抑制效果，10名受试者的4周后，利用皮肤油分测定器(Sebum meter SM810)测定皮肤的皮脂分泌量。实验在22±2℃、40±5％的湿度(humidity)下进行。在油性皮肤的情况下，测定值为220μg/cm2以上，在正常皮肤的情况下为100～220μg/cm2。作为对照组使用了纯净水。
表5
处理物质 0天(使用前) 28天(使用后)
对照组 232 225
0.5％的愈合组织复合体提取物 231 220
1％的愈合组织复合体提取物 230 191
2％的愈合组织复合体提取物 227 180
其结果确认，如上述表所示，本发明的愈合组织复合体提取物在处理浓度下使用4周后皮脂分泌量减少，具有皮脂抑制效果。
实验例13：收缩毛孔效果试验(体外试验(In vitro Test))
为了测定本发明的愈合组织复合体提取物组合物的收缩毛孔效果，以在上述实施例中制备的组合物对象，通过使用血红蛋白作为代替皮肤的蛋白质来测试收缩毛孔效果。利用0.9％的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)(0.1mM，pH 7.4)制备血红蛋白溶液(0.05g/50ml)，向2ml的血红蛋白溶液中加入2ml愈合组织复合体提取物，以使最终浓度为0.5％、1％、2％后，震荡混合30秒钟后，在3500rpm下离心10分钟，向1ml的其上清液加入2ml的纯净水，在407nm下利用紫外线可见光光谱(UV-Visible spectrum)进行测定。对照组加入2ml的磷酸盐缓冲液。
表6
处理物质 毛孔收缩效果(％)
对照组 0
0.5％的愈合组织复合体提取物 28.78
1％的愈合组织复合体提取物 35.74
2％的愈合组织复合体提取物 39.15
其结果确认，如上述表所示，本发明的愈合组织复合体提取物在处理浓度下具有收缩毛孔效果。

Claims (11)

1.一种皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，包含：
高山火绒草细胞培养物或其提取物；
海冬青细胞培养物或其提取物；
海茴香细胞培养物或其提取物；
苹果细胞培养物或其提取物；
葡萄细胞培养物或其提取物；
沙漠玫瑰细胞培养物或其提取物；
熏衣草细胞培养物或其提取物；
黄荆细胞培养物或其提取物；
莲花细胞培养物或其提取物；
没药细胞培养物或其提取物；以及
茉莉细胞培养物或其提取物作为有效成分，
其中，所述各个细胞培养物为愈合组织培养物。
2.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于预防或改善皱纹。
3.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于保护或增强皮肤屏障功能。
4.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于预防或改善痤疮。
5.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于保护因紫外线照射而引起的皮肤细胞凋亡。
6.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于美白皮肤。
7.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于抗老化或抗氧化。
8.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于抑制皮脂。
9.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，上述组合物用于收缩毛孔。
10.根据权利要求1所述的皮肤改善用化妆品组合物，其特征在于，使用上述各个植物的叶子。
11.一种根据权利要求1至10中任一项所述的皮肤改善用化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1，准备将从高山火绒草、海冬青、海茴香、苹果、葡萄、沙漠玫瑰、熏衣草、黄荆、莲花、没药及茉莉诱导的各个植物细胞培养物或其提取物混合而成的混合物；以及
步骤2，制备含有在上述步骤1中准备的混合物的化妆品组合物。
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